DE10249890A1

DE10249890A1 - Bile acid conjugates and particles formed with them

Info

Publication number: DE10249890A1
Application number: DE10249890A
Authority: DE
Inventors: Gerhard PÜTZ
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-10-25
Filing date: 2002-10-25
Publication date: 2004-05-13
Also published as: WO2004037275A1; AU2003275978A1

Abstract

Es wird ein Konjugat beschrieben, die eine Lipid-Struktur, eine Gallensäure- oder Gallensalz-Struktureinheit und gegebenenfalls eine Linker-Struktureinheit aufweist, wobei die Lipid-Struktureinheit und die Gallensäure- bzw. Gallensalz-Struktureinheit kovalent, gegebenenfalls über die dazwischenliegende Linker-Struktureinheit, verbunden ist. Mit solchen Konjugaten können, je nach Wunsch, mit weiteren Bestandteilen sehr nützliche Partikel, insbesondere Liposomen oder ähnliche vesikuläre Teilchen, aufgebaut werden. Solche Konjugate und Partikel, die die Konjugate umfassen bzw. gebunden enthalten, sind für therapeutische Anwendungen, insbesondere für die Target- und speziell die Leber-spezifische Therapie, besonderes gut geeignet.A conjugate is described which has a lipid structure, a bile acid or bile salt structural unit and optionally a linker structural unit, the lipid structural unit and the bile acid or bile salt structural unit being covalent, optionally via the linker structural unit in between , connected is. Such conjugates can, if desired, be used to build up very useful particles, in particular liposomes or similar vesicular particles, with other constituents. Such conjugates and particles which comprise or contain the conjugates are particularly well suited for therapeutic applications, in particular for target and, in particular, liver-specific therapy.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Konjugate, die eine Gallensäure- oder Gallensäuresalz-Komponente enthalten. Die Erfindung bezieht sich ferner auf Partikel, insbesondere Liposomen oder ähnliche vesikuläre Teilchen, die solche Konjugate umfassen oder die unter anderem mit diesen Konjugaten gebildet sind. Solche Konjugate und Partikel, die die Konjugate umfassen bzw. gebunden enthalten, sind für therapeutische Anwendungen, insbesondere für die Target- und speziell die Leberspezifische Therapie besonders gut geeignet.The present invention relates refer to conjugates that are a bile acid or bile salt component contain. The invention further relates to particles, in particular Liposomes or the like vesicular Particles that include such conjugates or that include these conjugates are formed. Such conjugates and particles, which contain or contain the conjugates are bound for therapeutic Applications, especially for the target and especially the liver-specific therapy is particularly good suitable.

Im Stand der Technik sind Target- bzw. zellartenspezifische Liposomen konstruiert worden, bei denen ein internalisierender Rezeptor als zelluläres Zielprotein für die Bindung der Liposomen auf der Zelloberfläche dient. Bei diesem Ansatz wird der Eintritt der so gebundenen Liposomen in die Zelle über eine rezeptorvermittelte Endozytose ermöglicht. Geho et. al. beschreiben im US-Patent 4,603,044 ein solches zielgerichtetes Wirkstoff-Freisetzungssystem (Trageted Drug Delivery), das an hepatobiliäre Rezeptoren gebunden werden soll. Ein Vesikel wird mit einem Konjugat verknüpft, das aus einem Verbindermolekül, einem Brückenmolekül und einem Zielmolekül besteht. Das Zielmolekül soll mit einem beabsichtigten Rezeptormolkekül des Hepatozyten interagieren. Zum Aufbau werden ein Iminodicarboxylsäurerest als Verbindermolekül, ein "Überbrückungsion", speziell ein Chromkomplex als Brückenmolekül, und ein dem Verbindermolekül identisches Zielmolekül vorgeschlagen, wobei auch andere Zielmoleküle zur Bindung an den gewünschten Rezeptor denkbar sind.In the prior art, target or cell type-specific liposomes were constructed in which a internalizing receptor as a cellular target protein for binding the liposomes on the cell surface. With this approach, the entry of the bound liposomes into the cell enables receptor-mediated endocytosis. Geho et. al. describe such a targeted drug delivery system in U.S. Patent 4,603,044 (Trageted Drug Delivery), which is to be bound to hepatobiliary receptors. A vesicle is linked to a conjugate that consists of a connector molecule, a Bridge molecule and one target molecule consists. The target molecule is said to interact with an intended receptor molecule of the hepatocyte. To build an iminodicarboxylic acid residue as a connector molecule, a "bridging ion", especially a chromium complex as a bridge molecule, and a the connector molecule identical target molecule proposed, with other target molecules for binding to the desired Receptor are conceivable.

Im US-Patent 6,063,400 wenden Geho et al. ein derartiges Konjugat für Liposomen an, die als therapeutischen Wirkstoff ein biogenes Amin und darüber hinaus ein sogenanntes Sequestriermittel (speziell Nukleotidderivate) enthalten, um eine zielgerichtete Bindung an einen Rezeptor zu ermöglichen.In U.S. Patent 6,063,400 Geho et al. such a conjugate for Liposomes that act as a therapeutic agent, a biogenic amine and above a so-called sequestering agent (especially nucleotide derivatives) included to enable targeted binding to a receptor.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein verbessertes System zur zielgerichteten Therapie bereitzustellen.The object of the present invention is an improved system for targeted therapy provide.

Die Aufgabe wird gemäß der Erfindung gelöst durch ein Konjugat gemäß Anspruch 1, ein Partikel gemäß Anspruch 12, eine Verwendung gemäß Anspruch 23 sowie einen Kit gemäß Anspruch 24. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen angegeben.The object is achieved according to the invention solved by a conjugate according to claim 1, a particle according to claim 12, a use according to claim 23 and a kit according to claim 24. Preferred embodiments are in the subclaims specified.

Das erfindungsgemäße Konjugat weist folgende Komponenten auf:

(a) eine Lipid-Struktureinheit und
(b) eine Gallensäure- oder Gallensäuresalz-Struktureinheit, wobei die Komponenten (a) und (b) kovalent, gegebenenfalls über eine
(c) Linker-Struktureinheit, verbunden sind.

