DE1112608B

DE1112608B - Manufacture and extraction of the antibiotic valacidin

Info

Publication number: DE1112608B
Application number: DEE19819A
Authority: DE
Inventors: William Wallis Bromer; James Merlin Mcguire
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1960-08-23
Filing date: 1960-08-23
Publication date: 1961-08-10

Description

Herstellung und Gewinnung des Antibioticums Valacidin Die Erfindung betrifft Herstellung und Reinigung einer antibiotischen Substanz, die im folgenden Valacidin genannt wird. Valacidin hat folgende Kennzeichen: Rötlichbraune feste Substanz, die in alkalischen wäßrigen Lösungen und in den meisten polaren Lösungsmitteln löslich, etwas löslich in niederen Alkoholen, praktisch unlöslich in den meisten nichtpolaren organischen Lösungsmitteln und in wäßriger Säure, beständig in wäßriger Lösung im PH-Bereich von etwa 1,0 bis 9 ist, ein Molekulargewicht im Bereich von etwa 470 bis 510 (durch Titration ermittelt) hat, etwa 60,01A/o,C, 4,66"/o H, 10,80o/oaN und 24,53"/a0 (durch Differenzbildung) enthält, eine ionisierbare Gruppe mit pK`a = 7,0 hat, durch elektrometrische Titration in Dimethylformamid-Wasser (2: 1 Volumteile) bestimmt, Spektralabsorptionsmaxima als Paste mit Mineralöl im Infrarotbereich bei etwa den folgenden Wellenlängen in Mikron hat: 2,90, 2,98, 3,07, 5,74, 5,95, 6,09, 6,18, 6,27, 6,39, 6,46, 6,65, 7,13, 7,46, 7,80, 8,11, 9,10, 9,24, 9,33, 9,63, 9,98, 10,89, 11,61, 12,32, 13,4, 13,9 und 14,2, und Spektralabsorptionsmaxima in Lösung im UV-Bereich bei etwa den folgenden Wellenlängen hat: 575, 294 und 246mit den folgenden Extinktionskoeffizienten: 16 800, 27100 und 40 400.Manufacture and Obtainment of the Antibiotic Valacidin The Invention relates to the manufacture and purification of an antibiotic substance, which follows Called valacidin. Valacidin has the following characteristics: Reddish brown solid Substance found in alkaline aqueous solutions and in most polar solvents soluble, somewhat soluble in lower alcohols, practically insoluble in most non-polar organic solvents and in aqueous acid, stable in aqueous Solution is in the pH range of about 1.0 to 9, a molecular weight in the range of about 470 to 510 (determined by titration), about 60.01 A / o, C, 4.66 "/ o H, 10.80o / oaN and contains 24.53 "/ a0 (by subtraction), an ionizable group with pK`a = 7.0, by electrometric titration in dimethylformamide water (2: 1 parts by volume) determined, spectral absorption maxima as a paste with mineral oil in the infrared range has approximately the following wavelengths in microns: 2.90, 2.98, 3.07, 5.74, 5.95, 6.09, 6.18, 6.27, 6.39, 6.46, 6.65, 7.13, 7.46, 7.80, 8.11, 9.10, 9.24, 9.33, 9, 63, 9.98, 10.89, 11.61, 12.32, 13.4, 13.9 and 14.2, and spectral absorption maxima in solution in the UV region at approximately the following wavelengths: 575, 294 and 246 with the following Extinction coefficients: 16,800, 27,100 and 40,400.

Die Herstellung von Valacidin erfolgt durch Züchtung eines Valaeidin erzeugenden Stammes von S:reptomyces lavendulae in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze in Wasser enthält, eingetaucht unter aeroben Bedingungen, bis von dem Organismus in dem Kulturmedium eine wesentliche Menge Valacidin gebildet worden ist.Valacidin is produced by cultivating a valaeidin producing strain of S: reptomyces lavendulae in a culture medium that is assimilable Containing sources of carbon, nitrogen and inorganic salts in water, immersed under aerobic conditions until a substantial amount of the organism in the culture medium Amount of valacidin has been formed.

Das Antibioticum ist durch seine chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften identifiziert worden. Es ist eine organische Säure, der willkürlich der Name Valacidin gegeben wurde. Das Antibioticum bildet leicht kationische Salze, die auch in den Erfindungsbereich gehören.The antibiotic is by its chemical, physical and biological Properties have been identified. It is an organic acid that is arbitrary the name valacidin was given. The antibiotic easily forms cationic salts, which also belong in the scope of the invention.

Die freie Säure Valacidin hat die folgenden Eigenschaften: Sie ist eine dunkelrötlichbraune feste Substanz. Sie kann in amorpher Form durch Gefriertrocknung einer wäßrigen Lösung oder durch rasches Ausfällen. der Säure aus einem organischen Lösungsmittel durch Zusatz eines Lösungsmittels, in dem die Säure unlöslich ist, erhalten werden. Die Säure kann leicht in verschiedenen Kristallformen gewonnen werden, die von der Natur des Lösungsmittels abhängen. So werden z. B. durch Umkristallisieren aus Äthylacetat oder wäßrigem Aceton lange rötlichbraune Nadeln erhalten, die unter Zersetzung bei etwa 261° C schmelzen, und beim Umkristallisieren aus Chloroform oder Tetrahydrofuran rötlichbraune Plättchen mit etwa dem gleichen Schmelzpunkt gebildet.The free acid valacidin has the following properties: It is a dark reddish brown solid substance. It can be freeze-dried in amorphous form an aqueous solution or by rapid precipitation. the acid from an organic Solvent by adding a solvent in which the acid is insoluble, can be obtained. The acid can easily be obtained in different crystal forms depending on the nature of the solvent. So z. B. by recrystallization obtained from ethyl acetate or aqueous acetone long reddish-brown needles, which under Melting decomposition at about 261 ° C, and upon recrystallization from chloroform or tetrahydrofuran reddish brown flakes with about the same melting point educated.

Die Säureform des Valacidins ist löslich in wäßrigen schwach alkalischen Lösungen, so z. B. in einer 2o/cigen Natriumbicarbonatlösung. Außerdem ist sie in den meisten polaren organischen Lösungsmitteln, z. B. Ketonen, wie Aceton und Methylisobutylketon, Estern, wie Äthylacetat, Amylacetat und Äthylpropionat, chlorierten Kohlenwasserstoffen, wie Chloroform und Tetrachlorkohlenstoff, und heterocyclischen organischen Lösungsmitteln, wie Tetrahydrofuran und Thiophen, löslich. Die kristalline Säure ist etwas löslich in niederen Alkoholen, wie Methanol und Äthanol, aber verhältnismäßig unlöslich in Wasser, verdünnten Säuren und in den meisten nichtpolaren Lösungsmitteln.The acid form of valacidin is soluble in weakly alkaline aqueous solutions Solutions such as B. in a 2o / cigen sodium bicarbonate solution. She's also in most polar organic solvents, e.g. B. ketones, such as acetone and methyl isobutyl ketone, Esters such as ethyl acetate, amyl acetate and ethyl propionate, chlorinated hydrocarbons, such as chloroform and carbon tetrachloride, and heterocyclic organic solvents, such as tetrahydrofuran and thiophene, soluble. The crystalline acid is somewhat soluble in lower alcohols such as methanol and ethanol, but relatively insoluble in water, dilute acids and in most non-polar solvents.

Das Antibioticum ist verhältnismäßig beständig in Lösung innerhalb eines PH-Bereiches von etwa 1 bis 9, aber unbeständig in stark sauren und stark basischen Lösungen.The antibiotic is relatively stable in solution within a pH range of about 1 to 9, but inconsistent in strongly acidic and strong basic solutions.

Die elektrometrische Titration in Dimethylformamid-Wasser (2: 1 Volumteile) ergibt die Anwesenheit einer titrierbaren Gruppe von pK'a = 7,0.Electrometric titration in dimethylformamide water (2: 1 parts by volume) gives the presence of a titratable group of pK'a = 7.0.

