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Verfahren zur mikrobiologischen Umwandlung von Steroiden und Fettsäuren
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiologischen Umwandlung von Steroiden
und Fettsäuren mit Hilfe von Sporen, die während der Züchtung in einem Nährstoffmedium
durch vegetatives Wachstumsmaterial gebildet worden sind. Das erfindungsgemäße Verfahren
ist insbesondere zur Einführung von Sauerstoff in Steroide, zur Einführung von Doppelbindungen
in Steroide und zur Umwandlung von Fettsäuren, die mindestens 4 Kohlenstoffatome
enthalten, in Ketone geeignet.
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Die mikrobiologische Umwandlung von Steroiden erfolgte bisher meistens
in einem Nährstoffe enthaltenden Gärmedium, das z. B. Maisquellwasser, Sojabohnenmehl
u. dgl. zusammen mit Melasse und Rohrzucker u. dgl. als assimilierbare Quellen von
sowohl Stickstoff als auch Kohlenstoff enthielt, und in Gegenwart des erhaltenen
Mycels und der während der Gärung gebildeten alkoholischen Flüssigkeit. Verfahren
dieser Art sind z. B. in den USA.-Patentschriften 2 753 290 und 2 793 162 beschrieben.
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Derartige Umwandlungen sind ferner schon sowohl mit dem Mycel als
auch mit der alkoholischen Gärflüssigkeit allein vorgenommen worden. Auch die Verwendung
einer überstehenden Flüssigkeit, die aus zerkleinertem Mycel erhalten worden ist,
ist schon vorgeschlagen worden. Ein solches Verfahren ist besonders in der USA.-Patentschrift
2 602 769 und speziell im Beispiel 18, Spalte 33 bis 34 dieser Patentschrift, beschrieben
worden. Wie in diesem Beispiel ausgeführt worden ist; ergibt die überstehende Flüssigkeit
eine beträchtliche, die alkoholische Gärflüssigkeit eine bessere und der Mycelrückstand
eine vollständige Umwandlung. Die sogenannte »Oxydationsaktivität«, auf die die
Umwandlung zurückzuführen ist, wird bekanntlich von Enzymen bewirkt, und wie aus
der genannten Patentschrift 2 602 769 ferner bekannt ist, sind die während der Gärung
gebildeten Enzyme sowohl mit dem Mycel als auch mit der alkoholischen Gärflüssigkeit
verbunden.
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Die Gewinnung der umgewandelten Steroide aus dem Gärungsmedium bietet
Schwierigkeiten. Auch die Gewinnung in guten Ausbeuten entweder aus dem das vegetative
Wachstum enthaltenden Mycel oder aus der organische Nährstoffe enthaltenden alkoholischen
Gärflüssigkeit, die beide von Gärungsnebenprodukten verunreinigt sind, bietet Schwierigkeiten.
Im Hinblick darauf sind sowohl verbesserte Gewinnungsverfahren (z. B. Extraktionsverfahren)
als auch Verfahren gesucht worden, bei denen die Umwandlung mit Enzymen, die sowohl
von Mycel als auch von alkoholischer Gärflüssigkeit frei sind, erfolgen sollte.
Dabei konnte jedoch kein geeigneter Enzymextrakt gefunden werden, der eine angemessene
Umwandlung bewirkt hätte, so daß bei technischen Arbeitsverfahren entweder das vollständig
vergorene Medium, das sowohl Mycel als auch alkoholische Gärflüssigkeit enthält
oder das Mycel oder die alkoholische Gärflüssigkeit allein, die durch Filtrieren
des vergorenen Mediums erhalten worden ist, verwendet worden ist.