The conjugate according to the invention has the following components:

(a) a lipid structural unit and
(b) a bile acid or bile acid salt structural unit, components (a) and (b) being covalent, optionally via a
(c) linker structural unit.

Ohne Linker-Komponente besitzt das Konjugat folglich den Strukturaufbau (a)-(b), mit dieser den bevorzugten Strukturaufbau (a)-(c)-(b) .Without a linker component it has Conjugate the structure (a) - (b), with this the preferred one Structure structure (a) - (c) - (b).

Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß ein solches Konjugat mit den Komponenten (a) und (b) und ggf. (c) in der Lage ist, spezifisch an Gallensalz transportierende Proteine der Hepatozyten, wie z.B. das hauptsächlich Cholyltaurin (CT) transportierende Na⁺/Cholyltaurin-kotransportierende-Polypeptid (Ntcp) und verschiedene Organische-Anionen-transportierende-Polypeptide (Oatp 1-x), zu binden, was durch Inhibierung des Gallensäuretransports durch das spezielle, erfindungsgemäße Konjugat bestätigt wurde. Die beobachtete Inhibierung der Gallensalzaufnahme ist selbst bei einer maximalen Belegung der Hepatocyten mit entsprechenden Vesikeln unvollständig, was eine wichtige, günstige Voraussetzung für die Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Konjugats für die Therapie schafft, da eine vollständige Inhibition des Transports der Gallensäure bzw. des Gallensalzes zu einer Choleastase und damit zu einer Schädigung des Patienten führen würde.According to the invention, it was found that such a conjugate with components (a) and (b) and optionally (c) is capable of hepatocyte-specific proteins transporting bile salt, such as Na ⁺ / cholyltaurine, which mainly transports cholyltaurine (CT) -cotransporting polypeptide (Ntcp) and various organic anion-transporting polypeptides (Oatp 1-x), which was confirmed by inhibition of bile acid transport by the special conjugate according to the invention. The observed inhibition of bile salt uptake is incomplete even with a maximum coverage of the hepatocytes with corresponding vesicles, which creates an important, favorable prerequisite for the applicability of the conjugate according to the invention for therapy, since a complete inhibition of the transport of the bile acid or the bile salt to a choleastase and would cause damage to the patient.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von bevorzugten Ausführungsformen und unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert.The invention is described below of preferred embodiments and explained in more detail with reference to the accompanying drawings.

1 zeigt ein Beispiel eines Konjugats gemäß einer Ausführungsform der Erfindung, bei dem eine Lipidstruktureinheit über eine Linker-Struktureinheit an eine Struktureinheit eines Gallensäuresalzes gebunden ist; 1 shows an example of a conjugate according to an embodiment of the invention, in which a lipid structural unit is linked via a linker structural unit to a structural unit of a bile acid salt;

2A zeigt schematisch die mögliche Struktur eines Gallen- , salz-tragendes Liposoms gemäß einer Ausführungsform der Erfindung, und 2A shows schematically the possible structure of a biliary, salt-bearing liposome according to an embodiment of the invention, and

2B zeigt eine Ausschnittsvergrößerung im Bereich X der 2A; 2 B shows an enlarged section in the area X of 2A ;

3 zeigt die Inhibierung der Aufnahme natürlicher Gallensalze in Hepatocyten durch Gallensalze tragende Partikel am Beispiel von Liposomen. 3 shows the inhibition of the uptake of natural bile salts in hepatocytes by particles carrying bile salts using the example of liposomes.

4 zeigt eine typische Organverteilung bei Anwendung von das erfindungsgemäße Konjugat tragenden Partikeln am Beispiel von Liposomen im Vergleich zu Liposomen ohne das Konjugat; 4 shows a typical organ distribution when using particles carrying the conjugate according to the invention using the example of liposomes compared to liposomes without the conjugate;

5A bis C zeigen (lie Bindung von das erfindungsgemäße Kon jugat tragenden Partikeln am Beispiel von Liposomen, in die eine fluoreszierende Modellsubstanz inkorporiert worden war, an Hepatocytenprimärkulturen, und 5D zeigt einen Vergleich mit Liposomen ohne das Konjugat, jeweils als fluoreszenz-mikroskopisches Bild der Hepatocyten. 5A to C show (lie binding of the conjugate-carrying particles according to the invention using the example of liposomes, in which a fluorescent model substance was incorporated, to hepatocyte primary cultures, and 5D shows a comparison with liposomes without the conjugate, each as a fluorescence microscopic image of the hepatocytes.

