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Verfahren zur Erzeugung von Itaconsäure durch Gärung Die vorliegende
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung von Itaconsäure mit hoher Ausbeute
durch Gärung von Ausfallmelasse unter Verwendung eines zur Gattung Aspergillus itaconicus
gehörenden Stammes.
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Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren
zur industriellen Erzeugung von Itaconsäure zu schaffen, nach dem ein Schimmelpilz
unter submersen Bedingungen gezüchtet und für kurze Zeit mit Ausfallmelasse fermentiert
wird, wobei eine günstige Ausbeute erzielt wird. Ausfallmelasse galt bisher als
ein industriell schwer verwertbarer Rohstoff.
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Zwar sind Aspergillus itaconicus und Aspergillus terreus bereits als
zur Erzeugung von Itaconsäure geeignete Pilzstämme bekanntgeworden, jedoch ist in
der industriellen Produktion von Itaconsäure bisher ausschließlich Aspergillus terreus
verwendet worden.
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Die submerse aerobe Gärung durch Züchtung des Schimmelpilzes Aspergillus
itaconicus in Melasse zur biotechnischen Gewinnung von Itaconsäure ist bekannt.
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Es hat sich erwiesen, daß bei Verwendung eines Stammes von Aspergillus
itaconicus die als äußerst vorteilhafter industrieller Rohstoff anzusehende Melasselösung
in nicht vorbehandelter Form verwendet werden kann, die einen Zuckergehalt von 15
bis 20% und einen Gehalt an einer an sich bekannten Stickstoffquelle von 0,1 bis
0,5°/o aufweist, ohne daß ihre Anwendung von itaxonsäureanreichernden Bedingungen
entscheidend beeinflußt wird, wie dies bei Verwendung von Apergillus terreus der
Fall ist, wo z. B. das Vorhandensein von Schwermetallen und Salzen sowie der pg-Bereich
und die Zuckerkonzentration in dem Kulturmittel zu berücksichtigen sind.
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Das Verfahren nach der Erfindung bietet den Vorteil, daß die Ausfallmelasse
in ihrem ursprünglichen Zustand ohne die Notwendigkeit beispielsweise eines Entsalzens
verwendet werden kann und keine Regulierung des pg und kein Zusatz verschiedener
die Gärung beschleunigender Mittel erforderlich ist. -Überdies kann Itaconsäure
in einem hochkonzentrierten Kulturmittel mit günstigster Ausbeute in kurzer Zeit
angereichert werden. Als organische oder anorganische Stickstoffquelle wird vorteilhaft
Na N 03,N H4 N 03 oder Pepton verwendet.
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Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung soll nunmehr durch die
nachstehenden Beispiele veranschaulicht werden: Beispiel 1 Beispiel einer submersen
Kultur in einem geschüttelten Kolben Ein 20 ml eines sterilisierten Kulturmittels
enthaltender Erlenmeyerkolben von 250 ml wurde auf eine drehbare Schüttelvorrichtung
von 5 cm Ausschlagweite gesetzt und bei 220 Umdrehungen in der Minute geschüttelt,
wobei die Kultivation bei einer gleichbleibenden Raumtemperatur von 28' C
durchgeführt wurde. a) Zuckerhaltige Stoffe Glucose, raffinierter weißer Zucker,
Rohzucker, Rohrzuckerausfallmelasse oder Rübenzuckerausfallmelasse in einer 15%
Glucose entsprechenden Menge wurden der Reihe nach verwendet, denen 0,1 bis 0,25%
N H4 N 03, 0,250/, K H2 P 04 und 0,0250/G M9S04.7H20 als organische Salze zur Bereitung
des Kulturmittels zugesetzt wurden.
