DE1057287B

DE1057287B - Process for the production of pure, therapeutically usable heparin preparations

Info

Publication number: DE1057287B
Application number: DEB34765A
Authority: DE
Inventors: Eric Arthur Burfoot; James Ernest Hatchett; Leslie William Robinson
Original assignee: Boots Pure Drug Co Ltd
Current assignee: Boots Pure Drug Co Ltd
Priority date: 1954-03-19
Filing date: 1955-03-04
Publication date: 1959-05-14

Description

Verfahren zur Herstellung reiner, therapeutisch verwendbarer Heparinpräparate Die Erfindung betrifft ein neues, wirkungsvolles Verfahren zur Herstellung reiner, therapeutisch verwendbarer, ungefärbter Heparinpräparate.Process for the production of pure, therapeutically usable heparin preparations The invention relates to a new, effective process for the production of pure, therapeutically usable, unstained heparin preparations.

Man nimmt an, daß Heparin ein Gemisch von Polyschwefelsäureestern des Mucoitins ist; es ist ein sehr wertvolles die Gerinnung hemmendes Mittel, welches in ausgedehntem Maße in der klinischen Medizin verwendet wird. Freies Heparin ist seiner Natur nach sauer; es wird im allgemeinen in der Form seines Salzes mit einem Alkalimetall isoliert, beispielsweise in der Form seines Natriumsalzes. Heparin wird den Arten im allgemeinen als eine gelblich- oder braungefärbte Lösung des Natriumsalzes zur Verfügung gestellt. Es bestand nun bereits seit langem der Wunsch, diese Färbung zu beseitigen, und es sind bereits verschiedene Verfahren bekannt, die sich das Ziel gesetzt hatten, durch eine bestimmte Behandlung Heparinsalze herzustellen, die beim Auflösen eine farblose Lösung ergeben. It is believed that heparin is a mixture of polysulfuric acid esters des mucoitin is; it is a very valuable anticoagulant which is used extensively in clinical medicine. Free heparin is acidic by nature; it is generally in the form of its salt with one Alkali metal isolated, for example in the form of its sodium salt. Heparin is generally found in the species as a yellowish or brown colored solution of the sodium salt made available. There has been a desire for this coloring for a long time to eliminate, and there are already various methods known that can Had set the goal of producing heparin salts through a certain treatment, which when dissolved give a colorless solution.

So wurde beispielsweise schon versucht (J. Biol. For example, attempts have already been made (J. Biol.

Chem., 1933, S. 439 bis 441), Rohheparin mit Wasserstoffsuperoxyd zu behandeln. Abgesehen davon, daß eine völlige Entfernung der gefärbten Verunreinigungen nicht gelang, mußten dabei erhebliche Aktivitätsverluste in Kauf genommen werden. Auch die aus der deutschen Patentschrift 712 564 bekannte enzymaische Verdauung der Verunreinigungen befriedigte infolge der umständlichen Verfahrensweise nicht.Chem., 1933, pp. 439 to 441), raw heparin with hydrogen peroxide to treat. Apart from the fact that a complete removal of the colored impurities did not succeed, a considerable loss of activity had to be accepted. Also the enzymatic digestion known from German patent specification 712 564 the impurities were unsatisfactory due to the cumbersome procedure.

Schließlich ist es bekannt, Heparinpräparate dadurch zu reinigen, daß das Rohheparin mit stark basisch reagierenden Stoffen bei einem pH-Wert zwischen 12 und 14 behandelt wird (deutsche Patentschrift 835 925). Aber auch hierbei gelingt es nicht, wie schon die noch verbleibende Verfärbung des anfallenden Produktes zeigt, alle Verunreinigungen zu beseitigen. After all, it is known to purify heparin preparations by that the raw heparin with strongly basic reacting substances at a pH value between 12 and 14 is treated (German Patent 835 925). But even here it succeeds it does not, as the remaining discoloration of the resulting product shows, to remove all impurities.

Die Erfindung hat sich nun zum Ziel gesetzt, ein, von gefärbten Verunreinigungen freies Heparin herzustellen. The invention has now set itself the goal of removing colored impurities to produce free heparin.