Das durch Titration bestimmte Molekulargewicht beträgt etwa 490 ± 20.The molecular weight determined by titration is approximately 490 ± 20th

Eine Löslichkeitsuntersuchung von kristallinem Valacidin in Tetrahydrofuran, die zeigte, daß die Probe rein war, ergab eine Löslichkeit von 6,3 mg/ccm bei 25,3° C. Mehrere Elementaranalysen von kristallinem Valacidin, das im Vakuum bei 70 bis 80° C über- Phosphorpentoxyd getrocknet worden war, ergaben die folgenden Mittelwerte: . Kohlenstoff ................... 60,01% Wasserstoff .................... 4,66% Stickstoff ...................... 10,80% Sauerstoff (durch Differenz) ..... 24,530/a Die obigen Analysenwerte ergeben eine empirische Formel für das Antibioticum von etwa C2,1 24()8N4* Eine mit Mineralöl hergestellte Paste einer Probe des kristallisierten Antibioticums, das, wie oben beschrieben, getrocknet wurde, ergibt die folgenden unterscheidbaren Banden im Infrarotspektrum innerhalb des Bereiches von 2,0 bis 15 @,: 2,90, 2,98, 3,07, 5,74, 5,95, 6,09, 6,18, 6,27, 6,39, 6,46, 6,65, 7,13, 7,46, 7,80, 8,11, 9,10, 9,24, 9,33, 9,63, 9,98, 10,89, 11,61, 12,32, 13,4, 13,9 und 14,2.A solubility study of crystalline valacidin in tetrahydrofuran, which showed that the sample was pure, indicated a solubility of 6.3 mg / cc at 25.3 ° C - Phosphorus pentoxide had been dried gave the following mean values:. Carbon ................... 60.01% hydrogen .................... 4.66% nitrogen ...................... 10.80% oxygen (by difference) ..... 24.530 / a The above analysis values result in an empirical formula for the antibiotic of Approximately C2.1 24 () 8N4 * A paste made with mineral oil of a sample of the crystallized antibiotic which has been dried as described above gives the following distinguishable bands in the infrared spectrum within the range of 2.0 to 15 @ ,: 2, 90, 2.98, 3.07, 5.74, 5.95, 6.09, 6.18, 6.27, 6.39, 6.46, 6.65, 7.13, 7.46, 7.80, 8.11, 9.10, 9.24, 9.33, 9.63, 9.98, 10.89, 11.61, 12.32, 13.4, 13.9 and 14, 2.

Das Infrarotabsorptionsdiagramm der Paste zeigt Fig. I der Zeichnung.The infrared absorption diagram of the paste is shown in FIG. 1 of the drawing.

Das Ultraviolettabsorptionssprektrum des Antibioticums in Methanol zeigt intensive Absorptionsmaxima bei 375, 294 und 246 mit mit den folgenden Extinktionskoeffizienten: 16800, 27100 und 40400.The ultraviolet absorption spectrum of the antibiotic in methanol shows intense absorption maxima at 375, 294 and 246 with the following extinction coefficients: 16800, 27100 and 40400.

Chemische Untersuchungen, die mit dem kristallisierten Antibioticum angestellt wurden, ergaben die Anwesenheit von Phenol-, Methoxy- und Carboxylgruppen. Das Antibioticum zeigt positive Ergebnisse bei den folgenden chemischen Untersuchungen: Fehlingsche und Permanganatprobe auf reduzierende Gruppen, Folin Malmrossche und Folin-Ciocalteausche Probe für phenolische Gruppen und Molischsche Probe auf Anwesenheit eines Kohlenhydratanteils im Molekül. Das kristalline Antibioticum ergibt eine negative Ninhydrinreaktion. Wenn das Antibioticum in einer basischen Lösung von mehr als etwa pH 9,5 gelöst wird, z. B. in wäßriger Natronlauge, ist die Lösung gelb gefärbt: Wenn jedoch der pH-Wert der Lösung sofort auf etwa 7,0 oder darunter erniedrigt wird, wird die Lösung rot.Chemical studies carried out with the crystallized antibiotic revealed the presence of phenolic, methoxy and carboxyl groups. The antibiotic shows positive results in the following chemical tests: Fehling and permanganate sample on reducing groups, Folin and Malmrossche Folin-Ciocalteau test for phenolic groups and Molisch test for presence a carbohydrate content in the molecule. The crystalline antibiotic gives a negative one Ninhydrin reaction. If the antibiotic is in a basic solution of more than about pH 9.5 is dissolved, e.g. B. in aqueous sodium hydroxide solution, the solution is colored yellow: However, if the pH of the solution is immediately lowered to about 7.0 or below the solution will turn red.

Wenn die kristalline Säure an Whatman-Nr.1-Papier chromatographiert wird und das Valacidin auf das Papier in einem polaren Lösungsmittel, wie Aceton, aufgetragen wirrt, hat es die folgenden RrWerte in den angegebenen Lösungsmitteln: R f = 0,40 in mit Wasser gesättigtem n-Butanol, Rf = 0,75 in mit Wasser gesättigtem Butanol, das 2-% p-Toluolsulfonsäuremonohydrat enthält, und Rf= 0,0 in mitWasser gesättigtem Methylisobutylketon, das 2'% Piperidin enthält.When the crystalline acid chromatographed on Whatman # 1 paper and the valacidin on the paper in a polar solvent, such as acetone, If applied, it has the following Rr values in the specified solvents: R f = 0.40 in n-butanol saturated with water, Rf = 0.75 in water saturated Butanol containing 2% p-toluenesulfonic acid monohydrate and Rf = 0.0 in with water saturated methyl isobutyl ketone containing 2% piperidine.

Das Antibioticum und seine Salze sind durch ein breites antibakterielles Spektrum gekennzeichnet, einschließlich grampositiven und gramnegativen Bakterien, von denen einige Pflanzenkrankheitserreger sind. Die Bakterien, gegen die sie wirksam sind, sind Organismen, die gegen eine Anzahl bekannter Antibiotica resistent sind. Die Wirksamkeit des Antibioticums gegen eine Reihe von Organismen zeigt Tabelle I, die die Inhibitorwirkung gegenüber einer Anzahl von Organismen in Zahlenwerten angibt. Die antibiotische Wirksamkeit wurde durch Ausstreichverdünnung ermittelt, wobei der zu untersuchende Organismus auf eine Reihe von Agarplatten ausgestrichen wurde, die verschiedene Konzentrationen des Antibioticums enthielten, um die Mindestkonzentration an Antibioticum in mcg/ccm eines Agarbodens zu ermitteln, die das Wachstum des Organismus innerhalb von 48 oder 72 Stunden bei Pflanzenkrankheitserregern hemmte. Die Salze des Antibioticums haben Aktivitäten, die den in Tabelle I angegebenen Werten entsprechen, wobei die erhöhten Molekulargewichte der Salze zu berücksichitgen sind. Tabelle I Hemmungs- Probeorganismus konzentration (mcg/ccm) Bakterien Klebsiella pneumoniae (erythromycinresistent) ......... 0,2 Micrococcus pyogenes var. aureus . . 0,1 Micrococcus pyogenes var. aureus (erythromycinresistent) . . . . . . . . . " 0,39 Micrococcus pyogenes var. aureus (penicilhnresistent) ............ 0,78 Micrococcus pyogenes var. aureus (streptomycinresistent) ......... 0,2 Styphylococcus aureus ........... 0,048 Staphylococcus albus ............ 0,048 Baeillus subtilis ................. 0,097 Mycobacterium phlei . . . . . . . . . . . . . 0,39 Mycobacterium tuberculosis (607) 0,78 Mycobacterium avium ........... 0,78 Escherichia coli ................. 0,78 Proteus vulgaris ................. 0,195 Pseudomonas aeruginosa ......... 3,13 Aerobacter aerogenes ............ 1,56 Klebsiella pneumoniae . . . . .. . . .. . 0,097 Salmonella enteritidis ............ 0,78 Shigella paradysenteriae .......... 0,39 Brucella Bronchiseptica ... . ... ... 0,195 Vibrio Metschnikovii ............ 1,56 Pflanzenkrankheitserreger Erwinia amylovora .............. 1,56 Agrobacterium tumefaciens . . .. . . . . 50,0 Xanthomonas campestris ......... 50,0 Xanthomonas malvacearum ...... 0,78 Xanthomonas phaseoli . . . . .. . . .. . 0,78 Pseudomonas solanacearum ...... 6,25 Pseudomonas syringae ........... 6,25 Corynebacterium insidiosum ...... 50,0 Corynebacterium sepodonicum .... 0,195 Wegen seiner breitgestreuten und starken antibiotischen Aktivität und anderer Eigenschaften kann das Antibioticum als Konservierungsmittel in verschiedenen äußerlich anzuwendenden Massen und in Flüssigkeiten verwendet werden, die zur Erhaltung von Tierkörpern und Teilen derselben dienen. Es ist besonders wertvoll zur Verbesserung der konservierenden Eigenschaften von normalerweise verwendeten Konservierungsflüssigkeiten, z. B. solchen, die Formaldehyd enthalten. Der Zusatz von etwa 1,0 mg Valacidin oder eines Salzes.desselben je Kubikzentimeter zu einer solchen Konservierungsflüssigkeit ergibt eine Lösung mit erhöhten konservierenden Eigenschaften. Ferner kann das Antibioticum wirksam zur Bekämpfung bestimmter Pflanzenkrankheitserreger, wie X. phaseoli und Alternaria solani, verwendet werden. Zur Bekämpfung derartiger Pflanzenkrankheitserreger wird das Antibioticum bevorzugt Sprühmitteln, Stäuben u. dgl. zugesetzt, wie sie gewöhnlich zur Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten verwendet werden.The antibiotic and its salts are characterized by a broad spectrum of antibacterial properties, including gram-positive and gram-negative bacteria, some of which are plant pathogens. The bacteria they are effective against are organisms that are resistant to a number of known antibiotics. The effectiveness of the antibiotic against a number of organisms is shown in Table I, which gives the inhibitory effect against a number of organisms in numerical values. The antibiotic effectiveness was determined by spreading dilution, whereby the organism to be examined was spread on a series of agar plates containing different concentrations of the antibiotic, in order to determine the minimum concentration of antibiotic in mcg / ccm of an agar soil that would allow the organism to grow within 48 or 72 hours in the case of plant pathogens. The salts of the antibiotic have activities which correspond to the values given in Table I, taking into account the increased molecular weights of the salts. Table I. Inhibitory Sample organism concentration (mcg / ccm) bacteria Klebsiella pneumoniae (erythromycin resistant) ......... 0.2 Micrococcus pyogenes var. Aureus. . 0.1 Micrococcus pyogenes var. Aureus (erythromycin resistant). . . . . . . . . "0.39 Micrococcus pyogenes var. Aureus (penile-resistant) ............ 0.78 Micrococcus pyogenes var. Aureus (streptomycin resistant) ......... 0.2 Styphylococcus aureus ........... 0.048 Staphylococcus albus ............ 0.048 Baeillus subtilis ................. 0.097 Mycobacterium phlei. . . . . . . . . . . . . 0.39 Mycobacterium tuberculosis (607) 0.78 Mycobacterium avium ........... 0.78 Escherichia coli ................. 0.78 Proteus vulgaris ................. 0.195 Pseudomonas aeruginosa ......... 3.13 Aerobacter aerogenes ............ 1.56 Klebsiella pneumoniae. . . . ... . ... 0.097 Salmonella enteritidis ............ 0.78 Shigella paradysenteriae .......... 0.39 Brucella Bronchiseptica .... ... ... 0.195 Vibrio Metschnikovii ............ 1.56 Plant pathogens Erwinia amylovora .............. 1.56 Agrobacterium tumefaciens. . ... . . . 50.0 Xanthomonas campestris ......... 50.0 Xanthomonas malvacearum ...... 0.78 Xanthomonas phaseoli. . . . ... . ... 0.78 Pseudomonas solanacearum ...... 6.25 Pseudomonas syringae ........... 6.25 Corynebacterium insidiosum ...... 50.0 Corynebacterium sepodonicum .... 0.195 Because of its widespread and potent antibiotic activity and other properties, the antibiotic can be used as a preservative in various topical compositions and in liquids used to preserve carcasses and parts thereof. It is particularly valuable for improving the preservative properties of normally used preservative liquids, e.g. B. those that contain formaldehyde. The addition of about 1.0 mg valacidin or a salt thereof per cubic centimeter to such a preservation liquid results in a solution with increased preservative properties. Furthermore, the antibiotic can be used effectively for combating certain plant pathogens such as X. phaseoli and Alternaria solani. To combat such plant pathogens, the antibiotic is preferably added to sprays, dusts and the like, such as are usually used to combat plant diseases.

