DE1215863B - Herstellung und Gewinnung des neuen Antibioticums 9865 R. P. - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. α.:

Nummer:
Aktenzeichen:
Anmeldetag:
Auslegetag:

C12d

DeutscheKL: 30 h- 6

1215 R 35175IV a/30 h 14. Mai 1963 5. Mai 1966

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung eines neuen Antibioticums, das im folgenden mit 9865 R.P. bezeichnet wird.

Es wurde gefunden, daß dieses Antibioticum 9865 R.P. im wesentlichen aus drei Bestandteilen besteht, die im folgenden mit den Nummern 13057 R.P., 13213 R.P. und 13330 R.P. bezeichnet werden. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Gewinnung dieser drei Bestandteile aus dem Antibioticum 9865 R.P. ίο

Das Antibioticum 9865 R.P. sowie seine drei Bestandteile sind insbesondere auf Grund ihrer sehr ausgeprägten Wirksamkeit gegen Carcinome wertvoll. Sie besitzen außerdem eine sehr beträchtliche antibakterielle Wirkung sowohl auf grampositive als auch auf gramnegative Keime. Diese Eigenschaft ist besonders interessant, da die Produkte eine starke Wirksamkeit auch gegenüber Keimen (und insbesondere Staphylokokkenstämmen) besitzen, die gegen übliche Antibiotica und selbst gegen gewisse ao Antibiotica mit Wirksamkeit gegenüber Carcinomen, wie beispielsweise dem Actinomycin und dem Rufochromomycin, resistent sind.

Das neue Antibioticum wird durch Züchtung eines der beiden im nachfolgenden vollständiger identifizierten Mikroorganismen, die dem Genus Streptomyces angehören und mit »Streptomyces 8899« bzw. »Streptomyces 31723« bezeichnet werden, unter geeigneten Bedingungen erzeugt.

Das Antibioticum 9865 R.P. ist in chlorhaltigen Lösungsmitteln, wie beispielsweise Chloroform und Dichlkroäthan, löslich, in auf pH 3 bis 4 angesäuertem Wasser relativ löslich, in Alkoholen sehr wenig löslich und in Wasser, Benzol und Äther praktisch unlöslich.

Das Antibioticum 9865 R.P. enthält Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff. Seine Elementarzusammensetzung ist die folgende: C = 61,0%, H = 6,2 %, O == 28,157ο, Ν = 2,65%· Herstellung und Gewinnung des neuen Antibioticums 9865 R. P.

Anmelder:
Rhöne-Poulenc S. A., Paris

Vertreter:

Dr. F. Zumstein, Dipl.-Chem. Dr. rer. nat. E. Assmann und Dipl.-Chem. Dr. R. Koenigsberger, Patentanwälte, München 2, Bräuhausstr.

Als Erfinder benannt:

Sylvie Pinnert,

Leon Ninet,

Jean Preud'Homme, Paris

Beanspruchte Priorität:

Frankreich vom 18. Mai 1962 (898 076)

Das Antibioticum besitzt die folgenden physikalischen Eigenschaften:

Aussehen: Rotoranges amorphes Pulver.

Ultraviolettspektrum (die Messung wurde mit einer Lösung in 96%igem Alkohol durchgeführt):

Absorptionsmaximum

bei 236 ΐημ BYL = 425

Absorptionsminimum

bei 245 ηιμ EIS, = 284

Absorptionsmaximum bei 255 ηιμ ΕΪ1 = 308

Absorptionsminimum bei 280 πιμ BYL = 108

Absorptionsmaximum bei 290 πψ, BYL = 114

Absorptionsminimum bei 325 ΐημ BYL = 20

Absorptionsmaximuur bei 495 mp Ei* = 146

Schulter

bei 533 πιμ BYL = 80

Dieses Spektrum ist in der F i g. 1 gezeigt.

Infrarotspektrum (die Messung wurde an mit Kaliumbromid verpreßtem Produkt vorgenommen):

Dieses Spektrum ist in der F i g. 2 wiedergegeben, in der als Abszisse einerseits die Wellenlängen in Mikron (unterer Maßstab) und andererseits die Wellenzahlen in cm-¹ (oberer Maßstab) und als Ordinaten die Transmissionen in % aufgetragen sind.

609 567/477

i 215

In der nachfolgenden Tabelle I sind die Hauptbanden der Infrarotabsorption für dieses Produkt wiedergegeben.

Tabelle I

etwa 3450 st	1260 Sch	990 sst
2925 st	1230 st	etwa 945 Sch
1715 st	1205 sst	917 m
1615 st etwa	1190 Sch	873 m
1580 st	1147 Sch	840 m
1445 st	1113 st	815 m
1410 sst	1080 st	793 m
1377 st	1067 st	764 m
1350 st	1030 st	etwa 690 m
1282 sst	1005 sst
sst = sehr stark
st = stark,
m = mittel,
Sch = Schulter.

Absorptionsminimum

bei 325 ΐημ Ε& = 10

Absorptionsmaximum

bei 482 bis 498 ΐημ E& == 230

Schulter

bei533 mμ E\?„ = 127

Dieses Spektrum ist in der Fig. 3 gezeigt.

Infrarotspektrum (die Messung wurde an mit Kaliumbromid verpreßtem Produkt vorgenommen).

Dieses Spektrum ist in der F i g. 4 wiedergegeben, in der die Maßstäbe denjenigen der F i g. 2 identisch sind.

^χ5 In der folgenden Tabelle II sind die Hauptbanden der Infrarotabsorption für dieses Produkt wiedergegeben.

Tabelle!!

Das Antibioticum 9865 R.P. kann durch Papier- ao Chromatographie identifiziert werden. Das Antibioticum wird auf Papier Arches Nr. 302, das mit Phosphatpuffer von pH 4,8 imprägniert ist, mit dem System n-Butanol, dks mit Wasser gesättigt ist, chromatographiert, wobei absteigend entwickelt wird. Die Auswertung des Chromatogramms erfolgt durch Bioautographie auf einer Nähragarplatte, die mit Bacillus subtilis oder Klebsiella pneumoniae beimpft ist. Das Chromatogramm zeigt, daß das Antibioticum 9865 R.P. drei aktive Substanzen enthält, die 13057 R.P., 13213 R.P. und 13330 R.P. genannt werden und deren Ri-Werte 0,3, 0,7 bzw. 0,9 betragen.

Diese drei Bestandteile, von denen die beiden ersten besonders wichtig sind, können aus dem Gemisch, das sie enthält, d. h. aus dem Antibioticum 9865 R.P., nach verschiedenen Methoden, die im folgenden noch besehrieben werden, isoliert werden.

Der Bestandteil 13057 R.P. kann in Form der Base oder in Form eines Additionssalzes vorliegen.

Das Antibioticum 13057 R.P. ist in Form der Base in Alkoholen und Chloroform löslich, in Wasser und Ketonen sehr wenig löslich und in Benzol und Äther praktisch unlöslich.

Die Base 13057 R.P. enthält Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff. Ihre Elementarzusammensetzung ist die folgende: C = 59,8 %, H = 5,85 %, N = 2,3 %, O = 29,45 %.

Diese Substanz besitzt die folgenden physikalischen Eigenschaften:

Aussehen: Rotes amorphes Pulver.
Schmelzpunkt: 155 bis 170⁰C (Zersetzung).

Ultraviolettspektrum (die __Messung wurde mit einer Lösung in 96%igeni Äthanol durchgeführt):

Absorptionsmaximum

bei 236 ηιμ EU = 621

Absorptionsminimum^T

bei 245 ΐημ E}1 = 378

Absorptionsmaximum

bei 255 ηψ. EX₁ = 426

Absorptionsminimum

bei 280 ηιμ EU = 122

Absorptionsmaximum

bei 290 bis 295 ηιμ. Eil = 135

etwa 3450 sst	1262 Sch	1010 st
2925 st	1230 st	983 st
1715 m	1205 st	950 sch
1615 st etwa	1190 Sch	918 sch
1582 st	1150 Sch	867 sch
1447 st	1117 st	etwa 840 sch
1410 st	1090 m	815 m
1380 st	1080 m	790 m
1355 st	1068 m	762 m
1282 st	1033 m .
st = stark;
sst = sehr stark;
m = mittel;
sch = schwach;
Sch = Schulter.

Das Antibioticum 13057 R.P. ist in Form seines Hydrochloride in Wasser und Alkoholen löslich, in Chloroform wenig löslich und in Benzol und Äther praktisch unlöslich.

Das Hydrochlorid des Antibioticums 13057 R.P. hat die folgende Elementarzusammensetzung: C = 55,4%, H = 5,45%, 0 = 28,8%, N = 2,3%, Cl = 6,15%.

Seine physikalischen Eigenschaften sind die folgenden:

Aussehen: Rotorange Nadeln.
Schmelzpunkt: 225 bis 23O⁰C (Zersetzung).

Drehvermögen: [<x]%° = +24O⁰C (c = 0,1% in Methanol).

Ultraviolettspektrum (die Messung wurde mit einer Lösung in 96%igem Äthanol durchgeführt):

Absorptionsmaximum

bei 236 ηιμ Effi. = 594

Absorptionsminimum

bei 245 πιμ El?» = 360

Absorptionsmaximum

bei 255 ηιμ EU = 410

Absorptionsminimum

bei 280 ΐημ EiL = 118

Absorptionsmaximum

bei 290 bis 295 ΐημ EJl = 129 Absorptionsminimum

bei 325 ΐημ E& = 10

Absorptionsmaximum

bei 482 bis 498 ΐημ Eli = 218

Schulter

bei 533 ηαμ B¹J*, = 120

Dieses Spektrum ist in der F i g. 5 gezeigt.

Infrarotspektrum (die Messung wurde an mit Kaliumbromid verpreßtem Produkt vorgenommen).

Dieses Spektrum ist in der F i g. 6 wiedergegeben, in der die Maßstäbe mit denjenigen der F i g. 2 und 4 identisch sind.

In der nachfolgenden Tabelle III sind die Hauptbanden der Infrarotabsorption für dieses Produkt wiedergegeben.

Tabelle III

etwa 3450 sst

etwa 2925 st
1707 st
1610 sst
1575 sst
1439 sst
1408 sst
1370 st
1350 st.
1282 sst

sst = sehr stark,

st = stark,

m = mittel

Sch = Schulter.