Es wurde nunmehr festgestellt, daß die gefärbten Verunreinigungen in den Heparinsalzen durch ein bestimmtes Verfahren rasch und wirksam entfernt werden können, und zwar ohne wesentlichen Verlust des Heparins in seiner Potenz bzw. Wirksamkeit. Das Heparin kann nach in der Technik wohlbekannten Verfahren der Extraktion und Reinigung aus tierischen Lungengeweben isoliert werden. Das Endprodukt dieser Verfahren ist ein schmutzfarbenes bzw. isabellfarbiges Pulver. Dem erfindungsgemäßen Verfahren zufolge wird nun so vorgegangen, daß die wäßrigen Heparinzubereitungen mit Permanganat bei einem pH-Wert von etwa 8,0 bis 8,5 vorzugsweise bei 60 bis 900 C behandelt und die ausgefällten Manganverbindungen abgetrennt werden. Zur Herstellung der wäßrigen Ausgangslösung wird das gefärbte Pulver (welches normalerweise eine Potenz von etwa 100 Einheiten/mg besitzt )in Wasser aufgelöst, und vorzugsweise eine Lösung hergestellt, welche ungefähr 5000 Einheiten auf den Kubikzentimeter enthält. It has now been found that the colored impurities in the heparin salts can be removed quickly and effectively by a certain procedure can, without a significant loss of the heparin in its potency or effectiveness. The heparin can be extracted by methods well known in the art Purification can be isolated from animal lung tissues. The end product of this process is a dirt-colored or isabel-colored powder. The method according to the invention According to the procedure now that the aqueous heparin preparations with permanganate treated at a pH of about 8.0 to 8.5, preferably at 60 to 900 C and the precipitated manganese compounds are separated. For the production the aqueous The starting solution is the colored powder (which usually has a potency of about 100 units / mg) dissolved in water, and preferably prepared a solution, which contains about 5000 units per cubic centimeter.

Das zu verwendende Salz der Permangansäure richtet sich teilweise nach der Art des Kations, welches in dem fertigen Heparinsalz vorhanden sein soll. Normalerweise wird Heparin in der Form seines Natriumsalzes hergestellt, weshalb zu dessen Herstellung nach dem obigen Verfahren Natriumpermanganat zur Anwendung gelangen würde. Es ist jedoch verständlich, daß die vorliegende Erfindung keineswegs auf die Verwendung des Natriumsalzes der Permangansäure beschränkt ist. The permanganic acid salt to be used depends in part according to the type of cation which is to be present in the finished heparin salt. Usually, heparin is made in the form of its sodium salt, which is why for its production by the above process sodium permanganate is used would arrive. It should be understood, however, that the present invention is by no means is limited to the use of the sodium salt of permanganic acid.

Die zur Entfärbung erforderliche Menge an Permanganat ist Änderungen unterworfen, je nach der besonderen Partie des zu entfärbenden Heparinsalzes. The amount of permanganate required for discoloration is changes subject, depending on the particular batch of heparin salt to be decolorized.

Die genaue, zu verwendende Menge kann bestimmt werden, wenn man gleiche Teilmengen aus jeder Partie des Heparinsalzes mit zunehmenden Mengen einer Permanganatlösung behandelt, bis man eine Menge derselben ermittelt hat, welche gerade ausreicht, um unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen die Entfärbung zu bewirken. Es wurde festgestellt, daß bei der Anwendung von Natriumpermanganat es im allgemeinen notwendig ist, etwa 1 Mof Permanganat zu verwenden, um 100 Millionen Einheiten Heparinsalz zu entfärben.The exact amount to be used can be determined if one is equal Sub-amounts from each batch of the heparin salt with increasing amounts of a permanganate solution treated until a set of them has been determined which is just sufficient, to effect the discoloration under the conditions described above. It it was found that with the use of sodium permanganate it generally does is necessary about 1 mof Permanganate use to 100 million Units of heparin salt to decolorize.

Die Zeitdauer, während welcher die Reaktion vor sich gehen soll, wechselt mit der Natur der besonderen zu behandelnden Partie des Heparinsalzes, jedoch wurde festgestellt, daß unter den oben erwähnten Bedingungen die Entfärbung der Heparinsalziösung innerhalb 15 bis 30 Minuten nach Zusatz der Permanganatlösung vollendet ist. Es wurde weiterhin festgestellt, daß das Heparin während dieses Zeitraums nur wenig oder gar nicht an Potenz verliert. The length of time during which the reaction should take place, changes with the nature of the particular part of the heparin salt to be treated, however, it was found that discoloration under the above-mentioned conditions of the heparin salt solution within 15 to 30 minutes after adding the permanganate solution is accomplished. It was also found that the heparin was removed during this period loses little or no potency.

Der pH-Wert-Bereich, innerhalb dessen die Reaktion durchzuführen ist, wurde als kritisch befunden. The pH range within which to carry out the reaction is was found to be critical.

Wenn nämlich der pi-Wert merklich unter 8,0 liegt, dann ist die Entfärbung des Heparinsalzes nur unter Schwierigkeiten oder überhaupt nicht durchzuführen.Namely, if the pi value is well below 8.0, then the discoloration is of the heparin salt can only be carried out with difficulty or not at all.

