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DE10330717A1 - Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis von Analyt - Google Patents

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DE10330717A1
DE10330717A1 DE2003130717 DE10330717A DE10330717A1 DE 10330717 A1 DE10330717 A1 DE 10330717A1 DE 2003130717 DE2003130717 DE 2003130717 DE 10330717 A DE10330717 A DE 10330717A DE 10330717 A1 DE10330717 A1 DE 10330717A1
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Ceased
Application number
DE2003130717
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English (en)
Inventor
Wolfgang Dr. Fritzsche
Robert MÖLLER
Uwe Klenz
Michael Dr. Kiehntopf
Michael Prof. Dr. Köhler
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Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Institut fuer Physikalische Hochtechnologie eV
Original Assignee
Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Institut fuer Physikalische Hochtechnologie eV
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Publication date
Application filed by Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU, Institut fuer Physikalische Hochtechnologie eV filed Critical Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
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Priority to PCT/EP2004/007249 priority patent/WO2005003772A1/de
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Nachweis von Analyt. DOLLAR A Die Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis von Analyt anzugeben, die die Nachteile des Standes der Technik überwinden und die insbesondere weder zwei spezifische Bindungspartner (= sandwich) für den nachzuweisenden Analyt benötigen noch eine aufwendige vorherige Markierung des Analyts einer bestimmten Moleküleklasse erfordern, wird dadurch gelöst, dass die Vorrichtung zum Nachweis von Analyt in einer Messprobe aus einem Trägersubstrat, das mit wenigstens zwei Elektroden versehen ist, die einen Zwischenraum umgeben, der immobilisiert spezifische Bindungspartner aufweist, die befähigt sind, komplementär zugehörigen Analyt direkt oder indirekt zu koppeln, wobei der Zwischenraum in seiner Breite und Tiefe so bemessen ist, dass Bindungsereignisse der immobilisierten spezifischen Bindungspartner mit dem komplementär zugehörigen Analyt möglich sind, wobei nach erfolgten Bindungsereignissen der komplementär zugehörige Analyt gezielt mit elektrisch leitfähigem Nachweissubstrat beladbar ist und einen elektrischen Stromfluss über die im Zwischenraum bei an den Elektroden angelegter Spannung ermöglicht, wobei die Elektroden mit einer Messeinheit in Verbindung stehen, so dass der Stromfluss permanent detektierbar ist, besteht.

Description

  • Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis von Analyt.
  • Eine Vorrichtung zum Nachweis von Analyten mittels analytspezifischer Reaktion nach Festphasenbindung ist in Form eines Biochips bspw. aus der Schrift WO 01/14425 A1 bekannt.
  • Bei diesem handelt es sich um einen Protein-Chip zur Massendiagnostik oder Analyse von Testproben, welcher aus einem Festsubstrat besteht, auf dem eine Vielzahl von Spots aus Testproteinen in einer definierten Anordnung fixiert sind, wobei diese Proteine der Gruppe von Antigenen, Rezeptoren und Enzymen zuzuordnen sind und die Probenproteine auf der Oberfläche über ihre Aminogruppen an die funktionellen Gruppen der auf der Oberfläche aufgebrachten Chemikalien gebunden sind.
  • Der Nachteil dieses Protein-Chips ist, daß bei dem Aufbringen der jeweiligen Spots ein Übersprechen der einzelnen Protein-Proben erfolgen kann, was zur Unbrauchbarkeit des Chips bzw. zu nicht verwertbaren Testergebnissen führt.
  • Aus der Schrift US 5,077,210 ist ein Verfahren zur Herstellung von Biochips bekannt, bei dem auf Festoberflächen Silane mit endständigen Thiolgruppen versehen sind, welche wiederum über entsprechende Cross-Linker mit Aminogruppen bioaktiver Moleküle reagieren können.
  • Der Nachteil dieses Protein-Chips ist, daß ausschließlich eine Kopplung der Biomoleküle über deren Aminogruppe erfolgen kann, was bei der Kopplung von Antikörpern dazu führt; daß die antigenbindende, NH2-tragende Region blockiert wird, wodurch keine Antigen-Antikörperreaktion mehr stattfinden kann.