Mit dem Ausdruck "Lipid" der Struktureinheit (a) des Konjugats ist irgendein Fettmolekül oder ein fettähnlicher Stoff gemeint, der vorzugsweise in natürlichen Zellen vorkommt. Mit in natürlichen Zellen vorkommenden Lipidstruktureinheiten können vorteilhaft immunologische Abwehrreaktionen besser unterdrückt werden. Besonders vorteilhaft sind Phospholipide, vor allem Phosphoglyceride. Eine Phospho-Diesterverknüpfung kann bequem zur kovalenten Verbindung zur Strukturtureinheit (b) oder – im bevorzugten Fall des dazwischenliegenden Linkers – (c) genutzt werden. Der Einsatz von Phosphoglyceriden als Lipidstruktureinheit im Konjugat ist sehr vorteilhaft, da beim Aufbau der unten näher beschriebenen Partikel, insbesondere bei Liposomen, eine stabile Verankerung des Konjugats über ein Phosphoglycerid mit langkettigen Acylresten ermöglicht wird. Folglich ist die Lipidstruktureinheit (a) vorzugsweise aufgebaut als Diacyl-Phosphoglycerid, wobei der Acylrest zum Beispiel ein gesättigter Fetsäurerest wie Lauryl, Myristyl, Palmitinyl, Stearinyl, Arachinyl oder ein ungesättigter Fettsäurerest wie Palmitoleyl, Oleyl, Linolyl, Lindenyl und Arachidonyl sein kann. Zur besseren Integration in bevorzugten Liposomenpartikel eignen sich C12- bis C18-Rcylreste, insbesondere C16- bis C18-Acylreste besonders gut. Die Acylreste können unabhängig voneinander gewählt werden.With the expression "lipid" of the structural unit (a) of the conjugate is some fat molecule or a fat-like one Substance that is found mainly in natural cells. With in natural Lipid structural units occurring in cells can advantageously be immunological Defense reactions better suppressed become. Phospholipids, especially phosphoglycerides, are particularly advantageous. A phospho diester linkage can easily be used for covalent connection to the structural unit (b) or - in preferred case of the intermediate linker - (c) used become. The use of phosphoglycerides as a lipid structure unit in the conjugate is very advantageous because the structure described in more detail below Particles, especially with liposomes, a stable anchorage of the Conjugate over a phosphoglyceride with long-chain acyl residues is made possible. Accordingly, the lipid structural unit (a) is preferably constructed as a diacyl phosphoglyceride, the acyl group being, for example saturated Fetsäurerest such as lauryl, myristyl, palmitinyl, stearinyl, arachinyl or a unsaturated fatty acid residue such as palmitoleyl, oleyl, linolyl, lindenyl and arachidonyl. Suitable for better integration into preferred liposome particles C12 to C18-Ryl radicals, in particular C16 to C18-acyl radicals particularly good. The acyl residues can independently chosen from each other become.

Als Struktureinheit (b) dient eine Gallensäure oder ein Gallensäuersalz, wobei als Salzform z.B. das Na-, das K-, das Ammonium-Salz, das Salz einer Aminosäure oder eines organischen Amins oder dergleichen in Betracht kommt. Nachfolgend werden, wenn nicht anders angegeben, die Ausdrücke Gallensäure und Gallensäuresalz als Synonyme verwendet. Die Struktureinheit (b) besitzt die für Gallensäure typische Steroid- Grundstruktur, z.B. in Form eines 5β-Cholansäurederivats. Das Cholansäurederivat ist vorzugsweise am 24C-Carboxylat mit stickstoffhaltigen Basen wie Glycin oder Taurin modifiziert. Insbesondere die Modifizierung mit Taurin ist vorteilhaft, weil die -SO₃H-Gruppe nach Dissoziation eine permanent geladene Sulfatgruppe am gegenüber der Lipidstruktureinheit entgegengesetzten Ende des Gallensalzes bildet und dadurch eine nicht gewünschte Insertion des hydrophoben Cholan-Gerüstbereichs in ein Partikel, speziell in eine Liposomenmembran, erschwert oder verhindert wird. Im übrigen kann durch die negative Ladung die nicht Hepatozyten spezifische Insertion des hydrophoben Gerüstbereichs in die Membranen von Zellen erschwert oder verhindert werden.A bile acid or a bile acid salt is used as the structural unit (b), the salt form being, for example, the Na, the K, the ammonium salt, the salt of an amino acid or an organic amine or the like. Unless otherwise stated, the terms bile acid and bile acid salt are used synonymously below. The structural unit (b) has the steroid basic structure typical of bile acid, for example in the form of a 5β-cholanic acid derivative. The cholanic acid derivative is preferably modified on the 24C carboxylate with nitrogen-containing bases such as glycine or taurine. Modification with taurine is particularly advantageous because after dissociation, the -SO ₃ H group forms a permanently charged sulfate group at the end of the bile salt opposite the lipid structure unit and thus an undesired insertion of the hydrophobic cholane framework area into a particle, especially into a liposome membrane , difficult or prevented. Moreover, the non-hepatocyte-specific insertion of the hydrophobic framework region into the membranes of cells can be made more difficult or prevented by the negative charge.

Zur Verknüpfung der Struktureinheiten (a) und (b) kommen grundsätzlich eine funktionelle Gruppe im 24C-Rest und eine oder mehrere Hydroxylgruppen in der 3-, 7- oder 12-Position des Cholan-Gerüsts in Betracht. Zur Verknüpfung können auch an anderen Stellen eine geeignete Funktionalisierung eingeführt werden. Im Hinblick auf eine stärkere spezifische Bindung an Hepatozyten ist es bevorzugt, die Verknüpfung an die Lipidstruktureinheit (a) oder den Linker (c) strukturell möglichst weit entfernt vom 24C-Rest des Gallensäure-Steoridgerüstes auszubilden. Die Verknüpfung erfolgt daher vorzugsweise über die 3-Hydroxy-Position des Steroidgerüsts der Gallensäure. Die 7- und 12-Positionen des Steroidgerüsts der Gallensäure können hydroxyliert sein oder nicht, oder sie können durch andere Struktureinheiten modifiziert sein. Besonders gut geeignete Gallensäuren sind Taurocholsäure und vor allem Lithotaurocholsäure sowie deren Salze.To link the structural units (a) and (b) always come a functional group in the 24C radical and one or more hydroxyl groups in the 3-, 7- or 12-position of the Cholan framework. For linking, too suitable functionalization will be introduced at other points. in the Towards a stronger one specific binding to hepatocytes, it is preferred to link to it the lipid structure unit (a) or the linker (c) structurally as possible far from the 24C residue of the bile acid steroid structure. The link is made therefore preferably about the 3-hydroxy position of the steroid structure of bile acid. The 7- and 12-positions of the steroid structure of bile acid can be hydroxylated or not or they can be modified by other structural units. Particularly suitable bile acids are taurocholic acid and especially lithotaurocholic acid and their salts.

Es wurde ferner festgestellt, daß die spezifische Bindung an Hepatozyten signifikant stärker war, wenn die Verknüpfung an die 3-Position des Steroidgerüsts der Gallensäure bzw. des -Salzes in der β-Konfiguration vorlag.It was also found that the specific Binding to hepatocytes was significantly stronger when linked to the 3 position of the steroid framework of bile acid or the salt was in the β configuration.

