DE10326302A1 - Bi-fluorophore-labeled probes for the detection of nucleic acids - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft 5',3'-Bi-Fluorophor-markierte Sonden zum Nachweis von Analyten, insbesondere von Nukleinsäuren, insbesondere für die konfokale Fluoreszenzspektroskopie.The present invention relates to 5 ', 3'-bi-fluorophore-labeled probes for the detection of analytes, in particular of nucleic acids, in particular for confocal fluorescence spectroscopy.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft 5'-3'-Bi-Fluorophor-markierte Sonden zum Nachweis von Analyten, insbesondere von Nukleinsäuren, insbesondere für die konfokale Fluoreszenzspektroskopie.The The present invention relates to 5'-3'-bi-fluorophore-labeled Probes for the detection of analytes, in particular nucleic acids, in particular for the confocal fluorescence spectroscopy.
Der Nachweis von Nukleinsäuremolekülen in einer Probe erfolgt üblicherweise durch Hybridisierung unter Verwendung von spezifischen Sonden. Eine Möglichkeit zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung der Hybridisierungsprodukte besteht darin, die Sonden mit Fluoreszenz-Farbstoffgruppen zu markieren, wobei die Markierungsgruppen in der Regel an das 5'-Ende der Nachweissonde gebunden werden. Nach Anregung mit einer spezifischen Wellenlänge emittieren die Fluoreszenz-Markierungsgruppen Photonen, die mittels geeigneter Detektionsmethoden nachgewiesen werden können. Das Auftreten einer Fluoreszenz-Markierung korreliert mit dem Vorhandensein der nachzuweisenden Nukleinsäure in der Probe. Durch Verwendung geeigneter Methoden können auch Anzahl und Größe der Hybridisierungsprodukte bestimmt werden.The Detection of nucleic acid molecules in one Trial is usually done by hybridization using specific probes. A possibility for the detection and quantitative determination of hybridization products is to label the probes with fluorescent dye groups, where the marker groups are usually bound to the 5 'end of the detection probe. After excitation with a specific wavelength, the fluorescent marker groups emit Photons detected using suitable detection methods can be. The appearance of a fluorescent label correlates with the presence the nucleic acid to be detected in the rehearsal. By using appropriate methods you can also Number and size of hybridization products be determined.
Die Anzahl der von den markierten Sonden emittierten Photonen hat einen erheblichen Einfluss auf die Sensitivität des Nachweisverfahrens. Während mit roten Fluoreszenz-Markierungsgruppen markierte Sonden in vielen Fällen eine ausreichende Sensitivität [ausgedrückt in IPM (Impulse pro Molekül)] aufweisen, ist die Quantenausbeute bestimmter Fluoreszenzfarbstoffe im grünen Bereich aufgrund von Elektronentransfervorgängen zwischen Nukleobasen und der Markierungsgruppe verringert. Um diese Wechselwirkungen zu vermindern, wurden Spacermoleküle, z.B. Hexaethylenglycol-Moleküle, zwischen der Sondensequenz und den Markierungsgruppen angebracht, die zu einer geringfügigen, aber für viele Anwendungen nicht ausreichenden Verbesserung führen.The Number of photons emitted by the labeled probes has one considerable influence on the sensitivity of the detection method. While with red fluorescent labeling groups labeled probes in many make sufficient sensitivity [expressed in IPM (impulses per molecule)] is the quantum yield of certain fluorescent dyes Out in the open Area due to electron transfer processes between nucleobases and the marker group decreased. To reduce these interactions became spacer molecules, e.g. Hexaethylene glycol molecules between the probe sequence and the marker groups, to a minor, but for many applications do not lead to sufficient improvement.
Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand darin, die Nachteile des Standes der Technik zu vermeiden und insbesondere Sonden zum Nachweis von Analyten, z.B. von Nukleinsäuren mit verbesserter Sensitivität bereitzustellen.The The object underlying the present invention was to avoid the disadvantages of the prior art and in particular Probes for the detection of analytes, e.g. of nucleic acids with improved sensitivity provide.