  • Weiterhin ist bekannt, daß man an Kohlenhydratresten oxidierte Antikörper über deren Aldehydreste gerichtet an Oberflächen binden kann (Qian, W. P., Yao, D. F., Xu, B., Yu, F., Lu, Z. H., and Knoll, W., 1999: "Atomic force microscopic studies of site-directed immobilization of antibodies using their carbohydrate residues." Chemistry of Materials, 11(6), 1399–1401). Der Nachteil dieser Oberflächen besteht darin, daß keine Separierung von Oberflächenbereichen erreicht wird, so daß eine Spotbarkeit von verschiedenen Proben ohne Proben-Übersprechen nicht gegeben ist.
  • Der Nachteil aller dieser bekannten Biochips ist, dass sie nicht elektrisch, sondern optisch ausgelesen werden.
  • So ist bspw. für das optische Auslesen bekannt, daß eine Automatisierung der Bildanalyse auf der Grundlage der Chip-Technologie durch Auslesen der verschiedenen Microarray-Strukturen erfolgen kann. Die meisten verfügbaren Technologien beruhen auf der Detektion von fluoreszenzmarkierten Bindungspaaren, die in einer spezifischen Art auf der Chip-Oberfläche festgehalten sind, wobei die Fluoreszenzdetektion durch optisches Auslesen der reaktiven Zentren des Microarrays ausgeführt wird. Der Gebrauch von fluoreszierenden oder chemilumineszierenden Proben findet dabei wie in den zuvor beschriebenen klassischen Methoden Anwendung und wird mit CCD-Imaging kombiniert (Eggers, M. et al., 1996: Professional Program Proceedings. Electro '96. IEEE, New York, NY, USA, 364 pp.).
  • Aus der Schrift DE 198 60 547.1-52 ist ein Affinitätssensor für den Nachweis spezifischer Bindungsereignisse bestehend aus einem Trägersubstrat, das mit wenigstens zwei Elektroden versehen ist, die einen Zwischenraum umgeben, der immobilisiert spezifische Bindungspartner aufweist, die befähigt sind, komplementär zugehörige Bindungspartner direkt oder über weitere spezifische Bindemoleküle zu koppeln, wobei die komplementär zugehörigen Bindungspartner mit elektrisch leitfähigen Partikeln direkt oder über verbindende Moleküle beladen sind und der Zwischenraum in seiner Breite und Tiefe so bemessen ist, daß Bindungsereignisse der immobilisierten spezifischen Bindungspartner mit den komplementär zugehörigen Bindungspartnern möglich sind und die Kopplung der Bindungspartner einen elektrischen Stromfluß über die im Zwischenraum positionierten leitfähigen bei an den Elektroden angelegter Spannung ermöglicht, wobei die Elektroden mit eine Meßeinheit in Verbindung stehen, so daß der Stromfluß permanent detektierbar ist.
  • Der Nachteil dieses elektrisch auslesbaren Chips ist, dass die Markierung im allgemeinen entweder an alle Moleküle der interessierenden Substanzklasse angebracht werden müssen, oder aber es wird ein Sandwich-Ansatz benutzt, bei dem ein weiteres Molekül, das eine Markierung trägt, spezifisch an das nachzuweisende und schon an der Oberfläche gebundene Analyt bindet. Dieses Sandwich-Verfahren ist durch die notwendige doppelte spezifische Bindung kompliziert, sowohl durch die zusätzlichen Schritte als auch infolge des Bedarfs an einem zweiten Molekül, welches an das gesuchte bindet.
  • Bei der anderen Methode, der Markierung aller Moleküle eines vorliegenden Ensembles (wie z.B. cDNA bei Expressionsstudien), werden Verfahren wie die Polymerasekettenreaktion (PCR) benutzt, durch die sich in diese Moleküle eine Markierung einfügen lässt. Diese Verfahren sind aber nur für ganz spezielle Molekülklassen einsetzbar, und zudem meist aufwendig und teuer. Gerade in Hinblick auf neue Markierungsmethoden, wie z.B. der Markierung mit kolloidalen Metallpartikeln für einen elektrischen Nachweis, ist diese Methode nur schwer bzw. gar nicht anwendbar.
  • Hinzu kommt, dass beide Methoden den entscheidenden Nachteil aufweisen, dass die Bindungsreaktion durch die Modifikation eines Bindungspartners beinflusst bzw. verändert wird und es nicht möglich ist, mit unmodifizierten Molekülen zu arbeiten, die diese Einflüsse nicht aufweisen würden.
