DE10308885A1

DE10308885A1 - Verwendung glycosidasehaltiger Lösungen zur Behandlung von neuronalen Zellen

Info

Publication number: DE10308885A1
Application number: DE2003108885
Authority: DE
Inventors: Klaus Syha
Original assignee: Syha Klaus Dr
Current assignee: Syha Klaus Dr
Priority date: 2003-02-28
Filing date: 2003-02-28
Publication date: 2004-09-23

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von glycosidasehaltigen Lösungen zur Regeneration und/oder Verbesserung des Zell-Zell-Kontaktes zwischen neuronalen Zellen oder zwischen neuronalen und nicht-neuronalen Zellen, zur Regeneration und/oder Verbesserung des Zell-Oberflächen-Kontaktes von neuronalen Zellen und zur Regeneration und/oder Förderung des Wachstums von neuronalen Zellen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung glycosidasehaltige Lösungen zur Behandlung von neuronalen Zellen.

Es dürfte unmittelbar einleuchtend sein, daß ein dringender Bedarf für Behandlungsmöglichkeiten funktionell beeinträchtigter neuronaler Zellen, beispielsweise nach Rückenmarksverletzungen oder bei Gehirnschädigungen, besteht. Chirugische Maßnahmen wie das Zusammennähen durchtrennter Nervenbahnen sind zeitaufwendig und erfordern großes Geschick. Zudem besteht insbesondere bei Eingriffen am Gehirn oder Rückenmark ein hohes Risiko für den Patienten. Transplantiertes körperfremdes Nervengewebe unterliegt Abstoßungsreaktionen, und selbst die Verwendung von körpereigenem Nervengewebe ist problematisch, weil keine funktionellen Verbindungen hergestellt werden. Ähnliche Probleme treten auf, wenn neuronale Zellen auf einer extrakorporalen Oberfläche angesiedelt werden, beispielsweise zur Herstellung eines Neurochips. Die Zellen haften schlecht oder nicht an der Oberfläche und bilden keine Verbindungen untereinander aus, so daß kein funktionsfähiger Verbund entsteht.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß sich diese Probleme durch eine Behandlung neuronaler Zellen unter Verwendung von glykosidasehaltigen Lösungen beseitigen lassen. Hierauf beruht die Erfindung.

Die Erfindung gibt somit die Verwendung von glycosidasehaltigen Lösungen (Glykosidasen sind polysaccharidabbauende Exo- und Endoenzyme) zur Regeneration (z.B. nach einer Schädigung) und/oder Verbesserung des Zell-Zell-Kontaktes zwischen neuronalen Zellen oder zwischen neuronalen und nicht-neuronalen Zellen (z.B. Muskelzellen), zur Regeneration und/oder Verbesserung des Zell-Oberflächen-Kontaktes von neuronalen Zellen (z.B. zwischen neuronalen Zellen und körperfremden Oberflächen wie auf Neurochips) und zur Regeneration und/oder Förderung des Wachstums von neuronalen Zellen an.

Es sei hier ausdrücklich darauf hingewiesen, daß sich die erfindungsgemäße Verwendung sowohl auf gesunde als auch auf beeinträchtigte bzw. geschädigte neuronale Zellen bezieht. Unter neuronalen Zellen werden Neuronen und Gliazellen verstanden, beispielsweise solche des Gehirns und des Rückenmarks (die zusammen das Zentralnervensystem bilden) oder des peripheren Nervensystems. Der Entwicklungsstand bzw. Differenzierungszustand der neuronalen Zellen unterliegt keinen besonderen Beschränkungen, beispielsweise kann es sich um embryonale, juvenile oder adulte neuronale Zellen handeln.

Der Begriff "Regeneration" ist hier nicht so zu verstehen, daß lediglich eine Normalisierung oder Wiederherstellung einer beeinträchtigten Funktion erfolgt, sondern es können auch Verbesserungen auftreten, die über den Normalzustand hinausgehen.

Vorteilhafte und/oder bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.

Nach einer Ausführungsform der Erfindung enthalten die verwendeten glykosidasehaltigen Lösungen mindestens eine Sialidase wie eine Neuraminidase. Es können beliebige Glykosidasen miteinander kombiniert werden, wenn dies zweckmäßig ist. Der Typ der erfindungsgemäß geeigneten Glykosidasen unterliegt keinen besonderen Beschränkungen. Es kommt auch nicht auf bestimmte Mengenanteile an.

Die erfindungsgemäße Verwendung bezieht sich nicht nur auf neuronale Zellen im Körper, beispielsweise im Bereich einer Rückenmarksschädigung oder einer Muskel-Nervenverbindung, sondern auch auf solche in Kulturen, Neuroimplantaten oder Neurotransplantaten oder auf solche auf beliebigen Oberflächen, z.B. auch körperfremden technischen Oberflächen wie Neuroprothesen, Neurosonden oder Neurochips. Die neuronalen Zellen können sich natürlich auch auf körpereigenem nichtneuronalen Gewebe befinden, beispielsweise auf Muskelgewebe, das innerviert werden soll. Neurochips können beispielsweise extrakorporal mit neuronalen Zellen besiedelt und dann in den Körper eingesetzt werden, oder die Besiedelung findet direkt im Körper statt. Durch die erfindungsgemäße Behandlung wird nicht nur der Kontakt zwischen den neuronalen Zellen verbessert, sondern auch der Kontakt an die jeweilige Besiedelungsoberfläche, im Falle von Neurochips beispielsweise aus Silicium, Gold oder Kunststoffen. Vorzugsweise werden als technische Oberflächen solche verwendet, die unter physiologischen Bedingungen körperverträglich sind, also beispielsweise nicht abgestoßen oder abgebaut werden.

Die erfindungsgemäße Verwendung bezieht sich insbesondere auf die Behandlung von funktionell beeinträchtigten neuronalen Zellen und/oder funktionell beeinträchtigten axonalen, dendritisch-synaptischen und nicht-synaptische Verbindungen und/oder beeinträchtigten funktionellen Interaktionen mit anderen Zellen mit glykosidasehaltigen Lösungen.

Der Begriff "beeinträchtigt" ist im breitesten Sinne zu verstehen und umfasst beispielsweise Beeinträchtigungen durch Noxen, Läsionen und Degenerationen aller Arten.

Beispiele für konkrete Noxen, Läsionen und Degenerationen sind Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson, Chorea Huntington, Schlaganfall, Multiple Sklerose, Rückenmarksverletzungen, Ischämie und Tumoren. Die erfindungsgemäß angegebene Verwendung ist aber nicht hierauf beschränkt.

Fakultativ können die erfindungsgemäß verwendeten glykosidasehaltigen Lösungen zum Schutz, zur Stabilisierung, zur Förderung des Wachstums und zur Differenzierung außerdem mindestens einen weiteren unter Lyasen wie Chondroitinasen, Antiphlogistika, Antioxidantien, Radikalfängern und Wachstumsfaktoren ausgewählten Wirkstoff enthalten.

Beispielsweise können die Antiphlogistika unter antünflammatorischen Steroiden wie Methylprednisolon und Tirilazad und nicht-steroidalen antünflammatorischen Substanzen wie Salicylaten, Modulene (Acetyl-Leu-Ala-His-Phe-Arg-Trp) und Thiole enthaltenden Aminosäuren wie N-Acetyl-L-Cystein ausgewählt werden.

Die Antioxidantien und Radikalfänger können zum Beispiel unter Thiole enthaltenden Aminosäuren wie N-Acetyl-L-Cystein, Polyaminen wie Spermin, Putrescin, Spermidin, Ascorbinsäure, Ascorbylphosphat, Carotinoiden, Tocopherolen und die Wachstumsfaktoren unter Neurotrophinen wie Nervenwachstumsfaktor (NGF)(im folgenden werden die englischsprachigen Bezeichnungen angegeben, weil die betreffenden Faktoren unter der jeweiligen Abkürzung bekannter sind als unter der vollen Be- Bezeichnung und die Abkürzungen sich wiederum am Englischen orientieren), brain derived growth factor (BDNF), ciliary neurotrophic factor (CNTF), glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), Neurotrophin-3 (NT-3), Neurotrophin-4 (NT-4), bone morphogenic protein 4 (BMP4), leukemia inhibiting factor (LIF), insulin-like growth factor 1, acidic fibroblast growth factor (aFGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), epidermal growth factor (EGF), transforming growth factor-β (TGF-β), platelet derived growth factor (PDGF) und dem Peptid E. T. F. Thymulene (Acetyl-Lys-Asp-Val-Tyr) ausgewählt werden.

