DE1097081B

DE1097081B - Process for converting benzimidazole-containing vitamin B factors, in particular factor III, into vitamin B12

Info

Publication number: DE1097081B
Application number: DEA31949A
Authority: DE
Inventors: Dr Konrad Bernhauer; Dipl-Chem Elisabeth Becher; Georg Wilharm
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1959-04-29
Filing date: 1959-04-29
Publication date: 1961-01-12

Description

Verfahren zur Umwandlung von benzimidazolhaltigen Vitamin - B12- Faktoren, insbesondere von Faktor III, in Vitamin B 12 Zusatz zum Patent 1 067562 Das Hauptpatent 1 067 562 betrifft ein Verfahren zur Biosynthese von Vitamin B12 und insbesondere ein Verfahren zur Umwandlung von benzimidazolhaltigen Vitamin-Bl2-Faktoren, z. B. von Faktor III, in Vitamin B12, wobei sich Propionsäurebakterien als besonders geeignet herausgestellt haben. Die Konzentration an Benzimidazolfaktoren im Gärmedium darf dabei einen bestimmten Höchstwert nicht überschreiten, wenn eine vollständige Umwandlung der Benzimidazolfaktoren stattfinden soll. Nach dem Hauptpatent 1 067 562 liegt dieser Wert bei 5 bis 10 mg im Liter. Es wurde nun gefunden, daß diese Konzentration an umzuwandelnden Benzimidazolfaktoren um das 2- bis 4fache, nämlich bis 20 mg im Liter, gesteigert werden kann und auch dann noch eine praktisch vollständige Umwandlung erzielt wird, wenn man eine Kultur von Propionibacterium shermanii Stamm 33 verwendet.Process for the conversion of benzimidazole-containing vitamin B12 factors, in particular of factor III, in vitamin B 12 addition to patent 1 067562 The main patent 1,067,562 relates to a method for the biosynthesis of vitamin B12 and in particular a process for the conversion of benzimidazole-containing vitamin Bl2 factors, e.g. B. of factor III, in vitamin B12, with propionic acid bacteria being particularly suitable have turned out. The concentration of benzimidazole factors in the fermentation medium is allowed Do not exceed a certain maximum value if a full conversion the benzimidazole factors should take place. According to the main patent 1 067 562 is this value is 5 to 10 mg per liter. It has now been found that this concentration of the benzimidazole factors to be converted by a factor of 2 to 4, namely up to 20 mg im Liters, can be increased and even then a practically complete conversion obtained using a culture of Propionibacterium shermanii strain 33.

Der für das vorliegende Verfahren zur Verwendung kommende Propionibacterium shermanii Stamm 33 wurde aus einer Quarkprobe in folgender Weise isoliert: Anreicherungskultur Je etwa 1 g Quark verschiedener Herkunft werden in nativem, unsterilisiertem Zustand in Reagenzröhrchen mit je 10 ccm eines sterilen und auf PH 6,8 gebrachten Nährmediums vermischt, das je Liter folgende Bestandteile enthält: 10 g G]ukose, 1,5 g Stickstoff in Form eines Casein-Proteolysates, 1 g Stickstoff in Form eines Casein-Säurehydrolysates, 1,6 g NaH2PO4, 1,6 g K3PO4, 0,4g MgCl2-6H2O, 10 mg FeSO4.7 7 H2O, 12 mg Com 04 7 H2O, 4 mg Pantothensäure, 0,3 mgBiotin, 5 g Hefeextrakt. The Propionibacterium used for the present method shermanii strain 33 was isolated from a quark sample in the following way: Enrichment culture About 1 g of quark of various origins are in a native, unsterilized state in test tubes with 10 ccm each of a sterile nutrient medium brought to pH 6.8 mixed, which contains the following ingredients per liter: 10 g g] ukose, 1.5 g nitrogen in the form of a casein proteolysate, 1 g nitrogen in the form of a casein acid hydrolyzate, 1.6 g NaH2PO4, 1.6 g K3PO4, 0.4g MgCl2-6H2O, 10 mg FeSO4.7 7 H2O, 12 mg Com 04 7 H2O, 4 mg pantothenic acid, 0.3 mg biotin, 5 g yeast extract.