Die Struktureinheit (b) kann direkt kovalent mit der Struktur einheit (a) verbunden sein, z.B. über eine Esterverknüpfung wie einer Phosphordiesterverknüpfung mit dem oben beschriebenen Phosphoglycerid. Zur leichteren Synthese sowie zur Einführung eines molekularen Abstandshalters, damit die Struktureinheiten (a) und (b) ihre jeweilige Funktion besser ausüben können, liegt zwischen den Struktureinheiten (a) und (b) vorzugsweise eine Linkerstruktureinheit (c) vor. Dieses Linkermolekül kann selbst aus einer oder mehreren Struktureinheiten bestehen. Geeignete Struktureinheiten sind zum Beispiel, allein oder in Kombination, eine Polyalkylenglykolgruppe mit n Polarisationseinheiten, wobei n eine ganzen natürliche Zahl ist, wie Di-, Tri- oder Tetramethylenglykol oder Polyethylenglykol, eine Dicarboxylatgruppe wie Succinyl und dergleichen.The structural unit (b) can directly covalently linked to the structural unit (a), e.g. via an ester linkage such as a phosphodiester linkage with the phosphoglyceride described above. For easier synthesis as well as for introduction of a molecular spacer so that the structural units (a) and (b) can perform their respective functions better, lies between the structural units (a) and (b) preferably a linker structure unit (c). This linker molecule can itself consist of one or more structural units. Suitable structural units are, for example, alone or in combination, a polyalkylene glycol group with n polarization units, where n a whole natural Number is, like di-, tri- or tetramethylene glycol or polyethylene glycol, a dicarboxylate group such as succinyl and the like.

Ein spezielles Beispiel eines erfindungsgemäßen Konjugats ist in 1 in Form einer schematischen Struktur dargestellt. Die jeweiligen Struktureinheiten (a)-(c)-(b) sind angegeben. Die strukturelle Darstellung dient nur zur Veranschaulichung einer möglichen Struktur, ist jedoch nicht einschränkend zu verstehen, da erfindungsgemäß im Rahmen der oben beschriebenen jeweiligen Struktureinheit (a), (b) und ggf. (c) beliebige Variationen möglich sind.A specific example of a conjugate according to the invention is in 1 represented in the form of a schematic structure. The respective structural units (a) - (c) - (b) are indicated. The structural representation only serves to illustrate a possible structure, but is not to be understood as restrictive, since according to the invention any variations are possible within the scope of the respective structural unit (a), (b) and, if appropriate, (c).

Das zuvor beschriebene, erfindungsgemäße Konjugat mit den wesentlichen Struktureinheiten (a) und (b), die vorzugsweise mit dem Linker (c) verknüpft sind, sind besonders geeignet zur Anwendung auf medizinischem Gebiet, insbesondere für therapeutische Verfahren.The conjugate according to the invention described above with the essential structural units (a) and (b), which are preferably linked to the linker (c) are particularly suitable for use in the medical field, especially for therapeutic procedures.

In einem weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Partikel das oben beschriebene, spezielle Konjugat. Als Partikel kommen mikropartikuläre Träger oder Transportvehikel geeigneter Größe in Betracht, die vorzugsweise so ausgestaltet sind, daß am und/oder im Partikel therapeutische Wirkstoffe gebunden oder eingeschlossen sind. Das Partikel kann natürlichen oder künstlichen Ursprungs sein oder eine künstliche Modifikation von natürlichen Vehikeln darstellen. Diesbezüglich kann auf Partikel verwiesen werden, die aus herkömmlichen Drug Delivery-Systemen bekannt sind. Geeignet sind z.B. Liposomen, Mikrosphären, Nanopartikel, Niosomen, Polymerpartikel, Lipoproteine, Viruspartikel (Viren, Virushüllen und andere, modifzierte Viruspartikel, deren Virulenzeigenschaft entfernt wurde oder in anderer Weise modifiziert wurde) und bestimmte Zellarten wie Blutzell-Subtypen, wie Erythrocyten und Lymphocyten. Die Funktionskomponente (b) wird dabei auf einfache Weise über die Lipidkomponente (a) in hydrophobe Bereiche des Partikels integriert und dort stabil verankert.In another object of the present invention, a particle comprises the one described above no, special conjugate. Suitable particles are microparticulate carriers or transport vehicles of suitable size, which are preferably designed such that therapeutic agents are bound or included on and / or in the particle. The particle can be of natural or artificial origin or an artificial modification of natural vehicles. In this regard, reference can be made to particles which are known from conventional drug delivery systems. Suitable are, for example, liposomes, microspheres, nanoparticles, niosomes, polymer particles, lipoproteins, virus particles (viruses, virus envelopes and other modified virus particles whose virulence properties have been removed or modified in some other way) and certain cell types such as blood cell subtypes such as erythrocytes and lymphocytes. The functional component (b) is easily integrated into the hydrophobic areas of the particle via the lipid component (a) and anchored there in a stable manner.

Die Partikelzusammensetzung enthält geeigneterweise 0,1-50 Gew.-%, vorzugsweise 0,5-5 Gew.-% und insbesondere 0,75-2 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der Partikelkomponenten wie z.B. der Liposomenmischung, des erfindungsgemäßen Konjugats.The particle composition suitably contains 0.1-50% by weight, preferably 0.5-5% by weight and in particular 0.75-2 % By weight, based on the total amount of particle components such as e.g. the liposome mixture, the conjugate according to the invention.