Ist dagegen der p-Wert erheblich höher als 8,5, dann tritt als Begleiterscheinung der Entfärbung ein merklicher Verlust an Heparin infolge dessen Abbaus auf.If, on the other hand, the p-value is considerably higher than 8.5, then this occurs as a concomitant phenomenon the discoloration shows a noticeable loss of heparin as a result of its degradation.

Es wurde festgestellt, daß die Reaktion so durchgeführt werden muß, daß der anfängliche pn-Wert des Reaktionsgemisches sich innerhalb des Bereiches von etwa 8,0 bis 8,5 hält. It was found that the reaction must be carried out in such a way that that the initial pn value of the reaction mixture is within the range holds from about 8.0 to 8.5.

Auch die Temperatur, bei welcher die Reaktion durchgeführt werden soll, ist von Bedeutung. So wurde beispielsweise festgestellt, daß, wenn die Reaktion bei Zimmertemperatur stattfindet, das sich dabei ergebende Mangandioxyd in der Form sehr feiner Teilchen abgelagert wird, welche durch Filtrieren äußerst schwer abzutrennen sind. In der Tat kann es vorkommen, daß das Mangandioxyd in kolloidaler Form abgelagert wird, wobei es dann so schwer zu entfernen ist, daß eine Verunreinigung des isolierten Heparinsalzes eintritt. Also the temperature at which the reaction is carried out should matters. For example, it was found that when the reaction takes place at room temperature, the resulting manganese dioxide in the form very fine particles are deposited, which are extremely difficult to separate by filtration are. In fact it can happen that the manganese dioxide is deposited in colloidal form becomes so difficult to remove that contamination of the isolated Heparin salt occurs.

Wenn auch bei Anwendung entsprechender Filter und Filtrationsmethoden die Durchführung der Reaktion bei Zimmertemperatur grundsätzlich möglich ist, so wird vielfach ein Erwärmen doch vorzuziehen sein. Even if the appropriate filters and filtration methods are used the reaction can in principle be carried out at room temperature, so In many cases, heating will be preferable.

Wird nämlich die Reaktion bei erhöhter Temperatur durchgeführt, dann wird das Mangandioxyd in körniger Form abgelagert und ist dann leicht aus dem Produkt zu entfernen. Es wurde festgestellt, daß die Reaktion am besten bei einer Temperatur von etwa 800 C durchgefiihrt wird, aber selbstverständlich ist die vorliegende Erfindung nicht auf die Verwendung dieser besonderen Reaktionstemperatur beschränkt. If the reaction is carried out at an elevated temperature, then the manganese dioxide is deposited in granular form and is then easily out of the product to remove. It has been found that the reaction works best at one temperature of about 800 C is carried out, but the present invention is of course not limited to the use of this particular reaction temperature.

Nachdem die Entfärbung der Heparinsalzlösung in der oben beschriebenen Weise bewerkstelligt wurde, wird das frei gemachte Mangandioxyd durch Filtrieren isoliert, und das feste Heparinsalz wird nach in der Technik wohlbekannten Verfahren aus dem Filtrat gewonnen. So kann heispielsweise das wäßrige Filtrat in im Überschuß vorhandenen Alkohol gegossen werden, wobei das Heparinsalz als weißer fester Körper ausgefällt wird und dann aufgesammelt und getrocknet werden kann. After the decolorization of the heparin salt solution in the above-described Wise done, the liberated manganese dioxide is by filtering and the solid heparin salt is prepared by methods well known in the art obtained from the filtrate. For example, the aqueous filtrate can be used in excess Any alcohol present is poured, leaving the heparin salt as a white solid precipitates and can then be collected and dried.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren fallen farblose Heparinpräparate an, wobei gleichzeitig die Pyrogene bzw. fiebererregenden Stoffe soweit entfernt worden sind, daß auch für therapeutische Zwecke eine Nachbehandlung nicht notwendig ist. Für eine völlige Entfernung des Pyrogens aus dem Heparinsalz kann das Material einer weiteren Behandlung unterworfen werden; diese letztere kann nach bekannten Verfahren erfolgen, beispielsweise durch Behandlung mit Aktivkohle oder durch Filtrieren durch eine Gellulosepackung hindurch. Colorless heparin preparations are used in the method according to the invention at the same time the pyrogens or fever-causing substances are removed that post-treatment is not necessary even for therapeutic purposes is. For a complete removal of the pyrogen from the heparin salt, the material be subjected to further treatment; this latter can be known according to Procedures take place, for example by treatment with activated carbon or by filtration through a cellulose pack.