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Bei Versuchen zur Umwandlung von Fetten, z. B. von Milchfett, in stark
schmeckende Mittel mit hilfe von Pilzen vom Stamm Penicillium, z. B. P.roqueforti,
wurde festgestellt, daß die Gärzeit bei Verwendung einer vegetativen Pilzkultur
(Pilzzellen in Mycelform mit Nährstoffwachstumsmedium) z. B. 2 Tage betrug und somit
verhältnismäßig kurz war im Vergleich zu der Gärzeit von z. B. 4 Tagen, die bei
der Verwendung von Sporen nötig war. Es wurde ferner festgestellt, daß die Gärzeit
bei Verwendung von z. B. 7 Tage alte Sporen. enthaltenden vegetativen Pilzkulturen
oder von Sporen allein länger als die mit jungen, z. B. 2 Tage alten, praktisch
sporenfreien vegetativen Pilzkulturen erforderliche Gärzeit war. Das schien die
seit langem vertretene Ansicht zu bestätigen, daß dit:Sporen als solche im Vergleich
zu den im Hinblick auf den Stoffwechsel sehr aktiven, jungen Mycelzellcn; praktisch
inaktiv, d. h. verhältnismäßig inert oder tot sind. Bei weiteren Versuchen
erwies
sich allerdings diese Annahme insofern als ungenau, als nach der Einwirkung von
fettspaltenden Enzymen, wie Lipase, auf das Fett in Milch gefunden wurde, daß nun
die Sporen unerwarteterweise selbst die erhaltenen freien Fettsäuren im Verlauf
weniger Stunden in Ketone umwandelten. Bei dieser Umsetzung wird durch die Sporen
an dem Kohlenstoff atom 2 eine Ketongruppe (C = O) eingeführt, worauf die Fettsäure
decarboxyliert wird. Diese Umsetzung kann durch die folgende Gleichung wiedergegeben
werden
wobei R eine Alkylgruppe ist, die z. B. 1 bis 18 Kohlenstoffatorne oder mehr enthält.
Wenn die Gruppe R eine Butylgruppe (- C,H9) ist, kann die Umsetzung durch die folgende
Gleichung wiedergegeben werden
Diese Entdeckung der Sporenaktivität gegenüber Fettsäuren führte zu der weiteren
Entdeckung, daß Sporen, die von dem vergorenen Medium, zu dem sowohl das Mycel als
auch die alkoholische Gärflüssigkeit gehört, frei sind, als solche zum Modifizieren
von Verbindungen nach verschiedenartigen Verfahren verwendet werden können, die
unten erläutert werden.
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Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur mikrobiologischen Umwandlung
von Steroiden und Fettsäuren mit Hilfe von Sporen, die während der Züchtung in einem
Nährstoffmedium durch vegetatives Wachstumsmaterial gebildet worden sind, vorgeschlagen,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Sporen von dem vegetativen Wachstumsmaterial
und dem Nährstoffe enthaltenden Züchtungsmedium abgetrennt werden und die mikrobiologische
Umwandlung mit Hilfe der Sporen in einem von vegetativem Wachstumsmaterial und von
Nährstoffen praktisch freien wäßrigen Medium unter Belüftung oder in Gegenwart von
reinem Sauerstoff, gegebenenfalls unter Rühren und erhöhtem Druck, durchgeführt
wird.
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Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Sporen können
leicht aus vegetativen Zellen (Mycel) erhalten werden, die in einer untergetauchten
Kultur in einem wäßrigen Maisquellflüssigkeit-Lactosemedium oder in einem anderen
Nährstoffmedium, das in bekannter Weise für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff
sorgt, unter Belüftung (z. B. durch Schütteln) 4 bis 6 Tage gezüchtet worden sind.
Die von den alten vegetativen Zellen gebildeten Sporen werden gewonnen, indem sie
zwecks Entfernung des größten Teils des Mycels durch ein Tuch gepreßt und dann zwecks
Entfernung des restlichen Mycels durch Glaswolle filtriert werden. Die in dem Filtrat
enthaltenen und durch Zentrifugieren gewonnenen Sporen werden dann zwecks Entfernung
etwa zurückgehaltener Nährstoffe mit Wasser gewaschen. Sie können in trockener Form
gelagert oder erneut in destilliertem Wasser suspendiert und bei 4°C gehalten werden.