Diese
Aufgabe wird gelöst
durch eine Sonde der allgemeinen Strukturformel (I)
Z jeweils unabhängig für ein Pyrimidin-Nukleotid oder
-Nukleotidanalogon steht,
M und M' Fluoreszenzmarkierungsgruppen darstellen,
n
und n' jeweils unabhängig ganze
Zahlen von 1 bis 15 darstellen und
m eine ganze Zahl entsprechend
der Länge
der Sondensequenz darstellt.This object is achieved by a probe of the general structural formula (I)
Z each independently represents a pyrimidine nucleotide or nucleotide analog,
M and M 'represent fluorescent labeling groups,
n and n 'each independently represent integers from 1 to 15 and
m represents an integer corresponding to the length of the probe sequence.
Die erfindungsgemäßen Nachweissonden enthalten neben der Fluoreszenz-Markierungsgruppe am 5'-Ende eine zweite Markierungsgruppe am 3'-Ende. Diese beiden Fluoreszenzfarbstoff-Moleküle sind von der mit der Zielnukleinsäure hybridisierenden Sondensequenz durch Oligo-Pyrimidin-Sequenzen als Spacer getrennt. Die IPM-Werte der erfindungsgemäßen Sonden sind bis zu 10 mal höher als diejenigen der aus dem Stand der Technik bekannten Sonden.The detection probes according to the invention contain in addition to the fluorescent labeling group one at the 5 'end second marker group at the 3 'end. These two fluorescent dye molecules are those that hybridize with the target nucleic acid Probe sequence separated by oligo-pyrimidine sequences as spacers. The IPM values of the probes according to the invention are up to 10 times higher than those of the probes known from the prior art.
Die
erfindungsgemäßen Sonden
können
aus Nukleotid- und Nukleotidanalogon-Bausteinen wie aus dem Stand
der Technik bekannt, z.B. PNA- oder LNA-Bausteinen, aufgebaut sein.
Vorzugsweise sind die mit dem Analyten bindefähige Sondensequenz bildenden
Einheiten X1, X2 ...
und Xm jeweils unabhängig ausgewählt aus Einheiten der allgemeinen
Strukturformel (II) oder Salzen davon 
B eine natürliche oder
nicht-natürliche
Nukleobase darstellt,
R einen Rest, ausgewählt aus H, OH, Halogen, -CN,
-C1-C6-Alkyl, -C2-C6-Alkenyl, -C2-C5-Alkinyl, -O-C1-C6-Alkyl, -O-C2-C6-Alkenyl, -O-C2-C6 Alkinyl, -SH,
-S-C1-C6-Alkyl,
-NH2, -NH(C1-C6-Alkyl) und -N(C1-C6-Alkyl)2, darstellt,
-X
jeweils unabhängig
einen Rest, ausgewählt
aus -O-, -S-, -NR'- und CR'2 darstellt,
-Y
jeweils unabhängig
einen Rest, ausgewählt
aus =O und =S, darstellt und
-Y' jeweils unabhängig einen Rest, ausgewählt aus
-OR', -SR', -(NR')2 und
-CH(R')2 darstellt,
wobei
R' jeweils unabhängig für H oder
C1-C3 Alkyl steht.The probes according to the invention can be constructed from nucleotide and nucleotide analog building blocks as known from the prior art, for example PNA or LNA building blocks. The units X 1 , X 2 ... And X m forming the probe sequence capable of binding to the analyte are preferably each independently selected from units of the general structural formula (II) or salts thereof
B represents a natural or non-natural nucleobase,
R is a radical selected from H, OH, halogen, -CN, -C 1 -C 6 alkyl, -C 2 -C 6 alkenyl, -C 2 -C 5 alkynyl, -OC 1 -C 6 alkyl , -OC 2 -C 6 alkenyl, -OC 2 -C 6 alkynyl, -SH, -SC 1 -C 6 alkyl, -NH 2 , -NH (C 1 -C 6 alkyl) and -N (C 1 -C 6 alkyl) 2 ,
-X each independently represents a residue selected from -O-, -S-, -NR'- and CR ' 2 ,
-Y each independently represents a residue selected from = O and = S, and
-Y 'each independently represents a radical selected from -OR', -SR ', - (NR') 2 and -CH (R ') 2 ,
where R 'is each independently H or C 1 -C 3 alkyl.
