DE1221643C2

DE1221643C2 - METHOD FOR PRODUCING HUMANHISTAMINE AZO ALBUMINES

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Publication number: DE1221643C2
Application number: DE19641221643
Authority: DE
Priority date: 1964-03-17
Filing date: 1964-03-17
Publication date: 1974-05-09
Also published as: DE1221643B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Human-Histaminazoalbuminen mit Hilfe der Diazoreaktion von H. P auly.The invention relates to a method for the production of human histamine zoological albumin with the aid the diazo reaction of H. P auly.

Es ist bekannt, daß aus p-Aminobenzol-azohistamin und Rind- und Pferdeseren bei der Diazoreaktion nach H. P aüly Histaminazobenzol-azoproteine erhalten werden können. Diese Verbindungen haben den Charakter von Histaminantigenen, d. h., sie vermögen der Wirkung von Histamindosen, die das Mehrfache der toxischen Dosis betragen, entgegenzutreten. Die auf diese Weise hergestellten Verbindungen werden in der Allergietherapie benutzt, vgl. Went und Kesztyüs, Allergie und Asthma, Bd.7 (1961), S. 144, sowie K. Hajos und M. Hajos, Acta Med. Hung., Bd. 2 (1951), S. 117.It is known that from p-aminobenzene-azohistamine and bovine and horse sera in the diazo reaction according to H. P aüly histaminezobenzene azo proteins can be obtained. Have these connections the character of histamine antigens, d. that is, they are capable of the effects of doses of histamine that Multiple times the toxic dose to counter. The connections made in this way are used in allergy therapy, see Went and Kesztyüs, Allergie und Asthma, Vol.7 (1961), p. 144, as well as K. Hajos and M. Hajos, Acta Med. Hung., Vol. 2 (1951), p. 117.

Nach dem bekannten Verfahren wird zur Herstellung der Histaminazobenzol-azoproteine p-Aminobenzolazohistamin in verdünnter Salzsäure gelöst und der Lösung Eis und portionsweise eine Natriumnitritlösung zugegeben. Die erhaltene salzsaure Histaminazobenzoldiazoniumchloridlösung wird unter Kühlung in mit Natriumcarbonätlösung vermischtes Rind- oder Pferdeserum einfließen gelassen, das gebildete Histaminazobenzol-azoprotein gefällt, mit Natronlauge in Lösung gebracht, mit Alkohol erneut gefällt und nach nochmaligem Lösen die Fällung mit Alkohol wiederholt. Das so erhaltene Endprodukt löst man in Natronlauge und neutalisiert es dann mit Salzsäure in Gegenwart von Phenolphthalein, wobei sich eine Histaminazoproteinlösung bildet.According to the known process, p-aminobenzolazohistamine is used for the production of the histamine azobenzene azo proteins dissolved in dilute hydrochloric acid and the solution ice and a portion of a sodium nitrite solution admitted. The hydrochloric acid histaminezobenzene diazonium chloride solution obtained is mixed with sodium carbonate solution while cooling Allowed beef or horse serum to flow in, the histaminezobenzene-azoprotein formed precipitates with Sodium hydroxide solution brought into solution, reprecipitated with alcohol and, after dissolving again, the precipitation with Alcohol repeated. The end product obtained in this way is dissolved in sodium hydroxide solution and then neutralized with it Hydrochloric acid in the presence of phenolphthalein, forming a histaminezoprotein solution.