Die abgefüllten je 10 ccm Nährmedium überschichtet man nach dem Beimpfen mit dem Quark mit etwas Paraffinöl. Man bebrütet nun in einem gründlich evakuierten Exsikkator 4 bis 5 Tage bei 30C C in Gegenwart eines mit 100/,iger alkalischer PyrogaUollösung beschickten Schälchens. Durch Einhaltung streng anaerober Bedingungen wird das Aufkommen anderer Keime weitgehend unterdrückt, zumindest verzögert. The filled 10 ccm nutrient medium is covered with a layer after inoculation with the quark with a little paraffin oil. One now incubates in a thoroughly evacuated one Desiccator for 4 to 5 days at 30C C in the presence of a 100% alkaline pyrogenic solution filled bowl. By observing strictly anaerobic conditions, the emergence other germs largely suppressed, or at least delayed.

Reinzüchtung Die Reinzüchtung der Kultur erfolgt vorteilhaft in der Hochschichtkultur (10 cm hoch, in Röhrchen) unter Benutzung desselben Nährbodens wie zuvor, der aber mit 201o Agar verfestigt wird. Die verschiedenen Anreiche- rungskulturen werden für sich in steigender Verdünnung in den sterilen, verflüssigten Agar bei 40° C eingetragen und durch Rollen gut verteilt. Man bebrütet nun die einzelnen Proben in der gleichen Weise, wie oben beschrieben, und wählt zur Isolierung jene Röhrchen aus, die nicht zu stark bewachsen sind, also gut getrennte Kolonien enthalten. Die ausgewählten Röhrchen werden kurz im Wasserbad erwärmt, so daß sich der Agarpfropfen in eine sterile Petrischale bringen läßt. Man sticht dann einzeln liegende Kolonien aus dem unteren Drittel des Pfropfens, wo die am strengsten anaeroben Bedingungen vorhanden waren, mit der Platinnadel aus, impft sie in ein gleiches Medium, wie es für die Gewinnung der Anreicherungskultur verwendet worden war, über und kultiviert nun weiter unter streng anaeroben Bedingungen, wie eingangs für die Gewinnung der Anreicherungskultur beschrieben. Etwa mitabgeimpfte Kolonien anderer Organismen, wie LactobaciUus lactis oder Streptococcus lactis, werden bei der mikroskopischen Durchmusterung erkannt und ausgesondert. Pure breeding Pure breeding of the culture takes place advantageously in the High layer culture (10 cm high, in tubes) using the same culture medium as before, but solidified with 201o agar. The various enrichment culture cultures are in increasing dilution in the sterile, liquefied agar 40 ° C entered and well distributed by rolling. You now incubate the individual Samples in the same manner as described above and select those for isolation Tubes that are not overgrown, i.e. contain well-separated colonies. The selected tubes are briefly heated in a water bath so that the agar plug is removed can be brought into a sterile Petri dish. You then stab solitary colonies from the lower third of the plug, where the most severe anaerobic conditions were present, with the platinum needle, inoculate them in the same medium as it had been used for the production of the enrichment culture, over and cultivated now continue under strictly anaerobic conditions, as for the extraction of the Enrichment culture described. About inoculated colonies of other organisms, such as LactobaciUus lactis or Streptococcus lactis, are used in the microscopic Screening recognized and sorted out.

Die so gewonnenen Proben werden auf ihr Vermögen zur Bildung von Vitamin-Bl2-Aktivität in üblicher Weise, z. B. mit Hilfe von E.coli, L.leichmannii oder Ochromonas malhamensis, geprüft. Man wählt nun die Kulturen mit dem höchsten Vitamin-B,PBillungsvermögen aus und wiederholt den Selektionsprozeß, wie oben unter »Reinzüchtung« beschrieben. The samples obtained in this way are based on their ability to form Vitamin Bl2 activity in the usual way, e.g. B. with the help of E. coli, L.leichmannii or Ochromonas malhamensis, checked. You now choose the cultures to the highest vitamin B, P-filling capacity and repeats the selection process, such as described above under "pure breeding".