  • Ein schneller und effizienter Nachweis von Biomolekülen ist gerade durch die rasch anwachsenden Zahl bekannter Sequenzen aus Genom und Proteom ein zentrales Problem der modernen Lebenswissenschaften geworden.
  • Eine wichtige Methode zum Nachweis von biologisch interessanten Molekülen beruht auf der spezifischen Bindung dieser Analyt-Moleküle an einem Bindungspartner. Wenn dieser analytspezifische Binder zur Vereinfachung der Auslesung vorher auf einem festen Substrat befestigt wurde, können nach der Bindung durch Waschschritte alle anderen Moleküle entfernt werden. In einem anschließenden Schritt wird nun die Anwesenheit des gesuchten Analyten am Substrat nachgewiesen.
  • Diese kann markierungsfrei durch Bestimmung der Änderung bestimmter physikalischer Eigenschaften des Substrates durch die Anbindung erfolgen, wie z.B. Massezunahme (Quarz-Kristallwaage oder Cantilever-basierte Messungen) oder Änderung optischer (dielektrischer) Eigenschaften (surface plasmon resonance) oder Änderung elektrochemischer Eigenschaften.
  • Diese markierungsfreien Methoden verlangen aber im allgemeinen eine komplizierte Auswertung aufgrund eines komplexen Messsignals, damit sind sie teuer und aufwendig.
  • Eine einfachere Auswertung und zudem oft eine Erhöhung der Empfindlichkeit ist durch den Einsatz von Markierungen (label) zu erreichen, von denen radioaktive und fluoreszente Markierungen die Bekanntesten sind.
  • Daneben gibt es aber auch Farbstoffe oder kolloidale Metallpartikel. Die Markierungen werden im allgemeinen entweder an alle Moleküle der interessierenden Substanzklasse angebracht oder aber es wird ein Sandwich-Ansatz benutzt, bei dem ein weiteres Molekül, eine Markierung tragend, spezifisch an das nachzuweisende und schon an der Oberfläche gebundene Analyt bindet.
  • Dieses Sandwichverfahren ist kompliziert durch die notwendige doppelte spezifische Bindung, sowohl durch die zusätzlichen Schritte als auch infolge des Bedarfs an einem zweiten Molekül welches an das gesuchte bindet.
  • Bei der anderen Methode, der Markierung aller Moleküle eines vorliegenden Ensembles (wie z.B. cDNA bei Expressionsstudien), werden Verfahren wie PCR benutzt, durch die sich in diese Moleküle eine Markierung einfügen lässt.
  • Diese Verfahren sind aber nur für ganz spezielle Klassen einsetzbar, und zudem meist aufwendig und teuer. Gerade in Hinblick auf neue Markierungsmethoden, wie z.B. der Verwendung kolloidaler Metallpartikel für einen elektrischen Nachweis, sind derartige Methoden nur schwer oder gar nicht anwendbar.
    •
  • Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis von Analyt anzugeben, die die Nachteile des Standes der Technik überwinden und die insbesondere weder zwei spezifische Bindungspartner (= sandwich) für den nachzuweisende Analyt benötigen noch eine aufwendige vorherige Markierung des Analyts einer bestimmten Moleküleklasse erfordern.
  • Gemäß der Erfindung wird diese Aufgabe durch die kennzeichnenden Merkmale des ersten bzw. dritten Patentanspruchs gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen werden durch die untergeordneten Ansprüche 2 bzw. 4 bis 6 angegeben.
  • Das Wesen der Erfindung besteht darin, dass durch den elektrischen Nachweis die Detektion vereinfacht wird, da anstelle eines optischen Aufbaus zur Abbildung und eines Bildverarbeitungsalgorithmus zur Konvertierung der analogen optischen Signale in ein digitales Ergebnis und viel direktere Umwandlung des elektrischen Signals in eine digitale Information erfolgen kann, so dass der Einsatz von robusteren Auslesegeräten ermöglicht wird, die wiederum auch ausserhalb des Labors und bspw. direkt vor Ort (z.B. point of care-Diagnostik) betrieben werden könnten.
  • Die erfindungsgemäße Kombination einer spezifischen Bindung zwischen verschiedenen Molekülklassen von Analyt und Bindungsmolekülen mit einem nachfolgenden Klassenspezifischen Markierungsschritt des Analyts erlaubt markierungsbasierte Affinitätstests ohne zweiten Analytspezifische Bindungspartner oder vorherige Markierungsroutinen.