Die Suspension kann standardisiert werden, so daß sie z. B. etwa 1 Milliarde Sporen
je Kubikzentimeter enthält. Die Sporen können auch auf einer Oberflächenkultur,
z. B. einer Nährstoffagarplatte, gezüchtet, dann abgeschabt uud in Wasser suspendiert
werden, worauf sie, wie oben beschrieben, durch Abfiltrieren, Zentrifugieren u.
dgl. in praktisch reiner Form gewonnen werden können. Eine Oberflächenkultur sollte
verwendet werden, wenn die Organismen in einer untergetauchten Kultur keine oder
nur schlecht Sporen bilden. Die Pilzarten der Reihe Mucorales, z. B. Rhizopus nigricans,
bilden in einer untergetauchten Kultur keine Sporen; Sporen dieses Pilzes sollten
deshalb, wie oben angegeben, durch Oberflächenkulturen hergestellt werden. Wenn
das beste Verfahren zur Erzielung einer hohen Sporenbildung nicht bekannt ist, kann
es durch Vorversuche leicht ermittelt werden.
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Zwecks schneller Umwandlung durch die Sporen sollte die Verbindung
eine feine Teilchengröße aufweisen. Dies kann leicht erfolgen, indem z. B. das Steroid
in einem inerten, mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, z. B. einem niederen
Alkohol (Methanol, Äthanol u. dgl.), mit Wasser mischbaren Glykolen, Aceton od.
dgl., gelöst und die organische Lösung einer wäßrigen Suspension der Sporen zugesetzt
wird. Dabei fällt das Steroid in der gewünschten Form als feine Suspension aus der
Lösung aus. Die Gewinnung des umgewandelten Steroids in der gewünschten hohen Ausbeute
mit organischen Lösungsmitteln, in denen das Steroid löslich ist, erfolgt ohne Schwierigkeiten,
weil vegetatives Wachstum (Mycel) und die alkoholische Gärflüssigkeit mit den restlichen
Nährstoffen wie auch die während der Gärung gebildeten komplexen Nebenprodukte nicht
zugegen sind. Das beanspruchte Verfahren zeichnet sich besonders dadurch aus, daß
die Sporen nach der Verwendung leicht zurückgewonnen und erneut verwendet werden
können. Dazu wird das Steroid in dem Umsetzungsgemisch vorzugsweise mit einem mit
Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie Propylenglykol, löslich gemacht, worauf das
erhaltene Gemisch zwecks Gewinnung der Sporen zentrifugiert und das sporenfreie
Medium, wie oben angegeben, zwecks Gewinnung des Steroids mit einem Lösungsmittel
extrahiert wird. Die vorzugsweise mit Wasser gewaschenen Sporen können dann erneut
verwendet werden, wenn sie in einem Medium gehalten werden, dem ein oder mehrere
Nährstoffe fehlen und das die Sporen vor dem Keimen bewahrt. Das Verfahren, bei
dem nur Sporen verwendet werden, und die Tatsache, daß diese erneut verwendet werden
können, stellen gegenüber den bisher verwendeten Gärverfahren große Verbesserungen
dar.
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Die Umwandlung des Steroids kann sowohl mit reinem Sauerstoff als
auch mit Luft erfolgen. Die Belüftung kann auch unter Rühren und dem Druck von Sauerstoffgasen
erfolgen. Eine geringe Menge KCN (0,65 Mol) oder CO wie auch eine geringe Menge
Glucose (wie 0;5°/0) kann dem Sporenmedium während der Umwandlung zugesetzt werden.
Es ist gefunden worden, daß durch die Zugabe einer geringen Menge eines oxydierbaren
Materials, wie Glucose, Essigsäure, Milchsäure u. dgl., die Ausbeuten erhöht werden.
Diese Modifizierungen können sowohl die schnelle als auch die vollständige Umwandlung
der Steroide unterstützen; wenn jedoch Glucose oder
eine ähnliche
Substanz verwendet wird, ist es wichtig, daß das Medium - zwecks Verhinderung des
Keimens - von assimilierbarem Stickstoff frei ist.