Das Antibioticum kann durch Züchten einer neuentdeckten und bisher nicht beschriebenen Organismusrasse hergestellt werden, die aus einer Bodenprobe aus Ongko, Indonesien, isoliert wurde. Der Organismus wird gezüchtet, indem eine eingetauchte Kultur unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium zur Gärung gebracht wird, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Wasserstoff und anorganische Salze enthält. Der Organismus wurde aus der genannten Bodenprobe isoliert, indem ein Teil der Probe in sterilem destilliertem Wasser suspendiert und die Suspension nach Verdünnen auf Nähragar ausgebreitet wurde. Die beimpfte Nähragarplatte wurde mehrere Tage bei etwa 25 bis 35° C bebrütet. Nach Ablauf der Bebrütungszeit werden Kolonien des Valacidin erzeugenden Organismus mit einer sterilen Platinöse zum Beimpfen von Agarhängen übertragen. Die beimpften Agarhänge werden bebrütet, um größere Mengen an Inoculum für die Erzeugung des Antibioticums zu erhalten.The antibiotic can be made by breeding a new and previously discovered Organism race not described can be produced from a soil sample isolated from Ongko, Indonesia. The organism is bred by a immersed culture fermented under aerobic conditions in a culture medium being assimilable sources of carbon, hydrogen and inorganic salts contains. The organism was isolated from the said soil sample by taking a part the sample is suspended in sterile distilled water and the suspension after dilution spread on nutrient agar. The inoculated nutrient agar plate was used for several days incubated at around 25 to 35 ° C. After the incubation period, colonies of Valacidin-producing organism with a sterile platinum loop for inoculating agar slopes transfer. The inoculated agar slopes are incubated to contain larger amounts of inoculum for the generation of the antibiotic.

Der neuentdeckte Organismus wird ständig von der Culture Collection der Northem Utilization Research and Development Branch of the U. S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, aufbewahrt und erhielt die Bezeichnung NRRL 2675.The newly discovered organism is constantly being added to the Culture Collection the Northem Utilization Research and Development Branch of the U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, and designated NRRL 2675.

Der neuentdeckte Organismus hat große Ähnlichkeit mit der Art Streptomyces lavendulae, die nach Bergey's Manual of Determinative B acteriology, 6. Auflage, S. 944, zu den Actinomycetalen gehört. Obgleich eine gewisse Unsicherheit bei der Einordnung derartiger Mikroorganismen besteht, ist man wahrscheinlich trotz einiger bestimmter Unterschiede berechtigt, den neuen Organismus NRRL 2675 als einen Stamm derArt S. lavendulae einzuordnen und denWaksmanschen Stamm von S. lavendulae der American Type Culture Collection, der als 8664 (Waksman 3440) bezeichnet wird, als den am nächsten verwandten bisher bekannten Organismus anzusehen.The newly discovered organism is very similar to the species Streptomyces lavendulae, according to Bergey's Manual of Determinative B acteriology, 6th edition, P. 944, belongs to the actinomycetals. Although there is some uncertainty about the Classification of such microorganisms exists, one is probably despite some certain differences entitle the new organism NRRL 2675 as a strain the species S. lavendulae and the Waksman strain of S. lavendulae the American Type Culture Collection designated as 8664 (Waksman 3440) as to consider the most closely related organism known so far.

Der Waksmansche Stamm von S. lavendulae, der dem erfindungsgemäßen Stamm NRRL 2675 am nächsten verwandte Stamm, wurde auf den hier beschriebenen bevorzugten Nährböden gezüchtet, aber es wurde keine erkennbare Menge Valacidin gebildet.The Waksman strain of S. lavendulae, which corresponds to the invention Strain NRRL 2675, the closest related strain, was preferred to those described herein Media grown, but no discernible amount of valacidin was produced.

Die Erfindung wird nun in Verbindung mit dem neugefundenen Organismus beschrieben. Selbstverständlich gehört auch die Herstellung des Antibioticums durch Züchten anderer antibiotischer Organismen, z. B. anderer Valacidin erzeugender Stämme oder Mutanten von S. lavendulae NRRL 2675, in den Erfindungsbereich. Derartige andere Organismen, Stämme oder Mutanten werden in der üblichenWeise erzeugt, z. B. indem ein Valacidin bildender Organismus mit Röntgen- oder UV-Strahlung oder mit chemischen Mitteln, z. B. Stickstoffsenfölen, behandelt wird.The invention is now used in conjunction with the newly found organism described. Of course, the manufacture of the antibiotic also belongs through Growing other antibiotic organisms, e.g. B. other valacidin producing strains or mutants of S. lavendulae NRRL 2675, within the scope of the invention. Such others Organisms, strains or mutants are generated in the usual manner, e.g. B. by a valacidin-forming organism with X-rays or UV radiation or with chemicals Means, e.g. B. nitrogen mustard is treated.

In den folgenden Absätzen sind die Erzeugnisse einer ausführlichen beschreibenden Untersuchung des obigen Antibiotica erzeugenden Stamms von S. lavendulae angegeben. Die in der Beschreibung angegebenen Farben wurden gemäß den von R i d g w a y in Culture Standards and Nomenclature [1912] angegebenen Richtlinien ausgedrückt.The following paragraphs are the products of a detailed descriptive study of the above antibiotic producing strain of S. lavendulae specified. The colors given in the description were made according to the specifications of R i d g w a y in the guidelines given in Culture Standards and Nomenclature [1912].

Mikroskopische Morphologie Glucose-Asparagin-Agar (14 Tage bei 30° C). Typisches liegendes Substratmycel und mäßig verzweigtes Luftmycel. Eiförmige Konidien, getragen von sehr langen geraden Ketten, die nicht sehr verzweigt sind. Keine Konidienketten in spiraliger Anordnung wurden gefunden.Microscopic morphology of glucose-asparagine agar (14 days at 30 ° C). Typical lying substrate mycelium and moderately branched aerial mycelium. Egg-shaped Conidia carried by very long straight chains that are not very branched. No spirally arranged conidia chains were found.