Neugewonnene Reinkulturen sind zunächst gärschwach. Newly obtained pure cultures are initially weak in fermentation.

Erst im Verlauf weiterer rührung in flüssigem Medium und hoher Schicht und bei Einhzaltung streng anaerober Bedingungen wird das Wachstums- und Gärvermögen erhöht, und die Vitamin-Bl2-Produktion erreicht dann eine Höhe von mindestens-15 mg je Liter Gärmedium.Only in the course of further agitation in the liquid medium and high layer and if strictly anaerobic conditions are observed, the growth and fermentation capacity is increased increases, and the vitamin Bl2 production then reaches a level of at least -15 mg per liter of fermentation medium.

Folgende Arbeitsweise- hat sich für die Erzielung gärkräftiger Kulturen bewährt: Man beimpft das Nährmedium jeweils mit 100/o obiger Kultur durch UberschichtenfsDie Luft über dem Medium verdrängt man mit Kohlensäure. Das Gärgefäß wird auf 1 Atm. Überdruck gebracht. Man bebrütet nun 2 Tage bei 300 C. Während dieser --Zeit wird die Glucose verbraucht, und das pH sinkt auf 4,5. Mit einer gesättigten Na2CO3-Lösung wird das putz auf 6,6 gebracht und 101, Glucose zugesetzt. Die- Durchmischung wird mit Kohlensäure, die ein steriles Wattefilter passiert und in feinverteilter Form durch das-Medium geleitet wird, vorgenommen. Man bebrütet -nut' .weitere 2 Tage bei 28° C, wobei das Medium wieder unter 1 Atm. Druck steht. The following working method has proven itself to achieve fermenting cultures Proven: The nutrient medium is inoculated with 100% of the above culture by overlaying the medium Air above the medium is displaced with carbonic acid. The fermentation vessel is set to 1 atm. Brought overpressure. Incubate for 2 days at 300 ° C. During this time, the glucose is consumed and the pH drops to 4.5. With a saturated Na2CO3 solution the plaster is brought to 6.6 and 101, glucose is added. The mixing will be with carbon dioxide, which passes through a sterile cotton wool filter and in finely divided form is passed through the medium. Incubate for another 2 days at 28 ° C, with the medium again below 1 atm. Pressure is on.

Durch diese Arbeitsweise wird schließlich der hochleistungsfähige Stamm 33 herausgezüchtet.This way of working eventually becomes the high-performance one Strain 33 bred out.

Der in der geschilderten Weise gewonnene Propionibacterium shermanü Stamm33 besitzt folgende Eigenschaften: Die Zellen der Kultur liegen in Diplo-Form und in kurzen, höchstens viergliedrigen Ketten vor. Bei Verwendung des beschriebenen Mediums, Einhaltung einer Impfgabe von 100/o möglichst anaerober Gärführung, fortlaufender par-Korrektur und Zuckerzugabe liegt die Größe der Zellen noch unter 0,5 Cu. Im übrigen wurden bei der Identifizierung nach Betgey's Manual of Determinative Bacteriology alle für das Propionibacterium shermanii geforderten Charakteristika ermittelt. Der Stamm zeichnet sich durch besondere Gärfreudigkeit z. B. im Glucosemedium aus; vergärt aber Lactose, im Gegensatz zu den Angaben Bergeys nur in geringem Maße und sehr zögernd. The Propionibacterium shermanü obtained in the manner described Strain33 has the following properties: The cells of the culture are in diplo form and in short, at most four-link chains. When using the described Medium, compliance with an inoculation dose of 100 / o, if possible anaerobic fermentation, ongoing par correction and the addition of sugar, the size of the cells is still below 0.5 Cu. in the remaining were identified according to Betgey's Manual of Determinative Bacteriology all characteristics required for Propionibacterium shermanii were determined. The trunk is characterized by special fermentation z. B. in the glucose medium; However, in contrast to Bergey's statements, lactose ferments only to a small extent and very hesitant.