1260 Sch 1228 st
1205 sst
etwa 1190 Sch etwa 1145 Sch 1112 sst
1080 st
1064 st
1028 st
1000 sst

982 sst 950 m 935 m 912 m 882 m 867 st 838 st 813 st 788 st 762 st etwa 692 m

Das Antibioticum 13213 R.P. ist in chlorhaltigen Lösungsmitteln, wie beispielsweise Chloroform, und in Dimethylformamid löslich, in auf pH 3 bis 4 angesäuertem Wasser verhältnismäßig löslich, in Alkoholen sehr wenig löslich und in Wasser, Benzol und Äther praktisch unlöslich.

Der Bestandteil 13213 R.P. enthält Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff. Seine Elementarzusammensetzung ist die folgende: C = 58,6%> H = 6,2%, N = 2,2%.

Der Bestandteil zeichnet sich durch die folgenden physikalischen Eigenschaften aus: Aussehen: Rotoranges amorphes Pulver.

Ultraviolettspektrum (die ^Messung wurde mit einer Lösung in 96%igem Äthanol durchgeführt):

Absorptionsmaximum

bei 236 πιμ Ε& = 425

Absorptionsminimura
bei 245 πιμ

Absorptionsmaximum

bei 255 ΐημ '
Absorptionsminimum

bei 280 ηιμ
Absorptionsmaximum

bei 290 bis 295 ηιμ
Absorptionsminimum

bei 325 πιμ
Absorptionsmaximum

bei 480 bis 495 ΐημ E
Schulter

bei 533 πιμ Eli

Dieses Spektrum ist in der F i g. 7 gezeigt.

Infrarotspektrum (die Messung wurde an mit Kaliumbromid verpreßtem Produkt vorgenommen) Dieses Spektrum ist in der F i g. 8 wiedergegeben, in der die Maßstäbe mit denjenigen der F i g. 2, 4 und 6 identisch sind.

In der folgenden Tabelle IV sind die Hauptbanden der Infrarotabsorption für dieses Produkt wiedergegeben.

Tabelle IV

etwa 3450 st 1230 st etwa 796 st

xo etwa 2925 m 1205 st 765 m

1715 m etwa 1190 Sch etwa 690 m

1615 st etwa 1180 Sch

1583 st 1117 sst

etwa 1445 st etwa 1080 st
1412 st 1032 st

1377 st 1008 st

1352 st 995 st

1282 st etwa 837 m

1262 st 812 st

sst = sehr stark,

st = stark,

m = mittel,

Sch = Schulter.

Die saure Hydrolyse des Antibioticums 9865 R.P. und seiner beiden Hauptbestandteile 13057 R.P. und 13213 R.P. setzt Aminozucker und eine gefärbte chromophore Gruppe, die das Aglycon ist, in Freiheit. Dieses Aglycon ist in Alkoholen, Essigsäureäthylester

und Chloroform löslich, in Benzol und Äther schwach löslich und in Wasser unlöslich.

Seine Elementarzusammensetzung ist die folgende: C = 63,4%, H = 5,7%, 0 = 30,4%, N<0,2%.

Seine physikalischen Eigenschaften sind die folgenden:

Aussehen: Rotorange Nadeln.
Schmelzpunkt: 16O⁰C, dann 225 bis 230⁰C.

Ultraviolettspektrum (die Messung wurde mit einer Lösung in 96%igera

Äthanol vorgenommen): Absorptionsmaximum

E^

Eil = 274 E& = 297

EIS, = 103

= 108

E₁ ¹I = 20

li

= 155 = 90 = 835

Eli = 510 EU = 570 EU = 149

bei 236 ηιμ
Äbsorptionsminimum

bei 245 ιημ
Absorptionsmaximum

bei 255 ηιμ
Absorptonsminimum

bei 280 ηιμ
Absorptionsmaximum

bei 290 bis 295 ηιμ EIL = 167 Absorptionsminimum

bei 325 πιμ EIL = nahe 0

Absorptionsmaximum

bei 470 bis 495 ηιμ EIL = 272 Schulter

bei 533 ηιμ EIL = 145

Dieses Spektrum ist in der Fig. 9 gezeigt.

Infrarotspektrum

(die Messung wurde an mit Kaliumbromid verpreßtem Produkt vorgenommen)

Dieses Spektrum ist in der Fig. 10 wiedergegeben, in der die Maßstäbe mit denjenigen der F i g. 2, 4, 6 und 8 identisch sind.

etwa 3430 st	1210 SSt	835 st
etwa 2910 st	1185 Sch	808 st
1707 st	1150 m	. 790 st
1610 sst	1117 st	762 st
1575 sst etwa	1083 st	737 m
1440 sst	1065 st	718 m
1415 sst	1032 st	695 st
1375 sst	988 sst
1350 st	941m
1275 sst	918 m
1228 sst	858 m
sst = sehr stark;
st = stark;
m = mittel;
Sch = Schulter.

7 8

In der folgenden Tabelle V sind die Hauptbanden reichung bestimmt: DL₅₀ = 8,75 mg/kg i. v., DL₅₀ der Infrarotabsorption für dieses Produkt wieder- = 13,65 mg/kg s. c. .

gegeben. Die das Antibioticum 9865 R.P. erzeugenden Orga-

Tabelle V nismen gehören zum Genus streptomyces und werden

-: 5 mit dem Namen Streptomyces 8899 und Streptomyces 31723 bezeichnet. Sie wurden im Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, V. St. A., unter den Nummern NRRL 3046 bzw. NRRL 3045 hinterlegt.

ίο Diese Organismen wurden aus in zwei verschiedenen Gebieten von Algerien entnommenen Erdproben isoliert.

Die Isolierungsmethode ist die folgende: Die entnommene Erdprobe wird in destilliertem, sterilem 15 Wasser suspendiert und die Suspension dann auf verschiedene Konzentrationen verdünnt. Ein kleines Volumen jeder Verdünnung wird auf die Oberfläche von Petrischalen aufgebracht, die ein Agar-Nährmedium enthalten.

20 Nach Inkubation von einigen Tagen bei 26° C Das Aglycon von 9865 R.P., 13057 R.P. und werden die Kolonien der Mikroorganismen, die man 13213 R.P. kann durch Kreischromatographie auf isolieren will, auf Schrägagar versetzt, um reich-Papier identifiziert werden. Diese wird auf Papier lichere Kulturen zu erhalten.·

Arches Nr. 302, das mit einer Lösung von Aceton In den modernen zur Identifizierung von Strepto-

mit einem Gehalt von 20% Formamid imprägniert 25 myces bestimmten Klassifikationen (S. A. Waksist, mit dem Gemisch Chloroform—Benzol (2:1), man, »The Actinomycetes«, The Williams and das mit Formamid gesättigt ist, durchgeführt. Man Wilkins Company, Baltimore, 1961, Bd. II; »Bergey's konnte so das Vorhandensein von nur einer einzigen Manual of Determinative Bacteriology«, 7. Auflage, Substanz, die einen Rt-Wert von 0,86 besitzt, zeigen. The Williams and Wilkins Company, Baltimore, Die bakteriostatische Wirkung von 9865R.P. und 30 1957; L. Ettlinger und Mitarbeiter, Archiv seinen beiden Hauptbestandteilen, 13057 R.P. und für Mikrobiologie, 31, 326 [1958]) findet man keine 13213 R.P., gegenüber einer gewissen Zahl von Beschreibung einer Species, deren Züchtungscharakte-Keimen wurde durch eine der üblicherweise zu ristiken mit denjenigen der Streptomyces 8899 und diesem Zweck angewendeten Verdünnungsmethoden 31723 übereinstimmen.

bestimmt. Für jeden Keim wurde die kleinste Kon- 35 In der Klassifikation, die von G. F. G a u s e zentration an Substanz, die unter bestimmten Bedin- und Mitarbeiter, »Zur Klassifizierung der Actinogungen jegliche sichtbare Entwicklung in einer ge- myceten«, VEB Gustav Fisher Verlag, Jena, 1958, eigneten Nährbouillon verhindert, bestimmt. Die gegeben wird, findet man jedoch die Species Strepto-Ergebnisse der verschiedenen Bestimmungen sind in _r myces coeruleorubidus, deren Beschreibung die Eigender Tabelle VE zusammengestellt, in der die mini- 40 schäften der vorliegenden Stämme ziemlich gut trifft, malen, bakteriostatischen Konzentrationen in Mikro- Obgleich diese Beschreibung nach S. A. Waksman, gramm Substanz je Kubikzentimeter Versuchsmedium »The Actinomycetes«, The Williams and Wilkins ausgedrückt sind. Company, Baltimore, 1961, Bd. Π^ S. 323 bis 326,

Die verschiedenen Ergebnisse zeigen, daß diebak- wenig genau ist, ist es doch möglich, Streptomyces 8899 teriostatische Wirksamkeit von 9865 R.P., 13057 R.P. 45 und Streptomyces 31723 in die Species Streptomyces und 13213 R.P. bei zahlreichen Bakterien in Erschei- coeruleorubidus einzuordnen und sie mit den Namen nung tritt, von denen gewisse gegenüber einem oder Streptomyces coeruleorubidus Stamm 8899 und mehreren der folgenden Antibiotika resistent sind; Streptomyces coeruleorubides Stamm 31723 zu be-Penicilh'n, Tetracyclin, Streptomycin, Streptothricin, zeichnen. Zur Präzisierung dieser Frage sind im Neomycin, Congocidin, Erythromycin, Carbomycin, 50 folgenden die einzelnen Charakteristiken der beiden Spiramycin, Streptogramin, Chloramphenicol, Stämme Streptomyces 8899 und Streptomyces 31723 Novobiocin und den folgenden Antibiotica mit definiert, wobei gleichzeitig die Charakteristiken von Wirkung gegen Carcinome; Actinomycin, Streptomyces coeruleorubidus, wie sie von G. F. Ruf ochromomycin. G a u s e und Mitarbeiter beschrieben sind, angegeben

Die Wirksamkeit von 9865 R.P. und seinen drei 55 sind.

Bestandteilen gegen Carcinome wurde im Laborato- .,., , ·,·.,- 11·

rium gezeigt, wobei sie sich gegen Impftumoren der Mikroskopische Morphologie

Maus, wie beispielsweise Ehrlich-Ascites -Tumor, Die Sporulation von Streptomyces 8899 und 31723

Sarkom 180, Benzpyren-Sarkom und lymphoblasti- ist auf Grund ihrer Kompliziertheit schwierig zu scher Leukämie AKR, als besonders wirksam er- 60 beobachten. Sie ist auf »synthetischen« Medien, wie wiesen haben'. Als interessantestes dieser vier Anti- beispielsweise den von Grundy und Mitarbeitern biotica hat sich das 13057 R.P. gezeigt, dessen Toxizi- (Antib. & Chemoth., 1951, Bd. 1, S. 309) beschriebetät hauptsächlich bei der Maus geprüft wurde. Seine nen sowie auf komplexen Medien, wie beispielsweise akute Dosis letalis 50% (DL50) wurde bei subcutaner dem Medium nach Benett (K.L.Jones, Verabreichung bestimmt: DL₅₀ = 47 mg/kg s. c. 65 J. Bacteriol., 1949, Bd. 57, S. 142) beobachtbar.