Die Nukleobase B kann eine natürliche Nukleobase, z.B. Adenin, Cytosin, Uracil, Guanin oder Thymin, oder eine nicht-natürliche Nukleobase, z.B. 2,6-Diaminopurin, 7-Deazaadenin, 7-Deazaguanin, ein 5-modifiziertes Thymin- oder Cytosin-Derivat oder Isoguanin (6-Amino-2-hydroxy-purin), sein.The Nucleobase B can be a natural one Nucleobase, e.g. Adenine, cytosine, uracil, guanine or thymine, or a non-natural Nucleobase, e.g. 2,6-diaminopurine, 7-deazaadenine, 7-deazaguanine, a 5-modified thymine or cytosine derivative or isoguanine (6-amino-2-hydroxy-purine).
Der Substituent R an der 2'-Position ist vorzugsweise H, so dass die Einheiten X1, X2 ... und Xm zumindest teilweise 2'-Desoxynukleotide sind. Andere bevorzugte Bedeutungen für R sind Alkyl, Alkoxy, Alkenyl und Halogen.The substituent R at the 2'-position is preferably H, so that the units X 1 , X 2 ... and X m are at least partially 2'-deoxynucleotides. Other preferred meanings for R are alkyl, alkoxy, alkenyl and halogen.
Die Einheiten der erfindungsgemäßen Sonde sind durch Phosphodiestergruppen oder modifizierte Phosphodiestergruppen verknüpft, worin bei den Einheiten der Strukturformel (II) X vorzugsweise jeweils unabhängig -O-, -S- oder -NH- darstellt, Y vorzugsweise jeweils unabhängig =O oder =S darstellt und Y' vorzugsweise jeweils unabhängig -OH, -SH, -NH2, -CH3 oder -C2H5 darstellt.The units of the probe according to the invention are linked by phosphodiester groups or modified phosphodiester groups, wherein in the units of structural formula (II) X preferably each independently represents -O-, -S- or -NH-, Y preferably each independently represents = O or = S and Y 'preferably each independently represents -OH, -SH, -NH 2 , -CH 3 or -C 2 H 5 .
In der Strukturformel (I) steht Z für ein Pyrimidin-Nukleotid oder ein Pyrimidin-Nukleotidanalogon, z. B. ein Thymidin- oder/und Cytidin-Nukleotid bzw. Nukleotidanalogon. Vorzugsweise steht Z für ein Thymidin-Nukleotid, so dass (Z)n und (Z)n, vorzugsweise jeweils mindestens ein Thymidin-Nukleotid enthalten. Besonders bevorzugt bedeutet Z jeweils ein Thymidin-2'-Desoxynukleotid. Grundsätzlich kann Z jedoch auch eine Nukleotidanalogon-Einheit, wie zuvor beschrieben, darstellen.In the structural formula (I), Z stands for a pyrimidine nucleotide or a pyrimidine nucleotide analog, e.g. B. a thymidine or / and cytidine nucleotide or nucleotide analog. Z is preferably a thymidine nucleotide, so that (Z) n and (Z) n , preferably each contain at least one thymidine nucleotide. Z is particularly preferably a thymidine-2'-deoxynucleotide. In principle, however, Z can also represent a nucleotide analog unit, as described above.
Die Fluoreszenz-Markierungsgruppen der Sonde (I) sind vorzugsweise jeweils unabhängig ausgewählt aus Rhodaminen, Fluoresceinen, Oxazinen, Cyaninen, Bodipy Farbstoffen, Alexa-Farbstoffen etc. Besonders bevorzugt sind Oxazine gemäß PCT/EP03/02981. Besonders bevorzugt sind M und M' grüne Fluoreszenz-Markierungsgruppen, wie etwa Rhodamingrün, Tetramethylrhodamin, Rhodamin 6G, Oregon grün, Bodipy 493, Alexa 488, deren Quantenausbeute bei üblichen Sondenkonstrukten durch Elektronentransfer-Prozesse gequencht wird.The Fluorescent labeling groups of the probe (I) are preferably each independently selected from rhodamines, fluoresceins, oxazines, cyanines, Bodipy dyes, Alexa dyes etc. Oxazines according to PCT / EP03 / 02981 are particularly preferred. M and M 'are particularly preferably green fluorescent labeling groups, like rhodamine green, Tetramethylrhodamine, Rhodamine 6G, Oregon Green, Bodipy 493, Alexa 488, their Quantum yield at usual Probe constructs is quenched by electron transfer processes.