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Nach dem oben angegebenen Verfahren können Sporen, die von Mycel und
Nährstoffmedium frei sind, aus verschiedenartigen Organismen gewonnen und zur mikrobiologischen
Herstellung chemischer Verbindungen, z. B. zum Einführen verschiedenartiger Gruppen
und von Doppelbindungen in verschiedenartige Steroidmoleküle, verwendet werden.
An Stelle der in den unten angegebenen Literaturstellen erläuterten Organismen,
die zum Einführen einer Hydroxygruppe oder einer Doppelbindung in ein Steroidmolekül
durch Gärung einer vegetativen Pilzkultur in einem wäßrigen Nährstoffmedium verwendet
werden, können die : Sporen des gleichen Organismus, die von dem Mycel und Nährstoffen
frei sind, als solche erfindungsgemäß zum Einführen der gleichen Gruppe oder einer
Doppelbindung in das gleiche Steroidmolekül verwendet werden.
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Die folgenden mikrobiologischen Umwandlungen sind hierfür Beispiele:
1. Reduktion von Progesteron zu d 4-Pregnen-20ß-ol-3-on mit Streptomyces lavendulae
(vgl. J. F r i e d u. a., J. Am. Chem. Soc., 75, S. 5764 [1953]).
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2. Dehydrierung von sekundären Alkoholen.
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a) d5-Androsten-3ß,17ß-diol zu Testosteron mit Proactinomyces erythropolis
(vgl. G. E. T u r f i t t, Biochem. J., 40, S.79 [1946]).
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b) Östradiol zu Östron mit Streptomyces albus (vgl. M. W e 1 s c h
u. a., Compt. rend. soc. biol., 142, S.1074 [l948]).
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3. Hydroxylierung in Stellung 1.
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d 4-Androsten-3,17-dion zu d 4-Androsten-l a-ol-3,17-dion mit Penicillium
sp., (vgl. R. M. D o ds o n u. a., J. Am. Chem. Soc., 79, S. 3921 [1957]).
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4. Hydroxylierung in Stellung 2.
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A4 -Pregnen-17oc,21-diol-3,20-dion zu d 4-Pregnen-2ß,17a,21-triol-3,20-dion
mit Streptomyces 5p. (vgl. H. L. H e r z o g u. a., J. Am. Chem. Soc., 79, S.3922
[19571).
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5. Hydroxylierung in Stellung 6.
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Progesteron zu d 4-Pregnen-6ß-ol-3,20-dion mit Streptomyces aureofaciens
(vgl. J. F r i e d u. a., Recent Progr. Hormone Res., 11, S.157 [1955]. Vergleiche
auch E. L. D u 1 a n e y u. a., Mycologia, 47, S.464 [1955]; J. F r i e d u. a.,
J. Am. Chem. Soc., 74, S.3962 [1952]; P. D. M e i s t e r u. a., J. Am. Chem. Soc.,
75, S.416 [1953]; und S. H. E p p s t e i n u. a., J. Am. Chem. Soc., 75, S.408
[1953] betreffend die Mikroorganismen Aspergillus ochraceus, Aspergillus niger und
Rhizopus arrhizus).
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6. Hydroxylierung in Stellung 7.
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Progesteron zu d4-Pregnen-7a-ol-3,20-dion mit Phycomyces blakesleanus
(vgl. J. F r i e d u. a., USA.-Patentschrift 2 753 290. Vergleiche auch C. M e y
s t r e u. a., Helv. Chim. Acta, 38, S.381 [1955]; hier wird eine Art von Peziza
für einen ähnlichen. Umsetzungstyp bei Desoxycorticosteron verwendet). 7. Hydroxylierung
in Stellung 10, 11 oder 12.
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ä) 19-NQr-progesteron zu 10-@-Hydroxy-19-norprogesteron mit Rhizopus
nigricans (vgl. R. L. P e d e r s o: n, u. a., J. Am. Chem. Soc., 78, S.1512 [1956]).