Die erfindungsgemäße Verwendung ist nicht auf eine bestimmte Verabreichungsform der glykosidasehaltigen Lösungen festgelegt. Die Verabreichung kann sowohl direkt als auch indirekt erfolgen, beispielsweise durch intrathekale Infusion des Rückenmarks oder durch Einbringen eines mit einer gykosidasehaltigen Lösung imprägnierten Schwammmaterials in einen geschädigten Rückenmarksbereich. Bei Individuen mit Morbus Parkinson oder Chorea Huntington kann die Verabreichung der glykosidasehaltigen Lösungen z.B. in das Striatum erfolgen. Grundsätzlich kann jede Verabreichungsform gewählt werden, die zweckmäßig erscheint oder angebracht ist.

Darüber hinaus können die erfindungsgemäß verwendeten glykosidasehaltigen Lösungen auch noch zusätzlich embryonale Stammzellen oder andere zur Transplantation geeignete neuronale oder nicht-neuronale Zellen wie autologe oder heterologe Zellen, geeignete adulte (differenzierte) Zellen, embryonale Stammzellen, fötale Mesencephalon-Zellen, andere progenitorische Zellen oder Knochenmarkszellen enthalten oder zusammen mit diesen in einen beeinträchtigten Bereich eingebracht wer den. Auf die Reihenfolge kommt es dabei nicht an, es kann also zuerst eine glykosidasehaltige Lösung verwendet werden und dann die vorstehend genannten Zellen eingebracht werden oder auch umgekehrt.

Zusammengefasst wird in der vorliegenden Erfindung primär von der Tatsache Gebrauch gemacht, dass sich an der Oberfläche von neuronalen Zellen verschiedene, gebundene Polysaccharide befinden, welche für die zelluläre Signaltransduktion, Zell-Zell-Erkennung, Zell-Oberflächen-Interaktion, Zellintegration, die Differenzierung, das Wachstum bzw. die Proliferation, die Regeneration und das Überleben neuronaler Zellen von essentieller Bedeutung sind.

Die enzymatische Behandlung von neuronalen Zellen mit Glycosidasen (polysaccharidabbauenden Exo- und Endoenzymen) führt zu Veränderungen der Zelloberflächen mit Implikationen für den Zell-Zellkontakt, wodurch Zellwachstum, Differenzierung und Wegfindung beeinflusst werden: Die neuronalen Zellen verändern ihre Adhäsionseigenschaften und runden sich innerhalb weniger Stunden ab, d.h. es bilden sich Sphäroide. Im weiteren Verlauf nehmen sie jedoch durch Neuritenwachstum (axonales und dendritisches Wachstum) erneut Kontakt miteinander auf und bilden im weiteren axonale und dendritische synaptische und nichtsysnaptische Verbindungen.

Die erfindungsgemäß verwendeten glycosidasehaltigen Lösungen, gegebenenfalls auch in Kombination mit Lyasen wie Chondroitinasen, können zur Behandlung von neuronalen Zellen im Gehirn, Rückenmark, peripheren Nervensystem und in technischen Systemen (Neurochips, Neuroimplantaten, Kulturen) eingesetzt werden.

Normale neuronale Zellen, transplantierte oder durch Noxen geschädigte neuronale Zellen können hierbei durch gegebenenfalls zusätzlich in den glycosidasehaltigen Lösungen enthaltene antiinflammatorisch wirksame Substanzen und/oder Antioxidantien/Radikalfänger und/oder Wachstumsfaktoren geschützt, stabilisiert und/oder zu Wachstum und/oder Differenzierung und/oder Regeneration/Aufnahme der Normalfunktion angeregt werden, oder diese Normalfunktion wird dadurch erst vollständig ermöglicht, oder die Adhäsion an eine Oberfläche (biologisch oder technisch) wird dadurch erst ermöglicht oder verbessert.

Die Behandlung neuronaler Zellen mit diesen glycosidasehaltigen Lösungen kann in situ, in vivo, ex vivo oder in vitro durchgeführt werden und soll die funktionelle Interaktion/-Funktionswiederkehr mit neuronalen Zellen, anderen Zellen (z.B. Muskelzellen) und/oder biokompatiblen Materialien (Neurochips, Neuroprothesen) ermöglichen.

Im folgenden wird die Erfindung nun ohne Beschränkung detaillierter erläutert.

Ein Verzeichnis der zitierten Literaturstellen mit genauen bibliographischen Angaben befindet sich am Ende dieser Beschreibung.

Noxen

Die Expression von Zelloberflächen- und Zelladhäsionsmolekülen und ihrer Rezeptoren auf Axonen und Gliazellen sind wichtige Voraussetzungen für das Wachstum von Nervenfasern. Dazu gehören verschiedene Klassen von Zelladhäsionsmolekülen, von denen speziell N-CAM (neurales Zelladhäsionsmolekül, neural cell adhesion molecule), N-Cadherin und Laminin von mesenchymalen und neuroepithelialen Zellen während der frühen Entwicklung gebildet werden. (Durbec et al.) Es finden Interaktionen durch homophile oder heterophile Bindung zwischen den einzelnen Adhäsionsmolekülen statt. Nur solche Nervenzellen, die ihre Zielzelle gefunden und sich mit ihr synaptisch verschaltet haben, bekommen von dieser Zelle überlebenswichtige neurotrophe Faktoren, Nervenwachstumsfaktor (NGF), aus Gehirngewebe isolierbarem Nervenwachstumsfaktor (BDNF) oder auch Neurotrophin 3 und 4/5 (NT-3, NT-4/5) geliefert oder andere Faktoren, die die Zellen überleben lassen. (von Bartheld et al., Skaper et al.)

Neuronen können durch verschiedene Faktoren wie beispielsweise Glucose- oder Sauerstoffmangel und andere Noxen und Läsionen in einen labilen Zustand geraten, der es ihnen nicht mehr erlaubt, freie Radikale in ausreichendem Masse zu entfernen, so dass diese in zu hoher lokaler Konzentration vermehrt zur enzymatischen oder peroxidativen Hydrolyse mit Schädigung der Zellmembran/cytosolischer Systeme beitragen. Gleichzeitig können durch Öffnung spannungsabhängiger Calciumkanäle nach oxidativem Stress ebenfalls vermehrt Calciumionen in das Zellinnere strömen und diese autodestruktive Kaskade über Induktion Calcium-abhängiger Enzyme weiter unterhalten.

Exzitatorische Aminosäuren (EAAs) Glutamat oder Aspartat können von geschädigten Zellen in grossen Mengen freigesetzt werden und dadurch die sekundäre, autodestruktive nervenzellschädigende Kaskaden in Gang setzen, die zum Teil durch eine Calciumüberladung der Neuronen vermittelt werden. (Lenzlinger et al., Sattler et al., Yakovlev et al.)

Umgekehrt sind Zellen, die Enzyme synthetisieren, die die Fähigkeit haben, freie Radikale zu eliminieren (zum Beispiel Superoxid-Dismutase), weitgehend resistent gegen die schädigende Wirkung von Glutamat.

Wichtigstes Ziel der Frühphase nach Noxen und Läsionen muss es daher sein, den Schaden zu begrenzen und den neuronalen Zelltod, der oft erst verzögert einsetzt, zu verhindern. Um nach einer axonalen Läsion zu überleben und auch wieder ein Axon zu regenerieren, müssen die betroffenen Neuronen Gene aktivieren, die auch während der Entwicklung exprimiert wurden.

Im peripheren Nervensystem können Axone nach Axonotmesis oder Neurotmesis wieder regenerieren. Im optimalen Fall kommt es zu einer restitutio ad integrum. Adulte Nervenzellen im Gehirn von Mammaliern können ihre Axone wieder regenerieren, wenn inhibitorische Einflüsse eliminiert oder neutralisiert werden und wachstumspermissive Bedingungen vorliegen oder experimentell erzeugt werden.

Sind Schaltkreise oder Projektionen an bestimmten Punkten unterbrochen, stellt sich die Frage, ob man – wie beispielsweise bei der Querschnittslähmung nach Rückenmarkstrauma – eine axonale Regeneration über die Läsionsstelle hinweg ermöglichen kann. Im peripheren Nervensystem ist dies durch die wachstumsförderliche Wirkung von Schwann-Zellen möglich, so dass hier alle Versuche unternommen werden, nach einer Nervendurchtrennung baldmöglichst eine Rekonnektion durch pri märe Nervennaht oder Transplantation eines Nervs (beispielsweise durch ein Suralis-Transplantat) zu erzielen. Die Frage der axonalen Regeneration ist eng mit dem Problem der Re-Expression von geeigneten Lenkungsmolekülen und reaktiven Veränderungen der deafferentierten Zielzellen verbunden. Damit eine Verbindungsbahn wieder effektiv regeneriert werden kann, müssen Entwicklungsprogramme in der Zelle reaktiviert werden. Erst wenn dies geschieht, kann im günstigen Fall eine funktionelle Restitution mit Wiederherstellung der physiologischen Parameter erfolgen. Im peripheren Nervensystem sind solche Voraussetzungen gegeben, so dass prinzipiell eine funktionelle Restitution möglich ist.