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Die Analysenresultate am 7. Tage der Kultivation waren wie folgt:
| Tabelle 1 |
| Raffinierter Rohrzucker Rübenzucker- |
| Glucose |
| weißer Zucker Rohzucker ausfallmelasse |
| ausfallmelasse |
| Anfall an Itaconsäure im Verhältnis |
| zu Zucker (%) . . . .............. 40,2 39,8 58,4 65,6
63,5 |
| pH zu Beginn . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
... 5,0 - 5,4 5,2 5,3 5,8 |
| pg am Ende ....................... 1,6 1,6 2,0 2,8 3,0 |
Bei den bekannten Verfahren zur Gewinnung von Itaconsäure wurde
es -als wesentliche Vorbedingung betrachtet, daß der pH-Bereich der Gärungsbrühe
zwischen 1,8 und 2,3 gehalten werden mußte, um eine hohe Ausbeute zu erzielen. Bekanntlich
wird bei diesen Verfahren die Gärung entscheidend durch Schwermetallinonen, insbesondere
Eisenionen, in der Gärungsbrühe beeinflußt, und es galt als schwierig, einen Rohstoff
wie Ausfallmelasse in der Form zu verwenden, in der er gewonnen wird bzw. anfällt.
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Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung zeichnet sich dadurch
aus, daß bei Verwendung von Rohstoffen, wie Rohzucker oder Ausfallmelasse, eine
höhere Ausbeute als bei Verwendung von raffiniertem Zucker, wie Glucose oder raffiniertem
weißem Zucker, zu erwarten ist, wie die Tabelle 1 zeigt, wobei sich noch die Vorteile
ergeben, daß die Gärung nicht, wie bisher, durch Eisenionen behindert wird und kein
Zusatz von die Gärung beschleunigenden Mitteln erforderlich ist, so daß ein Rohstoff,
wie beispielsweise Ausfallmelasse, ohne Vorbehandlung, wie Entsalzen, so verwendet
werden kann, wie er anfällt. Außer Ausfallmelasse kann auch jeder- andere zuckerhaltige
Rohstoff verwendet werden.
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b) pH-Bereich Die Bereitung des Kulturmittels erfolgt durch Zusatz
von 0,251% N H4 N 03, 0,25%, K H2 P O4 und 0,025°/(x Mg504-7H20 als anorganische
Salze zu Glucose oder Ausfallmelasse, deren Zuckerkonzentration 15 % betrug.
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Die Analysenresultate am 7. Tage der Kultivation lauteten wie folgt:
| Tabelle 2 |
| Ausbeute an Itaconsäure im Verhältnis zu Zucker (Oh) |
| Verwendeter Zucker |
| PH Rohrzucker- |
| - Glucose ausfallmelasse |
| 1,8 12,3 - |
| 2,0 17,5 21,8 |
| 2,5 35,0 36,5 |
| 3,0 39,9 49,0 |
| 3,5 40,2 56,6 |
| 4,0 31;0 50,0 |
| 5,0 28,5 39,9 |
| nicht reguliert 11,0 60,8 |
Bei der bisherigen Verwendung von Aspergillus terreus ist es als wesentliche Vorbedingung
angesehen worden, .das pg der Gärungsbrühe bei 1,3 bis 2,2 zu halten, um einen hohen
Anfall von Itaconsäure zu erzielen. Demgegenüber zeichnet sich das Verfahren nach
der vorliegenden Erfindung weiter dadurch aus, däß eine günstige Ausbeute innerhalb
eines weiteren p$-Bereiches von 2,5 bis 5,0 erzielt werden kann, wie dies aus Tabelle
2 eindeutig hervorgeht. Ein weiterer Vorteil liegt darin, daß bei Verwendung von
Ausfallmelasse als Kulturmittel mit großer Pufferungswirkung selbst dann, wenn das.
pn zu Beginn nicht reguliert wurde, die Gärungsbrühe automatisch innerhalb eines
pg-Bereiches von 2,5 bis 3,5 gehalten wird, so daß eine beträchtliche Menge von
Itaconsäure anfällt. Daher ist eine Regulierung des pg, wie sie bisher üblich war,
nicht erforderlich. c) Zuckerkonzentrationen Die Bereitung des Kurmittels erfolgt
durch Zusatz von 0,1% N H4 N 03 zu Lösungen von Rohzuckerausfallmelasse in 6,0 bis
20,0% Glucose entsprechenden Mengen.
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Die Analysenresultate am 7. Tage der Kultivation lauteten folgendermaßen:
| Tabelle 3 |
| Konzentrationen von |
| Rohrzuckerausfall- |
| melasse (%) ...... 6,0 10,0 15,0 20,0 |
| Anfall an Itaconsäure |
| im Verhältnis zu |
| Zucker (%) ....... 25;0 54,8 60,0 58,2 |
| pH zu Beginn ....... 5,1 5,2 5,0 5,1 |
| p$ am Ende ........: 2,4 2,5 2,7 2,8 |
Bei der bisher üblichen Kultivation von Aspergillus terreus unter submersen Bedingungen
wurden etwa 6% als optimale Zuckerkonzentration betrachtet, und es galt als schwierig,
eine hohe Ausbeute mit einem Kulturmittel von hoher Zuckerkonzentration zu erzielen.