Es wurde auch seine subakute Dosis letalis 50% Die mikroskopisch geprüften Kulturen auf Platten

(DL₅₀) (eine Verabreichung einmal täglich während zeigen die Bildung von verzweigten Fäden und 5 Tagen) bei intravenöser oder subcutaner Verab- Sporenketten, die für den Genus Streptomyces

charakteristisch sind. Die Sporenfäden, die den kompliziertesten Entwicklungsgrad aufweisen, liegen in Form von Spiralen mit engen Windungen mit mehreren Drehungen vor; man kann oft mehr als fünf davon zählen. Die Sporen sind oval, und ihre Abmessungen betragen etwa 0,6 bis 0,9 bis 0,8 bis 1,2 μ.

Die Befestigung der Sporenfäden liegt in quirlständiger Struktur, manchmal als Monoverticillus-Struktur, am häufigsten jedoch in Biverticillusstruktur vor. Diese Struktur ist mit dem Mikroskop nur beobachtbar, wenn die Sporenfäden nur Spiralen mit einer oder zwei Windungen oder nur zu einer Schlinge abgeschwächte Spiralen aufweisen, da anderenfalls die sehr dichte Ausbildung der Spiralen ihre Befestigung verdeckt und die Beobachtung ihrer Struktur in Sekundärverticillen verhindert.

Unter Berücksichtigung der Morphologieelemente, die den kompliziertesten Organisationsgrad aufweisen, kann man schließen, daß der Typ des Sporenteils von Streptomyces 8899 und 31723 dem Typ Biverticillusspira entspricht, der in der Klassifikation von T. G. Pridham und Mitarbeiter, Applied Microbiol., 1958, Bd. 6, S. 52, beschrieben ist.

Berücksichtigt man, daß das der Luft ausgesetzte Mycel der gut entwickelten Kulturen, wie im folgenden noch gezeigt wird, hellblau ist, und- kehrt man zu dieser Klassifikation zurück, so ordnet man die Streptomyces 8899 und 31723 in die Sektion Biverticillusspira, blaue Serie, ein, wo sich keine beschriebene Species findet, während Streptomyces coeruleorubidus in der Sektion Spira, blaue Serie, der genannten Klassifikation, auftritt.

Allgemeine Eigenschaften

35

Auf Medien, die »synthetische« genannt werden, weisen Streptomyces 8899 und 31723 im allgemeinen ein vegetatives Mycel auf, dessen Farbe zu Beginn der Entwicklung am häufigsten rosa oder rosaorange ist und dessen rote Farbe sich im Verlaufe der Inkubation intensiviert, bis sie lebhaftrot wird. Auf den »organischen« Medien ist das vegetative Mycel braungelb oder braunrot. Das Luft ausgesetzte Mycel ist im allgemeinen auf beiden Arten von Medien gut entwickelt. Es ist während seines Entwicklungsbeginns weiß und färbt sich dann sehr rasch in einem Hellblau, das unten durch den Hauptausdruck Türkisblau definiert ist. Es kann je nach dem Entwicklungsgrad oder der Art des Mediums eine Tönung von schwach veränderlicher Intensität aufweisen, oder seine Farbe kann etwas schwächer sein. Man beobachtet die Bildung von löslichen Pigmenten von reinroter oder rotoranger Farbe von je dem Alter der Kulturen wechselnder Intensität auf den »synthetischen« Medien und von gedämpftroter Farbe (braunrot, braunrosa) auf den »organischen« Medien.

Auf dem Medium nach Williams und McCoy stellt man eine reichliche Produktion von charakteristischem melaninschwarzem Pigment fest.

Eigenschaften der Kulturen
und biochemische Eigenschaften

Die Züchtungseigenschaften und die biochemischen Eigenschaften von Streptomyces 8899 und 31723 wurden in üblicherweise für die Identifizierung von Streptomycesstämmen verwendeten Agar-Nährmedien und Bouillons untersucht. Die gemachten Beobachtungen sind im einzelnen in der Tabelle YII angegeben.

Sie beziehen sich auf die Kulturen, die etwa 1 Monat bei 26° C inkubiert wurden. Es ist der Endzustand der Kulturen angegeben, wobei die Farbentwicklungen im Abschnitt »Allgemeine Eigenschaften« angeführt sind. Literaturhinweise oder Zusammensetzungen der Züchtungsmedien sind im folgenden angegeben. Der Tabelle ist eine Beschreibung von S. coeruleorubidus nach G. F. Ga.use und Mitarbeiter angefügt, in möglichster Übereinstimmung der Kulturen auf Medien ähnlicher Zusammensetzungen.

Anmerkungen

Literaturstellen oder Zusammensetzungen
der Züchtungsmedien

1. S. A. Waksman, »The Actinomycetes«,
Chronica Botanica Company Waltham (Mass.), USA., 1950, S. 193 bis 197.

IA. Erhalten durch Ersatz der Saccharose durch eine gleiche Gewichtsmenge Glucose in der vorstehenden Zubereitung.

2. Calciummalat 1%; Ammoniumchlorid 0,05%; Dikaliumphosphat 0,05 %; Agar 2%.

3. Pepton 0,05%; Fleischextrakt 0,3%; Tyrosin 0,5%; Agar 2%.

4. K. L. J ο η e s, J. Bacteriology, 1949, Bd. 57, S. 142.

5. G r u η d y und Mitarbeiter, Antib. and Chemoth., 1951, Bd. 1, S. 309.

6. A. M. Williams und E. McCoy, Appl. Microbiol., 1953, Bd. 1, S. 307.

7. Manual of Methods for pure culture study of bacteria, Society of American bacteriologists (Π50-Ι8).

8. Handelsübliches Magermilchpulver, nach den Angaben des Fabrikanten aufgefüllt.

Verwendung von verschiedenen Kohlenwasserstoffbestandteilen

(nach der Methode von T. G. Pridham und D. Gottlieb, J.Bact, 56, S. 467 [1946])

Die Kulturen wurden auf Schrägagar durchgeführt. Die Inkubation erfolgte bei 26°C. Zu den Stoffen, die ein rasches und vollständiges Wachstum der Stämme in regelmäßiger Weise hervorrufen, gehören: Xylose, Arabinose, Rhamnose, Glucose, Galactose, Mannose, Lactose, Maltose, Raffinose, Dextrin, Stärke, Glycerin (nur für S. 8899), Adonit, Mannit, Sorbit, Inosit (nur für S. 8899). Dagegen erlauben Sorbose, Inulin (nur für S. 31723), Äsculin, Erythrit und Dulcit keine Entwicklung oder führen nur zu einer außerordentlich beschränkten Entwicklung. Schließlich gehören zu den Substanzen, die ein je nach den Versuchen unregelmäßiges oder mittleres oder schwaches Wachstum hervorrufen, Ribose, Lävulose, Saccharose, Inulin (nur für S. 8899), Glycerin (nur für S. 31723) und Inosit (nur für S. 31723).

Systematische Klassifikation

Die zur systematischen Klassifikation von S. coeruleorubidus Stamm 8899 und Stamm 31723 in Betracht gezogenen Eigenschaften sind die folgenden:

Türkisblaue Farbe des Luft ausgesetzten Mycels. Biverticillenstruktur der Spiralen der Sporenteile. Positive Melaminreaktion der Kulturen auf den geeigneten Medien.

609 567/477

11 12

Die besondere rote Farbe des vegetativen Mycels Die geeigneten assimilierbaren Stickstoffquellen

auf den geeigneten Medien. sind außerordentlich verschiedenartig. Sie können

Die besondere rote Farbe der löslichen Pigmente sehr einfache, chemische Substanzen sein, wie bei-

auf den geeigneten Medien. spielsweise Nitrate, anorganische und organische

5 Ammoniumsalze, Harnstoff und Aminosäuren. Sie

Die zwei ersten Eigenschaften verweisen S. coe- können auch in Form von komplexen Substanzen,

ruleorubidus Stamm 8899 und Stamm 31723 in die die den Stickstoff hauptsächlich in proteidischer

Sektion Biverticillusspira, blaue Serie, der Klassifi- Form enthalten, zugeführt werden, wie beispielsweise

kation von Pridham, wo keine Species beschrie- in Form von Casein, Lactalbumin, Gluten und deren

ben ist. io Hydrolysaten, Sojamehlen, Arachismehlen, Fisch-

Die Gesamtheit der Eigenschaften verweisen S. coe- mehlen, Fleischextrakten, Hefeextrakten, Distillers' ruleorubidus Stamm 8899 und Stamm 31723 in der Solubles und Maisquellwasser,
neuen Klassifikation von S. A. Waksman, Unter den zugefügten mineralischen Stoffen können »The Actinomycetes« (The Williams & Wilkins Com- gewisse eine Pufferwirkung oder eine neutralisierende pany, Baltimore, 1961, Bd. II, S. 155) in die Gruppe 15 Wirkung besitzen, wie beispielsweise die Alkali- oder Melamin+, Serie 5 (Wachstum rot bis rötlichorange); Erdalkaliphosphate oder Calcium- oder Magnesiumin dieser Serie findet sich keine Species mit Luft aus- carbonat.

gesetztem blauem Mycel. S. coeruleorubidus Stamm Andere bewirken das zur Entwicklung von Strepto-

8899 und Stamm 31723 könnten in dieser Serie mit myces 8899 und Streptomyces 31723 und zur Erzeu-

der Qualifikation »blaues Luft ausgesetztes Mycel« 20 gung des Antibioticums erforderliche Ionengleich-

auftreten. gewicht, wie beispielsweise die Alkali- und Erdalkali-

Das Herstellungsverfahren des Antibioticums chloride und -sulfate. Schließlich wirken gewisse in

9865 R.P. besteht im wesentlichen darin, Strep- speziellerer Art als Aktivatoren der Stoffwechsel-

tomyces 8899 oder Streptomyces 31723 auf geeigneten reaktionen der Streptomyces 8899 und 31723. Zu

Medien und unter geeigneten Bedingungen zu züchten 25 diesen gehören die Zink-, Kobalt-, Eisen-, Kupfer-

und anschließend das im Verlaufe der Züchtung und Mangansalze,

gebildete Antibioticum abzutrennen. Zu Beginn der Züchtung soll der pH-Wert des

Die Züchtung des Streptomyces 8899 oder des Fermentationsmediums zwischen 6,0 und 7,8, vor-Streptomyces 31723 kann nach jeder aeroben Ober- zugsweise zwischen 6,5 und 7,5, liegen. Die zur flächenzüchtung oder Immersionszüchtung erfolgen, 30 Züchtung optimale Temperatur beträgt 25 bis 28⁰C, doch ist letztere aus Gründen der Bequemlichkeit zu doch wird auch bei Temperaturen zwischen 23 und bevorzugen. Man verwendet zu diesem Zweck die 35°C eine befriedigende Produktion erzielt. Die verschiedenen Apparaturtypen, die jetzt üblicherweise Belüftung der Züchtung kann zwischen weiten Grenzin der Technik der Fermentationen verwendet werden. werten schwanken. Es wurde jedoch gefunden, daß

Insbesondere kann man den folgenden Weg für die 35 Belüftungen von 0,3 bis 21 Luft je Liter Kultur-Durchführung der Arbeitsgänge einschlagen: flüssigkeit und Minute besonders gut geeignet sind.