Bennettscher Agar (14 Tage bei 30° C). Mikroskopische Morphologie wie die auf Glucose-Asparagin-Agar. Koloniemorphologie Bennettscher Agar (14 Tage bei 30° C). Kolonien sind flach, verästelt, ihre Größe schwankt umgekehrt mit der Anzahl der Kolonien je Platte, wobei der Durchmesser zwischen 4 und 10 mm liegt. Die Oberfläche ist pulverig, radial gestreift mit oder ohne zentrale Papillen. Rand sehr fädig. Das Luftmycel ist schwachgrau, die Rückseite der Kolonien gewöhnlich am Rand dunkelgrau und in der Mitte dunkelbraun bis schwarz. Kulturcharakteristik Synthetischer Agar (Czapekscher Agar, modifiziert von W ak s m an [1919]). Spuren von Substratwachstum, kein Luftmycel und kein lösliches Pigment.Bennett's agar (14 days at 30 ° C). Microscopic morphology like the one on glucose-asparagine agar. Colony morphology Bennett agar (14 days at 30 ° C). Colonies are flat, ramified, their size fluctuates inversely with the Number of colonies per plate, with a diameter between 4 and 10 mm. The surface is powdery, radially streaked with or without central papillae. edge very thready. The aerial mycelium is pale gray, the back of the colonies common dark gray on the edge and dark brown to black in the middle. Cultural characteristics Synthetic agar (Czapek agar, modified by W ak s m an [1919]). traces of substrate growth, no aerial mycelium and no soluble pigment.

Glucose-Asparagin Agar. Mäßige Mengen an tief eingedrungenem Substratmycel; schwachcremefarbig auf der Rückseite. Mäßige Mengen Luftmycel, pulverig, weiß, wird nach 14 Tagen hellgrau. Wachstum breitet sich langsam aus, der Rand wird nach 28 Tagen sehr fädig. Lösliches Pigment fehlt oder ist sehr hellgrünlichgelb (Spuren).Glucose-asparagine agar. Moderate amounts of deeply penetrated substrate mycelium; light cream colored on the back. Moderate amounts of aerial mycelium, powdery, white, will light gray after 14 days. Growth spreads slowly, the edge becomes after 28 Very threadbare days. Soluble pigment is absent or is very light greenish yellow (traces).

Stärkeagar (W a k s m a n [1919], S. 82, Medium 15 mit löslicher Stärke). Mäßige Mengen an Substrat mycel; Rückseite farblos bis hellcremefarbig. Spur von weißem Luftmycel. Wachstum auf die Linie der Beimpfung beschränkt. Kein lösliches Pigment.Starch agar (W a k s m a n [1919], p. 82, medium 15 with soluble starch). Moderate amounts of substrate mycelium; The reverse side is colorless to light cream colored. Trace of white aerial mycelium. Growth restricted to the inoculation line. Not soluble Pigment.

Calciummalat-Glycerin-Agar. Mäßiges bis gutes Wachstum des Substratmycels; mattcremefarbig auf der Rückseite. Eine Spur von weißem Luftmycel an dem glatten Rand des Streifens. Das Medium wird klar in der Nähe der wachsenden Kultur. Das Wachstum ist beschränkt. Spuren von sehr hellem, grünlichgelbem löslichem Pigment.Calcium Malate Glycerin Agar. Moderate to good growth of the substrate mycelium; matt cream colored on the back. A trace of white aerial mycelium on the smooth one Edge of the strip. The medium becomes clear in the vicinity of the growing culture. That Growth is limited. Traces of very light greenish yellow soluble pigment.

Waksmanscher Nähragar. Mäßige Menge an Substratmycel; Rückseite cremefarbig. Kein Luftmycel. Wachstum auf die Linie der Beimpfung beschränkt, Rand fein gewellt. Oberfläche der Kultur matt, gleichmäßig. Mäßige Mengen an braunem löslichem Pigment.Waksman nutrient agar. Moderate amount of substrate mycelium; Cream-colored back. No aerial mycelium. Growth restricted to the line of inoculation, the edge finely wavy. Surface of the culture matt, even. Moderate amounts of brown soluble pigment.

Emersonscher Agar. Gutes Wachstum des Substratmycels; Rückseite bei jungen Kulturen hellbraun, das nach 14 Tagen zu gelbbraun nachdunkelt. Reichliches Luftmycel, zunächst weiß, das nach 14 Tagen bläulichgrau mit weißen Flecken wird. Pigmentfarbe des Mycels etwa hellviolettgrau. Wachstum breitet sich aus und dringt mäßig ein. Oberfläche ist pulverig. Etwas braunes lösliches Pigment wird gebildet.Emerson agar. Good growth of the substrate mycelium; Back at young cultures light brown, which darkens to yellow-brown after 14 days. Plentiful Aerial mycelium, initially white, which turns bluish-gray with white spots after 14 days. The pigment color of the mycelium is about light purple-gray. Growth spreads and penetrates moderately a. The surface is powdery. Some brown soluble pigment will be produced.

Kartoffelpreßboden. Mäßiges Substratwachstum; starkes Luftmycel, pulverig, gräulichweis bis hellgrau. Wachstum breitet sich über den gesamten Boden aus, runzelig. Boden etwas verfärbt (blaugrau). Gelatine. Geringe bis mäßige Mengen an flockigem, -schwimmendem Wachstum, keine Bildung von zusammenhängendem Häutchen und kein Luftmycel. Dunkelbraunes lösliches Pigment. Verhältnismäßig rasche Verflüssigung, beginnend nach 4 Tagen, erreicht in 7 Tagen 4 bis 5 mm, in 14 Tagen etwa 15 mm; ist nach 17 Tagen vollständig.Potato press floor. Moderate substrate growth; strong aerial mycelium, powdery, grayish white to light gray. Growth spreads all over the ground, wrinkled. Bottom slightly discolored (blue-gray). Gelatin. Small to moderate amounts of flaky, floating growth, no cohesive membrane and no aerial mycelium. Dark brown soluble pigment. Relatively rapid liquefaction, starting after 4 days, reaching 4 to 5 mm in 7 days, about 15 mm in 14 days; is complete after 17 days.

Synthetische Nährlösung (synthetischer Agar ohne Agar). Kein Wachstum.Synthetic nutrient solution (synthetic agar without agar). No growth.

Tyrosinnährlösung. Kein Wachstum. Glucosenährlösung. Breiter Ring von mattem bräunlichem bis cremefarbigem Wachstum an der Wand des Röhrchens; kein Luftmycel. Kleine Mengen von ungebundenem, flockigem Wachstum in der Flüssigkeit. Spuren braunes, lösliches Pigment.Tyrosine nutrient solution. No growth. Glucose nutrient solution. Wide ring from dull brownish to cream colored growth on the wall of the tube; no Aerial mycelium. Small amounts of unbound, flaky growth in the liquid. Traces of brown, soluble pigment.

Lackmusmilch (30° C). Breiter Ring von mattem gräulichem Wachstum ohne Luftmycel. Schwärzliches lösliches Pigment und starke Abscheidung. Keine Koagulation oder Hydrolyse von Casein nach 14 Tagen, geringe Hydrolyse -- angezeigt durch Caseinausfällung - nach 28 Tagen. Lackmusfarbe durch das Pigment verdunkelt, endgültiger PH-Wert 7,82 (nach 28 Tagen).Litmus milk (30 ° C). Broad ring of dull grayish growth without aerial mycelium. Blackish soluble pigment and strong deposit. No coagulation or hydrolysis of casein after 14 days, low hydrolysis - indicated by casein precipitation - after 28 days. Litmus color darkened by the pigment, final pH value 7.82 (after 28 days).

Lackmusmilch (37° C). Wachstum weniger stark als bei 30° C. Keine Hydrolyse von Casein. Veränderungen sonst wie bei 30° C. Endgültiger pH-Wert 7,70.Litmus milk (37 ° C). Growth less than at 30 ° C. None Casein hydrolysis. Changes otherwise as at 30 ° C. Final pH value 7.70.