Darin bestanden die Mängel der Kultivation bei der submersen Itaconsäuregärung.
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Das erfindungsgemäße Verfahren hat den Vorteil, daß in kurzer Zeit
ein hoher Anfall an Itaconsäure mit einem Kulturmittel von hoher Zuckerkonzentration
erzielt werden kann, wie aus der Tabelle 3 ersichtlich ist.
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d) Stickstoffquellen Die Bereitung des Kulturmittels erfolgte durch
Zusatz von N H4 N 03, (NH4)2S04, N H4 Cl, Na N 03, Harnstoff oder Pepton als Stickstoffquelle
in einer Menge von 0,05 bis 0,5°/o im Verhältnis zu einer Lösung von Rohrzuckerausfallmelasse
in einer 15,00% Glucose entsprechenden Menge.
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Die Analysenresultate am 7. Tage der Kultivation waren wie folgt:
Bei dem üblichen Verfahren mit Aspergillus terreus wurden physiologisch saure anorganische
Salze, wie (NH4)2S04 und NH4C1, als bevorzugte Stickstoffquellen betrachtet, während
nach dem erfindungsgemäßen Verfahren physiologisch basische oder neutrale; Salze,
wie N H4 N 03, Na N 03 und Pepton, als am besten geeignet erkannt wurden.
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e) Stickstoffkonzentrationen Die Bereitung des Kulturmittels erfolgte
durch Zusatz von Mengen zwischen 0,01 und 0,5% N H4 N 03
zu einer
Lösung von Rohrzuckerausfallmelasse in einer 15% Glucose entsprechenden Menge.
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Die Analysenresultate am 7. Tage der Kultivation waren wie folgt:
| Tabelle 5 |
| Konzentrationen von |
| N H4 N 03 (0/0) . . . . 0,01 011 0,25 0,5 |
| Anfall an Itaconsäure |
| im Verhältnis zu |
| Zucker (%) ....... 35,3 60,5 24,0 22,7 |
| pl, zu Beginn ........ 5,1 5,3 5,2 5,3 |
| px am Ende ......... 2,7 2,8 2,8 2,8 |
Die optimale Stickstoffkonzentration liegt demnach in dem Bereich von 0,01 bis 0,25%.
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Beispiel 2 Beispiel einer Kultivation in einem submersen Kulturentank
von 51 Fassungsvermögen Eine Suspension von Mycelia, die 60 Stunden lang einer Schüttelbehandlung
unterworfen worden war, wurde in einer Menge von etwa 10% einem Kulturmittel zugesetzt,
und die Kultivation erfolgte unter den folgenden Bedingungen:
| Rühren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 540 Umdr./Min. |
| Lüftung ................... 11/1/Min. |
| Menge des Kulturmittels ... 3 1 |
| Temperatur . .... . . . . .. .. .. . 28' C |
| Kulturmittel in % I A B |
| Rohrzuckerausfallmelasse ....... 25 17 |
| NH4N03 ..................... 0,1 0,1 |
| Analysenresultate am 7. Tage |
| Anfall an Itaconsäure |
| Kultur- im Verhältnis zu im Verhältnis zu |
| mittel Pg zu Beginn verbrauchtem anfänglichem |
| Zucker Zuckergehalt |
| (%) (°/o) |
| A 5,0 62,5 50,1 |
| B 5,1 58,3 48,5 |
Nach Beendigung der Kultivation wurden die Mycelpilze entfernt, und die Brühe wurde
konzentriert, wobei Rohkristalle von Itaconsäure gewonnen wurden.
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Wie aus den vorstehenden Ausführungen ersichtlich ist, hat sich das
erfindungsgemäße Verfahren zur industriellen Erzeugung von Itaconsäure unter Verwendung
von Aspergillus itaconicus als ein in vielen Punkten weit vorteilhafteres Verfahren
erwiesen als das bisherige Verfahren, in welchem Aspergillus terreus verwendet wird.