_o. , _QOnn , , _c, , ,„.„ Die maximale Ausbeute an Antibioticum wird nach

Streptomyces 8899 oder Streptomyces 31723) - ₂. ^ _{5tägiger mchtüng erhalteQ; wobei diese Zeit}.

ammansa spanne hauptsächlich von dem verwendeten Medium

4 40 abhängt.

Kultur auf Agar Aus den vorstehenden Ausführungen ist ersichtlich,

1 daß die zur Produktion des Antibioticums 9865 R.P.

angewendeten allgemeinen Bedingungen der Züch-

Kultur im Kolben unter Bewegung tung d_es Streptomyces 8899 oder des Streptomyces

I 45 31723 in ziemlich weitem Maße variieren und jedem

Impfkultur im Fermentationsgefäß besonderen Erfordernis angepaßt werden können.

. Das Antibioticum 9865 R.P. kann aus den Fermen-

' tationsmaischen nach verschiedenen Methoden iso-

Produktionskultur im Fermentationsgefäß liert werden.

50 Man kann das Fermentationsmedium bei einem

Das Fermentationsmedium soll im wesentlichen pH-Wert zwischen 1,5 und 9 filtrieren, wobei unter

eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine assi- diesen Bedingungen der Hauptteil der Aktivität in

milierbare Stickstoffquelle, Mineralstoffe und ge- das Filtrat geht. Nach Waschen mit Wasser hält der

gebenenfalls Wachstumsfaktoren enthalten, wobei Filterkuchen praktisch keine Aktivität mehr zurück, alle diese Elemente in Form von gut definierten 55 Es ist vorteilhaft, diesen Arbeitsgang in saurem

Produkten oder von komplexen Gemischen, wie man Medium, insbesondere in einem mit Oxalsäure auf

sie in biologischen Produkten verschiedenen Ur- einen pH-Wert zwischen 1,5 und 2 angesäuerten

sprungs antrifft, zugeführt werden können. Medium, durchzuführen. Es ist auch möglich, die

Als assimilierbare Kohlenstoffquelle kann man Filtration bei einem pH-Wert zwischen 2 und 7, Kohlehydrate, wie beispielsweise Glucose, Saccharose, 60 vorzugsweise nahe 2, in Gegenwart eines alipha-

Lactose, Dextrine, Stärke, Melasse, oder andere tischen Alkohols mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen

Kohlehydratderivate, wie beispielsweise Zuckeralko- vorzunehmen.

hole, wie Mannit u. dgl., oder gewisse organische Bei den obenerwähnten Extraktionsarbeitsgängen

Säuren, wie Milchsäure, Citronensäure, Weinsäure wird das Antibioticum 9865 R.P. in wäßriger oder u. dgl., verwenden. Gewisse tierische und pflanzliche 65 wäßrig-alkoholischer Lösung erhalten; man führt es

Öle, wie beispielsweise Schmalzöl oder Sojaöl, können anschließend durch Extraktion mit einem mit Wasser

diese verschiedenen Kohlehydratquellen mit Vorteil nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie

ersetzen oder ihnen beigefügt werden. Beispielsweise Butanol, Methylisobutylketon, Essig-

13 14

säureäthylester oder Chloroform, bei einem pH-Wert Antibioticum in für die vorgesehenen Anwendungs-

zwischen 5,5 und 9, vorzugsweise nahe 7,5, in eine zwecke geeigneter Form zu erhalten,

organische Lösung über. Dieser Extraktion geht Das so isolierte Antibioticum 9865 R.P. kann in

gegebenenfalls eine Behandlung mit Ionenaustauscher- seine drei Bestandteile, 13057 R.P., 13213 R.P. und

harz voraus. In diesem Falle wird die wäßrige Lösung 5 13330 R.P., getrennt werden. Diese Trennung kann

auf einen pH-Wert von etwa 4 eingestellt und dann nach üblicherweise für die Auftrennung eines Anti-

an einem Carboxylgruppen enthaltenden Kationen- bioticums in seine Bestandteile angewendeten Me-

austauscherharz, vorzugsweise Amberlite IRC 50, in thoden durchgeführt werden, wie beispielsweise durch

der sauren Form, fixiert. Die Elution wird anschrie- Chromatographie an verschiedene Adsorbentien oder

ßend mit einer sauren, wäßrig-alkoholischen Lösung io durch Gegenstromverteilung. Es wurde gefunden,

oder einer wäßrig-alkoholischen Salzlösung, Vorzugs- daß diese letztere Arbeitsweise die vorteilhaftesten

weise mit Methanol mit einem Gehalt von 10% Ergebnisse liefert, insbesondere, wenn sie nach einem

Wasser und 1 % Natriumchlorid, durchgeführt. Das der im folgenden angegebenen bevorzugten Verfahren

Eluat wird anschließend eingeengt, um den Alkohol durchgeführt wird:

zu entfernen, und dann, wie oben angegeben, extra- 15 Zur Gewinnung von 13057 R.P. allein, Gegen-

hiert. stromverteilung von 9865 R.P. mit dem System

Man kann die Fermentationsmaische auch einer Butanol—Phosphatpuffer von pH 7 bis 7,5.
Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren Zur Gewinnung von 13213 R.P. allein, Gegenorganischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Buta- stromverteilung von 9865 R.P. in dem System Butanol, Essigsäureäthylester oder Chloroform, bei einem 20 nol—Essigsäureäthylesterpuffer von pH 4.
pH-Wert zwischen 5,5 und 9, vorzugsweise nahe 7,5, Zur getrennten Gewinnung der drei Bestandteile unterwerfen. In diesem Falle geht die gesamte Ak- aus dem 9865 R.P., zwei aufeinanderfolgende Gegentivität in die organische Phase, die nach üblichen Stromverteilungen: Zuerst mit einer beschränkten Methoden von der wäßrigen Phase abgetrennt wird. Anzahl an Überführungen mit dem aus zwei ali-

Man erhält das Antibioticum 9865 R.P., gleich- 25 phatischen chlorierten Kohlenwasserstoffen und einem gültig, welche Extraktionsweise man gewählt hat, Puffer von pH 5,8 bestehenden System, was ermögschließlich in organischer Lösung. Es kann vorteil- licht, zwei Fraktionen zu erhalten: einerseits in der haft sein, in dieser Stufe eine Reinigung durchzu- wäßrigen Phase das 13057 R.P., das mit 13213 R.P. führen, indem man das Antibioticum nacheinander verunreinigt ist, und andererseits in der organischen durch Veränderung des pH-Wertes in wäßrige Lösung 30 Phase das Gemisch von 13213 R.P. und 13330 R.P., und dann in organische Lösung überführt. Das rohe das mit 13057 R.P. verunreinigt ist; anschließend Antibioticum kann anschließend aus der zuletzt getrennte Behandlung der so erhaltenen zwei Frakerhaltenen organischen Lösung durch Konzentrieren tionen mit dem System Essigsäureäthylester—Metha- oder durch Ausfällung mit einer das Antibioticum nol—Phosphatpuffer von pH 5,5, was ermöglicht, schlecht lösenden Flüssigkeit, wie beispielsweise 35 einerseits das 13057 R.P. und andererseits getrennt Hexan, isoliert werden. Eine besonders vorteilhafte das 13213 R.P. und das 13330 R.P. zu erhalten.
Isolierungsmethode besteht darin, die organische Selbstverständlich kann man vor oder nach diesen Lösung auf einen pH-Wert von etwa 4, vorzugsweise verschiedenen Gegenstromverteilungen verschiedene mit Essigsäure, anzusäuern und dann unter vermin- übliche Reinigungsarbeitsgänge durchführen, insbedertem Druck auf ein kleines Volumen einzuengen. 40 sondere Extraktionen oder Umkristallisationen, um Die Zugabe eines das Antibioticum 9865 R.P. schlecht die drei gesuchten Bestandteile in der für die vorlösenden Mittels, wie beispielsweise von Hexan, zu gesehenen Anwendungszwecke geeigneten Form zu dem erhaltenen Konzentrat bewirkt dann die Aus- erhalten,
fällung des rohen Antibioticums. Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung,

Um reineres Antibioticum 9865 R.P. zu erhalten, 45 ohne sie zu beschränken. Im folgenden wird die kann man die üblichen Methoden, wie beispielsweise Aktivität stets nach einer Trübungsbestimmungs-Chromatographie an verschiedenen Adsorptionsmit- methode unter Verwendung von Klebsiella pneuteln, Gegenstromverteilung oder Verteilung in ver- moniae als empfindlichem Keim und bezogen auf schiedenen Lösungsmitteln, anwenden. Es hat sich eine Probe von 9865 R.P. mit bekannter Aktivität als besonders vorteilhaft erwiesen, eine der beiden 50 als Eichmaß bestimmt. Diese Aktivität ist in Einfolgenden Methoden anzuwenden: heiten (E) je Milligramm für die festen Produkte

Chromatographie des rohen, in Butanol gelösten und in Einheiten je Kubikzentimeter für die Lösungen

Antibioticums an Aluminiumoxyd bei pH 4. ausgedrückt (die Einheit ist als kleinste Menge des

Auflösen des rohen Antibioticums in einem Ge- Produkts definiert, die, gelöst in 1 ecm eines geeig-

misch von Methylenchlorid-Tetrachlorkohlenstoff- 55 neten Kulturmediums, das Wachstum von Klebsiella

Wasser (5:1:6 Volumina), Abtrennen der wäßrigen pneumoniae unter bestimmten Bedingungen inhibiert).