Im Gehirn ist die Situation viel komplexer. Hier dominieren inhibitorische Faktoren, welche eine axonale Regeneration verhindern. Alternativ zur (manchmal nicht möglichen) Neuroprotektion und axonalen Regeneration kann man auch Ersatzzellen für untergegangene Neuronen einbringen. So können durch Transplantation von unreifen Nervenzellen oder genetisch modifizierten Zellen die verlorengegangenen Neuronen zumindest teilweise ersetzt werden. Sobald diese Zellen transplantiert werden, stellt sich jedoch erneut die Frage nach ihrer Integration in komplexe Schaltkreise. Um sich funktional verschalten zu können, müssen die neuen Zellen ebenfalls genetische Programme aktivieren, welche während der Entwicklung des Nervensystems die weg- und Zielfindung sowie die Synaptogenese steuern. Weiterhin müssen deafferentierte Zielzellen verfügbar sein, die auch als solche erkannt werden müssen. Die Reifung eines regenerierten Systems erfordert dann eine Reihe weiterer, aktivitätsabhängiger Schritte, bei denen fehlerhafte Verschaltungen eliminiert werden. Kurzum, es müssen die wesentlichen Schritte der Bildung von Verschal tungen während der Entwicklung rekapituliert werden. (Strittmatter et al.)

Neben der zellulären Reaktion auf eine Läsion wurden in den vergangenen Jahren auch zunehmend Mechanismen der molekularen Regulation der Zellkörper-Reaktion untersucht. Um nach einer axonalen Läsion im Gehirn zu überleben und auch wieder ein Axon zu regenerieren, müssen die betroffenen Neuronen Gene aktivieren, die auch während der Entwicklung exprimiert wurden.

Soweit bislang untersucht, können Neuronen, die den Weg in Richtung Regeneration einschlagen, alle wesentlichen Zelloberflächen und Adhäsionsmoleküle reexprimieren, die sie auch während der Entwicklung gebildet hatten.

Rückenmark

Nach einer Verletzung im Rückenmark kommt es zu ausgeprägten Veränderungen, vor allem im distalen Nervstumpf (Wallersche Degeneration), aber auch im proximalen Anteil des durchtrennten Nervs. Die Axone im distalen Teil des Nervs haben keine Verbindung zum Zellkörper mehr und werden innerhalb kurzer Zeit samt ihrer Myelinhüllen von Schwann-Zellen und einwandernden Makrophagen abgebaut und für die Wiederverwertung prozessiert. Der grössere Anteil der Phagocytose wird dabei von Makrophagen geleistet. Werden diese künstlich am Einwandern in den geschädigten Nerven gehindert, kommt es nur zu einem sehr langsamen, unvollständigem Abbau des Myelins durch Schwann-Zellen. Durch den Verlust des Axonkontakts dedifferenzieren die Schwann-Zellen im distalen Nervstumpf und reduzieren die Expression von Myelinproteinen. Die Schwann-Zellen proliferieren, wahrscheinlich stimuliert durch Axon membranen und Myelindebris, innerhalb der ursprünglichen Basallamina-Hülle, den Büngnerschen Bändern. Umgekehrt produzieren Schwann-Zellen zahlreiche Proteine, die das Axonwachstum fördern. Die wichtigsten bekannten sind die neurotrophen Faktoren NGF und BDNF, NGF-Rezeptor, das Adhäsionsmolekül L1 und das ECM-Protein Laminin.

Im Bereich der denervierten Synapse werden, meist in ihrer Zusammensetzung und molekularen Struktur noch nicht charakterisierte Moleküle, freigesetzt, die sowohl die Aktivierung und Proliferation der terminalen Schwann-Zellen auslösen, aber auch die Axone direkt zur Region ihrer früheren Synapse lenken. Dabei ist neben N-CAM, ein dem Laminin verwandtes Molekül, das s-Laminin involviert, das in der Endplattenregion exprimiert wird. Entgegen der Wirkung von Laminin bremst s-Laminin das Wachstum von motorischen Axonen. Dadurch wird, zusammen mit anderen Kofaktoren die differentielle Termination der Axone im Bereich der früheren Endplattenregion gesteuert.

Werden wachstumsinhibitorische Moleküle eliminiert, in dem beispielsweise Myelin assoziierten Inhibitoren in vivo durch spezifische Antikörper neutralisiert werden, führt das ebenfalls zu einer signifikanten Verbesserung des regenerativen Axonwachstums nach Rückenmarkstrauma mit Durchtrennung des corticospinalen Traktes. (Caroni & Schwab). Hier konnten in den vergangenen Jahren erhebliche Erfolge erzielt werden. Durch Einsatz von spezifischen Antikörpern gegen Myelin-assoziierte Inhibitoren und von neurotrophen Faktoren konnte gezeigt werden, dass auch im Rückenmark erwachsener Ratten eine axonale Regeneration über lange Strecken möglich ist. Die Antikörper gegen die Myelin-assoziierten Inhibitoren scheinen die Erkennung von spezifischen Lenkungsmolekülen nicht zu beeinflussen, so dass die regenerierenden Axone ihre ursprünglichen Zielzellen wiederzufinden scheinen, und sich dort synaptisch verschalten. Mit dieser experimentellen Therapiestrategie war es möglich, das Laufverhalten von Ratten mit Rückenmarksläsionen signifikant zu verbessern, was zeigt, dass die axonale Regeneration auch zu einer partiellen funktionellen Restitution führt. (Bregman et al.)

Um der Narbenbildung vorzubeugen wurden im Tierversuch bei experimentell rückenmarksverletzten Ratten Chondroitinase ABC appliziert. Es konnte eine bemerkenswerte Wiederherstellung des Laufverhaltens erreicht werden. Dabei blieben aber die sensorischen Funktionen (Bemerken eines Klebebands an der Pfote) hinter den motorischen zurück. (Bradbury et al.). Weitere experimentelle Ansätze betreffenen die Applikation von No Go-Antikörpern, No Go-Peptid, CAMP, Fampride oder Methylprednisolon. (Wickelgren).

Gehirn

Nach einer Verletzung des Gehirns beobachtet man eine Aktivierung von Astrocyten, die sogenannte reaktive Gliose. Dabei kommt es zu einer verstärkten Expression des Intermediärfilaments GFAP (glial fibrillary acidic protein) sowie zur Vergrösserung von Zellkörpern und Fortsätzen der Astrocyten im Verletzungsbereich. Es bildet sich dort eine Glianarbe, ein Gewebe aus Astrocyten und Meningealzellen, welches die Wunde verschliesst und das Einwachsen von regenerierenden Nervenfortsätzen verhindert.

Als das Axonwachstum inhibierende Komponenten der Proteoglylykane müssen Monomere und Polymere von Chondroitin-Sulfat, Dermatan-Sulfat, Keratan-Sulfat und Hyaluronsäure angesehen werden. Diese können bemerkenswerterweise in den Narbengeweben des Gehirns nachgewiesen werden, in denen eine sogenannte reaktive Gliose vorliegt. In Zellkulturen gut permissiver Astrocyten findet man sowohl für das Neuritenwachstum günstige als auch ungünstige Proteoglykane. Dies lässt vermuten, dass auch hier nicht die An- oder Abwesenheit einzelner Proteoglykane, sondern die Mischung der verschiedenen Komponenten im Gewebe und die Expression entsprechender Rezeptoren auf den Axonen über die Permissivität entscheiden.

Es gibt jedoch einige Hinweise darauf, dass nach einer Läsion auch gliale Zellen Faktoren freisetzen, die möglicherweise an den reaktiven Vorgängen nach einer Verletzung beteiligt sind: CNTF (ciliary neurotrophic factor, aus Ciliarganglien gereinigter neurotropher Faktor, ein nicht sezerniertes Protein), wurde in reaktiven Astrocyten in vivo nachgewiesen. In Astrocyten-Kulturen fand man ausserdem NGF (nerve growth factor) NT-3 (Neurotrophin 3) und FGF. Astrocyten besitzen Rezeptoren für neurotrophe Faktoren.