Besonders bevorzugte Partikelträger für das erfindungsgemäße Konjugat sind Liposomen. In Kombination mit dem Lipid-haltigen Konjugat der Erfindung, insbesondere in Kombination mit den oben beschriebenen, bevorzugten Diacylphosphoglyceriden, ist eine besonders stabile Verankerung der funktionellen Komponente (b) an die Liposomen möglich. Ferner ist die Herstellung solcher Liposomenpartikel besonders einfach, da das erfindungsgemäße Konjugat leicht als Ausgangsmaterial eingesetzt werden kann und lediglich mit weiteren, für Liposomen geeignete Lipidkomponenten wie normale Phosphoglyceride, Cholesterol, Lecitin oder dergleichen gemischt zu werden braucht.Particularly preferred particle carriers for the conjugate according to the invention are liposomes. In combination with the lipid-containing conjugate of Invention, especially in combination with those described above, preferred diacylphosphoglycerides, is a particularly stable Anchoring of the functional component (b) to the liposomes possible. Further the production of such liposome particles is particularly simple because the conjugate according to the invention can easily be used as a starting material and only with others, for Liposome-suitable lipid components such as normal phosphoglycerides, Cholesterol, lecithin or the like needs to be mixed.

Im Fall der Liposomenpartikel kann die Liposomenmischung neben dem erfindungsgemäßen Konjugat, das geeigneterweise in einem Mengenanteil von 0,1 bis 50 Mol-%, vorzugsweise 0,5 bis 5 Mol% verwendet wird, bis 99,9 Mol-% normale Phospholipide und, falls gewünscht, 0,1 bis 80 Mol-% Cholesterol und gegebenenfalls weitere Bestandteile enthalten. Geeignete normale Phospholipide können aus folgender Gruppe ausgewählt werden: Phospholipide mit langkettigen gesättigten Fettsäureresten von C16 und darüber, insbesondere C16-C18 wie z.B. DPPC und DSPC, vorzugsweise in einem Anteil von 20 bis 40 Mol-%, oder von langkettigen ungesättigten Fettsäureresten wie z.B. POPC und DNPC, vorzugsweise in einem Anteil von 10 bis 30 Mol-%, da diese die Lagerung der Liposomen bei 4°C ohne Übergang in die flüssigkristalline Phase begünstigen; und Phospholipide mit mittleren gesättigten Kettenlängen (C8-C14) wie z.B. DMPC, vorzugsweise in einem Anteil von 20 bis 40 Mol-%, oder mit mittleren ungesättigten Kettenlängen wie z.B. DmyPC, vorzugsweise in einem Anteil von 20 bis 90 Mol-% und insbesondere von 40 bis 80 Mol-%, weil diese eine Fusion mit Zellmembranen begünstigen. Der Zusatz von Cholesterol zur Liposomenmischung verringert einerseits die Fluidität der Membran und vergrößert andererseits die Breite des Phasenübergangs zwischen der flüssigkristallinen und der Gelphase. Cholesterol verringert ferner die Permeabilität der Liposomenmembran und erhöht die Verweildauer der im Inneren der Liposomen gelöst vorliegenden hydrophilen Verbindungen in den Liposomen. Deshalb enthält die Liposomenmischung vorzugsweise von 10 bis 90 Mol-%, weiter bevorzugt von 20 bis 60 Mol-% Cholesterol. Während die Hauptkomponenten der Liposomenmischung in der Summe neutral geladen sind, wie z.B. das ungeladene Cholesterol oder das zwitterionige Diacyl-Phosphocholin, können zusätzlich ein oder mehrere negativ geladene Phospholipide der Liposomenmischung zugesetzt werden. Durch die Coulomb-Abstoßung gegenüber dem negativ geladenen Gallensäurerest, insbesondere der Taurin-modifizierten Gallensäure, kann die Struktureinheit (b) des im Liposom enthaltenen Konjugats nach außen ragen und besser an ein Transportprotein binden. Eine negative Gesamtladung des Liposomen führt darüber hinaus in vivo zu einer verlangsamten Opsonisierung und damit zu einer verlängerten Verweildauer der Liposomen im Blut. Als negativ geladenes Lipid eignet sich z.B. Phosphatidylglycerol, DSPC, DMPC und Glutyryl-DSPC, da es eine besonders lange Halbwertszeit der Liposomen im Blut gewährleistet. Die negativ geladene Lipidkomponente der Liposomen kann vorzugsweise in einem Anteil von 1 bis 50 Mol-%, weiter bevorzugt von 4 bis 15 Mol-% zugesetzt werden.In the case of liposome particles can the liposome mixture in addition to the conjugate according to the invention, suitably in a proportion of 0.1 to 50 mol%, preferably 0.5 to 5 mol% is used up to 99.9 mol% normal phospholipids and, if desired, 0.1 to 80 mol% of cholesterol and optionally further constituents contain. Suitable normal phospholipids can be selected from the following group: Phospholipids with long chain saturated fatty acid residues from C16 and above, especially C16-C18 such as DPPC and DSPC, preferably in one Proportion of 20 to 40 mol%, or of long-chain unsaturated fatty acid residues such as. POPC and DNPC, preferably in a proportion of 10 to 30 mol%, since this is the storage of the liposomes at 4 ° C without transition into the liquid crystalline Favor phase; and phospholipids with medium saturated chain lengths (C8-C14) such as. DMPC, preferably in a proportion of 20 to 40 mol%, or with medium unsaturated chain lengths such as. DmyPC, preferably in a proportion of 20 to 90 mol% and especially from 40 to 80 mole% because this is a fusion with Favor cell membranes. The addition of cholesterol to the liposome mixture reduces on the one hand the fluidity the membrane and on the other hand enlarges the width of the phase transition between the liquid crystalline and the gel phase. Cholesterol also reduces the permeability of the liposome membrane and increased the length of stay of those present inside the liposomes hydrophilic compounds in the liposomes. That is why the liposome mix contains preferably from 10 to 90 mol%, more preferably from 20 to 60 mol% Cholesterol. While the main components of the liposome mixture are neutral in total are loaded, e.g. the uncharged cholesterol or the zwitterionige Diacyl-phosphocholine, can additionally one or more negatively charged phospholipids of the liposome mixture be added. Due to the Coulomb rejection compared to the negatively charged bile acid residue, especially the taurine-modified bile acid, the structural unit (b) the conjugate contained in the liposome protrude outwards and better on Bind transport protein. A negative total charge of the liposome leads beyond in vivo to a slow opsonization and thus to a extended Residence time of the liposomes in the blood. As a negatively charged lipid is suitable e.g. Phosphatidylglycerol, DSPC, DMPC and glutyryl-DSPC, because it ensures a particularly long half-life of the liposomes in the blood. The negatively charged lipid component of the liposomes can preferably in a proportion of 1 to 50 mol%, more preferably 4 to 15 Mol% are added.