Die Fluoreszenz-Markierungsgruppen M und M' sind vorzugsweise gleich. In bestimmten Ausführungsformen können M und M' jedoch auch verschieden sein. In diesem Fall unterscheiden sich M und M' vorzugsweise in mindestens einem Messparameter, z.B. Emissionswellenlänge oder/und Abklingzeit, so dass ein separater Nachweis von M und M' möglich ist.The Fluorescent labeling groups M and M 'are preferably the same. In particular embodiments can M and M 'however also be different. In this case, M and M 'preferably differ in at least one measurement parameter, e.g. Emission wavelength or / and Cooldown so that a separate detection of M and M 'is possible.
Bei den Sonden (I) ist die Länge der Spacer n und n' jeweils unabhängig eine ganze Zahl von 1–15, vorzugsweise eine ganze Zahl von 3–10, besonders bevorzugt etwa 5.at the probes (I) is the length the spacers n and n ', respectively independently an integer of 1-15, preferably an integer from 3–10, particularly preferably about 5.
Die Länge m der mit den Analyten bindenden Sondensequenz wird günstigerweise so gewählt, dass unter den herrschenden Testbedingungen eine spezifische und nachweisbare Bindung des Analyten möglich ist. Üblicherweise stellt m eine ganze Zahl von 10–90, vorzugsweise von 12–50 dar.The length m of the probe sequence binding with the analytes is advantageously chosen so that under the prevailing test conditions a specific and detectable binding of the analyte is possible is. Usually m represents an integer from 10-90, preferably from 12-50.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung einer oder mehrerer Sonden der Strukturformel (I) in einem Verfahren zum Nachweis eines Analyten, z.B. einer Nukleinsäure, in einer Probe, wobei das Verfahren den Nachweis einer Bindung von einer oder mehreren Sonden an den Analyten umfasst. Vorzugsweise umfasst das Verfahren den Nachweis einer Hybridisierung von einer oder mehreren Sonden mit einer Zielnukleinsäure. Gegebenenfalls kann das Verfahren einen quantitativen Nachweis hinsichtlich der Anzahl der Hybridisierungsprodukte in der Probe oder/und der Größe der Hybridisierungsprodukte umfassen. Es sind jedoch auch andere Nachweisverfahren möglich, z.B. Nachweis der Bindung von einer oder mehreren Sonden an ein Protein, wie etwa der Bindung von Aptameren an Proteine.On Another object of the invention is the use of a several probes of structural formula (I) in a detection method an analyte, e.g. a nucleic acid in a sample, where the method demonstrates the binding of one or more Includes probes on the analyte. The method preferably comprises detection of hybridization of one or more probes with a target nucleic acid. If necessary, the method can provide quantitative evidence regarding the number of hybridization products in the sample or / and the Size of the hybridization products include. However, other detection methods are also possible, e.g. Detection of the binding of one or more probes to a protein, such as the binding of aptamers to proteins.
Die hervorragende Sensitivität der erfindungsgemäßen Nachweissonden erlaubt deren Einsatz auch bei sehr geringen Analytkonzentrationen. So wird bei Verwendung der erfindungsgemäßen Sonden eine ausreichende Nachweissensitivität selbst dann erzielt, wenn die Konzentration des nachzuweisenden Analyten ≤ 10–9 M in der Probe beträgt. Vorzugsweise beträgt die Konzentration des nachzuweisenden Analyten 10–10 bis 10–15 M. Die hohe Sensitivität der erfindungsgemäßen Sonden erlaubt einen Nachweis bei derart geringen Konzentrationen auch ohne vorhergehende Amplifikation des Analyten in der Probe.The outstanding sensitivity of the detection probes according to the invention allows them to be used even at very low analyte concentrations. When using the probes according to the invention, sufficient detection sensitivity is achieved even if the concentration of the analyte to be detected is 10 10 −9 M in the sample. The concentration of the analyte to be detected is preferably 10 -10 to 10 -15 M. The high sensitivity of the probes according to the invention allows detection at such low concentrations even without prior amplification of the analyte in the sample.