Dieses bekannte Verfahren weist zahlreiche Nachteile auf. Da das Rind- oder Pferdeserum inhomogen ist, ist auch das erhaltene Produkt nicht homogen, infolgedessen schwer löslich und läßt sich aus seinen Lösungen leicht fällen. Durch die Fällung mit Salzsäure wird das native Eiweiß teilweise denaturiert, was die Löslichkeit des Produktes ebenfalls beeinträchtigt. Bei den nach diesem Verfahren erhaltenen Azoproteinen werden mit 1 Mol Eiweiß höchstens 1,4 Mol p-Aminobenzol-azohistamin gekuppelt, was im Hinblick auf die biologische Wirksamkeit zu wenig ist.This known method has numerous disadvantages. Because the beef or horse serum is inhomogeneous is, the product obtained is also not homogeneous, as a result of which it is difficult to dissolve and can be extracted from it Find solutions easily. The native protein is partially denatured by precipitation with hydrochloric acid, which also affects the solubility of the product. In the azo proteins obtained by this process, 1 mol of protein is at most 1.4 mol of p-aminobenzene-azohistamine coupled what is too little in terms of biological effectiveness.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Human-Histaminazoalbuminen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man in an sich bekannter Weise p-Aminobenzolazohistamin in saurem Medium mit Natriumnitrat behandelt, das erhaltene Reaktionsgemisch mitHuman-Albuminen in einem Molverhältnis von mindestens 5:1 —■ bezogen auf das eingesetzte p-Aminobenzolazohistamin — umsetzt, das erhaltene Reaktionsgemisch mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel behandelt und das abgetrennte Reaktionsprodukt mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel wäscht.The invention relates to a method for producing human-Histaminazoalbuminen, which is characterized by treating in manner known per se p-Aminobenzolazohistamin in an acidic medium with sodium nitrate, and the resulting reaction mixture withhuman-albumins in a molar ratio of at least 5: 1 - ■ based on the p-aminobenzolazohistamine used, the reaction mixture obtained is treated with a water-miscible organic solvent and the reaction product separated off is washed with a water-miscible organic solvent.

Nach einer vorteilhaften Durchführungsform des Verfahrens wird das bei der Diazotierung von p-Ammobenzol-azohistamin mit Natriumnitrit inAccording to an advantageous embodiment of the method that is in the diazotization of p-Ammobenzene-azohistamine with sodium nitrite in

ίο saurem Medium in bekannter Weise erhaltene Reaktionsgemisch in bekannter Weise unter Kühlung einer wäßrigen Lösung zugetropft, die aus einem aus Humanseren isolierten Albumin und Alkalihydroxyd und/oder einem basisch dissoziierenden anorganischen Salz hergestellt worden ist. Nach einigem Stehen fällt man das erhaltene Reaktionsprodukt aus der Lösung im pH-Bereich von 4,5 bis 5,5, vorzugsweise von 4,8 bis 5,2, m'it einer so großen Menge an mit Wasser mischbarem organischem Lösungsmittel, vorzugsweise Äthanol, aus, daß die Konzentration des organischen Lösungsmittels in derίο acidic medium obtained in a known manner reaction mixture added dropwise in a known manner with cooling of an aqueous solution that consists of a Albumin and alkali hydroxide and / or a basic dissociating one isolated from human sera inorganic salt has been produced. After standing for a while, the reaction product obtained is precipitated from the solution in the pH range from 4.5 to 5.5, preferably from 4.8 to 5.2, with such a large one Amount of water-miscible organic solvent, preferably ethanol, from that the Concentration of the organic solvent in the

' Lösung nach der Fällung 20 bis 50 °/o, zweckmäßig 35 bis 45 % beträgt. Das erhaltene Human-Histaminazoalbumin wird mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, zweckmäßig 20 bis 50°/oigem, vorzugsweise 35 bis 45°/oigem, wäßrigem Äthanol ge- ' Solution after the precipitation is 20 to 50%, expediently 35 to 45%. The human histaminazoalbumin obtained is mixed with a water-miscible solvent, expediently 20 to 50%, preferably 35 to 45%, aqueous ethanol.

, waschen. Falls notwendig, wird das Reaktionsprodukt nach dem Waschen erneut mit Alkalien in Lösung gebracht und die bereits beschriebene Fällung sowie das Waschen wiederholt. Aus den auf diese Weise erhaltenen Human-Histaminazoalbuminen kann man nach Zusatz von Alkalien und Konservierungsmitteln Lösungen der gewünschten Konzentration herstellen., to wash. If necessary, the reaction product becomes again in solution after washing with alkalis brought and repeated the precipitation and washing already described. Out that way Human histaminazo albumins obtained can be obtained after the addition of alkalis and preservatives Prepare solutions of the desired concentration.