In den Tabellen 1I und III sind die Erzeugnisse der Nährbödenausnutzungsversuche zusammengestellt, die mit dem Stamm NRRL 2675 ausgeführt wurden. In den Tabellen werden die folgenden Symbole verwendet: + = Wachstum und Ausnutzung, - = kein Wachstum, keine Ausnutzung, begrenztes Wachstum, wahrscheinlich geringe Ausnutzung, (-) = geringes Wachstum, wahrscheinlich keine Ausnutzung. Tabelle II Kohlenstoffausnutzung von NRRL 2675 Verbindung ",'Vachs- tum Adonit.............................. - i.(-I-)-Arabinose ............ « ......... - L(-1-)-Rhanmose (Hydrat) . .. .. .. .. .. .. - D(-L)-Xylose ......................... - D-Mannit . .......................... - D-Sorbit(Hydrat) ..................... - D(-i-)-Glukose ....................... -f- Cellobiose .................... ...... - Lactose ............................. - n(-,` )-Melibiose (Hydrat) ............. - Rohrzucker .......................... (-) D(+)-Trehalose ............. ........ ± i)(; )-Melecitose (Hydrat) . .. . ... . . . ..: - i-)(-i-)-Raffmose (Hydrat) .............. - Inulin ............................... - Cellulose ............................ - i.-Asparagin (als Kohlenstoffquelle) .... ± Äsculin ............................. (-) i-Inosit .......................... ... - Salicin .............................. - Natriumcitrat ................. ....... _ Blindprobe (ohne Kohlenstoff) . . . . .... . - Tabelle III Stickstoffausnutzungsschema für NRRL 2675 Verbindung Wachs- tum Ämmoniumsulfat ..................... -f- Natriumnitrat ........................ - i.-Asparagin (als Stickstoffquelle) ...... - Harnstoff ........:................... Blindprobe (kein Stickstoff) . . . . . . . . . . . . - Physiologie Stärkehydrolyse: Mäßig schnell. Celluloseausnutzung: Keine. Proteolytische Aktivität: Casein wird, wenn überhaupt, schwach hydrolysiert.Tables 1I and III summarize the products of the culture medium utilization tests that were carried out with the strain NRRL 2675. The following symbols are used in the tables: + = growth and utilization, - = no growth, no utilization, limited growth, likely low utilization, (-) = low growth, likely no utilization. Table II Carbon utilization from NRRL 2675 Connection ", 'Vachs- tum Adonit .............................. - i. (- I -) - Arabinose ............ «......... - L (-1 -) - rhanmose (hydrate). .. .. .. .. .. .. - D (-L) -Xylose ......................... - D-mannitol. .......................... - D-sorbitol (hydrate) ..................... - D (-i -) - glucose ....................... -f- Cellobiose .................... ...... - Lactose ............................. - n (-, `) -Melibiose (hydrate) ............. - Cane sugar .......................... (-) D (+) - trehalose ............. ........ ± i) (;) -Melecitose (hydrate). ... ... . . ..: - i -) (- i -) - Raffmose (hydrate) .............. - Inulin ............................... - Cellulose ............................ - i.-asparagine (as a carbon source) .... ± Aesculin ............................. (-) i-inositol .......................... ... - Salicin .............................. - Sodium citrate. ................ ....... _ Blank sample (without carbon). . . . .... - Table III Nitrogen utilization scheme for NRRL 2675 Connection wax tum Ammonium sulfate ..................... -f- Sodium nitrate ........................ - i.-asparagine (as nitrogen source) ...... - Urea ........: ................... Blank sample (no nitrogen). . . . . . . . . . . . - Physiology Starch hydrolysis: Moderately rapid. Cellulose utilization: none. Proteolytic Activity: Casein is weakly hydrolyzed, if at all.

Gelatine: Wird mäßig schnell hydrolysiert. Reduktion von Nitrat zu Nitrat: Chemische Versuche ergeben keine Resuktion von Nitrat zu Nitrat nach 14 und 28 Tagen Wachstum auf allen Kohlenstoffquellen einschließlich Glycerin, Glucose und Stärke.Gelatin: Hydrolyzes moderately quickly. Reduction of nitrate too Nitrate: Chemical tests show no reduction from nitrate to nitrate after 14 and 28 days growth on all carbon sources including glycerin, glucose and strength.

Wie oben ausgeführt, kann Valacidin durch Züchten des neuen Stammes S. lavendulae, NRRL 2675, hergestellt werden. Das Kulturmedium kann jedes von einer Anzahl von Medien sein, wie aus den oben beschriebenen Ausnutzungsversuchen hervorgeht; der Organismus vermag viele Energiequellen zu nutzen. Für eine wirtschaftliche Herstellung, möglichst hohe Ausbeuten an Antibioticum und zur leichteren Isolierung des Antibioticums werden bestimmte Kulturmedien bevorzugt. Die Medien, die zur Herstellung des Antibioticums Valacidin verwendet werden können, sind eine assimilierbare Quelle für Kohlenstoff, wie Glucose, Rohrzucker, Stärke, Glycerin, Melasse, Sorbit, Dextrin, brauner Zucker, Mannit, Maisquellfeststoffe u. dgl. m. Die bevorzugten Quellen für Kohlenstoff sind Glucose und Stärke. Ferner können die Medien eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff enthalten, z. B. Leinsamenmehl, Öl (englisch: tankage), Fischmehl, Maismehl, Baumwollsamenmehl, Hafermehl, gemahlenen Weizen, Sojamehl, Rindfleischextrakt, Peptone (aus Fleisch oder Soja), Casein, Aminosäuregemische u. dgl. m. Bevorzugte Quellen für Stickstoff sind Sojamehl, Casein und Maisquellfeststoffe.As stated above, valacidin can be obtained by growing the new strain S. lavendulae, NRRL 2675. The culture medium can be any of one Be the number of media as can be seen from the exploitation tests described above; the organism can use many sources of energy. For economical production, the highest possible yields of antibiotic and for easier isolation of the antibiotic certain culture media are preferred. The media used to make the antibiotic Valacidin are an assimilable source of carbon, such as glucose, cane sugar, starch, glycerine, molasses, sorbitol, dextrin, brown sugar, Mannitol, corn steep solids, and the like. The preferred sources of carbon are Glucose and starch. In addition, the media can be a source of assimilable nitrogen included, e.g. B. Flaxseed meal, oil (English: tankage), fish meal, corn meal, cottonseed meal, Oat flour, ground wheat, soy flour, beef extract, peptones (made from meat or soy), casein, amino acid mixtures and the like. Preferred sources of nitrogen are soy flour, casein, and corn steep solids.

Mineralsalze, z. B. solche mit Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Magnesium-, Sulfat-, Chlorid-, Phosphat- und Nitrationen, und eine Quelle für Wachstumsfaktoren, wie lösliche Distillers solubles und Hefeextrakt, können mit Vorteil zugesetzt werden.Mineral salts, e.g. B. those with sodium, potassium, ammonium, calcium, Magnesium, sulfate, chloride, phosphate and nitrate ions, and a source of growth factors, such as soluble distillers solubles and yeast extract, can be added with advantage.

Wie es für das Wachstum und die Entwicklung anderer Mikroorganismen erforderlich ist, sollten auch essentielle Spurenelemente dem Kulturmedium zur Züchtung des erfindungsgemäß verwendeten Actinomyceten zugesetzt werden. Derartige Spurenelemente werden gewöhnlich als Verunreinigungen durch den Zusatz der anderen Bestandteile des Mediums mitgeliefert.As it is for the growth and development of other microorganisms is required, essential trace elements should also be added to the culture medium for cultivation of the actinomycetes used according to the invention are added. Such trace elements are usually considered impurities from the addition of the other ingredients of the medium supplied.

Der anfängliche pH-Wert des Kulturmediums kann stark schwanken. Es wurde jedoch als zweckmäßig erkannt, wenn der anfängliche pH-Wert des Mediums zwischen etwa 5,5 und 8,0, bevorzugt zwischen etwa 6,5 und 7,0 liegt. Wie auch bei anderen Actinomyceten beobachtet wurde, steigt der pH-Wert des Mediums während der Wachstumszeit des Organismus allmählich an, wobei das Antibioticum gebildet wird, und er kann etwa pH 7,2 bis 8,0 oder darüber erreichen, wobei der Endwert mindestens zum Teil von dem anfänglichen pH-Wert des Mediums, den in dem Medium enthaltenen Puffern und der Wachstumszeit des Organismus abhängt.The initial pH of the culture medium can vary widely. It however, it has been found useful when the initial pH of the medium is between about 5.5 and 8.0, preferably between about 6.5 and 7.0. As has also been observed in other actinomycetes, the pH of the medium increases During the growth period of the organism it gradually increases, whereby the antibiotic is formed and it can reach about pH 7.2 to 8.0 or above, which is the final value at least in part of the initial pH of the medium that is in the medium contained buffers and the growth time of the organism depends.