Der nachzuweisende Analyt ist vorzugsweise eine Nukleinsäure, z.B. DNA oder RNA beliebiger Herkunft, die beispielsweise aus Prokaryonten, insbesondere pathogenen Prokaryonten, Archea oder Eukaryonten, insbesondere Säugern, wie etwa dem Menschen, stammen kann. Besonders bevorzugt stammt die nachzuweisende Nukleinsäure aus einer humanen Probe, z.B. einer Körperflüssigkeit, einer Gewebeprobe etc.The The analyte to be detected is preferably a nucleic acid, e.g. DNA or RNA of any origin, for example from prokaryotes, especially pathogenic prokaryotes, archea or eukaryotes, in particular mammals, such as humans. Particularly preferably comes the nucleic acid to be detected from a human sample, e.g. a body fluid, a tissue sample Etc.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der nachzuweisenden Nukleinsäure um eine RNA aus einer biologischen Probe oder eine daraus synthetisierte nicht-amplifizierte cDNA. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der nachzuweisenden Nukleinsäure um eine nicht-amplifizierte genomische DNA.In a preferred embodiment the nucleic acid to be detected is an RNA from a biological Sample or a non-amplified cDNA synthesized therefrom. In a further preferred embodiment it is in the nucleic acid to be detected a non-amplified genomic DNA.
Der Nachweis der Fluoreszenz der erfindungsgemäßen Sonden kann mit einer beliebigen Messmethode, z.B. mit einer orts- oder/und zeitaufgelösten Fluoreszenz-Spektroskopie erfolgen. Bevorzugt wird eine Messmethode verwendet, die in der Lage ist, in einem sehr kleinen Volumenelement, Fluoreszenzsignale bis hinunter zu Einzelphotonenzählung zu erfassen.The Detection of the fluorescence of the probes according to the invention can be carried out with any Measurement method, e.g. with a spatially and / or time-resolved fluorescence spectroscopy respectively. A measurement method is preferably used which is in the It is capable of fluorescence signals in a very small volume element down to single photon counting capture.
Beispielsweise kann die Detektion mittels konfokaler Einzelmoleküldetektion, wie etwa durch Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie erfolgen, wobei ein sehr kleines, vorzugsweise ein konfokales Volumenelement, beispielsweise 0,1 × 10–5 bis 20 × 10–12 l der Probenflüssigkeit, dem Anregungslicht eines Lasers ausgesetzt wird, das die in diesem Messvolumen befindlichen Fluoreszenzmarkierungen zur Emission von Fluoreszenzstrahlung anregt, wobei die emittierte Fluoreszenzstrahlung aus dem Messvolumen mittels eines Photodetektors gemessen wird, und eine Korrelation zwischen der zeitlichen Veränderung der gemessenen Emission und der relativen Beweglichkeit der beteiligten Moleküle erstellt werden kann, so dass bei entsprechend starker Verdünnung einzelne Moleküle in dem Messvolumen identifiziert werden können.For example, the detection can be carried out by means of confocal single-molecule detection, such as by fluorescence correlation spectroscopy, a very small, preferably a confocal volume element, for example 0.1 × 10 -5 to 20 × 10 -12 l of the sample liquid, being exposed to the excitation light of a laser , which excites the fluorescence markings located in this measurement volume to emit fluorescence radiation, the emitted fluorescence radiation from the measurement volume being measured by means of a photodetector, and a correlation between the temporal change in the measured emission and the relative mobility of the molecules involved can be established, so that with correspondingly strong dilution, individual molecules can be identified in the measurement volume.
Auf Einzelheiten zur Verfahrensdurchführung und apparative Details zu den für die Detektion verwendeten Vorrichtungen wird auf die Offenbarung des europäischen Patentes 0 679 251 verwiesen. Die konfokale Einzelmolekülbestimmung ist weiterhin bei Rigler und Mets (Soc. Photo-Opt. Instrum. Eng. 1921 (1993), 239 ff.) und Mets und Rigler (J. Fluoresc. 4 (1994), 259–264) beschrieben.On Details of the procedure and equipment details to the for The detection devices used will be based on the disclosure of the European Patent 0 679 251. Confocal single molecule determination is still with Rigler and Mets (Soc. Photo-Opt. Instrum. Eng. 1921 (1993), 239 ff.) and Mets and Rigler (J. Fluoresc. 4 (1994), 259-264).