  • Wenn derartige Reaktionen für die spezifische Bindung des gesuchten Analyts an den elektrisch auszulesenden Chip benutzt werden, ergeben sich überraschenderweise ganz neue Möglichkeiten für den anschließenden Markierungsschritt. Dieser muss nicht, wie nach dem Stand der Technik üblich, molekülspezifisch erfolgen, sondern kann substanz- (Molekülklassen-) spezifisch durchgeführt werden, ohne dass die Spezifität des Signals leidet.
  • Aufgrund der Erfindung sind diejenigen bekannten, Molekülklassen-spezifischen Markierungsmethoden, wie sie beispielsweise für die Auswertung von gel-elektrophoretischen Verfahren bei Proteinen als Silberfärbung zum Einsatz kommen, auch für die Chiptechnologie anwendbar.
    •
  • Die Erfindung wird nachstehend an Hand der Zeichnungen und Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigt:
  • 1a: eine Ausführungsform der erfindungsgemäße Anordnung in schematischer Darstellung,
  • 1b: eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Anordnung in schematischer Darstellung,
  • 2a bis c: eine schematische Darstellung der analytspezifischen Nachweisschritte,
  • 3a bis c: eine schematische Darstellung der analytspezifischen Markierungsreaktionen.
  • Wie in 1 dargestellt, besteht die Vorrichtung aus einem Trägersubstrat, das mit wenigstens zwei Elektroden versehen ist, die einen Zwischenraum umgeben, der immobilisierte spezifische Bindungspartner aufweist, die befähigt sind, komplementär zugehörigen Analyt direkt oder indirekt zu koppeln, wobei der Zwischenraum in seiner Breite und Tiefe so bemessen ist, daß Bindungsereignisse der immobilisierten spezifischen Bindungspartner mit den komplementär zugehörigen Analyt möglich sind, wobei nach erfolgten Bindungsereignissen der komplementär zugehörige Analyt spezifisch mit elektrisch leitfähigen Nachweissubstrat beladbar ist und einen elektrischen Stromfluß über die im Zwischenraum bei an den Elektroden angelegter Spannung ermöglicht, wobei die Elektroden mit einer in der 1 nicht dargestellten Meßeinheit in Verbindung stehen, so daß der Stromfluß permanent detektierbar ist.
  • Der Nachweis von Analyt 4 in einer Meßprobe erfolgt auf dem planaren Substrat 1, indem analytspezifische Bindungspartner 2 in einem oder mehreren Nachweisfeldern 3 immobilisiert werden, sodann die Meßprobe in Kontakt mit den Nachweisfeldern 3 gebracht wird und anschliessend nach einem Waschvorgang zum Entfernen unspezifisch gebundener Analyt 4 das Vorhandensein und/oder die Menge des nachzuweisenden Analyt 4 durch elektrische Auswertung der Nachweisfelder 3 ermittelt wird, wobei der Analyt 4 und die Analyt 4-spezifischen Bindungspartner 2 zu verschiedenen, durch Markierungsreaktionen unterscheidbaren Verbindungsklassen gehören (2a bis c).
  • Der am immobilisierten Analyt 4-spezifischen Bindungspartner 2 gebundene Analyt 4 wird dabei in einer ein- oder mehrstufigen Verbindungsklassen-spezifischen Reaktion mit Markierungssubstrat 5 markiert und dieses Markierungssubstrat 5 anschließend mit elektrischen Strom beaufschlagt, so dass ein elektrisches Auslesen der Analyt 4-Bindungspartner 5-Bindungen möglicht ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die, den Analyt 4 enthaltende Meßprobe in Kontakt mit Nachweisfeldern 3 gebracht und anschliessend nach einem Waschvorgang zum Entfernen unspezifisch gebundenen Analyts 4 das Vorhandensein und/oder die Menge der nachzuweisenden Analyten 4 durch elektrische Auswertung der Nachweisfelder ermittelt, wobei der Analyt 4 und die analytspezifische Bindemoleküle 2 zu verschiedenen, durch Markierungsreaktionen unterscheidbaren Verbindungsklassen gehören.
  • Dabei handelt es sich bei den analytspezifischen Bindemolekülen 2 um DNA, RNA, PNA oder deren Derivate und bei dem Analyt 4 um Proteine, Hormone, Vitamine, Zucker oder deren Derivate bzw. um Therapeutika.