2A zeigt eine schematische Darstellung der möglichen Struktur eines Gallensalz tragenden Liposoms, und 2B zeigt den Ausschnitt X der 2A vergrößert. Die hydrophilen Reste in der Gallensalz-Struktureinheit (b) des erfindungsgemäßen Konjugats (3-Litho-Cholyltaurin-Distearoyl-Phosphoethanolamin) zeigen beispielsweise nach innen und nach außen der doppelwandigen Lipsomenmembran, während die Lipidstruktureinheit (a) des Konjugats stabil in der Liposomenmembran integriert und somit verankert ist. In der praktischen Anwendung ist es bevorzugt, dass die Gallensalz-Struktureinheit (b) im wesentlichen nach außen zeigt. 2A shows a schematic representation of the possible structure of a bile salt-bearing liposome, and 2 B shows the section X of the 2A increased. The hydrophilic residues in the bile salt structural unit (b) of the conjugate according to the invention (3-litho-cholyltaurine-distearoyl-phosphoethanolamine) point, for example, inwards and outwards of the double-walled liposome membrane, while the lipid structure unit (a) of the conjugate is stably integrated in the liposome membrane and is thus anchored. In practical use, it is preferred that the bile salt structural unit (b) points essentially outwards.

Die Größe des erfindungsgemäßen Partikels kann im allgemeinen im Nanometerbereich bis hin zum Mikrometerbereich liegen. Die mittlere Partikelgröße liegt geeigneter Weise im Bereich von 10 nm bis 10 μm, weiter bevorzugt von 40 bis 200 nm und insbesondere von 100 bis 150 nm.The size of the particle according to the invention can generally in the nanometer range up to the micrometer range lie. The average particle size is suitably in the range from 10 nm to 10 μm, more preferably from 40 to 200 nm and in particular from 100 to 150 nm.

Das Partikel umfaßt neben dem erfindungsgemäßen Konjugat vorzugsweise ferner ein an sich bekanntes Fusionspeptid, z.B. die in der WO 99/39742 A Beschriebenen, wie die 25 Aminosäuren umfassende N-terminale Sequenz des Surfactant Associated Protein B, um nach der Bindung des Partikels an den Transporter des Hepatozyten die Verschmelzung mit der zellulären Membran zu fördern und so den Inhalt des Partikels leichter in das Zelluplasma zu entladen. Das Fusionspeptid kann über maßgeschneiderte Aminosäuresequenzen, z.B. über hydrophobe Aminosäuren, oder geeignete Modifizierungen, z.B. über kovalente Verknüpfungen, fest mit dem Partikel verbunden bzw. dort verankert werden, wie z.B. in der WO 99/39742 A und von Pecheur et al. (Biochemistry 36, 3773–3781 (1997) und Biochemistry 37, 2361-2371 (1998) beschrieben.In addition to the conjugate according to the invention, the particle preferably further comprises a fusion peptide known per se, for example the one described in WO 99/39742 A, such as the 25-amino acid N-terminal sequence of the surfactant-associated protein B, in order to bind the particle to the trans porter of the hepatocyte to promote the fusion with the cellular membrane and thus easier to discharge the content of the particle into the cell plasma. The fusion peptide can be firmly attached to the particle or anchored there via tailored amino acid sequences, for example via hydrophobic amino acids, or suitable modifications, for example via covalent linkages, as described, for example, in WO 99/39742 A and by Pecheur et al. (Biochemistry 36, 3773-3781 (1997) and Biochemistry 37, 2361-2371 (1998).

Die Partikel, insbesondere die Liposomen, können vorzugsweise ferner neben dem erfindungsgemäßen Konjugat und ggf. dem Fusionspeptid eine sterisch stabilisierte, d.h. eine sogenannte "Stealth-Komponente" aufweisen, z.B. Lipid-gebundenes Polye thylenglycol (PEG) oder Lipid-gebundenes Glutaryl, um die Halbwertszeit der Partikel gegenüber dem Immunsystem in der Zirkulation in vivo zu verlängern.The particles, especially the liposomes, can preferably also in addition to the conjugate according to the invention and optionally the fusion peptide a sterically stabilized, i.e. have a so-called "stealth component", e.g. Lipid-bound polyethylene glycol (PEG) or lipid-bound glutaryl, by the half-life of the particles against the immune system in the To prolong circulation in vivo.

Das erfindungsgemäße Partikel kann zur Anwendung auf medizinischem Gebiet vorzugsweise einen therapeutischen Wirkstoff oder eine Arzeneimittelzusammensetzung oder ein diagnostisches Mittel umfassen. Geeignete therapeutische Wirkstoffe sind zum Beispiel Cytostatika, Antibiotika, Antivirusmittel, Antimykotika, gentherapeutische Substanzen wie DNAs oder Antisense-Moleküle, Antikörper, Cytokine, Interferone, Radionuklide und dergleichen. Geeignete diagnostische Mittel sind zum Beispiel Kontrastmittel, radioaktive Isotrope, NMR-bildgebende Mittel und dergleichen.The particle according to the invention can be used preferably a therapeutic agent in the medical field or a drug composition or diagnostic agent include. Suitable therapeutic agents are, for example Cytostatics, antibiotics, antivirals, antifungals, gene therapy Substances such as DNAs or antisense molecules, antibodies, cytokines, interferons, Radionuclides and the like. Suitable diagnostic tools are for example contrast media, radioactive isotropes, NMR imaging Means and the like.