Wie es für die Herstellung anderer Antibiotica in großen Mengen bevorzugt wird, werden auch eingetauchte aerobe Kulturen für die Herstellung großer Mengen Valacidin als Bedingungen gewählt. Für die Herstellung verhältnismäßig kleiner Mengen können Schüttelkolben und Oberflächenkulturen in Flaschen verwendet werden. Für die Herstellung großer Mengen des Antibioticums sind eingetauchte aerobe Kulturen in zuvor sterilisierten Tanks zweckmäßig. Die Medien in den sterilisierten Tanks können durch eine Sporensuspension beimpft werden, aber wegen des langsamen Wachstums, das eine als Inoculum verwendete Sporensuspension erfahrungsgemäß zeigt, wird bevorzugt mit der vegetativen Form der Kultur beimpft. Indem dadurch die Wachstumsverzögerung vermieden wird, ist eine wirksamere Verwendung der Gärungsvorrichtung möglich. Demgemäß ist es notwendig, zunächst ein vegetatives Inoculum der Organismen herzustellen, indem eine verhältnismäßig kleine Menge des Kulturmediums mit der Sporenform des Organismus beimpft wird und, wenn ein junges, aktives vegetatives Inoculum erhalten worden ist, das vegetative Inoculum in die großen Tanks zu übertragen. Das Medium, in dem das vegetative Inoculum hergestellt wird, kann das gleiche oder ein anderes Medium sein, wie es für die Herstellung des Antibioticums im großen Maßstabe verwendet wird.As it is preferred for the production of other antibiotics in large quantities Submerged aerobic cultures are also used for large volume production Valacidin chosen as conditions. For the production of relatively small quantities Shake flasks and flask surface cultures can be used. For the manufacture of large quantities of the antibiotic are submerged aerobic cultures in previously sterilized tanks. The media in the sterilized tanks can be inoculated through a spore suspension, but because of the slow growth, which experience shows that a spore suspension used as an inoculum is preferred inoculated with the vegetative form of the culture. By doing this the growth retardation is avoided, the fermenter can be used more effectively. Accordingly it is necessary to first prepare a vegetative inoculum of the organisms, by mixing a relatively small amount of the culture medium with the spore shape of the Organism is inoculated and, if a young, active vegetative inoculum is obtained has been to transfer the vegetative inoculum to the large tanks. The medium, in which the vegetative inoculum is made can be the same or different Medium as it is used for large-scale manufacture of the antibiotic will.

Die Organismen wachsen am besten bei Temperaturen in einem Bereich von etwa 25 bis 32° C. Die beste Erzeugung von Antibioticum scheint bei Temperaturen von etwa 26 bis 30° C zu erfolgen.The organisms grow best at temperatures in one area from about 25 to 32 ° C. The best generation of antibiotic appears at temperatures from about 26 to 30 ° C.

Wie es bei der Herstellung von Antibiotica durch Eintauchkulturen üblich ist, wird sterile Luft durch das Kulturmedium geblasen. Für ein wirksames Wachstum des Organismus und eine wirksame Erzeugung von Antibioticum liegt das bei der Tankerzeugung von Valacidin verwendete Luftvolumen bevorzugt bei mehr als 0,1 Volumteilen Luft je Minute je 1 Volumteil Kulturmedium. Ein wirksames Wachstum und eine wirksame Erzeugung von Antibioticum werden erreicht, wenn das angewendete Luftvolumen mindestens 1 Volumteil Luft je Minute je 1 Volumteil Kulturmedium beträgt.As is the case with the production of antibiotics through immersion cultures is usual, sterile air is blown through the culture medium. For an effective The growth of the organism and an effective production of antibiotic are included The volume of air used in the tank production of valacidin is preferably greater than 0.1 Parts by volume of air per minute per 1 part by volume of culture medium. Effective growth and Effective generation of antibiotic can be achieved when the volume of air applied is at least 1 part by volume of air per minute per 1 part by volume of culture medium.

Die Erzeugungsgeschwindigkeit des Antibioticums und die Konzentration der antibiotischen Aktivität in dem Kulturmedium kann leicht während der Wachstumszeit des Mikroorganismus verfolgt werden, indem Proben des Kulturmediums auf ihre antibiotische Aktivität gegenüber dem Wachstum eines Organismus untersucht werden, der dafür bekannt ist, daß er durch die Anwesenheit des Antibioticums gehemmt wird. Die Verwendung des Organismus Staphylococcus aureus hat sich als sehr befriedigend für eine solche Prüfung erwiesen. Die Prüfung kann durch die übliche Trübungsmessung oder durch Schalenplattenverfahren erfolgen.The rate of production of the antibiotic and the concentration the antibiotic activity in the culture medium can be easily observed during the growth period The microorganism can be tracked by taking samples of the culture medium for their antibiotic Activity towards the growth of an organism known to be studied is that it is inhibited by the presence of the antibiotic. The usage The organism's Staphylococcus aureus has proven to be very satisfactory for such Examination proven. The test can be carried out by the usual turbidity measurement or by Shell plate process take place.

Im allgemeinen wird die größtmögliche Erzeugung an Antibioticum nach dem Beimpfen des Kulturmediums innerhalb von etwa 2 bis 5 Tagen erreicht, wenn eine eingetauchte Kultur oder eine Schüttelkolbenkultur verwendet wird, und innerhalb von etwa 5 bis 10 Tagen, wenn man eine Oberflächenkultur verwendet.In general, the greatest possible production of antibiotic is after inoculating the culture medium within about 2 to 5 days if a immersed culture or a shake flask culture is used, and within from about 5 to 10 days when using surface culture.

Die Mycele und ungelösten Festsubstanzen werden aus der Gärungslösung durch übliche Mittel, z. B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren, abgetrennt. Das Antibioticum wird aus der filtrierten oder zentrifugierten Lösung durch Anwendung von Adsorptions-oder Extraktionsverfahren entfernt. Bevorzugt wird ein Extraktionsverfahren zur Gewinnung des Antibioticums aus der filtrierten Lösung angewendet, weil ein solches Extraktionsverfahren gewöhnlich schneller, wirksamer und wirtschaftlicher ist. Zur Extraktion der antibiotischen Substanz aus der filtrierten Lösung werden mit Wasser nicht mischbare polare organische Lösungsmittel bevorzugt, z. B. Ester von Fettsäuren, wie Athylacetat und Amylacetat; chlorierte Kohlenwasserstoffe, z. B. Chloroform, Äthylendichlorid und Trichloräthylen; mit Wasser nicht mischbare Alkohole, wie Butyl- und Amylalkohol; mit Wasser nicht mischbare Ketone, wie Methylisobutylketon und Methylamylketon, und Äther, z. B. Äthyläther und Dibutyläther. Es können auch andere Lösungsmittel von ähnlicher Natur verwendet werden. Chloroform und Amylacetat sind die gegenwärtig bevorzugten Extraktionslösungsmittel.The mycelia and undissolved solids are from the fermentation solution by usual means, e.g. B. separated by filtration or centrifugation. That Antibiotic is obtained from the filtered or centrifuged solution by application removed from adsorption or extraction processes. An extraction process is preferred to extract the antibiotic from the filtered solution because a such extraction process is usually faster, more efficient and more economical is. Use to extract the antibiotic substance from the filtered solution water-immiscible polar organic solvents are preferred, e.g. B. Esters of fatty acids such as ethyl acetate and amyl acetate; chlorinated hydrocarbons, e.g. B. chloroform, ethylene dichloride and trichlorethylene; immiscible with water Alcohols such as butyl and amyl alcohol; water-immiscible ketones such as methyl isobutyl ketone and methyl amyl ketone, and ethers, e.g. B. ethyl ether and dibutyl ether. It can too other solvents of a similar nature can be used. Chloroform and amyl acetate are the currently preferred extraction solvents.

Bei Anwendung von Adsorptionsverfahren können verschiedene Adsorptionsmittel und Ionenaustauschharze verwendet werden, z. B. Kohle und Ionenaustauschharze mit basischem Charakter, wie. »Permutit« DR (ein Ionenaüstauschharz der Permutit Co.) und »Amberlite« IRA-400 und Amberlite IR-4 B (Ionenaustauschharze der Rohm & Haas Co.). Bei Verwendung von Adsorptionsmitteln werden je- doch gewöhnlich geringere Ausbeuten an Antibioticum erhalten als bei dem Extraktionsverfahren.Using adsorption methods, various adsorbents and ion exchange resins can be used, e.g. B. coal and ion exchange resins with basic character, such as. "Permutit" DR (an ion exchange resin from Permutit Co.) and "Amberlite" IRA-400 and Amberlite IR-4 B (ion exchange resins from Rohm & Haas Co.). When using adsorbents, however, lower yields of antibiotic are usually obtained than with the extraction process.