  • Besonders bevorzugt erfolgt die erfindungsgemäße analytspezifische Markierungsreaktionen durch eine Anlagerung von Metallatomen an den Analyt 4, wobei nach dieser Anlagerungsreaktion, die direkt oder indirekt möglich ist, eine Verstärkungsreaktion der Art, dass die Metallatome als Keime für weitere Materialabscheidung gleicher oder anderer Metalle dienen, so dass eine optimale elektrisch Detektion erfolgen kann. Als Metalle werden dabei bspw. Gold oder Silber verwendet (3a bis c).
  • Besonders vorteilhaft sind dabei die einzelnen Nachweisfelder 3 mit vorstrukturierten metallischen Elektroden 6 oder während des Auslesevorgangs aufgesetzten Elektroden 6 elektrisch ausgelesen versehen, so dass die Anwesenheit des Analyt 4 anhand einer Analyt 4-spezifischen Abscheidung von leitfähigem Material auf den jeweiligen Nachweisfeldern 3 durch eine messbare, elektrische Leitfähigkeit der Oberfläche dieser Nachweisfelder 3 nachweisbar ist.
  • 1. Ausführungsbeispiel:
  • DNA zur Bindung von Proteinen am Beispiel des Thrombins
  • Zur Reinigung werden Chipsubstrate mit mikrostrukturierten Elektrodenanordnungen jeweils 10 min. in Aceton, Ethanol und Wasser gereinigt. Die Aktivierung der Oberflächen erfolgt für eine Stunde bei 70°C in einer Lösung aus konz. Ammoniaklösung: Wasserstoffperoxid: Wasser im Verhältnis 1:1:1 (v/v/v). Sind keine Gold- oder andere metallische Strukturen auf der Chipoberfläche vorhanden kann die konz. Ammoniaklösung gegen konz. Salzsäure ersetzt werden. die Aktivierung erfolgt dann bei Raumtemperatur für 10 min. Anschließend werden die Chips gründlich mit dest. Wasser gewaschen, um alle Reste der Aktivierungslösung zu entfernen, und für 10 min bei 80°C getrocknet. Zur Weiterverarbeitung sollten die Chips absolut trocken sein.
  • Die Modifizierung der Oberfläche der Chips erfolgt in einer 10 mM Glycidoxypropyltrimethoxysilanlösung in trockenem Toluol. Die Inkubation sollte mindestens 4 Stunden bei 70°C betragen. Danach werden die Chips für jeweils 2 × 5 min. gründlich in Toluol, Ethanol und abschließend in Wasser gespült.
  • Zur Immobilisation auf den modifizierten Chipoberflächen sollte die Konzentration der 3' oder 5'aminomodifizierten Oligonucleotide zwischen 5 und 50μM, in 0,1 M Kaliumhydroxidlösung, liegen. Die so vorbereiteten Oligolösungen werden nun im angestrebten Muster auf die Chips aufgetragen und für mindestens 4 Stunden bei 37°C in einer Feuchtkammer inkubiert und anschließend bei 80°C eingetrocknet. Die Chips werden nun gewaschen um ungebundene Oligonucleotide zu entfernen, und die Oberfläche außerdem geblockt, um eine weitere Bindung von Molekülen zu verhindern. Die Waschschritte und -lösungen sind Folgende:
    • – 5 min in 0,1 % Triton X-100
    • – 2 × 2 min in HCl pH 4
    • – 10 min in 100mM KCl
    • – 1 min in dest. Wasser
    • – 15 min 50mM Ethanolamin 0,1 % SDS in 0,1 M Tris, pH 9,0
    • – 1 min in dest. Wasser
  • Danach werden die Chips unter einem Stickstoffstrom getrocknet.
  • Die Inkubation mit der Thrombin Lösung erfolgt bei Raumtemperatur in einer Feuchtkammer für 2 Stunden. Die bisher nachgewiesenen Thrombinkonzentrationen reichen von 1 μg/ml bis 0,1 ng/ml in PBS pH 7,4. Die Chips werden dann 5 min in PBS pH 7,4, 0,03 % Tween 20 und 2 × 5 min in PBS pH 7,4 gewaschen und unter Stickstoff getrocknet. Nun werden die Chips mit negativ geladenem Gold-Sol bedeckt und für mindestens 2 Stunden inkubiert. Anschließend werden die Chips kurz mit dest. Wasser gespült und unter Stickstoff getrocknet.