Wie die Ergebnisse von Vergleichsversuchen zeigen, weisen die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Heparinzubereitungen einen geringeren Gehalt an Verunreinigungen auf als die nach bekaml ten Verfahren hergestellten Produkte. Tatsächlich scheint der Grad der Verfärbung ein Anhaltspunkt für den Gehalt an Verunreinigungen zu sein, d. h. daß rein weißes Heparin bzw. farblose Heparinlösungen den höchsten Reinheitsgrad besitzen. As the results of comparative tests show, they prove the heparin preparations produced by the method according to the invention have a lower value salary of impurities than the products manufactured by the best methods. In fact, the degree of discoloration seems to be an indication of the level of impurities to be, d. H. that pure white heparin or colorless heparin solutions have the highest Possess degree of purity.

So zeigten Vergleichsversuche, daß die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Heparinprodukte gegenüber den nach dem Verfahren der deutschen Patentschrift 835 925 hergestellten Produkte - bei gleicher Aktivität und bei gleich geringem Pyrogengehalt - einen erheblich geringeren Gehalt an Eisen sowie an blutdrucksenkenden, histaminartig wirkenden Verunreinigungen aufweisen. Comparative tests showed that according to the invention Process produced heparin products compared to the process of the German Patent 835 925 products manufactured - with the same activity and with the same low pyrogen content - a significantly lower content of iron and antihypertensive, have histamine-like impurities.

Der Gehalt an blutdrucksenkenden, histaminartig wirkenden Verunreinigungen der Proben wurde dabei als »histaminartige Aktivität« durch einen In-vitro-Test, nämlich durch die Messung der Muskelkontraktion am extirpierten Ileum von Meerschweinchen bestimmt. Diese durch die jeweilige Probe verursachte Kontraktion wurde verglichen mit jener Kontraktion, die durch eine bekannte Menge von Histamin verursacht wurde. Dieser - Wert wurde ausgedrückt als Histaminäquivalente in y/mg. Eisengehalt Histaminartige Aktivität Probe (Teile Histaminäquivalente pro Million) in ,blmg G. P. 1 180 0,01 bis 0,02 G. P. 4 50 0,005 bis 0,01 G. P. 8 40 0,005 bis 0,01 G. P. 9 280 0,02 bis 0,03 Bei der Probe 1 handelt es sich um Rohheparin.The content of blood pressure-lowering, histamine-like impurities in the samples was determined as "histamine-like activity" by an in vitro test, namely by measuring the muscle contraction on the extirpated ileum of guinea pigs. This contraction caused by each sample was compared to the contraction caused by a known amount of histamine. This value was expressed as histamine equivalents in y / mg. Iron content histamine-like activity Sample (parts of histamine equivalents per million) in, blmg GP 1 180 0.01 to 0.02 GP 4 50 0.005 to 0.01 GP 8 40 0.005 to 0.01 GP 9 280 0.02 to 0.03 Sample 1 is raw heparin.

Bei der Probe 2 handelt es sich um Heparin, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren aus dem Heparin gemäß Probe 1 hergestellt wurde. The sample 2 is heparin, which according to the invention Method from which heparin according to sample 1 was produced.

Die Probe 3 ist ein Produkt, das durch Behandlung des Materials gemäß Probe 1, nach dem Verfahren der deutschen Patentschrift 835 925 und anschließende Behandlung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnen wurde. The sample 3 is a product obtained by treating the material according to Sample 1, according to the method of German patent specification 835 925 and subsequent Treatment was obtained by the method according to the invention.

Die Probe 4 ist ein Produkt, wie es durch Behandlung eines Materials gemäß Probe 1 nach dem Verfahren der deutschen Patentschrift 835 925 gewonnen wurde. Sample 4 is a product as obtained by treating a material according to sample 1 was obtained by the method of German patent specification 835 925.

Das nachstehende, den Erfindungsbereich in keiner Weise einschränkende Beispiel, erläutert die vorliegende Erfindung des näheren. The following does not limit the scope of the invention in any way Example explains the present invention in more detail.