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b) Progesteron zu d4-Pregnen-lla-ol-3,20-dion mit Rhizopus arrhizus
(vgl. D. H. P e t er -s o n u. a., J. Am: Chem. Soc., 74, S.1871 [1952]. Vergleiche
auch D. H. P e t e r s o n u. a.,: J. Am: Chem. Soc., 75, S.412 [1953]).
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c)' Reichsteinsche Verbindung S (d 4-Pregnen-17a,21- diö1= 3,20 -
dion) zu Hydrocortison (d4-Pregneri-Ilß,17a,21-triol-3,20-dion) mit Cunninghamella
blakesleeana (vgl. F. R. H a n s o n- u. a., J. Am. Chem. Soc., 75, `S. 5369 [1953}:
Vergleiche auch G. M. S h u 11 u. a., J: Am. Chem. Soc.; 77, S.763 [1955], und T
h o m a u. a., USA: Patentschrift 2 793 162, `betreffend ähnliche Umsetzungen mit
Curvularia lunata, Trichothecium roseum und Coniothyrium helleborine.
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d) Progesteron zu d 4-Pregnen-12ß-ol-3,20-dion und das dazugehörige
12ß,15ß-Diol mit Calnectria decora (vgl. A. S c h u b e r t u. a. Ber., 90, S.2576
[1957]). B. Die Hydroxylierung in anderen Stellungen sind in den folgenden Literaturstellen
beschrieben worden: P. D. M e i s t e r u. a., Absts. 123rd meeting Am. Chem. Soc.
[1953]; F r i e d u. a., USA.-Patentschrift 2 753 290; B. C a m e r i n o u.. a.,
Gazz. chim. ital., 86, S.1226 [1956]; C. M e y s t r e u. a., Helv. Chim. Acta,
38, S. 381 [1955] ; D. P e r 1 m a n u. a., J. Am. Chem. Soc., 74, S.2126 [1952];
R. W. T h o m a u. a., J. Am. Chem. Soc., 79, S.4818 [1957]; E. L. D u 1 a n e y
u. a., Appl. Microbiol., 3, S.372 [1955]; C. M e y s t r e u. a., Helv. Chim. Acta,
37, S. 1548 [1954]; W. J. Mc A 1 e e r u. a., Arch: Biochem. Biophys., 62, S.129
[1956]). 9. Dehydrierungen.
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Hydrocortison zu d14-Pregnadien-llß,17a-21-triol-3,20-dion mit Streptomyces
lavendulae (vgl. F r i e d u. a.; USA.-Patentschrift 2 793 164. Vergleiche auch
A. N o b i 1 e u. a., J. Am. Chem, Soc., 77, S.4184 [1955],; E. V i s c h e r u.
a., Helv. Chim. Acta, 38, S.835, und 38, S..1502 [19551,- wobei Alternaria sp. bzw.
Didyg#clla lycoperici. verwendet', wurde. Vergleiche ,, huch S p e r o u. a., J.
Soc., 78, S: 6213.[1a56], wobei Septomyxa: affinis, wie in df.;okg gen Beispiel
II, zur Einführung einer ;].(2.L>Qppelbindung verwendet worden ist).
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10: Abbau der Seitenkette: Progesteron> Zu- di4-Andröstadien 3,17-dxö47
mit Streptomyces laendulae (vgl. G. E. P e t e r s ö n u., a., J.. Bactl., 74,#,
S. 684 [1957]. Vergleiche auch E. V i s c. h e x ü. , Experientia, 9, S.371 [1953],
wobei durch Üusarium solani und F. caucasicum bei einer. Spaltung der Seitenkette
eine 1(2)-Doppelbindung eing@fülirt wird. Vergleiche auch G. E. T: u r ;f i t t,
Biochem. J., 42,S.376 [1948]).