Durch verschieden Adaptationsvorgänge ist nach Läsion im Gehirn in begrenztem Umfang eine Funktionswiederkehr möglich. Zentrale Projektionsgebiete können restrukturiert, zuvor supprimierte Bahnsysteme aktiviert und auf zellulärer Ebene Reorganisationsvorgänge in Gang gesetzt werden. Welcher dieser Vorgänge allein oder in Kombination nach einer Verletzung einsetzt, ist auch von der Grösse und Lokalisation der Schädigung abhängig.

Im normalen adulten Gehirn von Mammaliern scheint unter physiologischen Bedingungen ein Gleichgewicht zwischen wachstumsfördemden und -hemmenden Mechanismen zu herrschen. So werden plastische Veränderungen auf synaptisches Remodeling und sogenanntes Sprouting beschränkt. Axonales Wachstum findet daher in der Regel – wenn überhaupt – nur über sehr geringe Entfernungen statt. Damit unterscheidet sich das Mammalier-Gehirn von dem niederer Vertebraten, bei denen auch im adulten Nervensystem unter normalen Bedingungen kontinuierlich ein Wachstum stattfindet und nach Läsion die überwiegende Mehrzahl der geschädigten Neuronen durch Neurogenese ersetzt, beziehungsweise durchtrennte Projektionsbahnen regeneriert werden können.

Toxische Schädigungen durch Medikamente (Abusus, Nebenwirkungen), Hypoxämie und Erkrankungen können zu Schädigungen und Ausfällen neuronaler Zellen mit erheblichen Konsequenzen für die Betroffenen führen.

Erkrankungen der Basalganglien umfassen idiopathische (zum Beispiel die Parkinson-Krankheit) und hereditäre (zum Beispiel die Huntington-Krankheit) Erkrankungen mit selektivem Zelluntergang in unterschiedlichen Kerngebieten und Neuronen der Basalganglien.

Erkrankungen der Basalganglien zeichnen sich klinisch durch unwillkürliche Bewegungen, Verlangsamung und Armut von Bewegungen und Veränderungen von Muskeltonus und posturalen Reflexen aus.

Zu diesen pathologischen Bewegungen zählen:
Tremor: Rhythmische, regelmässige, oszillierende, unwillkürliche Bewegungen
eines Körperteils infolge einer alternierenden oder synchronen Kontraktion reziprok innervierter agonistischer und antagonistischer Muskeln.
Dystonie: Unwillkürliche, anhaltende Muskelkontraktionen, die aufgrund ihrer Dauer zu teilweise bizarren Bewegungen (Verdrehungen) und auch zu abnormen Haltungen führen, gelegentlich auch zu repetitiven Bewegungen, insbesondere wenn der Patient aktiv gegen die dystone Muskelkontraktion arbeitet.
Chorea: Kurzzeitige, zufällig verteilte, nicht repetitive, unwillkürliche, unregelmässige Muskelkontraktionen mit Bewegungseffekt, die von einer Körperregion zur anderen wandern können.
Ballismus: Grossamplitudige, schleudernde Bewegungen zumeist proximaler Muskelgruppen, die überwiegend halbseitig als Hemiballismus auftreten.
Akinesie: Bewegungsarmut, Hemmung oder Verzögerung des Bewegungsstarts.
Rigor: Wachsartiger, während des gesamten aktiven oder passiven Bewegungsablaufs erhöhter Muskeltonus. (Löschmann & Schulz).

Zur Sanierung verlorengegangener neuronaler Netzwerke, die bei vielen degenerativen Erkrankungen wie Morbus Parkinson oder Chorea Huntington auftreten, bietet sich die Implanta tion geeigneter Zellen als Bioprothese an. Erfolgreiche klinische Anwendung hat seit einigen Jahren die Implantation dopamin-produzierender fötaler Neurone ins Gehirn von Parkinson-Patienten gefunden. Die mangelhafte dopaminerge Neurotransmission im motorischen System der behandelten Parkinson-Patienten konnte durch die fötalen Neurone positiv beeinflusst werden. Die Besserung der klinischen Symptomatik hält in manchen Fällen bereits seit über 10 Jahren an. Zur Behandlung eines Patienten ist das Zellmaterial von mehreren Föten notwendig und somit ist dieses Verfahren nicht für alle Parkinson-Patienten anwendbar. Daher erhofft man sich aus der Stammzellenforschung neue Therapiemöglichkeiten für neurodegenerative Erkrankungen.

Weitere denkbare Ansätze sind sogenannte transdifferenzierbare Zellen z.B aus dem hämopoetischen System (Knochenmark), denen man auch die Fähigkeit zur Differenzierung in neuronale Zellen zuschreibt.: Embryonale Stammzellen oder z.T. auch adulte aus dem hämopoietischen System lassen sich in Kultur unbegrenzt vermehren und aufgrund ihrer Omnipotenz können sie sich theoretisch in jeden Zelltyp differenzieren. Wenn es gelänge, die Mechanismen aufzuklären und nachzuahmen, die zu einer bestimmten Differenzierung führen, liesse sich ein unbegrenztes Reservoir an Reparaturzellen heranzüchten, die auch bei M. Parkinson etc. als Bioprothese dienen könnten. Bereits jetzt existieren verschiedene Ansätze, die Differenzierung von embryonalen Stammzellinien in bestimmte Nervenzellen in vitro hervorzurufen. Allerdings muss die molekulare Identität der jeweiligen Induktionsfaktoren gelöst werden, da nicht alle neuronale Zellen wie gewünscht einwachsen (atypische Integration) und es auch zu Hyperplasien kommen kann. (Zheng et al.). Der Vorteil von Stammzellen liegt darin, dass sie vor der Implantation in gewünschter Weisemanipuliert werden können: So z.B. durch Transfektion mit Trägern bestimmter Merkmale, die für Immortalisierung und für dauerhafte Produktion von gewünschten Substanzen sorgen. Pluripotente Stammzellen aus frühembryonalen Stadien sind eine denkbare aber noch zu etablierende weitere Möglichkeit. Eine andere Möglichkeit wären adulte Stammzellen aus dem Gehirn, die nach Reinigung, Aufzucht und Transfektion in ähnlicher Weise zur Pluripotenz gebracht werden. Auch dieser Ansatz ist allerdings noch zu verifizieren, da diese Zellen noch keinesfalls als Ersatz für Hirnzellen in Betracht kommen.

Neuromedizin - neurotechnologischer Kontakt mit transplantierten Neuronen

Bei einer neurotechnologischen Kontaktierung soll die natürliche Eigenschaft von Neuronen, mittels axonaler Sprossung synaptischen Kontakt zu Neuronen herstellen zu können, ausgenutzt werden, um synaptischen Kontakt zu einem Neurochip und/oder dort bereits haftenden Neuronen herzustellen. Diese Neurochips könnten dann zu Forschungszwecken verwendet oder implaniert werden. Ein grundsätzliches und bislang nicht geklärtes Problem stellt allerdings die Immunverträglichkeit solcher transplantierter Neurone und Neurochips dar.

Bei der Herstellung eines neurotechnologischen Kontaktes mit Hilfe gezüchteter Neuronen auf Siliciumträgern ergeben sich folgende Vorteile: Keine Gewebstraumatisierung durch Elektroden; ein funktionsfähiges Zellkultursystem ist bereits vorhanden; dem biologischen System weitgehend adaptierte axonale Kontaktierung in Form synaptischen Kontaktes. Schwer überwindbare biologische Hindernisse könnten sein: Immunverträglichkeit und/oder Langzeitüberlebensfähigkeit.

1. Mikrostrukturen zur Aufnahme von Nervenzellen

Kultivierte, embryonale Nervenzellen können gerichtet in Gräben mit einer Tiefe von 2 μm wachsen. Das Substrat bestand aus einem 2 mm dünnen Plastikmaterial (Perspex) und war mit Poly L-Lysin beschichtet. Einen geringeren Einfluss als die Tiefe der Strukturen hatte ihre Periodizität. Untersuchungen deuten auch an, dass ein wesentlicher Faktor die Organisation des Cytoskeletts ist. Je höher das Cytoskelett organisiert ist, desto stärker ist ein gerichtetes Zellwachstum zu beobachten. Fromherz et al. und Weis et al. konnten das gerichtete Wachstum von Nervenzellen des Blutegels (Retzius-Zellen) entlang einer quadratischen oder hexagonalen Gitterstruktur zeigen. Dieser Forschergruppe gelang es, eine Kopplung zwischen einem einzelnen Neuron und einer oxidierten Siliciumschicht des Gates eines Feldeffekttransistors (FET) herzustellen. Aktionspotentiale der Retziuszelle modulierten den Source-Drain-Strom des Transistors. Da Arrays aus vielzähligen eng gepackten FETs auf einem Siliciumwafer hergestellt werden können, kann Multikontaktierung von Nervenzelden mittels FETs angestrebt werden. weiterhin konnte eine funktionelle Verbindung von Hirnschnitten mit Planaren elektronische Kontakten hergestellt werden. (Fromherz). Mit FET-Kontaktierung können allerdings nur Neuronensignale empfangen, nicht aber stimuliert werden.