Die gemäß Erfindung hergstellten Human-Histaminazoalbumine weisen im Gegensatz zu den Produkten des vorbekannten Verfahrens folgende vorteilhafte Eigenschaften auf, wie neuere physikochemische Untersuchungen ergeben haben:In contrast to the products, the human histaminazoalbumins produced according to the invention have of the previously known method on the following advantageous properties, such as newer physicochemical Studies have shown:

Infolge der Verwendung von Albuminen können die Naphteile der mit Serumproteinen erhaltenen Histaminazoproteine, die sich daraus ergeben, daß die Serumproteine gemischte Eiweißstoffe sind, d. h., daß sie Albumine und Globuline enthalten und wegen der schwankenden Zusammensetzung der Globuline eine von Fall zu Fall abweichende Zusamensetzung aufweisen, beseitigt werden. Darüber hinaus ist wegen der Abwesenheit von artfremden Proteinen keine Fällung mit Salzsäure, d. h. keine Denaturierung, notwendig, und so kann die Entstehung von unlöslichen Produkten vermieden werden. Dies hat zur Folge, daß die Produkte des Verfahrens der Erfindung einer Sterilfiltration zugänglich sind, was im Falle der Fällung der Proteine mit Salzsäure nicht möglich ist.As a result of the use of albumins, the naph parts can be those obtained with serum proteins Histamine inazoproteins resulting from the serum proteins being mixed proteins, i.e. H., that they contain albumins and globulins and because of the fluctuating composition of the Globulins have a composition that varies from case to case. About it In addition, due to the absence of foreign proteins, no precipitation with hydrochloric acid is possible, i. H. none Denaturation, necessary, and thus the formation of insoluble products can be avoided. As a result, the products of the process of the invention are accessible to sterile filtration are, which is not possible in the case of precipitation of the proteins with hydrochloric acid.

Wird ein nach dem vorbekannten Verfahren erhaltenes Histaminazoprotein in 0,12 molarer Pufferlösung von Diäthylbarbitursäurelösung bei pH 8,6 in einer Mikroelektrophoreseapparatur bei einer Stromstärke von 1,5 mA und einer Spannung von 50 V 20 Minuten der Elektrophorese unterworfen, treten zwei Spitzen auf, während bei dem gemäß Erfindung erhaltenen Produkt nur eine Spitze erhalten wird. Damit ist die Einheitlichkeit des gemäß Erfindung erhaltenen Produktes bewiesen. Auch nach den Ergebnissen der Untersuchungen mit der Ultrazentrifuge ist das gemäß Erfindung erhaltene Reaktionsprodukt einheitlicher als das Produkt des vorbekannten Verfahrens. Der Reinheitsgrad des gemäß ErfindungIs a obtained according to the previously known method Histamine inazoprotein in 0.12 molar buffer solution of diethylbarbituric acid solution at pH 8.6 in a microelectrophoresis apparatus at a current of 1.5 mA and a voltage of 50 V. Subjected to electrophoresis for 20 minutes, two peaks appear, while that of the invention obtained product is only obtained a tip. This is the uniformity of the invention obtained product proved. Also according to the results of the investigations with the ultracentrifuge the reaction product obtained according to the invention is more uniform than the product of the previously known process. The degree of purity of the invention

erhaltenen Produktes läßt sich — im Gegensatz zu dem des vorbekannten Verfahrens — photometrisch kontrollieren.The product obtained can be - in contrast to that of the previously known process - photometrically check.

Ferner wird mit der Verwendung der aus Seren isolierten Albumine gemäß Erfindung — an Stelle der inhomogenen Seren, wie nach dem vorbekannten Verfahren — ein stabileres und besser lösliches End^- produkt erhalten. Mit der Vergrößerung des Verhältnisses von p-Aminobenzol-azohistamin zu Albumin von 1,4:1 auf mindestens 5:1 wird auch die Histaminantigen-Wirkung des Produktes erhöht.Furthermore, with the use of the albumins isolated from sera according to the invention - instead of of the inhomogeneous sera, as in the previously known method - a more stable and more soluble end ^ - product received. With the increase in the ratio of p-aminobenzene-azohistamine to albumin The histamine antigen effect is also increased from 1.4: 1 to at least 5: 1 of the product increased.

Mit der Maßnahme, die vorbekannte Salzsäuiefällung durch eine Alkoholfällung zu ersetzen, wird die Denaturierung des Eiweißes sicher umgangen und damit die Löslichkeit des Endproduktes ebenfalls verbessert.With the measure of replacing the previously known Salzsäuiefällung with an alcohol precipitation, is the denaturation of the protein safely bypassed and thus the solubility of the end product as well improved.