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Sporen bildende ;@ikioorgänisinen, deren Sporen in einem von vegetäriivenä
Wachstu_ tn und Nährstoffen freien Medium _ erfindunsgemaß verwendet; werden
können,
sind auch in den USA.-Patentschriften 2 602 769, 2 649 400, 2 649 401, 2 649 402,
2 695 260, 2 735 800, 2 753 290, 2 762 747, 2 768 928, 2 789 940, 2 802 775, 2 809
919, 2 812 285 und 2 830 937 beschrieben worden.
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Die zur Durchführung der Umwandlung mit Sporen benötigte Zeit (die
in jedem Fall durch Vorversuche leicht bestimmt werden kann) ist gewöhnlich gegenüber
der bei bekannten Verfahren erforderlichen Zeit wesentlich kürzer, wobei noch eine
erhöhte Ausbeute erzielt wird. Von der kürzeren Zeitdauer abgesehen, ist die Gewinnung
der modifizierten Verbindung (die auch nach den Verfahren der Literaturstellen erfolgen
kann) in guten Ausbeuten aus dem verhältnismäßig reinen Umsetzungsgemisch des erfindungsgemäßen
Verfahrens wesentlich leichter als die Gewinnung aus den bisher verwendeten Gärungsgemischen,
die vegetatives Wachstum, organische Nährstoffe, Nebenprodukte derselben u. dgl.
enthalten. Die Reinigung der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren modifizierten
Verbindung nach der Abtrennung ist ebenfalls wesentlich einfacher als die Reinigung
der stark verunreinigten Gemische, die nach den bekannten Verfahren erhalten worden
sind.
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Es können auch zwei Umwandlungen gleichzeitig durchgeführt werden,
wenn Sporen verschiedener Pilze verwendet werden; der Unterschied kann so gering
wie der Unterschied zwischen den Stämmen des gleichen Pilzes oder so groß wie ein
Unterschied zwischen den Klassen sein. Dieser Unterschied kann auch durch Mutation
eines besonderen Organismus erreicht werden.
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Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.
Beispiel I Ein Nährstoffmedium aus Glucose-Neopepton [sogenanntes Sabourauds-Medium,
beschrieben in Difeo-Handbuch, S.200, 9.Auflage (1953)], das mit 20/0 Agar
verfestigt worden war, wurde in bekannter Weise zunächst mit Aspergillus ochraceus
angeimpft und dann bei einer Temperatur von etwa 30°C etwa 5 Tage lang bebrütet.
Die während dieses Zeitraums gebildeten Sporen wurden von der Oberfläche des vegetativen
Mycelwachstums mit destilliertem Wasser abgewaschen. Die erhaltene, mit etwas Mycel
und Nährstoffmedium verunreinigte wäßrige Suspension wurde zwecks Entfernung des
Mycels und unlöslicher Nährstoffe durch Glaswolle filtriert und dann zwecks Gewinnung
der Sporen zentrifugiert. Die löslichen Nährstoffe in dem Medium, die von den Sporen
zurückgehalten worden waren, wurden anschließend entfernt, indem die Sporen in destilliertem
Wasser suspendiert und dann zwecks Gewinnung der Sporen zentrifugiert wurden. Diese
Waschstufe (erneutes Suspendieren der Sporen in destilliertem Wasser und Abzentrifugieren)
kann gegebenenfalls wiederholt werden, so daß die Sporen von allem verunreinigenden
Nährstoffmaterial als auch vom Mycel praktisch frei sind.
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Die in der oben angegebenen Weise erhaltenen Sporen wurden in destilliertem
Wasser, das mit einer etwa l%igen Phosphatpufferlösung auf einen pH-Wert von 6,5
bis 7,0 gepuffert worden war, zwecks Herstellung einer Suspension suspendiert, die
etwa 1 bis 10 Milliarden Sporen je Kubikzentimeter enthielt. Zu etwa 20 ccm dieser
Suspension in einem 125 ccm fassenden Erlenmeyerkolben wurde dann eine Lösung von
1 mg Progesteron in 1 ccm Propylenglykol gegeben. Da das Glykol mit Wasser mischbar
und das Progesteron in Wasser unlöslich ist, fällt das Progesteron in Form einer
feinen Suspension aus der Lösung aus, wenn diese Lösung der gepufferten wäßrigen
Suspension zugesetzt wird. Die erhaltene Suspension aus Sporen und Progesteron wurde
dann durch Schütteln auf einer Drehschüttelvorrichtung, die bei einem Radius von
6,35 mm etwa 150 Umdrehungen je Minute machte, etwa 12 Stunden lang bei einer
Temperatur von etwa 25°C belüftet.