Phase, Extraktion derselben mit Methylenchlorid, . -I₁

Vereinigung der Methylenchloridextrakte, Konzen- Beispiel 1

trierung derselben unter vermindertem Druck und In ein 170-1-Fermentationsgefäß bringt man die

schließlich Zugabe von Hexan zu dem erhaltenen 60 folgenden Bestandteile ein:

Konzentrat, um das gereinigte Antibioticum auszu- Maisquellwasser 2,400 kg

fallen. Eine vergleichbare Methode unter Ersatz des Saccharose 3 600 kg

Methylenchlorids durch Essigsäureäthylester kann Calciumcarbonate'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'. 0^900 kg

ebenfalls angewendet werden. Ammoniumsulfat 0,240 kg

Es ist ersichtlich, daß die verschiedenen zur Ex- 65 Wasser ad 1001

traktion und Isolierung von 9865 R.P. angegebenen

Methoden mehrere Male wiederholt werden können, Dieses Züchtungsmedium hat einen pH-Wert von

je nach den Herstellungserfordernissen, um dieses 6,15. Man sterilisiert durch 40minutiges Durchleiten

15 16

von Dampf von 122°C. Nach Abkühlen beträgt gebracht (Durchmesser der Kolonne: 15,2 cm; Höhe

das Volumen der Bouillon 1201 und der pH-Wert der Kolonne: 200 cm; Höhe des Harzes im Ruhe-

7,20. Das Medium wird dann mit 200 ecm einer zustand in der Kolonne: 110 cm). Das Filtrat geht

gerührten bzw. geschüttelten Erlenmeyer-Kultur des durch das Amberlite-Bett von unten nach oben mit

Stammes »Streptomyces 31723« beimpft, Die Züch- 5 einem Durchsatz von 401 je Stunde durch. Die

tung wird 27 Stunden bei 26 bis 27°C unter Rühren Kolonne wird anschließend mit 1001 Wasser in

und Belüftung mit steriler Luft durchgeführt. Sie ist einer Menge von 501 je Stunde, das von unten nach

dann zur Beimpfung der Produktionskultur geeignet. oben geführt wird, und dann mit 751 einer Methanol-

Die Produktionskultur wird in einem 800-1-FermenT- lösung mit einem Gehalt von 10 % Wasser, die von

tationsgefäß durchgeführt, das mit folgenden Sub- ίο oben nach unten geführt wird, in einer Menge von

stanzen beschickt ist: 501 je Stunde während IVa Stunden gewaschen.

Soiamehl 20 kg ^^e Waschflüssigkeiten werden verworfen, und die

»Distillers'Solubles« ".'.'.'.'.'.'.'.'.'.-.'.] 2,500kg 5^ölf*^e f^Tt ^dann mit einer Lösung eluiert, die

Statte 10 kg ^e folgende Zusammensetzung besitzt:

Sojaöl.., 2,5001 ¹^ Natriumchlorid 10 g

Natriumchlorid 5kg Wasser 100 ecm

Wasser ad 4651 Methanol ad 1000 ecm

Der pH-Wert des so erhaltenen Mediums wird

mit 400 ecm. konzentrierter Natronlauge auf 7,20 ao Das Eluat, das den Hauptteil des Antibioticums eingestellt. Das Medium wird durch 40minutiges enthält, besitzt ein Volumen von 1001. Es wird unter Durchleiten von Dampf von 122⁰C sterilisiert. Man vermindertem Druck bei 35°C bis zu einem Volumen beimpft dann mit 501 der obigen Kultur aus dem von 101 eingeengt.

170-1-Fermentationsgefäß. Die Züchtung wird 67 Stun- Das Konzentrat wird bei pH 7,5 nacheinander

den bei 28° C unter Rühren und Belüftung mit steriler 25 zweimal mit je 51 Chloroform extrahiert. Der Chloro-Luft durchgeführt. Der pH-Wert des Mediums formextrakt wird mit einer ,Lösung von Essigsäure

beträgt dann 7,40 und das Volumen der Maische in Chloroform (10:100 Volumina) auf pH 4 ein-

5201. Die in dem Medium vorhandene Antibioticum- gestellt und dann unter vermindertem Druck bei

menge beträgt 29 E/ccm. 30° C auf ein Volumen von 100 ecm eingeengt. Das

' T₁ ■ · · 1 ο ³° Antibioticum wird mit 11 Hexan ausgefällt, abge-

±5 ei spiel 2 _{saugtj gewasc}hen und getrocknet. Man erhält 9 g

Man züchtet eine Impfkultur in einem 170-1-Fer- eines roten amorphen Pulvers mit einem Gehalt mentationsgefäß unter den gleichen Bedingungen wie von 1400 E/mg,
im Beispiel 1, beimpft jedoch mit 200 ecm einer - Beisüiel4

gerührten bzw. geschüttelten Erlenmeyer-Kultur des 35
Stammes »Streptomyces 8899«. 17,1 g Rohprodukt, das wie im Beispiel 3 be-

Die Produktionskultur wird dann in einem 800-1- schrieben erhalten wurde (Gehalt = 1530 E/mg), Fermentationsgefäß, das, wie im Beispiel 1 beschrie- werden unter Rühren in einem Gemisch aus 1,51 ben, beschickt ist, durchgeführt. Methylenchlorid, 0,3 1 Tetrachlorkohlenstoff und 1,8 1

Der pH-Wert des Mediums wird dann mit 750 ecm 40 Wasser gelöst. Der pH-Wert wird anschließend durch konzentrierter Natronlauge auf 8,10 eingestellt. Das Zugabe von 8 ecm ln-Salzsäure auf 3 eingesetllt. Medium wird anschließend durch 40minutiges Durch- Nach Dekantieren wird die wäßrige Phase mit 71 leiten von Dampf von 122° C sterilisiert. Nach Ab- Methylenchlorid und 200 ecm O,ln-Natronlauge bekühlen beträgt das Volumen der Bouillon 5001 und handelt, um den pH-Wert auf 7,5 einzustellen. Man der pH-Wert 6,80. Man beimpft dann mit 751 der 45 dekantiert und extrahiert erneut die wäßrige Phase obigen Kultur aus dem 170-1-Fermentationsgefäß. bei pH 7,5 mit 3,51 Methylenchlorid. Die Methylen-Die Züchtung wird 67 Stunden bei 26 bis 27°C chloridextrakte werden vereinigt und auf 100 ecm unter Rühren und Belüftung mit steriler Luft durch- eingeengt. Nach Zugabe von 11 Hexan zu dem geführt. Der pH-Wert des Mediums beträgt dann Konzentrat fällt ein Produkt aus, das abfiltriert, 7,40 und das Volumen der Maische 5451. Die in 50 gewaschen und bei 30° C unter vermindertem Druck dem Medium vorhandene Antibioticummenge be- getrocknet wird. Man erhält so 9,15 g Antibioticum trägt 9,1 E/ccm. 9865 R.P. in Form eines rotorangen amorphen PuI-

_, . . . , „ vers mit einem Gehalt von 2180 E/mg.

Beispiel 3

Die gemäß Beispiel 1 erhaltene Maische (5201 mit 55 Beispiel5
einem Gehalt von 29 E/ccm) wird in einen Behälter,

der mit einem Rührer ausgestattet ist, eingebracht, Man stellt ein Gemisch von Methylenchlorid, und ihr pH-Wert wird mit einer konzentrierten Tetrachlorkohlenstoff und MacHvaine-Puffer von Oxalsäurelösung auf 1,8 eingestellt. Es wird 1 Stunde pH 5,8 (20 ecm dieses Puffers werden durch Zugabe gerührt, dann werden 20 kg Filterhilfe zugesetzt. 60 von 12,09 ecm 0,2m-Na₂HPO₄ zu 7,91 ecm 0,1m-Das Gemisch wird auf einer Filterpresse filtriert, Citronensäure hergestellt) in dem Verhältnis 2:1:3 und der Filterkuchen wird mit 1001 Wasser, das (Volumina) her. Wenn sich das Gemisch im Gleichmit Oxalsäure auf pH 2 angesäuert ist, gewaschen. gewicht befindet, trennt man die zwei Phasen. Man Das Filtrat, dessen Volumen 6121 beträgt, wird mit löst 10 g Antibioticum 9865 R.P. mit einem Gehalt einer konzentrierten Natriumhydroxydlösung ver- 65 von 1750 E/mg (hergestellt wie im Beispiel 4 besetzt, bis der pH-Wert einen Wert von 4,5 erreicht. schrieben) in dem Gemisch von 11 jeder Phase. Das Filtrat wird dann auf eine Kolonne, die 201 Man unterwirft dieses System einer Gegenstrom-Amberlite IRC 50 in der Säureform enthält, auf- verteilung von sechs Überführungen in Gefäßen von

17 18

51, wobei man die schwere Phase (Lösungsmittel) eingestellt und 12 Stunden bei 4⁰C aufbewahrt. Es

als mobile Phase und die leichte Phase (wäßrige bilden sich Kristalle, die abfiltriert, gewaschen und

Phase) als stationäre Phase verwendet und jedesmal getrocknet werden. Man erhält so eine erste Fraktion

11 jeder Phase einsetzt. Man gewinnt getrennt das von 4,55 g des Hydrochlorids des rohen 13057 R.P.

Gemisch der unteren Phasen (Gemisch A) und der 5 Durch Einengen der Kristallisationsmutterlaugen auf

oberen Phasen (Gemisch B) der vier ersten Gefäße 100 ecm, Zugabe von 11 Hexan und anschließendes

und das Gemisch der unteren Phasen (Gemisch C) Filtrieren, Waschen und Trocknen des erhaltenen

und der oberen Phasen (Gemisch D) der drei letzten Niederschlags erhält man eine zweite Fraktion von

Gefäße. 2,5 g des Hydrochlorids des rohen 13057 R.P.

Das Gemisch B wird durch Zugabe von 300 ecm ίο

ln-Natronlauge auf pH7,5 eingestellt und dann Beispiel 7
nacheinander mit 4, 2 und 11 Chloroform extrahiert.

Die Chloroformextrakte und das Gemisch A werden 3,75 g des, wie im Beispiel 6 beschrieben, erhal-

vereinigt und unter vermindertem Druck auf 700 ecm tenen Hydrochlorids des rohen 13057 R.P. werden

eingeengt. Das Konzentrat wird zweimal mit je 15 in 40 ecm Dioxan, das 20% Wasser enthält, gelöst.