Das erfindungsgemäße Konjugat und das dieses umfassende, erfindungsgemäße Partikel sind daher besonders gut geeignet zur Anwendung bei Therapie und Diagnostik in der Medizin, insbesondere bei Hepatozyten-bezogenen Erkrankungen wie der Hepatitis oder dem Leberzellkarzinom.The conjugate according to the invention and this Comprehensive particles according to the invention are therefore particularly well suited for use in therapy and Diagnostics in medicine, especially with hepatocyte-related Diseases such as hepatitis or liver cell carcinoma.

In einem weiteren Gegenstand der Erfindung sind das erfindungsgemäße Konjugat und ein Partikel und/oder ein therapeutisches oder diagnostisches Mittel in jeweils getrennten Kompatimenten eines Kits kombiniert. Vorzugsweise umfaßt der Kit in getrennten Kompatimenten eine Liposomenpräparation, bei der in den Liposomen das erfindungsgemäße Konjugat eingeschlossen ist, und getrennt davon das therapeutische oder diagnostische Mittel. Vor der Anwendung kann dann die Liposomenpräparation mit dem therapeutischen oder diagnostischen Mittel beladen werden.In another subject of Invention are the conjugate of the invention and a particle and / or a therapeutic or diagnostic Means combined in separate compliments of a kit. Preferably includes the kit in separate compliments a liposome preparation, in which the conjugate according to the invention is enclosed in the liposomes and, separately, the therapeutic or diagnostic agent. The liposome preparation can then be mixed with the therapeutic one before use or diagnostic agents.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von nicht einschränkend zu verstehenden Beispielen näher erläutert.The invention is described below from not limiting explained examples to understand.

BeispieleExamples

Abkürzungen:Abbreviations:

CT Cholyltaurin
DCCI Dicyclohexylcarbodiimid
DMPG 1,2-O-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol)
DMPC 1,2-O-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin
DmyPC 1,2-O-Dimyristoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin
DNPC 1,2-O-Dinervonoyl-sn-glycero-3-phosphocholin
DPPC 1,2-O-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin
DSPE 1,2-O-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin
DSPG 1,2-O-Distearoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol)
Glutaryl-DSPE N-Glutaryl-1,2-O-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin
LCT Lithocholyltaurin
LCT-DSPE Dinatrium-3-(1,2-O-distearoyl-sn-glycero-3-phospho-2'-ethanolamidosuccinyl)-ethoxy-cholan-24-oyl-2'- aminoethansulfonat
Ph₂-DiOC18 3,3'-Dioctadecyl-5,5'-diphenyloxacarbocyaninchlorid
PC Phosphatidylcholin
POPC 1-O-Palmitoyl-2-0-oleoyl-sn-glycero-l-phosphocholin
UDCT UrsodeoxycholyltaurinCT cholyltaurine
DCCI dicyclohexylcarbodiimide
DMPG 1,2-O-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-rac- (1-glycerol)
DMPC 1,2-O-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
DmyPC 1,2-O-dimyristoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
DNPC 1,2-O-dinervonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
DPPC 1,2-O-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
DSPE 1,2-O-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
DSPG 1,2-O-distearoyl-sn-glycero-3-phospho-rac- (1-glycerol)
Glutaryl-DSPE N-glutaryl-1,2-O-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
LCT lithocholyl taurine
LCT-DSPE disodium 3- (1,2-O-distearoyl-sn-glycero-3-phospho-2'-ethanolamidosuccinyl) ethoxy-cholan-24-oyl-2'-aminoethanesulfonate
Ph ₂ -DiOC18 3,3'-dioctadecyl-5,5'-diphenyloxacarbocyanine chloride
PC phosphatidylcholine
POPC 1-O-palmitoyl-2-0-oleoyl-sn-glycero-l-phosphocholine
UDCT Ursodeoxycholyltaurine

Beispiel 1: Herstellung eines erfindungsgemäßen KonjugatsExample 1: Production of a conjugate according to the invention

(1) Herstellung von 3α-(2-Hydroxyethoxy)-5β-cholan-24-säure Literatur: G. Wess et al., Tetrahedron Letters 33, 195–198 (1992)(1) Preparation of 3α- (2-hydroxyethoxy) -5β-cholan-24-acid Literature: G. Wess et al., Tetrahedron Letters 33, 195-198 (1992)

(1-1) Synthese von 3α-Hydroxy-5β-cholan-24-säure-methylester(1-1) Synthesis of 3α-hydroxy-5β-cholan-24-acidic acid methyl ester

In 150 ml absolutiertem Methanol wurden 15 g 3α-Hydroxy-5βcholan-24-säure (39,8 mMole) gelöst und mit 70 μl konzentrierter Salzsäure versetzt. Nach 4-stündigem Erhitzen unter Rückfluss wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und das erhaltene Rohprodukt wurde durch Umkristallisation in Me-OH/Wasser gereinigt. Ausbeute: 4,3 g (36,6 mMole, 92 %).In 150 ml of absolute methanol 15 g of 3α-hydroxy-5βcholan-24-acid (39.8 mmol) dissolved and with 70 μl concentrated hydrochloric acid added. After 4 hours Reflux became the solvent removed in vacuo and the crude product obtained was recrystallized in Me-OH / water cleaned. Yield: 4.3 g (36.6 mmol, 92%).