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Anschließend wurde die die Sporen und das Steroid enthaltende Suspension
mit Chloroform extrahiert und der Auszug zwecks Abtrennung des unlöslichen Materials
und Trennung der wäßrigen Phase von dem Chloroform zentrifugiert. Der erhaltene,
klare, sporenfreie Auszug enthielt das gewünschte 11 a-Hydroxyprogesteron, das durch
Abziehen des Chloroforms unter verringertem Druck leicht gewonnen werden konnte.
Die Untersuchung des Produkts, das durch Vergleich mit einer bekannten Probe von
lla-Hydroxyprogesteron identifiziert worden war, ergab, daß praktisch 100% des Progesterons
in das gewünschte 11 a-Hydroxyderivat umgewandelt worden waren. Dieses Ergebnis
zeigt, daß die oben verwendete Umwandlungszeit von 12 Stunden angemessen war und
daß möglicherweise eine noch kürzere Zeit verwendet werden kann, um die Einführung
der Hydroxygruppe in Progesteron mit Sporen von A. ochraceus in einem von Mycel
und Nährstoffen praktisch freien Medium zu vervollständigen. Bei der praktischen
Durchführung des beanspruchten Verfahrens kann das Verhältnis von Zeitdauer zu Konzentration
der Sporen zwecks Erreichung bestimmter Ziele eingestellt werden. Beispiel 1I Das
im Beispiell beschriebene Verfahren wurde wiederholt, nur wurden Sporen aus einer
10 bis 14 Tage alten Kultur von Septomyxa affinis und die Reichsteinsche Verbindung
S in einem Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7 verwendet. Nach 24 Stunden wurde
die erhaltene d i-Reichsteinsche Verbindung S nach dem im Beispiel I beschriebenen
Verfahren gewonnen.
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Beispiel III Einem l%igen wäßrigen Gemisch von Caprylsäure, das mit
einem Phosphatpuffer auf einen pH-Wert von 6,5 gepuffert worden war, werden Sporen
von P.roqueforti, die von vegetativem Kulturmedium und von Nährstoffen praktisch
frei sind, in einem Verhältnis von etwa 100 000 000 Sporen je 3 ccm des wäßrigen
Caprylsäuregeniisches zugesetzt. Das Gemisch wird dann etwa 2 Stunden bei einer
Temperatur von etwa 25°C unter Belüftung gerührt. Das erhaltene Methylamylketon
kann dann durch Destillieren oder ähnliche bekannte Verfahren gewonnen werden.
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Beispiel IV Das im Beispiel 111 beschriebene Verfahren wurde
wiederholt, wobei jedoch jeweils Capronsäure, Pelargonsäure und Caprinsäure für
die Herstellung von Methylpropylketon, Methylhexylketon bzw. Methylheptylketon verwendet
wurden. Durch Auswahl der geeigneten Fettsäure, die mindestens 4 Kohlenstoff=
atome
enthält, können andere Ketone nach einem gleichen Verfahren mit Hilfe von Sporen
hergestellt werden, die nach dem oben angegebenen Verfahren hergestellt worden sind
und keine vegetative Pilzkultur oder Nährstoffe enthalten.