Ein bidirektionaler Informationsaustausch mit Nervenstrukturen kann z.B. mittels metallischer Mikroelektroden auf pla naren Glassubstraten realisiert werden. Gross & Kowalski leiteten simultan in einem Areal (Durchmesser: 1 mm) die elektrischen Aktivitäten von embryonalen Rückenmarkszellen der Maus über 64 Indium-Zinnoxid-Elektroden (indium-tin oxide = ITO)ab. Die einlagige Nervenzellkultur wuchs auf Poly-D-Lysin, das an einem mit Flamme vorbehandelten Photoresist haftete. Der Photoresist isolierte die Nervenzellen gegenüber dem Elektrodenpotential. An den Elektrodenspitzen war zuvor der Photoresist mit einem Laser abgetragen worden.

Jimbo et al. stellten in eine Anordnung von 4 × 4 Elektroden aus Indium-Zinnoxid vor, die in 10 μm hohes Polyimid eingebettet waren. Das Polyimid wurde strukturiert, so dass Kanäle zwischen den Elektroden ausgebildet wurden. Das gerichtete Zellenwachstum wurde dadurch unterstützt, dass der Kanalboden mit Aluminiumoxid ausgelegt war. Aluminiumoxid bewirkt ein selektives Wachstum von Axonen. So konnte ein gerichtetes Wachstum von embryonalen Rattenzellen (cortical tissue) in der Elektrodenanordnung bewirkt werden. Über die Elektroden konnten die elektrischen Aktivitäten der Zellen registriert und aufgezeichnet werden. Von Jerome Pine und seiner Gruppe wurde eine Neuronenmikrosonde entwickelt, die in das intakte Nervensystem implantiert werden soll. Die Gruppe entwickelte einen Neurochip aus Silicium, der es erlaubt, kultivierte neuronale Netzwerke extracellulär zu stimulieren und abzuleiten. Ein grosser Vorteil des Siliciumchips ist die geringe Grösse sowie die gute Biokompatibilität. Der Neurochip besteht aus einer 9 mm langen, 3 mm breiten und 20 μm dicken Siliciummembran, mit einem zentralen 4 × 4 Array aus Kompartimenten. Am Boden eines jeden Kompartiments befindet sich eine runde Goldelektrode. Bedeckt wird das Kompartiment von einem bordotierten Siliciumgitterwerk. Damit zeigt eine Seite der Membran ein 4 × 4 Array aus Goldelektroden, die andere Seite ein korrespondierendes Array aus Silziumgitterwerk. Der Gruppe von Pine gelang es als erste, dissoziierte, embryonale Nervenzellen aus dem Hippocampus sowie dem Sympathicus der Ratte in eine solche dreidimensionale Siliciumstruktur zu verpflanzen. Die Neurone werden in relativ hoher Dichte auf die Mikrostruktur aufgebracht. Nach ca. 10 Minuten werden einzelne, noch nicht adhärierte Neurone mit Hilfe einer Pipette durch die Gitterstruktur hindurch in das Kompartiment gepflanzt. Während der Wachstums- und Differenzierungsphase können Neuriten aus dem Kompartiment herauswachsen und ein neuronales Netzwerk bilden. Der Zellkörper des wachsenden Neurons wird durch die Gitterstruktur im Kompartiment festgehalten. Dadurch können mittels der Goldelektroden am Boden des Kompartiments Aktionspotentiale extracellulär direkt vom Zellkörper abgeleitet bzw. das Neuron stimuliert werden. (Pine)

2. Kulturbedingungen für Nervenzellwachstum auf der Mikrostruktur

Damit Nervenzellen auf Mikrostrukturen unter Kulturbedingungen optimal wachsen und sich differenzieren können, müssen geeignete Grenzflächen gefunden werden, die eine gute Adhäsion der Zellen an der anorganischen Struktur ermöglichen. Komponenten, die die Zelladhäsion fördern, beeinflussen allerdings auch eine Vielzahl cellulärer Funktionen, wie Wachstum, Differenzierung und Zellbewegungen. Neuronale Zellen adhärieren und wachsen besonders gut auf Komponenten der extracellulären Matrix, wie z.B. auf Kollagen oder den Glycoproteinen Fibronectin und Laminin. Die Zellen binden an diese Komponenten durch spezifische Rezeptoren der Zelloberfläche.

Für Mikrostrukturen aus Silicium oder Glas wurde eine gute Adhäsion der wachsenden Neurone (Pyramidenzellen des Hippocampus, Rückenmarkszellen) erzielt, wenn die Mikrostruktur zunächst mit Poly-D-Lysin, anschliessend mit Laminin beschichtet wurde. Damit wird die Adhäsionsschicht über einen langen Zeitraum aufrechterhalten. Wachstum und Entwicklung der Neurone in vitro sind umso besser, je mehr das Substrat den in-vivo-Bedingungen ähnelt. Das Wachstum neuronaler Zellen wird durch Laminin und Fibronectin gefördert. Beide Komponenten bewirken gemeinsam ein starkes Auswachsen der Neuriten. Wachsen Neurone aus dem peripheren Nervensystem, z.B. aus den Spinalganglien, auf Laminin, produzieren die mit kultivierten Schwann-Zellen kein Myelin. Wird dagegen eine rekonstituierte Basalmembran (Hauptkomponenten: Kollagen, Proteoglykane, Laminin und Entactin) als Substrat verwendet, so umgeben die Schwann-Zellen die Neurone und produzieren Myelin.

Das Neuronenwachstum in Mikrostrukturen kann molekular begünstigt oder unterstützt werden. Die Myelinscheide des zentralen Nervensystems, die aus der das Axon umwickelnden Membran des Oligodendrozyten besteht, enthält Membranproteine, die das Nervenwachstum inhibieren. Werden die Oligodendrozyten durch Röntgenbestrahlung entfernt oder ein monoklonaler Antikörper zur Neutralisation der inhibitorischen Eigenschaften verwendet, werden ein (ungerichtetes) Nervenwachstum, z. B. im Rückenmark, und entsprechende Synapsenbildung begünstigt. Obwohl dieser Effekt im Rückenmark unerwünscht ist (absteigende Nervenfasern des Corticospinaltraktes mischen sich mit aufsteigenden sensorischen Fasern), scheint eine molekulare Konditionierung der Nervenzelle oder des extracellulären Milieus zukünftig zunehmend an Bedeutung zu gewinnen. In Abhängigkeit von der verwendeten Adhärenz muss die Mikrostruktur ausserdem so beschaffen sein, dass keine Migration der Neurone erfolgen kann. Untersuchungen von Liang & Crutcher zeigten, dass Neurone auf Laminin sowie auf mit Laminin beschichtetem Poly-D,L-Ornithin oder Poly-L-Lysin migrierten. Dagegen wurde keine Migration der Neurone beobachtet, wenn die Kulturschalen lediglich mit Poly-D,L-Ornithin oder Poly-L-Lysin behandelt worden waren. (Eckmiller)

Zur Herstellung von glykosidasehaltigen Lösungen zur Behandlung humaner neuronaler Zellen werden in der Erfindung verschiedene Stoffgruppen angegeben. Hierbei können neben der Stoffgruppe Enzyme weitere Substanzen aus den Stoffgruppen Antiphlogistika, Antioxidantien/Radikalfänger oder Wachstumsfaktoren alleine oder in Kombination zugefügt werden. Die genannten Substanzen aus diesen Stoffgruppen sind lediglich beispielhaft. Die Substanzen können gentechnologisch, biotechnologisch oder durch chemische Synthese oder andere technische Verfahren, aus biologischen oder anderem natürlichen Material hergestellt oder gewonnen werden. Alle verwendeten Enzyme und weiteren Substanzen sind frei von anderen Enzymen (im Besonderen Proteasen, Nucleasen, Lipasen). Die Behandlung der neuronalen Zellen mit den glycosidasehaltigen Lösungen kann jeden Zeitraum im Bereich von wenigen Sekunden bis mehrere Monate oder Jahre umfassen. Die Behandlung kann ohne Begrenzung wiederholt werden. Alle Substanzen aus den verschiedenen Stoffgruppen und weitere Stoffe (z.B. Wasser, Salze) werden in physiologisch-pharmakologisch wirksamen oder verträglichen Konzentrationen (fM – mM) eingesetzt und nach GLP/GMP-Richtlinien für den Gebrauch am Menschen zubereitet (μ. a. Filtration durch 0,2-μm-Filter).