Die nach dem bevorzugten Extraktionsverfahren erhaltenen Auszüge in organischem Lösungsmittel können direkt zur Trockne eingedampft werden, um das rohe Antibioticum zu erhalten. Bevorzugt werden jedoch die Lösungsmittelauszüge verwendet, um reinere Formen des Antibioticums zu erhalten. So kann z. B. ein Antibioticum enthaltender Auszug im Vakuum auf ein geringes Volumen eingedampft werden. Das Antibioticum des Konzentrates kann mit einer schwach basischen wäßrigen Lösung, z: B. 2a/ciger Natronlauge, extrahiert werden. Das Antibioticum kann dann aus dem erhaltenen wäßrigen Auszug nachdem Ansäuern wieder mit einem polaren organischen Lösungsmittel extrahiert werden. Der Löungsmittelauszug kann dann wieder mit einer wäßrigen basischen Lösung extrahiert und der wäßrige Auszug dann bis pH 3 oder darunter angesäuert werden, so daß das Antibioticum ausfällt. Nach einem anderen Verfahren kann das Antibioticum aus einer es enthaltenden organischen Lösung durch Zusatz eines nichtpolaren Lösungsmittels, z. B. eines 5- bis 10fachen Überschusses an Petroläther, ausgefällt werden. Oder aber das Antibioticum kann aus dem organischen Extrakt durch Adsorptionschromatographie unter Anwendung von Adsorptionsmitteln, wie Kieselsäure, Tonerde und Florisil, oder Ionenaustauschharzen, wie sie oben erwähnt wurden, aus dem organischen Auszug gewonnen werden. Das adsorbierte Antibioticum kann aus dem Adsorptionsmittel in verhältnismäßig reiner Form durch- Eluieren mit Mitteln, z. B. geeigneten polaren organischen Lösungsmitteln, wie sie oben als zweckmäßig für die Extraktion angegeben wurden, gewonnen werden.The extracts obtained by the preferred extraction process in organic solvents can be evaporated directly to dryness to get the crude Obtain antibiotic. However, preference is given to using the solvent extracts, to get purer forms of the antibiotic. So z. B. an antibiotic containing extract are evaporated in vacuo to a small volume. The antibiotic the concentrate can be mixed with a weakly basic aqueous solution, e.g. 2a / ciger Caustic soda, extracted. The antibiotic can then be obtained from the aqueous Extract, after acidification, extracted again with a polar organic solvent will. The solvent extract can then be reassembled with an aqueous basic solution extracted and the aqueous extract then acidified to pH 3 or below, so that the antibiotic fails. Another method can be the antibiotic from an organic solution containing it by adding a non-polar solvent, z. B. a 5- to 10-fold excess of petroleum ether, are precipitated. or but the antibiotic can be obtained from the organic extract by adsorption chromatography using adsorbents such as silica, clay and Florisil, or Ion exchange resins as mentioned above are obtained from the organic extract will. The adsorbed antibiotic can from the adsorbent in proportion pure form by eluting with agents, e.g. B. suitable polar organic solvents, as indicated above as being appropriate for the extraction were won.

Die Salze des Valacidins werden gebildet, wenn die freie Säure Valacidin und eine anorganische oder organische Base verwendet werden. Die Valaeidinsalze können z. B. durch Suspendieren der freien Säure des Valacidins in Wasser, Zusetzen einer verdünnten Base, bis der pH-Wert des Gemisches etwa 7,5 beträgt, und Gefriertrocknen des alkalischen Gemisches hergestellt werden, wobei ein aus dem Valacidinsalz bestehender getrockneter Rückstand erhalten wird. Valacidinsalze, die hergestellt werden können, sind z. B. das Natrium-, Kalium-, Caleium- und Magnesiumsalz. Es können aber auch andere Salze des Valacidins, einschließlich derjenigen mit organischen Basen, wie Tributylamin und Diäthanolamin, nach den oben angegebenen oder anderen bekannten Verfahren erhalten werden.The salts of valacidin are formed when the free acid is valacidin and an inorganic or organic base can be used. The valaeidin salts can e.g. B. by suspending the free acid of the valacidine in water, adding a dilute base until the pH of the mixture is about 7.5 and freeze drying of the alkaline mixture are prepared, one consisting of the valacidine salt dried residue is obtained. Valacidin Salts That Can Be Made are z. B. the sodium, potassium, calcium and magnesium salts. But it can also other salts of valacidin, including those with organic bases, such as Tributylamine and diethanolamine, according to those given above or other known ones Procedures are obtained.

Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele erläutert.The invention is further illustrated by the following examples.

Beispiel 1 Herstellung von Valacidin Eine Sporenkultur von NRRL 2675 wird durch Züchten des Organismus auf einem Nähragarhang hergestellt, der aus einem Medium der folgenden Zusammensetzung besteht: Stärke ................................ 20 g Asparagin ... ....................... 1 g Rindfleischextrakt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 g Agar ................................. 20 g Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 11 Der Hang wird mit Sporen beimpft und 5 Tage bei etwa 26° C bebrütet. Die Sporenkultur auf dem Hang wird mit Wasser bedeckt und der Hang dann vorsichtig gerieben, um die Sporen zu einer wäßrigen Sporensupension abzulösen.Example 1 Preparation of Valacidin A spore culture of NRRL 2675 is made by growing the organism on a nutrient agar slope composed of a Medium consists of the following composition: Starch ................................ 20 g asparagine ... ....................... 1 g beef extract. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 g agar ................................. 20 g water up to a total volume of 11 The slope is inoculated with spores and 5 days at incubated about 26 ° C. The spore culture on the slope is covered with water and the Hang then rubbed gently to loosen the spores into an aqueous spore suspension.

1 ccm der Sporensuspension wird zum Beimpfen von 100 ccm des folgenden sterilisierten vegetativen Kulturmediums unter aseptischen Bedingungen verwendet: Glucose .............................. 15 g Sojabohnenmehl ....................... 15 g Maisquellfeststoffe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 g Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 g Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 g Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 11 Das beimpfte vegetative Medium wird 48 Stunden bei etwa 26° C bebrütet, während welcher Zeit das Incubat mit einer Geschwindigkeit von 110 Umdrehungen je Minute auf einer Schüttelmaschine mit 50,8 mm Hub geschüttelt wird.1 cc of the spore suspension is used to inoculate 100 cc of the following sterilized vegetative culture medium used under aseptic conditions: Glucose .............................. 15 g soybean meal ................ ....... 15 g corn steep solids. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 g sodium chloride . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 g calcium carbonate. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 g water up to a total volume of 11 Das inoculated vegetative medium is incubated for 48 hours at about 26 ° C, during which Time the incubate at a speed of 110 revolutions per minute on one Shaking machine is shaken with 50.8 mm stroke.

5 ccm des so bereiteten vegetativen Inoculums werden verwendet, um Portionen von 100 ccm des folgenden sterilisierten Herstellungsmediums in 500-ccm-Erlenmeyerkolben aseptisch zu beimpfen: Sojabohnenmehl ....................... 15 g Casein ................................ 1 g Rohglucosesirup ....................... 20 g Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,5 g Natriumnitrat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 g Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 11 Die beimpfte Kultur wird 100 Stunden bei etwa 26 bis 28°C bebrütet. Während der Bebrütungszeit wird das Ineubat mit 114 Umdrehungen je Minute auf einer Schüttelmaschine mit 50,8 mm Hub geschüttelt. Der pH-Wert des Ausgangsmediums beträgt etwa 6,5. Am Ende derBebrütungszeit ist der pH-Wert auf etwa 7,5 gestiegen.5 cc of the vegetative inoculum prepared in this way are used to make 100 cc portions of the following sterilized preparation medium in 500 cc Erlenmeyer flasks to inoculate aseptically: soybean meal ....................... 15 g casein ................... ............. 1 g raw glucose syrup ....................... 20 g calcium carbonate. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5 g sodium nitrate. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 g of water up to a total volume of 11 The inoculated culture is incubated for 100 hours at about 26 to 28 ° C. During the incubation period the Ineubat at 114 revolutions per minute on a shaker with 50.8 mm Hub shaken. The pH of the starting medium is about 6.5. At the end of the incubation period the pH has risen to around 7.5.

Die erhaltene Nährlösung wird filtriert, um das Mycel und andere ungelöste Feststoffe abzutrennen. Die filtrierte Lösung enthält das erzeugte Antibioticum. Beispiel 2 Herstellung von Valacidin Eine Sporenkultur von NRRL 2675 wird durch Züchten des Organismus auf einem Nähragarhang der folgenden Zusammensetzung hergestellt: Emersonscher Agar Rindfleischextrakt ..................... 4 g Pepton ............................... 4 g Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,5 g Hefeextrakt ........................... 1 g Glucose ............................... log Agar ................................. 20 g Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 11 Der Hang wird mit Sporen von NRRL 2675 beimpft und der beimpfte Hang 4 Tage bei etwa 28° C bebrütet. Nach dem Bebrüten wird die Sporenkultur des Hanges mit Wasser bedeckt und die Oberfläche des Hanges vorsichtig gerieben, um die Sporen zu einer wäßrigen Sporensuspension abzulösen.The resulting nutrient solution is filtered to separate the mycelium and other undissolved solids. The filtered solution contains the generated antibiotic. Example 2 Preparation of Valacidin A spore culture of NRRL 2675 is prepared by growing the organism on a nutrient agar slope of the following composition: Emerson Agar Beef Extract ..................... 4 g peptone ............................... 4 g sodium chloride. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5 g yeast extract ........................... 1 g glucose ............... ................ log agar ................................ 20 g water up to a total volume of 11 The slope is inoculated with spores from NRRL 2675 and the inoculated slope is incubated for 4 days at about 28 ° C. After incubation, the spore culture of the slope is covered with water and the surface of the slope is carefully rubbed in order to detach the spores into an aqueous spore suspension.