  • Zur Silberverstärkung werden 80 mg Silberacetat in 40 ml dest. Wasser und 200 mg Hydrochinon in Citratpuffer pH 3,8 gelöst. Nun werden beide Lösungen 1:1 gemischt und die Chips in diese Lösung getaucht und für max. 10 min in dieser Lösung unter Lichtabschluß gelassen. Die Reaktion wird durch Waschen mit dest. Wasser gestoppt. Der Silberverstärkungschritt kann so oft wiederholt werden bis die abgeschiedene Silberschicht für einen elektrischen Nachweis ausreicht. Dieser erfolgt auf Chipsubstraten entweder mit Messspitzen oder in einem Auslesegerät.
  • 2. Ausführungsbeispiel
  • PNA (Peptide nucleic acid)-DNA
  • Zur Reinigung werden die Chipsubstrate jeweils 10 min. in Aceton, Ethanol und Wasser gereinigt. Die Aktivierung der Oberflächen erfolgt für eine Stunde bei 70°C in einer Lösung aus konz. Ammoniaklösung: Wasserstoffperoxid: Wasser im Verhältnis 1:1:1 (v/v/v). Sind keine Gold- oder andere metallische Strukturen auf der Chipoberfläche vorhanden kann die konz. Ammoniaklösung gegen konz. Salzsäure ersetzt werden. die Aktivierung erfolgt dann bei Raumtemperatur für 10 min.. Anschließend werden die Chips gründlich mit dest. Wasser gewaschen, um alle Reste der Aktivierungslösung zu entfernen, und für 10 min bei 80°C getrocknet. Zur Weiterverarbeitung sollten die Chips absolut trocken sein.
  • Die Modifizierung der Oberfläche der Chips erfolgt in einer 10 mM Glycidoxypropyltrimethoxysilanlösung in trockenem Toluol. Die Inkubation sollte mindestens 4 Stunden bei 70°C betragen. Danach werden die Chips für jeweils 2 × 5 min. gründlich in Toluol, Ethanol und abschließend in Wasser gespült.
  • Zur Immobilisation auf den modifizierten Chipoberflächen sollte die Konzentration der 3' oder 5'aminomodifizierten PNA zwischen 5 und 50μM, in 0,1M Kaliumhydroxidlösung, liegen. Die so vorbereiteten PNAlösungen werden nun im angestrebten Muster auf die Chips aufgetragen und für mindestens 4 Stunden bei 37°C in einer Feuchtkammer inkubiert und anschließend bei 80°C eingetrocknet. Die Chips werden nun gewaschen um ungebundene PNA zu entfernen, und die Oberfläche außerdem geblockt, um eine weitere Bindung von Molekülen zu verhindern. Die Waschschritte und -lösungen sind
    • – 5 min in 0,1 % Triton X-100
    • – 2 × 2min in HCl pH 4
    • – 10 min in 100mM KCl
    • – 1 min in dest. Wasser
    • – 15 min 50mM Ethanolamin 0,1 % SDS in 0,1 M Tris, pH 9,0
    • – 1 min in dest. Wasser
  • Danach werden die Chips unter einem Stickstoffstrom getrocknet.
  • Die Chips werden nun in einer Feuchtkammer bei 40°C für mindestens 2 Stunden mit der DNA-Lösung inkubiert und anschließend mit Puffer gewaschen. Nun werden die Chips mit positiv geladenem Gold-Sol bedeckt und für mindestens 2 Stunden inkubiert. Anschließend werden die Chips kurz mit dest. Wasser gespült und unter Stickstoff getrocknet. Zur Silberverstärkung werden 80 mg Silberacetat in 40 ml dest. Wasser und 200 mg Hydrochinon in Citratpuffer pH 3,8 gelöst. Nun werden bide Lösungen 1:1 gemischt und die Chips in diese Lösung getaucht und für max. 10 min in dieser Lösung unter Lichtabschluß gelassen. Die Reaktion wird durch waschen mit dest. Wasser gestoppt. der Silberverstärkungschritt kann so oft wiederholt werden bis die abgeschiedene Silberschicht für einen elektrischen Nachweis ausreicht.
  • Dieser erfolgt auf Chipsubstraten entweder mit Messspitzen oder in einem Auslesegerät.