Die besonderen Eigenschaften des Stammes 33, sein hohes Vitamin-Bl2-Bildungsvermögen, die unter der Norm liegende Größe der Bakterienzellen und die rasche Zunahme der Bakteriendichte--stellen sich erst nach zahlreichen Passagen in flüssigem Medium ein, wie oben geschildert. The special properties of strain 33, its high vitamin Bl2 production capacity, the below normal size of the bacterial cells and the rapid increase in Bacteria density - only appear after numerous passages in a liquid medium as described above.

Die Gewinnung von Propionibacterium shermaiiii, Stamm 33 und die Gewinnung von Vitamin-Bl2 unter Verwendung dieses Stammes durch Kultur in üblichen Nährmedien ohne Zusatz von benzimidazolhaltigen Vitamin-Bl2-Faktoren, wie Faktor III, gehört nicht zum Gegenstand der Erfindung. The recovery of Propionibacterium shermaiiii, strain 33 and the Obtaining vitamin Bl2 using this strain by culture in the usual way Culture media without the addition of benzimidazole-containing vitamin Bl2 factors such as factor III, does not belong to the subject of the invention.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird im Prinzip folgendermaßen durchgeführt: In einem Medium, das die erforderlichen Nährstoffe, wie vor allem Zucker, ein Aminosäuregemisch, Phosphat und andere Nährsalze, enthält, läßt man eine Kultur von Propionibacterium shermanii Stamm 33 wachsen. Nach etwa 2tägiger Bebrütung bei 28 bis 30° C versetzt man das Gärmedium mit dem umzuwandelnden Benzimidazolfaktor, wie vor allem mit Faktor III (auch in rohem, also ungereinigtem Zustand), und mit 5,6-Dimethylbenzimidazol. Die Konzentration an Benzimidazolfaktor im Medium beträgt etwa 10 bis 20 mg, die an 5,6-Dimethylbenzimidazol etwa 20 bis 40 mg je Liter. Durch weiteren Zusatz von Glukose zum Nährmedium und Regelung des ps-Wertes auf etwa 6,5 hält man den Gärprozeß einige Tage in Gang. The method according to the invention is carried out in principle as follows: In a medium that contains the necessary nutrients, especially sugar, an amino acid mixture, Phosphate and other nutrient salts, are left in a culture of Propionibacterium shermanii strain 33 grow. After about 2 days of incubation at 28 to 30 ° C the fermentation medium with the benzimidazole factor to be converted, as above all with factor III (also in the raw, i.e. uncleaned state), and with 5,6-dimethylbenzimidazole. The concentration of benzimidazole factor in the medium is approximately 10 to 20 mg, the of 5,6-dimethylbenzimidazole about 20 to 40 mg per liter. By adding Glucose to the nutrient medium and regulation of the ps value to about 6.5 keeps the fermentation process in progress for a few days.

Nach Beendigung des Gärprozesses wird die Gärbrühe zentrifugiert, wobei man erforderlichenfalls auf einen p-Wert von etwa 4 bis 4,5 einstellt. Die abgeschleuderte und gegebenenfalls mit Wasser gewaschene Bakterienmasse wird in der Hitze (z. B. bei 80 bis 110° C) mit Wasser extrahiert. Man erhält dabei einen bereits orangerotgefärbten Extrakt. Dieser wird mit Aktivkohle behandelt. Das Kohleadsorbat wird durch Filtrieren oder Zentrifugieren gewonnen und in üblicher Weise, z. B. mit einem wäßrigen Alkohol, eluiert. Das so erhaltene Eluat hat bereits die typische reinrote Farbe des Vitamins B12. After completion of the fermentation process, the fermentation broth is centrifuged, if necessary, one adjusts the p-value from about 4 to 4.5. the Bacterial mass thrown off and possibly washed with water is in the heat (z. B. at 80 to 110 ° C) extracted with water. You get one already orange-red colored extract. This is treated with activated carbon. The carbon adsorbate is obtained by filtration or centrifugation and in the usual way, for. B. with an aqueous alcohol. The eluate obtained in this way already has the typical one vitamin B12 pure red color.

Man kann aus demselben sehr leicht in üblicher Weise kristallisiertes Vitamin B12 gewinnen.One can very easily crystallize from it in the usual way Gain vitamin B12.