Die eine Hälfte des Inoculums aus einem Agarhang wird zum aseptischen Beimpfen von 500 ccm des folgenden sterilisierten vegetativen Kulturmediums in einem 2-1-Erlenmeyerkolben verwendet: Maisquell-Soja-XII-Medium Glucose .............................. 15 g Sajamehl.............................. 15 g Maisquellfeststoffe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 g Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 g Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 g Antischaummittel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,1 g Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 11 Die Bebrütung wird 48 Stunden bei 28° C unter Schütteln bei 110 Umdrehungen je Minute auf einer Schüttelmaschine mit 50,8 mm Hub ausgeführt. 0,941 (0,1 Volumprozent) des vegetativen Inoculums aus dem Kolben werden aseptisch als Inoculum zu 9461 eines sterilen Mediums aus Maisquellsubstanz und Sojamehl wie oben (XII) gegeben, das in einem eisernen, 1325 1 fassenden Gärtank enthalten ist. Das beimpfte Medium wird 24 Stunden bei 28° C gären gelassen. Nach Bedarf wird Antischaummittel zugesetzt. Während der Gärung wird das Medium mit steriler Luft in einer Menge von 0,848 m3 je Minute belüftet und mit zwei Kreiselmischern von 40,6 cm mit 160 Umdrehungen je Minute gerührt.One half of the inoculum from an agar slope becomes aseptic Inoculation of 500 cc of the following sterilized vegetative culture medium in one 2-1 Erlenmeyer flask used: Corn soya XII medium glucose .............................. 15 g saja flour .............................. 15 g corn swell solids. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 g calcium carbonate. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 g sodium chloride. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 g antifoam agent. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.1 g water up to to a total volume of 11 The incubation is 48 hours at 28 ° C with shaking carried out at 110 revolutions per minute on a shaker with 50.8 mm stroke. 0.941 (0.1 volume percent) of the vegetative inoculum from the flask become aseptic as an inoculum to 9461 of a sterile medium made from corn swelling substance and soybean meal such as given above (XII), which is contained in an iron fermentation tank with a capacity of 1325 1. The inoculated medium is left to ferment at 28 ° C. for 24 hours. If necessary, antifoam is used added. During fermentation, the medium is filled with sterile air in an amount of 0.848 m3 per minute aerated and with two rotary mixers of 40.6 cm with 160 revolutions stirred per minute.

In einen 64351 fassenden eisernen Gärtank werden 45421 des folgenden Mediums gegeben: Casein-Soja-I-Medium Glucose .............................. 30g Sojamehl.............................. 20 g Casein (gereinigt) ...................... 1 g Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,5 g Natriumnitrat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 g Antischaummittel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,1 g Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 11 Das Medium wird mit 3631 (8 Volumprozent) des in dem Gärtank gezüchteten Mediums beimpft. Die Gärung dauert 3 Tage bei 28° C. Der Schaum wird durch Zusatz von Antischaummittel nach Bedarf unterdrückt. Das Gärungsmedium wird durch Zusatz von steriler Luft in einer Geschwindigkeit von 40701 je Minute mit zwei Kreiselmischern von 61 cm mit 100 Umdrehungen je Minute gerührt.45421 of the following medium are placed in an iron fermentation tank with a capacity of 64351: Casein-Soy-I-Medium Glucose ............................. . 30g soy flour .............................. 20 g casein (purified) ........... ........... 1 g calcium carbonate. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5 g sodium nitrate. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 g antifoam agent. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.1 g of water up to a total volume of 11 The medium is inoculated with 3631 (8 percent by volume) of the medium grown in the fermentation tank. Fermentation lasts 3 days at 28 ° C. The foam is suppressed by adding antifoam agents as required. The fermentation medium is stirred by adding sterile air at a rate of 40701 per minute with two rotary mixers measuring 61 cm at 100 revolutions per minute.

Der pH-Wert des Mediums beträgt am Ende der Bebrütungszeit etwa 5,9. 113,3 kg Diatomeenerde werden als Filtrierhilfsmittel zugesetzt worauf das Gemisch filtriert wird. 9461 Chloroform werden zu dem Filtrat gegeben, das Chloroformgemisch wird 45 Minuten gerührt und dann. etwa 2 Tage stehengelassen. Die das Valacidin enthaltende Chloroformschicht besteht aus einer Emulsion und wird abdekantiert. Das Chloroform wird aus der dekantierten Emulsion mit einem De Lavalschen Abscheider abgetrennt. Die Menge des abgetrennten Chloroforms beträgt 8101. Die restliche wäßrige Phase wird nochmals mit 5861 Chloroform extrahiert. Das Chloroform des zweiten Auszugs wird dem ersten Chloroformauszug zugesetzt, und die vereinigten Auszüge werden im Vakuum auf 9,8l eingeengt. Das Chloroformkonzentrat wird auf etwa 4 bis 6° C abgekühlt und einige wenige Tage bei dieser Temperatur gehalten, wobei das Valacidin auskristallisiert. Das kristalline Valacidin wird abfiltriert, zweimal mit Petroläther gewaschen und im Vakuum getrocknet.The pH of the medium at the end of the incubation time is about 5.9. 113.3 kg of diatomaceous earth are added as a filter aid, whereupon the mixture is added is filtered. 9461 chloroform are added to the filtrate, the chloroform mixture is stirred for 45 minutes and then. left for about 2 days. The the valacidin containing chloroform layer consists of an emulsion and is decanted off. The chloroform is extracted from the decanted emulsion using a De Laval separator severed. The amount of chloroform separated off is 8,101. The remaining aqueous Phase is extracted again with 5861 chloroform. The chloroform of the second extract is added to the first chloroform extract and the combined extracts are im Concentrated in vacuo to 9.8 l. The chloroform concentrate is cooled to about 4 to 6 ° C and kept at this temperature for a few days, the valacidin crystallizing out. The crystalline valacidin is filtered off, washed twice with petroleum ether and dried in vacuum.

Das Filtrat wird weiter im Vakuum auf 4,461 eingeengt, wonach eine weitere Menge des Antibioticums auskristallisiert. Das kristalline Antibioticum wird abfiltriert und gewaschen und im Vakuum in der oben beschriebenen Weise getrocknet.The filtrate is further concentrated in vacuo to 4.461, after which a further amount of the antibiotic crystallized out. The crystalline antibiotic is filtered off, washed and dried in vacuo in the manner described above.

Beispiel 3 Herstellung des Natriumsalzes von Valacidin 500 mg der kristallinen freien Säure Valacidin werden in 100 ccm Wasser suspendiert. Zu der Suspension wird tropfenweise 0,1 n-Natronlauge unter Rühren gegeben, bis der pH-Wert 7,5 erreicht ist. Das alkalische Gemisch wird gefriergetrocknet und ergibt das Natriumsalz von Valacidin. Zum Unterschied zur freien Säure ist das Natriumsalz in Wasser löslich.Example 3 Preparation of the sodium salt of valacidin 500 mg of the crystalline free acid valacidin are suspended in 100 cc of water. To the 0.1 N sodium hydroxide solution is added dropwise to the suspension with stirring until the pH value 7.5 is reached. The alkaline mixture is freeze-dried to give the sodium salt of valacidin. In contrast to the free acid, the sodium salt is soluble in water.

Beispiel 4 Herstellung des Kaliumsalzes von Valacidin 500 mg der kristallinen freien Säure Valacidin werden in 100 ccm Wasser suspendiert. Zu der Suspension wird tropfenweise unter Rühren 0,15 n-Kalilauge gegeben, bis der pH-Wert 7,5 erreicht ist. Das alkalische Gemisch wird zum Kaliumsalz des Valacidins gefriergetrocknet. Das Kaliumsalz von Valacidin ist löslich in Wasser. Beispiel 5 Herstellung des Calciumsalzes von Valacidin 200 mg der kristallinen freien Säure Valacidin werden in 50 ccm Wasser suspendiert. Zu der Suspension wird tropfenweise unter Rühren 0,1 n-Calciumhydroxydlösung gegeben, bis der pH-Wert 7,5 erreicht ist. Das alkalische Gemisch wird zu dem Calciumsalz des Valacidins gefriergetrocknet. Das Calciumsalz von Valacidin ist in Wasser löslich.Example 4 Preparation of the potassium salt of valacidin 500 mg of the crystalline free acid valacidin are suspended in 100 cc of water. Becomes the suspension 0.15 N potassium hydroxide solution was added dropwise with stirring until the pH reached 7.5 is. The alkaline mixture is freeze-dried to the potassium salt of valacidin. The potassium salt of valacidin is soluble in water. Example 5 Preparation of the calcium salt of valacidin 200 mg of the crystalline free acid valacidin are dissolved in 50 cc of water suspended. 0.1 N calcium hydroxide solution is added dropwise to the suspension with stirring given until pH 7.5 is reached. The alkaline mixture becomes the calcium salt of valacidin freeze-dried. The calcium salt of valacidin is soluble in water.

Claims

PATENT CLAIM: The use of strains of Streptomyces lavendulae, like NRRL 2675, for the production of the antibiotic valacidin, on the usual biological Paths and production of the antibiotic by extraction or adsorption and elution from the culture medium and, if necessary, converting the valacidine into its salts.