    • 1
    planaren Substrat
    2
    Bindungspartner
    3
    Nachweisfelder
    4
    Analyt
    5
    Markierungssubstrat
    6
    Elektroden

Claims (8)

  1. Vorrichtung zum Nachweis von Analyt in einer Meßprobe bestehend aus einem Trägersubstrat, das mit wenigstens zwei Elektroden versehen ist, die einen Zwischenraum umgeben, der immobilisiert spezifische Bindungspartner aufweist, die befähigt sind, komplementär zugehörigen Analyt direkt oder indirekt zu koppeln, wobei der Zwischenraum in seiner Breite und Tiefe so bemessen ist, daß Bindungsereignisse der immobilisierten spezifischen Bindungspartner mit den komplementär zugehörigen Analyt möglich sind, dadurch gekennzeichnet, daß nach erfolgten Bindungsereignissen der komplementär zugehörige Analyt spezifisch mit elektrisch leitfähigen Nachweissubstrat beladbar ist und einen elektrischen Stromfluß über die im Zwischenraum bei an den Elektroden angelegter Spannung ermöglicht, wobei die Elektroden mit eine Meßeinheit in Verbindung stehen, so daß der Stromfluß permanent detektierbar ist.
  2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Analyt und Bindungspartner verschiedenen Substanzklassen angehören.
  3. Verfahren zum Nachweis von Analyt (4) in einer Meßprobe, bei dem auf einem planaren Substrat (1) analytspezifische Bindungspartner (2) in einem oder mehreren Nachweisfeldern (3) immobilisiert werden, sodann die Meßprobe in Kontakt mit den Nachweisfeldern (3) gebracht wird und anschliessend nach einem Waschvorgang zum Entfernen unspezifisch gebundener Analyt (4) das Vorhandensein und/oder die Menge des nachzuweisenden Analyt (4) durch elektrische Auswertung der Nachweisfelder (3) ermittelt wird, dadurch gekennzeichnet, dass Analyt (4) und analytspezifische Bindungspartner (2) zu verschiedenen, durch Markierungsreaktionen unterscheidbaren Verbindungsklassen gehören, dass der am immobilisierten analytspezifischen Bindungspartner (2) gebundene Analyt (4) in einer ein- oder mehrstufigen Verbindungsklassen-spezifischen Reaktion mit Markierungssubstrat (5) markiert wird und dass dieses Markierungssubstrat (5) ein elektrisches Auslesen der Analyt(4)-Bindungspartner (5)-Bindungen ermöglicht.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyt (4) enthaltende Meßprobe in Kontakt mit den Nachweisfeldern (3) gebracht wird und anschliessend nach einem Waschvorgang zum Entfernen unspezifisch gebundenen Analyts (4) das Vorhandensein und/oder die Menge der nachzuweisenden Analyten (4) durch elektrische Auswertung der Nachweisfelder ermittelt wird, wobei der Analyt (4) und analytspezifische Bindemoleküle (2) zu verschiedenen, durch Markierungsreaktionen unterscheidbaren Verbindungsklassen gehören.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass als analytspezifische Bindemoleküle (2) DNA, RNA, PNA oder deren Derivate dieser und als Analyt (4) Proteine, Hormone, Vitamine, Zucker deren Derivate dieser oder Therapeutika verwendet werden.
  6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass bei der analytspezifischen Markierungsreaktionen eine Anlagerung von Metallatomen an das Analyt (4) erfolgt, welche direkt oder nach einer Verstärkungsreaktion, bei denen die Metallatome als Keime für weitere Materialabscheidung dienen, elektrisch detektiert werden.
  7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen Nachweisfelder (3) mit vorstrukturierten metallischen Elektroden (6) oder während des Auslesevorgangs aufgesetzten Elektroden (6) elektrisch ausgelesen werden, indem die Anwesenheit des Analyt (4) anhand einer Analyt (4)-spezifischen Abscheidung von leitfähigem Material auf den jeweiligen Nachweisfeldern (3) zur messbaren elektrischen Leitfähigkeit der Oberfläche dieser Nachweisfelder (3) führt.
  8. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass eine Vorrichtung gemäß Anspruch 1 verwendet wird.
DE2003130717 2003-07-03 2003-07-03 Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis von Analyt Ceased DE10330717A1 (de)

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