Wenn die Menge an Benzimidazolfaktor, wie Faktor III im Kulturmedium zu hoch gewählt wird, dann kann es vorkommen, daß sie bei dem Prozeß nicht vollständig in der gewünschten Weise umgewandelt wird. Dies erkennt man daran, daß im Kulturfiltrat nach Gewinnung der Bakterienmasse eine restliche »B12-Aktivität« verbleibt (z. B. ermittelt durch den Test mit E.coli oder L.leichmannii). Wie die nähere Untersuchung zeigte, ist nämlich diese Aktivität auf das Vorhandensein von Resten an Benzimidazolfaktoren, wie Faktor III, zurückzuführen, die also von den Bakterien nicht aufgenommen wurden, wogegen die von den Zellen assimilierten Anteile praktisch quantitativ umgewandelt werden. Man kann nun die im Kulturfiltrat verbliebenen Mengen an Benzimidazolfaktoren, wie Faktor III, dadurch völlig verwerten, daß man das Kulturfiltratnach weiterem Zusatz von Zucker einer erneuten Gärung mit den gleichen Bakterien unterwirft, wobei man im Prinzip ebenso vorgeht, wie bereits beschrieben wurde. When the amount of benzimidazole factor such as factor III in the culture medium is chosen too high, then it may happen that it is not completely in the process is converted in the desired manner. This can be seen from the fact that in the culture filtrate after the bacterial mass has been obtained, a residual »B12 activity« remains (e.g. determined by the test with E. coli or L.leichmannii). Like the closer examination showed, namely this activity is due to the presence of residues of benzimidazole factors, like factor III, which was not absorbed by the bacteria, whereas the parts assimilated by the cells are converted practically quantitatively will. You can now see the amounts of benzimidazole factors remaining in the culture filtrate, like factor III, completely utilize by the fact that the culture filtrate after further Addition of sugar subjected to re-fermentation with the same bacteria, whereby one proceeds in principle in the same way as has already been described.