Stoffgruppe Enzyme

In den glycosidasehaltigen Lösungen werden stets polysaccharidabbauende Glycosidasen (Hydrolasen), E. C. Nomenklatur 3.2.1.1 ff, im besonderen Sialidasen (Neuraminidasen) E. C. 3.2.1.18., geeignet zur Veränderung der Oberfächeneigenschaften von neuronalen Zellen, verwendet.

Optional können erfindungsgemäss zusätzlich Lyasen E. C. 4.1.1. 23 ff, im besonderen Chondroitinasen E. C. 4.2.2. 4 ff., verwendet werden. Werden Lyasen verwendet, so werden diese in sinnvollen Kombinationen mit Substanzen aus der eigenen oder den anderen Stoffgruppen verwendet.

Stoffgruppe Antiphlogistika

Zur Vermeidung und/oder Reduzierung inflammatorischer Prozesse können die glycosidasehaltigen Lösungen erfindungsgemäss antiinflammatorische Steroide und nicht-steroide Substanzen zur Protektion enthalten: Verwendet werden können die eigentlichen Steroide; hierbei kommen dem Methylprednisolon und dem Tirilazad eine besondere Rolle zu. Auch Salicylate kommen als gut dokumentierte Inflammationssuppressoren in Frage. Als nicht-steroide antiinflammatorische Substanzen (NSAIDs) verfügen sie über ein hohes Potential bei der Reduktion der proinflammatorischer Cytokine auf der Ebene der Transkriptionsfaktoren NFκB und AP1 für TNFα und IL-1 sowie durch Hemmung der Cycloxigenasen (COX-1, COX-2) von PGE₂ und anderen Prostaglandinen.

Des Weiteren können verwendet werden: Modulene (Acetyl-Leu-Ala-His-Phe-Arg-Trp), ein synthetisches biomimetisches Peptid, mit den antünflammatorischen und anti-allergischen Eigenschaften der C-terminalen Sequenz des α-Melanotrophins. Weiterhin können erfindungsgemäss Thiole, bevorzugt, wegen seiner guten antiinflammatorische Wirkung, N-Acetyl-L-Cystein (N-AC), verwendet werden.

Stoffgruppe Antioxidantien/Radikalfänger

Zur Verhinderung von und Protektion vor zellschädigenden Oxidationsprodukten und/oder Radikalen können erfindungsgemäss Antioxidanten und/oder Radikalfänger (scavengers) eingesetzt werden.

Bevorzugt werden: Thiole enthaltende Aminosäuren, wie N-Acetyl-L-Cystein, welches, ausser seinem indirekten Beitrag (Einbau in Gluthation) auch als direkter Radikalfänger verwendet werden kann, wobei seine Thiogruppe von wesentlicher Bedeutung ist. Polyamine, insbesondere Spermin, mit Zell- und DNA-protektiven Eigenschaften. Ascorbinsäure/Ascorbylphosphat übt einen stabilisierenden Effekt auf Atmungskettenenzyme aus und trägt so zur Verringerung des electron leakage aus der Atmungskette und dem nachgeschalteten Entstehen von Sauerstoffradikalen bei. α-Tocopherol hat eine starke Wirkung bei der Inhibition der Oxidation von Lipiden, wobei es selbst einer Oxidation zu Tocopherylchinonen unterliegt. Dabei wird es schneller oxydiert als γ- und δ-Tocopherole. Spermin ist, wie die anderen biogenen Polyamine, Putrescin und Spermidin, ein aliphatisches Amin, welches in organischen Lösemitteln und in Wasser löslich ist. Im besonderen wird Spermin als Chelator der bei der UV-Exposition freigesetzten Eisenionen diskutiert, wodurch es das Entstehen von Superoxidanionen, dadurch den Ablauf der Fentonreaktion und das Entstehen von Hydroxylradikalen, verhindert. Von besonderer Bedeutung ist die Assoziation von Spermin mit der DNA, wodurch das dort vorhandene Fe2+-Spermin-Chelat gebildet, und somit die Fentonreaktion nahe der DNA verhindert wird. Spermin besitzt aber auch selbst Radikalfänger-Eigenschaften und schützt die DNA vor direkten Radikalangriffen.

Von besonderer Bedeutung ist die Kombination von Antioxidantienten/Radikalfänger wegen des gleichzeitigen Schutzes hydrophiler und hydrophober Zellkompartimente, der Interaktion mit unterschiedlichen Radikalen, aber auch wegen ihrer unterschiedlichen Redoxpotentiale, wodurch es zu Regenerationseffekten kommt.

Stoffgruppe Wachstumsfaktoren

Zur Förderung der Proliferation, Regeneration/Differenzierung neuronaler Zellen können erfindungsgemäss neuronale (Neutrophine) und nicht-neuronale Wachstumsfaktoren eingesetzt werden: Nervenwachstumsfaktor (NGF), brain derived growth factor (BDNF), ciliary neurotrophic factor (CNTF), glial cell linederived neurotrophic factor (GDNF), Neurotrophin-3 (NT-3), Neurotrophin-4 (NT-4), leukemia inhibiting factor (LIF), insulin-like growth factor 1, acidic fibroblast Growth Factor (aFGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), epidermal growth factor (EGF), transforming growth factor-β (TGF-β), platelet derived growth factor (PDGF), etc. Auch indirekte Stimulatoren des/der Zellwachstums/Proliferation, wie das Peptid E. T. F. Thymulene (Acetyl-Lys-Asp-Val-Tyr) können erfindungsgemäss verwendet werden.

Im folgenden wird die Erfindung ohne Beschränkung anhand von Ausführungsbeispielen illustriert.
Krebs-Ringer-Lösung.
Als Basis der wässrigen glycosidasehaltigen Lösungen 1 und 2 in den unten angegebenen in-vivo-Beipielen 1 und 2 wird folgende modifizierte Krebs-Ringer-Lösung (KRL), pH 7,4 verwendet: (McIlwain)