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Beispiel V Sporen von Fusarium solani wurden in einer 1°Ngen Phosphatpufferlösung
vom pH 7,0 suspendiert, und zwar bis zu einer Endkonzentration von 4 - 108 Sporen
je Milliliter. Zu 20 m1 dieser Suspension in einem 125-ml-Erlenmeyerkolben wurden
10 mg der Reichsteinschen Verbindung S, die in 0,4m1 Methanol gelöst war, und 0,4m1
einer 25°/oigen Glukoselösung hinzugefügt. Diese Suspension wurde dann auf einer
Drehschüttelvorrichtung mit 2,5 cm Hub bei 200 Umdrehungen je Minute 48 Stunden
bei 280C belüftet.
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Danach wurde die die Sporen und das Steroid enthaltende Suspension
zweimal mit je 20 ml Äthylenchlorid extrahiert. Der Extrakt wurde unter einem Stickstoffstrom
zur Trockne eingedampft. Der trokkene Rückstand wurde auf Papier im Zaffaroni-System
(Toluol-Propylenglykol) chromategraphiert, auf dem sich Spuren der uriumgesetzten
Verbindung S und ein dem Standard-d 1-S entsprechender Hauptfleck zeigte. Eine eindeutige
Identifizierung dieses Produktes wurde durch Herstellung größerer Mengen des Umwandlungsproduktes
erzielt. Das Umwandlungsprodukt wurde von der Verbindung S durch aufeinanderfolgende
Kristallisation aus Chloroform, Methanol und Aceton getrennt. Die physikalischen
Daten des kristallinen Umwandlungsproduktes waren folgende: Schmelzpunkt: 246bis248°C;
[all'. =-r-81,3 (10/, in Chloroform); E' j = 15,950 bei 244 m#t; das Infrarotspektrum
war identisch mit demjenigen der authentischen 1-Dehydroverbindung-S. Beispiel VI
In der gleichen Weise wie im vorstehenden Beispiel V wurde die Reichsteinsche Verbindung
S der Umwandlung mittels Sporn von Fusarium metismoides und Septomyxa affinis unterworfen.
In jedem der Fälle wurde eine fast vollständige Umwandlung der Verbindung S in die
Verbindung d I-S erzielt. Beispiel VII Sporen von Didymella lycopersici wurden in
einer 1°/oigen Phosphatpufferlösung vom pH 7,0 suspendiert, und zwar bis zu einer
Endkonzentration von 3 - 108 Sporen je Milliliter. Zu dieser Suspension wurden 0,2
ml einer 25°/oigen Glukoselösung und 10 mg der in 0,4 ml Methanol gelösten Reichsteinschen
Verbindung S hinzugefügt. Das Gemisch wurde wie im Beispiel V beschrieben belüftet.
Nach 72 Stunden wurde das Gemisch aus Sporen und dem Steroid nach der im Beispiel
V beschriebenen Arbeitsweise extrahiert und ein steroidhaltiger Rückstand gewonnen.
Die Papierchromatographie zeigte, daß dieser Rückstand hauptsächlich zwei Umwandlungsprodukte
enthielt, von denen eines die gleiche Beweglichkeit wie Epi-F (4-Pregnen-lla,l7a,21-triol-3,20-dion)
hatte und das andere weniger polar war. Eine größere Menge der Umwandlungsprodukte
wurde wie vorstehend beschrieben erhalten, und die Umwandlungsprodukte wurden an
einer Aluminiumoxydsäule getrennt. Das polarere der beiden Umwandlungsprodukte mit
einem Schmelzpunkt von 210 bis 212°C und einem mit Standard-Epi-F identischen IR-Spektrum
wurde eindeutig als diese Verbindung identifiziert. Das weniger polare Produkt wurde
noch weiter gereinigt, und es wurde gefunden, daß es Spuren von einem polyhydroxyherten
17-Keto-Produkt enthielt und hauptsächlich aus einem Stoff bestand, welcher nach
der Acetylierung ein Diacetat mit einem Schmelzpunkt von 195 bis 196°C und einem
mit Standard-20ß,21-Diacetoxy-l7a-hydroxy-4-pregnen-3-on identischen IR-Spektrum
ergab. Das Hauptumwandlungsprodukt konnte also als 17ca,20ß, 21-Trihydroxy-4-pregnen-3-on
identifiziert werden.