350 ecm Wasser von pH 7,5 gewaschen, und die Die erhaltene Lösung wird filtriert und zuerst mit

Waschmutterlaugen werden zweimal mit je 100 ecm 15 ecm wasserfreiem Dioxan innerhalb von 2 Stunden

Chloroform extrahiert. Das gewaschene Konzentrat und dann mit 235 ecm wasserfreiem Dioxan in

und die Chloroformextrakte werden vereinigt und 30 Minuten versetzt. Es kristallisiert ein Produkt

unter vermindertem Druck auf 70 ecm eingeengt. 20 aus, das abgesaugt, gewaschen und getrocknet wird.

Man setzt dann 700 ecm Hexan zu; der erhaltene Man erhält so 2,75 g Hydrochlorid von 13057 R.P.

Niederschlag wird abfiltriert, gewaschen und unter in Form von orangeroten Nadeln vom F. = 225

vermindertem Druck bei 30°C getrocknet. Man bis 230°C (Zersetzung) mit einem Gehalt von

erhält so 5,1 g einer Fraktion F₁, die hauptsächlich 151 E/mg,

das Antibioticum 13057 R.P. enthält. 25 0,208 g dieser Verbindung werden in einem Ge-

Andererseits wird das Gemisch D nacheinander misch von 200 ecm Wasser von 150 ecm Butanol

mit 31 und dann mit 1,51 Methylenchlorid extrahiert. gelöst. Man setzt dann 3,4 ecm Ο,ΐη-Natronlauge

Die Methylenchloridextrakte und das Gemisch C zu, dekantiert und extrahiert anschließend die wäß-

werden vereinigt und unter vermindertem Druck rige Phase mit 50 ecm Butanol. Die Butanolextrakte

auf 800 ecm eingeengt. Das Konzentrat wird mit 30 werden vereinigt, zweimal mit je 100 ecm Wasser,

400 ecm Wasser gewaschen und dann erneut auf das auf pH 8 alkalisch gemacht ist, gewaschen und

700 ecm eingeengt. Man setzt 11 Hexan zu. Die auf 10 ecm eingeengt. Das erhaltene Konzentrat

erhaltene Ausfällung wird abfiltriert, gewaschen und wird mit 50 ecm Hexan behandelt, und der erhaltene

unter vermindertem Druck bei 30°C getrocknet. Man Niederschlag wird abfiltriert, gewaschen und getrock-

erhält so 3,7 g einer Fraktion F₂, die hauptsächlich 35 net. Man erhält so 0,0945 g Antibioticum 13057 R.P.

die Bestandteile 13213 R.P. und 13330 R.P. enthält. in Form eines amorphen roten Pulvers mit einem

Gehalt von 160 E/mg.
Beispiel 6

Beispiel 8

10 g eines Produkts, das der obenerwähnten Frak- 40

tion JF₁ vergleichbar ist, werden nach Auflösen in 5 g eines Produkts, das der gemäß Beispiel 5 200 ecm des Systems Essigsäureäthylester—Methanol- erhaltenen Fraktion F_z vergleichbar ist, werden nach m/15-Phosphatpuffer von pH 5,5 (8:3:5 Volumina) Auflösen in 200 ecm des Systems Essigsäureäthyleiner Gegenstromverteilung von 110 Überführungen ester — Methanol — m/15-Phosphatpuffer von in einer Apparatur nach Craig mit 50 Zellen 45 pH 5,5 (8:3:5 Volumina) einer Gegenstromvertei-(50 Überführungen in der Apparatur und 60 Über- lung, die der im Beispiel 6 beschriebenen entspricht, führungen nach der Technik der »single withdrawal«) unterworfen. Man gewinnt das Gemisch der oberen unter Beginn in den beiden ersten Zellen unterworfen. Phasen der Zellen 36 bis 89 (5,31) und engt es auf Man gewinnt das Gemisch der oberen Phasen der 500 ecm ein. Das so erhaltene Konzentrat und das Zellen 0 bis 37 (3,81), das man auf 300 ecm einengt. 50 Gemisch der unteren Phasen der Zellen 36 bis 89 Das so erhaltene Konzentrat und das Gemisch der (5,3 1) werden anschließend vereinigt und auf 800 ecm unteren Phasen der Zellen 0 bis 37 (3,81) werden eingeengt. Das Konzentrat wird nacheinander zweimal anschließend vereinigt und auf 800 ecm eingeengt. mit je 800 ecm Methylenchlorid und dann mit 800 ecm Der pH-Wert wird dann durch Zugabe von 180 ecm Chloroform extrahiert. Die erhaltenen Extrakte werln-Natronlauge auf 8 eingestellt, und die erhaltene 55 den vereinigt, auf 400 ecm eingeengt, zweimal mit je Lösung wird nacheinander mit 800 ecm und dann 400 ecm Wasser von pH 7,5 gewaschen und schließmit 400 ecm Chloroform extrahiert. Die Chloroform- lieh auf 10 ecm eingeengt. Durch Zugabe von 100 ecm extrakte werden auf 400 ecm eingeengt und mit Hexan fällt dann ein Produkt aus, das man abfiltriert, 400 ecm Wasser, das auf pH 8 alkalisch gemacht wäscht und unter vermindertem Druck trocknet, wurde, gewaschen. Die Waschmutterlaugen werden 60 Man erhält so 1,1 g Antibioticum 13213 R.P. in mit 200 ecm Chloroform extrahiert. Das gewaschene Form eines rotorangen amorphen Pulvers mit einem Konzentrat und die Chloroformextrakte werden ver- Gehalt von 2650 E/mg,
einigt, auf 400 ecm eingeengt, mit 400 ecm Wasser, . · 1 ο
das bis auf pH 8 alkalisch gemacht ist, gewaschen, Beispiel y
auf 100 ecm eingeengt, mit 200 ecm Butanol versetzt 65 5001 der gemäß Beispiel 2 erhaltenen Züchtungsund erneut auf 100 ecm eingeengt. Die so erhaltene maische werden, wie im Beispiel 3 beschrieben, Butanollösung wird durch Zugabe von 30 ecm Buta- behandelt. Man erhält so 8,5 g rohes 9865 R.P. mit nol, das mit ln-Salzsäure gesättigt ist, auf pH 3,5 einem Gehalt von 395 E/mg.

19 20

. 17 g eines Rohprodukts, das dem oben beschrie- beiden letzen Fraktionen werden jeweils unter ver-

benen vergleichbar ist, werden, wie im Beispiel 4 mindertem Druck auf 100 ecm eingeengt und dann

beschrieben, gereinigt, wobei jedoch'das Methylen- mit 11 Hexan behandelt. Man erhält so 4,4 g Anti-

chlorid durch Essigsäureäthylester ersetzt wird. Man bioticum 9865 RJP. mit einem Gehalt von 216 E/mg

erhält so 3 g Antibioticum 9865 R.P. mit einem 5 und 1,35 g Antibioticum 9865 R.P. mit einem Gehalt

Gehalt von 1300 E/mg. von 800 E/mg.

Beispiel 12
Beispiel 10

4251 Maische, die wie im Beispiel 1 beschrieben

12,4 g Antibioticum 9865 R.P., das, wie im Bei- io hergestellt sind, mit einem Gehalt von 40 E/ccm

spiel 9 beschrieben, erhalten ist, werden in dem werden mit Oxalsäure auf pH 1,8 angesäuert und

System Butanol—m/3-Phosphatpuffer von pH 7,35 filtriert. Der Filterkuchen wird mit 1001 Wasser,

einer Gegenstromverteilung mit 50 Überführungen das mit Oxalsäure auf pH 2 angesäuert ist, gewaschen,

unterworfen. Man erhält so 5001 Filtrat. Diese werden bei pH 8

Durch Extraktion der unteren Phasen der Zellen 15 nacheinander zweimal mit je 1501 und dann mit 12 bis 35 mit Butanol, Einengen der Butanolextrakte, 1001 Chloroform extrahiert. Die Extrakte werden Waschen und Zugabe von Hexan erhält man eine vereinigt und mit Wasser, das auf pH 4 eingestellt erste Fraktion von 1 g Hydrochlorid von 13057 R.P. ist (nacheinander mit 80 und 501) extrahiert. Der Und dann nach Einengen der Mutterlaugen eine erhaltene Extrakt wird mit ln-Natronlauge auf pH 8 zweite Fraktion von 1,1 g Hydrochlorid von 13057 ao alkalisch gemacht und mit 401 und dann mit 201 R.P. Diese zwei Fraktionen bilden nach Umkristalli- Chloroform extrahiert. Die so erhaltenen Chloroformsieren aus wäßrigem Dioxan rotorange Nadeln, die extrakte werden mit einer Lösung von Essigsäure in bei etwa 225 bis 230⁰C unter Zersetzung schmelzen Chloroform (10:100 Volumina) auf pH 4 angesäuert, und einen Gehalt von 67 E/mg aufweisen. Der angesäuerte Extrakt wird bei 30⁰C unter ver-

Eine auf die Zellen 36 bis 49 angewendete ent- 25 mindertem Druck auf ein Volumen von 50 ecm

sprechende Behandlung liefert 1,1 g rohes 13213 R.P. eingeengt. Das rohe Antibioticum wird dann mit

mit einem Gehalt von 1800 E/mg, aus denen man 500 ecm Hexan ausgefällt, abgesaugt, gewaschen und

nach Durchführung einer Gegenstromverteilung mit im Trockenschrank im Vakuum bei 3O⁰C getrocknet.