NaCl 118,00 mM

KCl 4,70 mM

KH2PO4 1,17 mM

MgSO4 1,17 mM

NaHCO3 35,00 mM

D-Glucose 10,00 mM
Beispiel 1
Glycosidasehaltige Lösungen zur Applikation bei Noxen des Rückenmarks
Lösung 1
Zur intrathekalen Infusion des Rückenmarks wird Lösung 1 (KRL-Neuraminidase-Puffer 1) mit folgenden Substanzen in KRL hergestellt:
Lösung 1: KRL-Neuraminidase-Puffer 1
Neuraminidase (E. C. 3. 2. 18 ) von Clostridium perfringens (C. welchii, 150–400 units/mg Protein), in einer Endkonzentration von 5 units/mL. Chondroitinase ABC (E. C. 4. 2 .2. 4) von Proteus vulgaris (Chondroitin ABC Lyase, 50–250 units/mg Protein), in einer Endkonzentration von 2,5 units/mL. ETF Modulene in einer Endkonzentration von 1 ng/mL. N-Acetyl-L-Cystein in einer Endkonzentration von 10 μmol/L.
Die sterile Lösung 1 wird bei 25 °C auf pH 7,4 nachjustiert und kann dann zur intrathekalen oder direkten Infusion im Rückenmark verwendet werden (Bradbury et al. 1999, Bradbury et al. 2002). Nach oder mit der Infusion von Lösung 1 können embryonale Stammzellen oder andere zur Transplantation geeignete neuronale oder nicht-neuronale Zellen (autologe oder heterologe, geeignete, adulte (differenzierte) Zellen, embryonale Stammzellen, fötale Mesencephalon-Zellen, andere progenitorische Zellen oder Knochenmarkszellen) in einer Konzentration von z. B. 50 000 Zellen/μL, Xenotransplantate, oder andere Faktoren, z. B. Polymer-Implante, welche kontrolliert NGF oder andere Wachstumsfaktoren freisetzen, in den geschädigten Rückenmarksbereich eingebracht werden. (McDonald et al.). Alternativ kann mit dieser Lösung ein steriles Schwammaterial getränkt und dieses alleine oder mit einem geeigneten Nerventransplantat nach den Regeln der Chirurgie und Anästhesie in das Rückenmark (Ruptur) eingebracht werden. (Yick et al.).
Hierbei sollte die Infusion der Lösung 1 unmittelbar nach lebensrettenden, stabilisierenden und die Rückenmarksverletzung versorgenden, reinigenden medizinischen Eingriffen erfolgen.
Die Applikationsdauer kann im Bereich von wenigen Minuten bis mehreren Monaten liegen.
Beispiel 2
Lösung 2 (KRL-Neuramindase-Puffer 2) zur sterotaktischen Applikation in das Striatum (Caudatum, Putamen) bei M. Parkinson oder C. Huntigton.
Zur sterotaktischen Applikation in das Striatum wird eine Lösung folgender Substanzen in KRL hergestellt:
Lösung 2: KRL-Neuraminidase-Puffer 2
Neuraminidase (E. C. 3. 2. 18 ) von Clostridium perfringens (C. welchii, 150–400 units/mg Protein), in einer Endkonzentration von 5 units/mL. IGF-1 in einer Enkonzentration von 10 nmol/L. N-Acetyl-L-Cystein in einer Endkonzentration von 10 μmol/L. Nachjustierung des pH-Werts auf 7,4 bei 25 °C.
Die Lösung 2 kann in Volumen von 80 μL unter MRI/CT- oder PET-geleiteter stereotaktischer Neurochirurgie einmal oder mehrmals in verschiedenen Lokalisationen in das Striatum (Caudatum, Putamen) eingebracht werden. Gleichzeitig mit der Lösung 2 oder nach Applikation der Lösung 2 können autologe oder heterologe, geeignete adulte (differenzierte) Zellen, embryonale Stammzellen, fötale Mesencephalon-Zellen, andere progenitorische Zellen oder Knochenmarkszellen in einer Konzentration von z. B. 50 000 Zellen/μL, Xenotransplantate, oder andere Faktoren (z. B. Polymer-Implante, welche kontrolliert NGF oder andere Wachstumsfaktoren freisetzen) eingebracht werden. (Björklund et al. Fink et al., Freed et al., Gage et al., Hassler et al., Kordower et al., Mahoney & Saltzman, Mezey et al.).
Beispiel 3
Als Lösung 3 wird in dem hier angegebenen in-vitro-Beispiel folgender HEPES-Neuraminidase-Puffer, pH 6,2 verwendet. Lösung 3 : HEPES-Neuraminidase-Puffer, pH 6,2

NaCl 152,00 mM

KCl 4,17 mM

HEPES 10,00 mM

EDTA Na₂ 3,00 mM

D-Glucose 10,00 mM

Einstellung des pH-Wertes erfolgt mit Essigsäure
Behandlung von neuronalen Zellen zur Aufbringung auf einen Neurochip:
Embryonalen Ratten (E 18, E 19) werden nach tierschutzge- rechter Tötung des trächtigen Tieres die Hippocampi entnommen und in eiskalter, oxigenierter Hanks balanced Salt solution (HBSS, Good et al.) ohne zweiwertige Kationen zur Weiterbehandlung aubewahrt. Die Hippocampi werden mit einer Schere zerkleinert und bei 37 °C in HEPES-Neuraminidase-Puffer, pH 6,2) für 5 min äqulibriert. Danach wird in HEPES-Neuraminidase-Puffer, pH 6,2 aufgenommene Neuraminidase (E. C. 3. 2. 18 ) von Clostridium perfringens C. welchii, 150–400 units/mg Protein) (Lösung 4), in einer Endkonzentration von 5 units/mL (Lösung 3) zugegeben und die Hippocampi bei 37°C unter gelegentlichem Rühren für 20 min inkubiert. Zur Beendingung der enzymatischen Reaktion wird HEPES-Waschpuffer, pH 7,2 , 37 °C, in einem 4-fachen Überschuss zugegeben. (Menashi et al.). Die Suspension wird anschliessend bei 1200 × g 15 min bei 25 °C zentrifugiert und der Überstand entfernt. Es erfolgt ein zweiter Wascheschritt mit HEPES-Waschpuffer und Zentrifugation unter identischen Bedingungen. Die partiell in neuronale Zellen getrennten Hippocampi werden in Zellkulturmedium (Neurobasal, Fa. Gibco Nr. 17504-044, mit B27-Supplement, Fa. Gibco 35050-06, und 500 μM Glutamin) aufgenommen und dann durch wiederholtes Agitieren in einer Pipettenspitze (1000 μL, Eppendorf) weiter vereinzelt. Verbleibende Glia-Zellen werden durch Zugabe von 2,5 μM Cytosin-Arabinose an der Teilung gehindert. Das Zellkulturmedium wird zunächst alle 4 Tage und später wöchentlich gewechselt. Die neuronalen Zellen können dann mit einer Pipette auf geeignete, vorher sterilisierte Neurochips in einer Dichte von ca. 100–500 Zellen/mm² aufgebracht und dort gehalten werden. Da die neuronalen Zellen nach der enzymatischen Behandlung als Späroide vorliegen, welche dann wieder neuronale Strukturen annehmen und axonale und dentritische Verbindungen eingehen, eignen sie sich zur Etablierung gerichteter neuronaler Verbindungen auf einem Neurochip.
Die Neurochips stehen nach Weiterbehandlung (z. B. Entfernen überschüssiger neuronaler Zellen) für extrazelluläre Ableitungen zur Verfügung. (Claverol-Tinture & Pine, Cohen & Wilkin, Maher et al.).
Erfindungsgemäß verwendet werden glycosidasehaltige Lösungen, die gegebenenfalls weitere Substanzen aus den folgenden Stoffgruppen enthalten: Enzyme, Antiphlogistika, Antioxidantien/Radikalfänger oder Wachstumsfaktoren. Glycosidasehaltige Lösungen im Sinne der Erfindung sind freie oder an Träger kovalent gebundene, adsorbierte oder darin eingeschlossene Glycosidasen in flüssigen Systemen.
Die verwendeten Enzyme (Glycosidasen und Lyasen), Antiphlogistika, Antioxidantien/Radikalfänger und Wachstumsfaktoren, weiteren Chemikalien und die flüssigen Systeme sind frei von verunreinigenden Enzymen, insbesondere Proteasen, Peptidasen, Nukleasen (DNAsen, RNAsen), Lipasen und weiteren, nicht gewünschten polysaccharid-aktiven Glykosidasen und Lyasen.
Die glycosidasehaltigen Lösungen enthalten immer eine oder mehrere Glycosidasen in einem geeigneten flüssigen System. Im Sinne der Erfindung sind Glycosidasen polysaccharidabbauende Hydrolasens E. C. Nomenklatur 3.2.1.1 ff., im besonderen Sialidasen (Neuraminidasen) E. C. 3.2.1.18.
Die glycosidasehaltige Lösungen können optional enthalten: Eine oder mehrere Lyasen. Im Sinne der Erfindung sind Lyasen Enzyme, die die nichthydrolytische Abspaltung von Gruppen aus Substraten unter Ausbildung einer Doppelbindung katalysieren: E. C. Nomenklatur 4.1.1. 23 ff, im besonderen Chondroitinasen E. C. 4.2.2. 4 ff. Im Sinne der Erfindung liegen Lyasen in flüssigen Systemen frei oder in/an Träger fixiert vor.
Ein oderen mehrere Antiphlogistikum(ka). Im Sinne der Erfindung sind Substanzen der Stoffgruppe Antiphlogistika:
Antiinflammatorische Steroide, bevorzugt Methylpredinsolon und Tirilazad. Antiinflammatorische nicht-steroide Substanzen, bevorzugt Salicylate. Antinflammatorische Peptide, bevorzugt Modulene (Acetyl-Leu-Ala-His-Phe-Arg-Trp). Thiole enthaltende Aminosäuren, bevorzugt N-Acetyl-L-Cystein (N-AC).
Ein oder mehrere Antioxidant(ien)/Radikalfänger. Im Sinne der Erfindung sind Antioxidant(ien)/Radikalfänger:
Wasser- und fettlösliche Antioxidantien/Radikalfänger, wie Polyamine, bevorzugt Spermin. Wasserlösliche Antioxidantien/Radialfänger, wie vorzugsweise Vitamin C (Ascorbinsäure) und Ascorbylphosphat. Fettlösliche Antioxidantien/Radikalfänger, wie Carotinoide und Tocopherole, bevorzugt α-Tocopherol. Thiole enthaltende Aminosäuren, bevorzugt N-Acetyl-L-Cystein (N-AC).
Einen oder mehrere neuronale und/oder nicht-neuronale Wachstumsfaktor(en). Im Sinne der Erfindung sind Substanzen der Stoffgruppe Wachstumsfaktoren:
Neuronale und nicht neuronale Wachstumsfaktoren: Bevorzugt Neutrophine wie Nervenwachstumsfaktor (NGF), brain derived growth factor (BDNF), ciliary neurotrophic factor (GNTF), glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), neurotrophin-3 (NT-3), Neurotrophin-4 (NT-4), bone morphogenetic protein 4 (BMP4). Ebenso bevorzugt sind leukemia inhibiting factor (LIF), insulin-like growth factor 1, acidic fibroblast growth factor (aFGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), epidermal growth factor (EGF), transforming growth factor-β (TGF-β), platelet derived growth factor (PDGF). Weiterhin bevorzugt sind indirekte Stimulatoren des/der Zellwachstums/Proliferation, wie das Peptid E. T. F. Thymulene (Acetyl-Lys-Asp-val-Tyr).
Flüssige Systeme im Sinne der Erfindung bestehen aus einer oder mehreren geeigneten, miteinander mischbaren oder nicht-mischbaren Flüssigkeiten mit oder ohne Festphase(n): Bevorzugt Wasser, Puffersysteme (Acetat-Puffer, Krebs-Ringer-Lösung, HEPEs-Puffer, Sörensen-Puffer, Tris-HCl-Puffer, Phosphate-buffered saline), Nährlösungen (HBSS, Dulbecco's modified eagles medium, RPMI), organische Flüssigkeiten [(Solventien), Methanol, Ethanol, n-Octanol, Aceton, Pyridin, Diethylether, n-Hexan, n-Decan], wässrig-organische Flüssigkeiten, wässrig-organische Phasensysteme, Emulsionen, Dispersionen, oder wässrige, wässrig-organische und organische Flüssigkeits-/Festphasensysteme (Aluminium, Silikagel, Kieselgur, Glas, Alginate, Cellulose, Agarose, Chitosan, Dextran, Collagen, Polyacrylamid, Polymethylacrylamid, Polyhydroxyethymethyacrylat, Polyamid, Vinyalacetat-Divinylethylen-Harnstoff, Polystyrol) sowie andere geeignete Flüssigkeiten und Trägermaterialien. (Bornscheuer et al., Poppe et al., Drauz & Waldmann, Wong & Whitesides).
Zur Behandlung mit glycosidasehaltige Lösungen können die neuronalen Zellen im Sinne der Erfindung in freier oder fixierter Form, entweder in biologischen oder technischen Systeme vorliegen. Die Behandlung von neuronalen Zellen im Sinne der Erfindung umfasst Veränderungen der Zelloberflächen mit Implikationen auf den Zell-Zellkontakt, Zell-Oberflächenkontakt, das Zellwachstum, die Differenzierung und Wegfindung von beliebigen neuronalen Zellen. Die Behandlung ermöglicht den Schutz, das Überleben, die Stabilisation, Anregung oder das vollständige Wachstum und/oder Differenzierung und/oder Regeneration/Aufnahme der Normalfunktion von beliebigen neuronalen Zellen. Die Behandlung eignet sich für normale neuronale Zellen, transplantierte oder durch Noxen geschädigte neuronale Zellen, und zwar in situ, in vivo, ex vivo oder in vitro. Dabei kann es sich um beliebige neuronale Zellen im Gehirn, Rückenmark, peripheren Nervensystem und in technischen Systemen (Neurochips, Neuroimplantaten, Neurosonden, Kulturen) handeln. Die Behandlung kann bei neuronalen Störungen und/oder Noxen wie M. Alzheimer, Schlaganfall, Multipler Sklerose, Rückenmarksverletzungen, Ischämien, Tumoren, operativen Eingriffen, Gewalteinwirkungen in situ, in vivo, ex vivo oder in vitro vorgenommen werden. Die Behandlung dient auch zur Erlangung der funktionellen Interaktion/Funktionswiederkehr mit anderen Zellen (z.B. Muskelzellen). Die Behandlung kann in situ, in vivo, ex vivo oder in vitro auf und oder zur Einbringung von Neuroprothesen, Neurochips, Neuroimplantaten, Neurotransplantaten, Xenotranplantaten, autologen Transplantaten, Neurosonden, Biosensoren oder in Kultur gehaltenen neuronalen Zellen, Stammzellen, embryonalen, juvenilen, adulten Progenitorzellen und/oder entsprechenden nicht-neuronalen Zellen erfolgen. Die neuronalen Zellen können in Kontakt mit biokompatiblen oder nicht biokompatiblen Materialien sein.
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Claims