Alternativ bzw. zusätzlich kann die Detektion auch durch eine zeitaufgelöste Abklingmessung, ein sogenanntes Time Gating erfolgen, wie beispielsweise von Rigler et al., "Picosecond Single Photon Fluorescence Spetroscopy of Nucleic Acids", in: "Ultrafast Phenomena", D.H. Auston, Ed., Springer 1984, beschrieben. Dabei erfolgt die Anregung der Fluoreszenzmoleküle innerhalb eines Messvolumens und anschließend – vorzugsweise in einem zeitlichen Abstand von ≥ 100 ps – das Öffnen eines Detektionsintervalls am Fotodetektor. Auf diese Weise können durch Raman-Effekte erzeugte Hintergrundsignale ausreichend gering gehalten werden, um eine im Wesentlichen störungsfreie Detektion zu ermöglichen.alternative or additionally detection can also be carried out by a time-resolved decay measurement, a so-called Time gating takes place, as for example by Rigler et al., "Picosecond Single Photon Fluorescence Spetroscopy of Nucleic Acids ", in:" Ultrafast Phenomena ", D.H. Auston, Ed., Springer 1984. The fluorescence molecules are excited within a measurement volume and then - preferably at a time interval of ≥ 100 ps - opening one Detection interval at the photo detector. That way you can go through Background signals generated by Raman effects were kept sufficiently low in order to enable essentially interference-free detection.
Besonders bevorzugte Detektionsverfahren und -vorrichtungen sind z.B. in PCT/EP01/07190, PCT/EP01/05408, PCT/EP01/05410, PCT/EP01/05409, PCT/EP01/13120, PCT/EP02/02582, PCT/EP02/05866, PCT/EP02/13390, PCT/EP02/09610 und PCT/EP03/02713 beschrieben.Especially preferred detection methods and devices are e.g. in PCT / EP01 / 07190, PCT / EP01 / 05408, PCT / EP01 / 05410, PCT / EP01 / 05409, PCT / EP01 / 13120, PCT / EP02 / 02582, PCT / EP02 / 05866, PCT / EP02 / 13390, PCT / EP02 / 09610 and PCT / EP03 / 02713.
Besonders bevorzugt erfolgt die Verfahrensdurchführung derart, dass man mehrere Fluoreszenz-markierte Sonden, wobei es sich mindestens bei einer Sonde um eine erfindungsgemäße Sonde handelt, mit jeweils verschiedener Sequenz und verschiedenen Markierungsgruppen zum Nachweis eines einzigen Analyten verwendet. In diesem Fall wird das Vorhandensein des Analyten in der Probe vorzugsweise durch Vorhandensein einer Korrelation zwischen dem Auftreten verschiedener Sonden entsprechend der gleichzeitigen Bindung an den Analyten bestimmt. Vorzugsweise wird ein solches Verfahren als Kreuzkorrelationsbestimmung durchgeführt, wie z.B. bei Schwille et al. (Biophys. J. 72 (1997), 1878–1886) und Rigler et al. (J. Biotechnol. 63 (1998), 97–109) beschrieben. Andere bevorzugte Nachweismethoden umfassen die Koinzidenz-Analyse, die Principle Component-Analyse (PCA), die Fluoreszenzintensitäts-Distributionsanalyse (FIDA) und die Fluoreszenzintensitäts-Multiple-Distributionsanalyse (FIMDA).The process is particularly preferably carried out in such a way that several fluorescence mar cated probes, where at least one probe is a probe according to the invention, each with a different sequence and different labeling groups for the detection of a single analyte. In this case, the presence of the analyte in the sample is preferably determined by the presence of a correlation between the occurrence of different probes corresponding to the simultaneous binding to the analyte. Such a method is preferably carried out as a cross-correlation determination, as for example in Schwille et al. (Biophys. J. 72 (1997), 1878-1886) and Rigler et al. (J. Biotechnol. 63 (1998), 97-109). Other preferred detection methods include coincidence analysis, principle component analysis (PCA), fluorescence intensity distribution analysis (FIDA) and fluorescence intensity multiple distribution analysis (FIMDA).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird eine Sondenkombination verwendet, die eine erfindungsgemäße doppelt markierte Sonde, die grüne Fluoreszenz-Markierungsgruppen trägt, zusammen mit einer Sonde, die eine oder mehrere rote Fluoreszenz-Markierungsgruppen trägt, beinhaltet.In a particularly preferred embodiment a combination of probes is used which doubles an inventive marked probe, the green one Fluorescent label groups, together with a probe, carries which carries one or more red fluorescent labeling groups.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer Probe, umfassend das Inkontaktbringen der Probe mit einer oder mehreren erfindungsgemäßen Sonden unter Bedingungen, bei denen eine Bindung der einen oder mehreren Sonden an den nachzuweisenden Analyten erfolgen kann, und Bestimmen, ob eine Bindung stattfindet oder nicht.Finally concerns the present invention a method for the detection of an analyte in a sample comprising contacting the sample with a or more probes according to the invention under conditions where binding of the one or more Probes on the analyte to be detected, and determining whether a bond takes place or not.