50 Überführungen in dem System Butanol—Essig- Man erhält schließlich 680 mg Antibioticum 9865 R.P.

säureäthylester—Macllvaine-Puffer von pH 4 (3:7:10 30 in Form eines roten Pulvers mit einem Gehalt von

Volumina) 0,5 g Antibioticum 13213 R.P. in Form 1080 E/mg,

eines rotorangen amorphen Pulvers mit einem Gehalt _η.;...·.ι ₁₅

von 2000E/mg erhält. Beispiel 13

500 mg Antibioticum 9865 R.P., das wie im Bei-

Beispiel 11 35 spiel4 beschrieben erhalten ist, werden in 100ecm

ln-Schwefelsäure gelöst, und die erhaltene Lösung

6251 Wie im Beispiel 2 beschrieben hergestellte wird 20 Minuten auf einem Wasserbad erhitzt. Nach Maische werden in einen Rühr- bzw. Schüttelbehälter Abkühlen extrahiert man dreimal mit je 200 ecm eingebracht. Der pH-Wert wird mit konzentrierter Essigsäureäthylester. Die organische Lösung wird Natriumhydroxydlösung auf 9 eingestellt. Man rührt 40 dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, bzw. schüttelt 30 Minuten und setzt dann 32 kg nitriert und auf ein kleines Volumen eingeengt. Man Filterhilfe zu. erhält so nach Filtrieren, Waschen und Trocknen

Das Gemisch wird auf einer Filterpresse filtriert 218,5 mg Kristalle.

und mit 2751 Wasser gewaschen. Das Filtrat, dessen 150 mg der obigen Kristalle werden in 3 ecm

Volumen 7801 beträgt, wird mit 156 kg Natrium- 45 Chloroform und 1,5 ecm Benzol gelöst, und die chlorid versetzt; dann wird der pH-Wert mit 12n- erhaltene Lösung wird auf 20 Blättern Papier Arches Salzsäure auf 3 eingestellt. Das Filtrat wird an- Nr. 310, das mit einer Acetonlösung mit einem schließend mit 2601 Butanol extrahiert. Der Butanol- Gehalt von 20 % Formamid imprägniert ist, chroextrakt wird unter vermindertem Druck bei 35° C matographiert. Man entwickelt während 90 Minuten auf 41 eingeengt. Das Konzentrat wird filtriert. 50 mit einem Gemisch Chloroform—Benzol (2:1), das Das rohe Antibioticum wird aus der geklärten Lösung mit Formamid gesättigt ist. Man schneidet aus den durch 321 Petroläther ausgefällt, abgesaugt, ge- 20 Blättern die Hauptzone, die einen Rf von 0,86 waschen und in einem Trockenschrank bei 30° C besitzt, aus und zerkleinert die so erhaltenen ausim Vakuum getrocknet. Man erhält so 227 g rohes geschnittenen 20 Zonen in einem Mixer in Gegenwart 9865 R.P. in Form eines braunroten Pulvers mit 55 von Methanol. Das erhaltene Gemisch wird filtriert, einem Gehalt von 45 E/mg. eingeengt und mit 10 Volumina Wasser versetzt.

50 g dieses Rohprodukts werden in 200 ecm mit Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert, gewaschen Wasser gesättigtem Butanol gelöst, und die erhaltene und unter vermindertem Druck getrocknet. Man Lösung wird bei pH 4 durch Durchleiten durch eine erhält so 120 mg Kristalle.

Kolonne, die 500 ecm Aluminiumoxyd enthält, chro- 6₀ 170 mg Kristalle, die mit den oben erhaltenen matographiert. Nach der Fixierung des Antibioticums identisch sind, werden in 15 ecm Dioxan mit einem wird mit 41 Butanol, das mit Wasser gesättigt ist, Gehalt von 20% Wasser gelöst. Man setzt tropfenentwickelt und eluiert. Man gewinnt so drei gefärbte weise Wasser, das mit Ο,ΐη-Salzsäure auf pH 4 Fraktionen, deren Volumina 450,1500 bzw. 1500 ecm angesäuert ist, zu. Die gebildeten Kristalle werden betragen. Die erste Fraktion wird unter vermindertem g₅ abfiltriert, gewaschen und getrocknet. Man erhält Druck auf 50 ecm eingeengt und dann mit 500 ecm so 130 mg Aglycon von 9865 R.P. in Form von Hexan behandelt. Man erhält so 8,3 g Antibioticum orangeroten Nadeln, die bei 160° C und dann bei 9865 R.P. mit einem Gehalt von 68,5 E/mg. Die 225 bis 23O⁰C schmelzen.

Beispiel 14

500 mg Antibioticum 13057 R.P., die wie im Beispiel 7 beschrieben erhalten sind, werden mit Schwefelsäure wie im Beispiel 13 für das 9865 R.P. beschrieben behandelt. Man erhält so 300 mg Kristalle, die nach

22

Reinigung wie im Beispiel 13 beschrieben 202 mg Aglycon von 13057 R.P. in Form von rotorangenen Nadeln liefern, die bei 160° C und dann bei 225 bis 230°C schmelzen. Dieses Aglycon ist mit dem-5 jenigen von 9865 R.P. identisch.

Tabelle VI
Antibakterielle Spektren

Geprüfte Bakterienstämme

Minimale
bakteriostatische Konzentration

in jttg/cm³
9865 R. P. I 13057 R. P. I 13213 R. P.

Staphylococcus aureus, Stamm 209 P — ATCC 6538 P

Staphy. aureus, Stamm Oxford — ATCC 9144

Staphy. aureus, Stamm 133, Institut Pasteur

Staphy. aureus, Stamm B₃ (resistent gegen Streptomycin und Penicillin) Staphy. aureus, Stamm Hb (resistent gegen Tetracyclin und Penicillin)

Staphy. aureus, Stamm Launoy 1 (resistent gegen Tetracyclin, Streptomycin, Chloramphenicol und Penicillin)

Staphy. aureus, Stamm Launoy 2 (resistent gegen Tetracyclin, Streptomycin und Penicilhn)

Staphy. aureus, Stamm Beaujon 3 (resistent gegen Tetracyclin, Streptomycin, Chloramphenicol und Penicillin)

Staphy. aureus, Stamm 2700 R (resistent gegen Streptothricin)

Staphy. aureus, Stamm 1142 R (resistent gegen Congocidin)

Staphy. aureus, Stamm 3486 R (resistent gegen Spiramycin)

Staphy. aureus, gegen Carbomycin resistenter Stamm

Staphy. aureus, gegen Erythromycin resistenter Stamm

Staphy. aureus, gegen Chloramphenicol resistenter Stamm

Staphy. aureus, gegen Novobiocin resistenter Stamm

Staphy. aureus, gegen Streptogramin resistenter Stamm

Staphy. aureus, gegen Actinomycin resistenter Stamm

Staphy. aureus, Stamm 662 R (gegen Rufochromomycin resistent)

Micrococcus citreus — ATCC 8411

Micrococcus lysodeikticus

Gaffkya tetragena (Faculte de Pharmacie)

Sarcina lutea — ATCC 9341

Sarcina alba (Faculte de Pharmacie)

Streptococcus faecalis (Enterococcus von Thiercelin, Faculte de Pharmacie)

Streptococcus faecalis — ATCC 9790

Streptococcus viridans (Institut Pasteur)

Streptococcus pyogenes haemolyticus (Stamm Dig 7, Institut Pasteur)..

Diplococcus pneumoniae (Stamm TiI., Institut Pasteur)

Neisseria catarrhalis (Faculte de Pharmacie)

Corynebacterium pseudodiphtericum (Faculte de Pharmacie)

Lactobacillus casei —ATCC 7469

Bacillus subtilis — ATCC 6633

Bacillus subtilis Stamm ZO 5 A (Faculte de Pharmacie)

Bacillus subtilis Stamm 3 R 9575, Merck — ATCC 9524

Bacillus cereus — ATCC 6630

Bacillus brevis — ATCC 8185

Bacillus mycoides

Bacillus megatherium (NRRL B 1125)

Bacillus polymyxa (NCTC 4747)

Mycobacterium smegmatis — ATCC 607

Mycobacterium phlei — bakteriologisches Institut von Lyon

Mycobacterium para-smegmatis (A 75 — Lausanne)

Escherichia coli — ATCC 9637

Shigella dysenteriae — Shiga L (Institut Pasteur)

Sahnonella typhimurium (Institut Pasteur)

Salmonella paratyphi A (Lacasse, Institut Pasteur)

Salmonella Schottmuelleri (paratyphi B, Fougenc, Institut Pasteur)

Bacillus lactis aerogenes (Faculte de Pharmacie)

0,20
0,26
0,14
0,35
0,32

0,21
0,17

4,3
4,2
4,2
5,2
5,3

7,1
4,8

0,16	4,4	0,068
0,21	4,7	0,10
0,17	2,1	0,10
0,21	5,2	0,091
0,23	5,3	0,12
0,11	3,8	0,055
0,08	4,1	0,045
0,12	3,9	0,075
0,16	1,9	0,076
0,19	5,8	0,10
0,29	6,3	0,16
0,71	4,2	0,19
0,21	2,5	0,068
0,44	6,7	0,23
0,15	1,2	0,088
0,38	3,3	0,18
1,2	19	0,55
2,1	30	1
	43	2,1
0,11	1,6	0,17
0,075	0,89	0,05
0,31	2,2	0,12
0,026	1,7	0,017
0,035	1,2	0,017
0,12	1,2	0,058
0,12	1,5	0,044
0,12	1,8	0,052
0,24	2,2	0,084
0,14	1,4	0,083
0,14	1,8	0,049
0,25	1,3	0,15
0,70	4,4	0,83
0,13	1,2	0,21
0,041	5	0,035
0,069	2,2	0,09
>4,3	500	5,1
16	2000	13
31	1000	13
3,9	16
16	1000	13
1,9	120

0,14

0,15

0,083

0,20

0,17

0,091 0,091

Tabelle VI (Fortsetzung) 24

Geprüfte Bakterienstämme

	in jUg/cm3	13213 R. P.
Minimale	13057 R. P.	6,3
	1000	0,065
bakteriostatische Konzentration	1,8	25
	>2000	3,1
9865 R. P.	62	0,88
7,8	8,9	6,3
0,18	120	12
16	1000	6,3
3,9	62	0,07
1	1,8
7,8
16
0,24

Aerobacter aerogenes — ATCC 8308

Alcaligenes f aecalis — ATCC 8749

Proteus vulgaris (Faculto de Pharmacie)

Proteus X19

Klebsiella pneumoniae — ATCC 10031

Serratia marcescens (A 476, Lausanne)

Pseudomonas aeruginosa (Stamm Bass — Institut Pasteur) Bruceila bronchiseptica (CN 387 — Wellcomme Institut) Pasteurella multocida (A 125 — Institut Pasteur)

Tabelle VII

Streptomyces 8899

Streptomyces 31723

Streptomyces coeruleorubidus

Agar nach.
Czapek (mit
Saccharose)
(Anmerkung 1,
Medium Nr. 1)

Agar nach
Czapek (mit
Glucose)
(Anmerkung
1-A)

Agar mit
Calciummalat
(Anmerkung 2)

Agar mit Tyrosin
(Anmerkung 3)

Agar mit Stärke
(Anmerkung 1,
Medium Nr. 10)

Vegetatives Mycel: dünn, flach, rosa, Unterseite lebhaft rot

Luft ausgesetztes Mycel: türkisblau

Lösliches Pigment: hellrot

Vegetatives Mycel: dünn, faltig, rissig, rosa, Unterseite rosaorange

Luft ausgesetztes Mycel: türkisblau

Lösliches Pigment: rotorange

Vegetatives Mycel: dünn, flach,

Unterseite blaßrosa Luft ausgesetztes Mycel:

türkisblau

Lösliches Pigment: blaßrosa

Bemerkung: vollständige Löslichmachung von Malat in 1 Monat

Vegetatives Mycel: dünn, faltig, braunschwarz

Luft ausgesetztes Mycel: in Form von Spuren, gräulichweiß

Lösliches Pigment: dunkelbraun

Bemerkung: keine Löslichmachung von Tyrosin

Vegetatives Mycel: dick, wenig faltig, gelblichrosa, Unterseite blaßmalvenrosa

Luft ausgesetztes Mycel: türkisblau

Lösliches Pigment: orangerosa Vegetatives Mycel: dünn, rissig, gelblichrosa, Unterseite wird mittelrot

Luft ausgesetzes Mycel:
türkisblau

Lösliches Pigment: mittehOt

Vegetatives Mycel: dünn, rissig, rosagelbÜch, Unterseite wird mittelrot.