Das erfindungsgemäß erhaltene Produkt läßt sich im Gegensatz zu dem inhomogenen Produkt des vorbekannten Verfahrens standardisieren, was zur Folge hat, daß man die Lösung des Human-Histaminazoalbumins unter sterilen Bedingungen zu einem stabilen Präparat konfektionieren kann.The product obtained according to the invention, in contrast to the inhomogeneous product of the previously known Standardize the procedure, with the result that the human histaminazoalbumin solution is used can be made into a stable preparation under sterile conditions.

Das Verfahren gemäß Erfindung wird durch folgendes Beispiel näher erläutert.The method according to the invention is illustrated in more detail by the following example.

example

14,7 g p-Aminobenzol-azohistamin werden in 360 ecm 3%>iger Salzsäure gelöst, die erhaltene Lösung auf 0° C abgekühlt und unter weiterer Kühlung und stetigem Rühren mit 641 ecm einer 0,In-Natriumnitritlösung diazotiert. Sodann tropft man das Reaktionsgemisch unter Kühlen und Rühren einer auf 0° C gekühlten Lösung zu, die durch das Lösen von 420 g Humanalbumin, in 101 O,5n-Dinatriumhydrogenphosphatlösung und 80 ecm n-Natriumhydroxydlösung hergestellt worden ist, läßt das erhaltene Reaktionsgemisch eine Stunde bei 0° C stehen, kühlt es danach auf eine Temperatur von —4 bis —7° C ab und gibt bei einem pH-Wert von ίο 4,8 bis 5,2 Äthanol bis zu einer Konzentration zwischen 35 und 45 % im Gemisch zu, wäscht das ausgefallene Produkt mit 35- bis 45°/oigem wäßrigem Äthanol und trennt es ab. Falls notwendig, wird die beschriebene Fällung und das Waschen nach erneütem Lösen wiederholt.14.7 g of p-aminobenzene-azohistamine are dissolved in 360 ecm of 3% hydrochloric acid, the resulting solution cooled to 0 ° C and with further cooling and constant stirring with 641 ecm of a 0.1 In sodium nitrite solution diazotized. The reaction mixture is then added dropwise with cooling and stirring to 0 ° C cooled solution, which is obtained by dissolving 420 g of human albumin in 101 O, 5N disodium hydrogen phosphate solution and 80 cc of n-sodium hydroxide solution has been prepared, leaves the obtained Reaction mixture stand for one hour at 0 ° C, then cools it to a temperature of -4 to -7 ° C and gives at a pH of ίο 4.8 to 5.2 ethanol up to a concentration between 35 and 45% in the mixture, the precipitated product washes with 35 to 45% aqueous Ethanol and separates it. If necessary, the described precipitation and washing are renewed Loosen repeatedly.

Wird der Niederschlag in physiologischer NaCl-Lösung gelöst und der Stickstoff nach Kjeldahl bestimmt, ergibt sich eine Ausbeute von 350 bis 360 g, auf das Protein bezogen.
Eigenschaften des Präparates:If the precipitate is dissolved in physiological NaCl solution and the nitrogen is determined according to Kjeldahl, the result is a yield of 350 to 360 g, based on the protein.
Properties of the preparation:

a) Bei Untersuchung unter Anwendung der freien Elektrophorese oder der Papierelektrophorese ergab sich, daß die Beweglichkeit des Histaminazoalbumins gleich der des Albumins ist.
b) Bei der Untersuchung in der Ultrazentrifuge ergab sich für das Histaminazoalbumin eine Sedimentationskonstante von 4,2 bis 4,5.
,c) Bei den spektrophotometrischen Untersuchungen gab das Endprodukt bei einem Histamin: Albumin-Verhältnis von 10:1 eine Kurve mit einem Maximum bei 390 ιημ.a) When examined using free electrophoresis or paper electrophoresis, it was found that the mobility of histamine zoalbumin is equal to that of albumin.
b) The investigation in the ultracentrifuge showed a sedimentation constant of 4.2 to 4.5 for the histaminazoalbumin.
, c) In the spectrophotometric investigations, the end product gave a curve with a maximum at 390 μm at a histamine: albumin ratio of 10: 1.

Claims

Claim:

Process for the production of human histamine zoological albumin, characterized in that one in a known manner Treated p-aminobenzolazohistamine in acidic medium with sodium nitrite, the resulting reaction mixture with human albumins in a molar ratio of at least 5: 1 based on the p-aminobenzolazohistamine used, converts the reaction mixture obtained with a treated with water-miscible organic solvent and the separated reaction product with a water-miscible organic solvent Solvent washes.