Verwendung von glycosidasehaltigen Lösungen zur Regeneration und/oder Verbesserung des Zell-Zell-Kontaktes zwischen neuronalen Zellen oder zwischen neuronalen und nicht-neuronalen Zellen, zur Regeneration und/oder Verbesserung des Zell-Oberflächen-Kontaktes von neuronalen Zellen und zur Regeneration und/oder Förderung des Wachstums von neuronalen Zellen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die glykosidasehaltigen Lösungen mindestens eine Sialidase wie eine Neuraminidase enthalten.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei es sich um neuronale Zellen des Gehirns, des Rückenmarks oder des peripheren Nervensystems handelt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei sich die neuronalen Zellen in Kulturen, Neuroimplantaten oder -transplantaten oder auf technischen Oberflächen wie Neuroprothesen, Neurosonden oder Neurochips befinden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei es sich um funktionell beeinträchtigte neuronale Zellen und/oder um funktionell beeinträchtigte axonale, dendritisch-synaptische und nicht-synaptische Verbindungen und/oder beeinträchtigte funktionelle Interaktionen mit anderen Zellen handelt.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei die Beeinträchtigung Noxen, Läsionen und Degenerationen umfasst.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Noxen, Läsionen und Degenerationen Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson, Chorea Huntington, Schlaganfall, Multiple Sklerose, Rückenmarksverletzungen, Ischämie und Tumoren umfassen.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die glykosidasehaltigen Lösungen zum Schutz, zur Stabilisierung, zur Förderung des Wachstums und zur Differenzierung außerdem mindestens einen weiteren unter Lyasen wie Chondroitinasen, Antiphlogistika, Antioxidantien, Radikalfängern und Wachstumsfaktoren ausgewählten Wirkstoff enthalten.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Antiphlogistika unter antiinflammatorischen Steroiden wie Methylprednisolon und Tirilazad und nicht-steroidalen antünflammatorischen Substanzen wie Salicylaten, Modulene (Acetyl-Leu-Ala-His-Phe-Arg-Trp) und Thiole enthaltenden Aminosäuren wie N-Acetyl-L-Cystein ausgewählt werden.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Antioxidantien und Radikalfänger unter Thiole enthaltenden Aminosäuren wie N-Acetyl-L-Cystein, Polyaminen wie Spermin, Putrescin, Spermidin, Ascorbinsäure, Ascorbylphosphat, Carotinoiden, Tocopherolen und die Wachstumsfaktoren unter Neurotrophinen wie Nervenwachstumsfaktor (NGF), brain derived growth factor (BDNF), ciliary neurotrophic factor (CNTF), glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), Neurotrophin-3 (NT-3), Neurotrophin-4 (NT-4), bone morphogenic Protein 4 (BMP4), leukemia inhibiting factor (LIF), insulin-like growth factor 1, acidic fi broblast growth factor (aFGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), epidermal growth factor (EGF), transforming growth factor-β (TGF-β), platelet derived growth factor (PDGF) und dem Peptid E. T. F. Thymulene (Acetyl-Lys-Asp-val-Tyr) ausgewählt werden.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Verabreichung der in einem der vorstehenden Ansprüche definierten glykosidasehaltigen Lösungen direkt oder durch intrathekale Infusion des Rückenmarks oder durch Einbringen eines mit einer der in den vorstehenden Ansprüchen definierten gykosidasehaltigen Lösungen imprägnierten Schwammmaterials in den geschädigten Rückenmarksbereich erfolgt.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Verabreichung der in einem der vorstehenden Ansprüche definierten glykosidasehaltigen Lösungen bei Individuen mit Morbus Parkinson oder Chorea Huntington in das Striatum erfolgt.
Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, wobei neben den in einem der vorstehenden Ansprüche definierten glykosidasehaltigen Lösungen embryonale Stammzellen oder andere zur Transplantation geeignete neuronale oder nicht-neuronale Zellen wie autologe oder heterologe, geeignete adulte (differenzierte) Zellen, embryonale Stammzellen, fötale Mesencephalon-Zellen, andere progenitorische Zellen oder Knochenmarkszellen in einen beeinträchtigten Bereich eingebracht werden.