Luft ausgesetztes Mycel:
türkisblau

Lösliches Pigment: mittelrot

VegetativesMycel:dünn, flach, Unterseite blaßmalvenfarbig Luft ausgesetztes Mycel:
ziemlich wenig entwickelt, weiß bis türkisblau

Lösliches Pigment: rosamalvenfarbig

Bemerkung: vollständige Löslichmachung von Malat in 1 Monat

Vegetatives Mycel: ziemlich dick, faltig, sehr dunkelbraun Luft ausgesetztes Mycel:
keines

Lösliches Pigment: dunkelbräun

Bemerkung: keine Löslichmachung von Tyrosin

Vegetatives Mycel; dick, fein gefaltet, Unterseite stumpfrot

Luft ausgesetztes Mycel:
türkisblau
Lösliches Pigment: orangerosa

(Synthetisches Medium Nr. nach G a u s e und Mitarbeiter)

Vegetatives Mycel: himbeerrot bis graubraun

Luft ausgesetztes Mycel: bläulich

Lösliches Pigment: himbeerrot bis graubraun

Vegetatives Mycel: farblos oder rot

Luft ausgesetztes Mycel: weißlich-bläulich Lösliches Pigment; keines Keine Hydrolyse oder langsame Hydrolyse von Stärke

Tabelle VII (Fortsetzung)

	Streptomyces 8899	Streptomyces 31723	Streptomyces coeruleorubidus
Agar mit Glucose	Vegetatives Mycel: fein gefal	Vegetatives Mycel: dünn und	(Organisches Medium Nr. 2
(Anmerkung 1,	tet, zimtfarbig, Unterseite	sehr fein gefaltet, gelblichrot,	nach G a u s e und Mitar
Medium Nr. 7)	braunhellgelb	dann rötlichbraun	beiter)
			Vegetatives Mycel: rötlich-
			braun
	Luft ausgesetztes Mycel:	Luft ausgesetztes Mycel:	Luft ausgesetztes Mycel:
	wenig entwickelt, weiß bis	in Form von Spuren weiß	wenig reichlich, weißlich
	türkisblau
	Lösliches Pigment:	Lösliches Pigment:	Lösliches Pigment:
	braungelb bis braunhellrot	hellgelblichbraun	rötlichbraun
Asparagin-	Vegetatives Mycel: dünn,	Vegetatives Mycel: ziemlich
Glycerin-Agar	wenig gefaltet, blaßorange-	dick und faltig, hellrosa, Un
(Anmerkung 1,	rosa, Unterseite rosaorange	terseite orangerot
Medium Nr. 3)	Luft ausgesetztes Mycel:	Luft ausgesetztes Mycel:
	türkisblau	türkisblau
	Lösliches Pigment:	Lösliches Pigment:
	blaßrosaorange	blaßorangerot
Agar nach	Vegetatives Mycel: ziemlich	Vegetatives Mycel: dünn und
Benett	dick, fein gefaltet, hellbraun	sehr fein gefaltet, krabbenrot,
(Anmerkung 4)	rot, Unterseite dunkelbraun	Unterseite braunrötlich
	Luft ausgesetztes Mycel:	Luft ausgesetztes Mycel:
	türkisblau	türkisblau
	Lösliches Pigment:	Lösliches Pigment:
	braunrot	schwach rosabraun
Stärke- Ammo-	Vegetatives Mycel: dünn, flach,	Vegetatives Mycel: dünn, un
niumphosphat-	Unterseite blaßgelblich bis	gefärbt, flach, Unterseite
Agar	bläulich	schwachrosa
(Anmerkung 5)	Luft ausgesetztes Mycel:	Luft ausgesetztes Mycel:
	sehr gut entwickelt, türkisblau	sehr gut entwickelt, türkisblau
	Lösliches Pigment: keines	Lösliches Pigment: keines
Maltose -Trypton-	Vegetatives Mycel: sehr dick,	Vegetatives Mycel: dick,
Agar	faltig, rissig, Unterseite	faltig, rissig, Unterseite
(Anmerkung 6)	schwarzbraun	schwarzbraun
	Luft ausgesetztes Mycel:	Luft ausgesetztes Mycel:
	sehr gut entwickelt,	sehr gut entwickelt,
	türkisblau bis blaugrau	türkisblau bis blaugrau
	Lösliches Pigment:	Lösliches Pigment:
	charakteristisches, intensiv	charakteristisches, intensiv
	schwarzbraunes Melanin	schwarzbraunes Melanin
	pigment	pigment
Gelatine	Vegetatives Mycel: dünner	Vegetatives Mycel:	Vegetatives Mycel: dunkel
(Stichkultur)	Schleier mit gelblicher	zerstückelter Schleier mit	gelb oder graubraun
	Unterseite	gelblichrosa Unterseite
	Luft ausgesetztes Mycel:	Luft ausgesetztes Mycel:	Lösliches Pigment: graubraun
	wenig entwickelt, bleibt weiß	wenig entwickelt, weiß	Bemerkung: langsame und
	Lösliches Pigment:	Lösliches Pigment:	vollständige Verflüssigung
	mittelbraun	braungelb, wenig reichlich	von Gelatine
	Bemerkung: verzögerte und	Bemerkung: verzögerte und
	unvollständige Verflüssigung	unvollständige Verflüssigung
	von Gelatine	von Gelatine
Kartoffeln	Vegetatives Mycel: fein	Vegetatives Mycel: dick und	Vegetatives Mycel: glatt,
(Anmerkung 1,	gefaltet, dick, hellgelbbraun,	gefaltet, orangerot bis	ungefärbt, gebllich oder
Medium Nr. 27)	dann rötlichbraun	rötlichbraun	dunkelrosa
	Luft ausgesetztes Mycel:	Luft ausgesetztes Mycel:	Luft ausgesetztes Mycel:
	türkisblau	türkisblau	weißblau, blau oder grün
			blau, einige Stämme rosablau
	Lösliches Pigment:	Lösliches Pigment:	Lösliches Pigment:
	dunkelrotbraun	dunkelbraunrot	manchmal dunkelrosa

Tabelle VII (Fortsetzung)

	Streptomyces 8899	Streptomyces 31723	Streptomyces coeruleorubidus
Magermilch	Vegetatives Mycel: dicker	Vegetatives Mycel: dünner	Vegetatives Mycel:
(Anmerkung 8)	dunkelgelblichbrauner Ring	gelblichrosa bis braun	ungefärbt oder gelblich
		rötlicher Ring	Lösliches Pigment· graubraun
	Luft ausgesetztes Mycel: in	Luft ausgesetztes Mycel: in	Bemerkung: keine oder
	Form von Spuren, weiß	Form von Spuren, weiß	positive Koagulation und
	Lösliches Pigment: braun	Lösliches Pigment: braun	Peptonisation, je nach den
			Stämmen
	Bemerkung:	Bemerkung:
	weder Koagulation noch	weder Koagulation noch
	Peptonisation, sehr schwache	Peptonisation, schwache
	Veränderung des pH von	Ansäuerung des Mediums
	6,3 bis 6,5 auf 6,0 bis 6,3	wie S. 8899
Lösung mit Stärke	Vegetatives Mycel: dünner	Vegetatives Mycel: dünner
(Anmerkung 1,	Schleier, lebhaft rot	Schleier, lebhaft rot
Medium Nr. 19)	Luft ausgesetztes Mycel:	Luftausgesetztes Mycel:
	wenig entwickelt, weiß bis	in Form von Spuren, weiß
	türkisblau
	Lösliches Pigment:	Lösliches Pigment:
	orangerot	orangerosa
	Bemerkung: vollständige	Bemerkung: vollständige
	Hydrolyse von Stärke in	Hydrolyse von Stärke in
	1 Monat	1 Monat
»Synthetische«	Vegetatives Mycel: wenig	Vegetatives Mycel: einige	Vegetatives Mycel: ungefärbt
LösungmitNitrat	entwickelt, dünner	isolierte Kolonien, gelblich	Lösliches Pigment:
(Anmerkung 7)	ungefärbter Schleier		Manchmal gelb
	Luft ausgesetztes Mycel:	Luft ausgesetztes Mycel:	Bemerkung: positive oder
	keines	keines	negative Reduktion je nach
	Lösliches Pigment: keines	Lösliches Pigment: keines	den Stämmen
	Bemerkung: keine Reduktion	Bemerkung: keine Reduktion
	zu Nitrit	zu Nitrit
Mikroskopische	Sporenfäden in Form von	Wie Streptomyces 8899	Spiralen mit fünf bis sieben
Morphologie	Spiralen, organisiert nach		Windungen, kugelige Sporen
(Medien: An	der Struktur mit sekun
merkung 4 und 5)	dären Verticillen :
	Kurz oder ovale Sporen

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verwendung der Streptomyces coeruleorubidus-Stämme 8899 (NRRL 3046) oder 31723 (NRRL 45 3045) zur Herstellung des Antibioticums 9865 R.P. sowie seiner Bestandteile 13057 R.P., 13213 R.P. und 13330 R.P. durch aerobe Züchtung in einem

   üblichen Nährmedium und Gewinnung des Antibioticums durch Extraktion, das gegebenenfalls in seine Bestandteile 13057 R.P., 13213 R.P. und 13330 R.P. durch Anwendung von an sich bekannten physikalisch-chemischen Methoden getrennt wird.

   Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

   509 567/477 4.66 © Bundesdruckerei Berlin