Vorzugsweise ist der Analyt eine Nukleinsäure und der Nachweis umfasst eine Hybridisierung der einen oder mehreren Sonden mit der nachzuweisenden Nukleinsäure. Besonders bevorzugt wird die nachzuweisende Nukleinsäure vor dem Inkontaktbringen mit der oder den Sonden nicht einer Amplifikation, z.B. einer PCR, unterzogen.Preferably the analyte is a nucleic acid and detection involves hybridization of the one or more Probes with the nucleic acid to be detected. Is particularly preferred the nucleic acid to be detected prior to contacting the probe (s) not amplification, e.g. subjected to a PCR.
Weiterhin soll die Erfindung durch das nachfolgende Beispiel erläutert werden.Farther the invention is illustrated by the following example.
Beispiel: Verwendung von Bi-fluorophor-markierten OligonukleotidenExample: Using Bi-fluorophore-labeled oligonucleotides
Im Folgenden wird die hervorragende Sensitivität der Nachweissonden verdeutlicht. Es werden zwei unterschiedliche grüne Sonden mit identischer Sequenz verwendet. Im ersten Fall handelt es sich um eine 5'-Rhodamingrün einfach markierte Sonde, im anderen Fall um eine erfindungsgemäße 5'-3' Rhodamingrün doppelt markierte Sonde, die einen Thymidin-Spacer von jeweils 5 Nukleotiden Länge sowohl für den 3' als auch 5'-Farbstoff beinhaltet. Die Sequenz der Nachweissonde ist spezifisch für die PGK-1-Sequenz (Accession-Number: V00572). Zur Bestimmung der unteren Nachweisgrenze werden jeweils eine grüne markierte Sonde und eine rote markierte Sonde (ebenfalls PGK-1 spezifisch) in Lösung gleichzeitig an ein PGK-1-spezifisches cDNA-Fragment (Länge: 969 nt) hybridisiert. Die Hybridisierung erfolgt in 6 X SSC, 0,06% NP40 Puffer bei 60°C über einen Zeitraum von 8 Stunden. Dabei werden unterschiedliche Konzentrationen des PGK-1 Fragments (0,0 nM PGK-1 bis 2 nM PGK-1) verwendet. Die Hybridisierungsprodukte werden mittels Kreuzkorrelationsspektroskopie analysiert.in the The excellent sensitivity of the detection probes is illustrated below. There will be two different green probes with an identical sequence used. In the first case, it is a 5 'rhodamine green, simply labeled probe, in the other case by a 5'-3 'rhodamine green according to the invention labeled probe, which has a thymidine spacer of 5 nucleotides each Length both for the 3 'and 5' dye included. The sequence of the detection probe is specific for the PGK-1 sequence (Accession Number: V00572). To determine the lower detection limit, each a green labeled probe and a red labeled probe (also PGK-1 specific) in solution at the same time to a PGK-1-specific cDNA fragment (length: 969 nt) hybridized. Hybridization takes place in 6 X SSC, 0.06% NP40 Buffer at 60 ° C over a Period of 8 hours. Different concentrations of the PGK-1 fragment (0.0 nM PGK-1 to 2 nM PGK-1) was used. The Hybridization products are by means of cross correlation spectroscopy analyzed.
Das
Ergebnis dieser Analyse ist in den
In
Die
Sondenkonzentration in
Ein
Vergleich der
Claims (23)
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