Beispiel Man sterilisiert in üblicher Weise (30 Minuten bei 120°C) 101 eines Mediums, das je Liter folgende Bestandteile enthält und auf pB 6,7 eingestellt ist: Säurehydrolysiertes Kasein, entsprechend 1,1 g N Tryptisch verdautes Kasein, entsprechend 1,6 g N NaH2PO4 . . 1,76g K,PO, ......... 1,76g MgCl2 6 H2O . .. 0,4g FeS Oo 7 H2O .. 10 mg Hefeextrakt ........ .. 3g Technische Glukose . . . 10 g Sodann beimpft man mit 1 1 einer Vorkultur von Propionibacterium shermarii Stamm 33 im gleichen Medium und bebrütet unter anaeroben Bedingungen bei 20 bis 30° C. Nach 2tägiger Gärung versetzt man mit einer sterilen Lösung von 200 mg Faktor III und 200 mg 5,6-Dimethylbenzimidazol. Während des Prozesses fügt man zeitweise sterile Glukoselösung zu, um die Gärung in Gang zu halten, und regelt durch Zugabe von gesättigter Natriumcarbonatlösung den pH-Wert auf 6,6. Nach weiteren 2 Tagen setzt man nochmals 200 mg 5,6-Dimethylbenzimidazol zu. Nach einer Gärdauer von 6Tagen ist der Prozeß beendet. Man säuert durch Zusatz von Schwefelsäure auf einen pxr-Wert von 4,0 an, wodurch die Bakterien zum Sedimentieren gebracht werden. Durch Abschleudern erhält man 275 g Bakterienmasse mit einem Trockensubstanzgehalt von 30 °/0. Die feuchte Bakterienmasse wird mehrmals unter Druck je 10 Minuten bei 110° C mit Wasser extrahiert, wobei man insgesamt 2,61 orangeroten wäßrigen Extrakt erhält. Diesen versetzt man nach dem Erkalten unter Rühren mit 26 g Aktivkohle, saugt diese über Kieselgur ab und eluiert das Kohleadsorbat wiederholt bei Siedetemperatur mit einer Mischung aus 70 Volumteilen Isopropanol, 25 Teilen Wasser und 5 Teilen Benzol so lange, bis das Eluat praktisch farblos ist. Man erhält so 11 eines reinrotgefärbten Eluates, das im Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt wird. Man gewinnt daraus in üblicher Weise 178,2 mg kristallisiertes Vitamin B12. Example It is sterilized in the usual way (30 minutes at 120 ° C) 101 of a medium containing the following components per liter and adjusted to pB 6.7 is: acid hydrolyzed casein, equivalent to 1.1 g N tryptically digested casein, corresponding to 1.6 g of N NaH2PO4. . 1.76g K, PO, ......... 1.76g MgCl2 6 H2O. .. 0.4g FeS Oo 7 H2O .. 10 mg yeast extract ........ .. 3g technical glucose. . . 10 g then is inoculated with 1 l of a preculture of Propionibacterium shermarii strain 33 im same medium and incubated under anaerobic conditions at 20 to 30 ° C. After Two days of fermentation are mixed with a sterile solution of 200 mg factor III and 200 mg 5,6-dimethylbenzimidazole. During the process one adds sterile at times Glucose solution to keep the fermentation going, and regulates by adding saturated Sodium carbonate solution adjust the pH to 6.6. After a further 2 days, you set again 200 mg of 5,6-dimethylbenzimidazole are added. The process takes place after a fermentation period of 6 days completed. It is acidified by adding sulfuric acid to a pxr value of 4.0, thereby causing the bacteria to sediment. Received by hurling one 275 g of bacterial mass with a dry matter content of 30 ° / 0. The damp Bacterial mass is extracted several times under pressure for 10 minutes at 110 ° C with water, a total of 2.61 orange-red aqueous extract being obtained. This one relocates after cooling with stirring with 26 g of activated charcoal, this is suctioned off over kieselguhr and the carbon adsorbate repeatedly elutes at boiling temperature with a mixture from 70 parts by volume of isopropanol, 25 parts of water and 5 parts of benzene until the eluate is practically colorless. This gives 11 of a pure red-colored eluate, that in a vacuum to a small volume is narrowed. One wins from it in the usual way 178.2 mg crystallized vitamin B12.

Es wurde durch Ermittlung seiner Eigenschaften, besonders des elektrophoretischen Verhaltens bei pe 11 identifiziert, also unter Bedingungen, unter denen Vitamin B12 neutral ist, während Faktor III anodisch wandert (s. dazu W. Friedrich und K. Bernhauer: Chem. Ber., 90, S. 154, 1957). Ferner wurde seine Identität auch papierchromatographisch unter Benutzung der üblichen Entwicklungssysteme bestätigt. Vor allem die Verwendung von wassergesättigtem sec.Butanol+0,01 0/, HCN + 0,5 0/, Natriumtetraphenylborat führte zur ein- deutigen Entscheidung, daß Vitamin B12 vorlag, nicht aber Faktor III m, da dieser im erwähnten Entwicklungssystem -einen viel niedrigeren Rf-Wert besitzt als Vitamin B12 (Faktor IIIm: RB12 = 0,67 im genannten Entwickler, 24 Stunden, aufsteigend bei 20 bis 22° C). It was made by identifying its properties, especially electrophoretic Identified behavior at pe 11, that is, under conditions where vitamin B12 is neutral, while factor III migrates anodically (see W. Friedrich and K. Bernhauer: Chem. Ber., 90, p. 154, 1957). Furthermore, his identity was also determined by paper chromatography confirmed using the usual development systems. First of all, the use of water-saturated sec-butanol + 0.01 0 /, HCN + 0.5 0 /, sodium tetraphenylborate led to the clear decision that vitamin B12 was present, but not factor III m, since this has a much lower Rf value in the development system mentioned possesses as vitamin B12 (factor IIIm: RB12 = 0.67 in the named developer, 24 hours, increasing at 20 to 22 ° C).

Claims

PATENT CLAIM: Process for the biosynthesis of vitamin B12 according to patent 1 067 562, characterized in that the Propionibacterium shermanii Strain 33 used.