Beispiel 300 g Heparin (in der Form seines Natriumsalzes) mit einer Potenz von 100 Einheiten/mg werden in 4 1 destillierten Wassers aufgelöst, und die Lösung wird durch ein Bett von Kieselgur filtriert, wobei die letztere mehrmals mit kleinen Teilmengen von je 100 cm8 destillierten Wassers ausgewaschen wird. Das Volumen der mit dem Filtrat vereinigten Waschlösungen wird durch den Zusatz destillierten Wassers auf 6 1 gebracht, worauf die Lösung rasch auf 800 C erhitzt wird. Der pn-Wert der heißen Lösung wird durch den Zusatz einer 5n-Natriumhydroxydlösung auf 8,0 bis 8,5 eingestellt, worauf 100cm8 einer 40°/igen Gewicht/Volumen - Lösung von Natriumpermanganat unter kräftigem Rühren hinzugesetzt werden. Man läßt die Lösung 30Minufen lang stehen, wobei die Temperatur auf 800 C gehalten wird. Das Produkt wird auf etwa 400 C gekühlt, und das Mangandioxyd, welches sich inzwischen ausgeschieden hat, wird durch Filtrieren durch ein Bett von Kieselgur hindurch isoliert. Das Kieselgur-Filterbett wird in 11 destillierten Wassers suspendiert, und die Suspension wird auf 800 C erhitzt, wobei der pH-Wert - falls notwendig -auf 8,0 bis 8,5 eingestellt wird. Die Suspension wird auf 400 C gekühlt und filtriert, und das Filterbett wird mit zwei Teilmengen von je 250 cm3 destillierten Wassers ausgewaschen. Das Filtrat wird mit demjenigen aus der Hauptmasse der Reaktion vereinigt, worauf die Lösung auf einen pE-Wert von 6,5 eingestellt wird. Der Lösung wird ausreichend Natriumchlorid hinzugesetzt, um der fertigen Lösung eine Konzentration von 1 O/o zu verleihen. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wird durch Filtrieren geklärt, und das Filtrat wird unter Rühren in das Vierfache seines Volumens 950/obigen Alkohols gegossen. Der sich ausscheidende feste Stoff wird durch Filtrieren isoliert und im Vakuum bei 350 C getrocknet. Man erhält auf diese Weise Heparin (als das Natriumsalz) in der Form eines weißen Pulvers mit einer Potenz von etwa 100 Einheiten/mg. Example 300 g of heparin (in the form of its sodium salt) with a Potency of 100 units / mg are dissolved in 4 liters of distilled water, and the Solution is filtered through a bed of kieselguhr, the latter several times is washed out with small portions of 100 cm8 each of distilled water. That Volume of the washing solutions combined with the filtrate is distilled by the addition Brought water to 6 l, whereupon the solution is quickly heated to 800.degree. The pn value the hot solution is by the addition of a 5N sodium hydroxide solution to 8.0 to 8.5 adjusted, whereupon 100 cm8 of a 40% weight / volume solution of sodium permanganate be added with vigorous stirring. The solution is left to stand for 30 minutes, the temperature being kept at 800.degree. The product will be on chilled about 400 C, and the manganese dioxide, which has been excreted in the meantime is isolated by filtering through a bed of kieselguhr. The kieselguhr filter bed is suspended in 11 distilled water and the suspension is brought to 800.degree heated, the pH - if necessary - is adjusted to 8.0 to 8.5. The suspension is cooled to 400 C and filtered, and the filter bed is with Washed out two aliquots of 250 cm3 each of distilled water. The filtrate will combined with that from the bulk of the reaction, whereupon the solution occurs a pE value of 6.5 is set. The solution becomes sufficient sodium chloride added to give the final solution a concentration of 1 O / o. The solution thus obtained is clarified by filtration, and the filtrate is poured into four times its volume 950 / above alcohol with stirring. The solid substance which separates out is isolated by filtration and in vacuo dried at 350 ° C. In this way, heparin (as the sodium salt) is obtained in in the form of a white powder with a potency of about 100 units / mg.

PATENTANSPROCHE: 1. Verfahren zur Herstellung reiner, therapeutisch verwendbarer Heparinpräparate, dadurch gekennzeichnet, daß wäßrige Heparinzubereitungen mit Permanganat bei einem p-Wert von etwa 8,0 bis 8,5 vorzugsweise bei. 60 bis 900 C behandelt und die ausgefällten Manganverbindungen abgetrennt werden. PATENT CLAIM: 1. Process for making pure, therapeutic usable heparin preparations, characterized in that aqueous heparin preparations with permanganate at a p-value of approximately 8.0 to 8.5, preferably at. 60 to 900 C treated and the precipitated manganese compounds are separated.

Claims

2. The method according to claim 1, characterized in that the permanganate the sodium permanganate and preferably in an amount of 1 mole per 100 million Units of heparin is used.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the heparin after separation of the manganese compounds from the aqueous solutions in in a known manner z. B. isolated by the addition of sodium chloride and alcohol will. ~~~~~~~ Publications taken into consideration: German Patent Specifications No. 712 564, 835 925.