(1-2) Synthese von 3α-(2-Propenoxy)-5β-cholan-24-säuremethylester(1-2) Synthesis of 3α- (2-propenoxy) -5β-cholan-24-acidic acid methyl ester

Unter Argonatmosphäre wurden 5 g (12,8 mMole) 3a-Hydroxy-5ßcholan-24-säure-methylester und 6,5 ml Diisopropyl-ethyl-amin in 15 ml wasserfreiem DMF gelöst und auf Siedetemperatur erhitzt. Die Zugabe von 15 ml Allylbromid (173 mMole) erfolgte tropfenweise über einen Zeitraum von 8 h. Anschließend wurden das überschüssige Allylbromid, gebildetes HBr und das Diisopropyl-ethyl-amin durch Destillation bei Normaldruck, das Lösungsmittel durch Destillation im Hochvakuum entfernt. Der abgekühlte Rückstand wurde in Ether aufgenommen und säulenchromatographisch im Laufmittel Cyclohexan/Essigester 30/1 (v/v) gereinigt. Ausbeute: 4,2 g (9,8 mMole, 77%).Under an argon atmosphere 5 g (12.8 mmol) of methyl 3a-hydroxy-5-cholane-24-acid and 6.5 ml of diisopropyl-ethyl-amine dissolved in 15 ml of anhydrous DMF and on Boiling temperature heated. The addition of 15 ml allyl bromide (173 mmol) was done dropwise over a period of 8 h. Then the excess allyl bromide, HBr and the diisopropyl-ethyl-amine formed by distillation at normal pressure, the solvent removed by distillation in a high vacuum. The cooled residue was taken up in ether and by column chromatography in the mobile phase cyclohexane / ethyl acetate 30/1 (v / v) cleaned. Yield: 4.2 g (9.8 mmol, 77%).

(1-3) Synthese von 3α-(2-Oxoethoxy)-5β-cholan-24-säuremethylester(1-3) Synthesis of 3α- (2-oxoethoxy) -5β-cholan-24-acidic acid methyl ester

Zu einer Lösung von 3,5 g 3α-(2-Propen)-5β-cholan-24-säuremethylester (8,1 mMole) und 56mg Osmiumtetraoxid (0,21 mMole) in 50 ml Dioxan und 10 ml Wasser wurden innerhalb von 45 min in kleinen Portionen 4,5 g Natriumperiodat (21 mMole) gegeben. Nach 10-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde das bis dahin ausgefallene Salz abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Die Reinigung erfolgte chromatographisch im Laufmittelgemisch Cyclohexan/Essigester 5/1 (v/v). Ausbeute: 2,8 g (6,5 mMole, 80%).To a solution of 3.5 g of methyl 3α- (2-propene) -5β-cholan-24-ester (8.1 mmol) and 56 mg of osmium tetraoxide (0.21 mmol) in 50 ml of dioxane and 10 ml of water were added in small portions within 45 min 4.5 g of sodium periodate (21 mmol) were added. After stirring for 10 hours The salt which had precipitated until then was filtered off at room temperature and the solvent removed in vacuum. The cleaning was carried out chromatographically in Mobile phase mixture cyclohexane / ethyl acetate 5/1 (v / v). Yield: 2.8 g (6.5 mmol, 80%).

(1-4) Synthese von 3α-(2-Hydroxyethoxy)-5β-cholan-24-säuremethylester(1-4) Synthesis of 3α- (2-hydroxyethoxy) -5β-cholan-24-acidic acid methyl ester

In 40 ml eines Gemisches aus THF und Wasser im Verhältnis 4/1 (v/v) wurden 3,5 g 3α-Hydroxyethoxy-5β-cholan-24-säuremethyiester (8,1 mMole) gelöst und mit 250 mg Natriumborhydrid (6,61 mMole) versetzt. Nach 14-stündigem Rühren wurde solange 0,1 N HCl zugegeben, bis keine Wasserstoffentwicklung mehr zu beobachten war. Die organischen Bestandteile er Lösung wurden mit Ether extrahiert, die vereinigten Etherphasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde anschließend am Rotationsverdampfer entfernt. Das erhaltene Rohprodukt wurde mit Hilfe einer Flashchromatographie im Laufmittel Cyclohexan/Essigester 4:1 (v/v) gereinigt. Ausbeute: 2,2 g (5,1 mMole, 63 %).In 40 ml of a mixture of THF and water in proportion 4/1 (v / v), 3.5 g of 3α-hydroxyethoxy-5β-cholan-24-acid methyl ester (8.1 mmol) dissolved and mixed with 250 mg sodium borohydride (6.61 mmol). After stirring for 14 hours as long as 0.1 N HCl was added until no more evolution of hydrogen was to be observed. The organic components of the solution were extracted with ether, the combined ether phases were over sodium sulfate dried and the solvent was subsequently removed on the rotary evaporator. The crude product obtained was using flash chromatography in the mobile phase cyclohexane / ethyl acetate 4: 1 (v / v) cleaned. Yield: 2.2 g (5.1 mmol, 63%).

(1-5) Synthese von 3α-(2-Hydroxyethoxy)-5β-cholan-24-säure(1-5) Synthesis of 3α- (2-hydroxyethoxy) -5β-cholan-24-acid

Die Verseifung von 1 g 3α-(2-Hydroxyethoxy)-5β-cholan-24-säure-methylester (2,3 mMole) erfolgte durch vierstündiges Erhitzen unter Rückfluss in einer Lösung von 260 mg Kaliumhydroxid (4,6 mMole) in 20 ml Methanol und 5 ml Wasser. Nach Abkühlung wurde diese Lösung mit 250 ml verdünnter Salzsäure versetzt und 3-mal mit jeweils 200 ml Ether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Zur Reinigung des erhaltenen Produktes wurde eine Chromatographie mit einem Gemisch aus Cyclohexan/Essigester/Essigsäure in einem Verhältnis von 70/30/1 (v/v/v) als Laufmittel durchgeführt.
Ausbeute: 0,89 g (2,1 mMole, 92%).The saponification of 1 g of methyl 3α- (2-hydroxyethoxy) -5β-cholan-24-acid (2.3 mmol) was carried out by refluxing for four hours in a solution of 260 mg of potassium hydroxide (4.6 mmol) in 20 ml Methanol and 5 ml water. After cooling, this solution was mixed with 250 ml of dilute hydrochloric acid and extracted 3 times with 200 ml of ether each time. The combined organic phases were dried over sodium sulfate and the solvent was removed in vacuo. To purify the product obtained, chromatography was carried out using a mixture of cyclohexane / ethyl acetate / acetic acid in a ratio of 70/30/1 (v / v / v) as the eluent.
Yield: 0.89 g (2.1 mmol, 92%).

(2) Synthese von 3β-(2-Hydroxyethoxy)-5β-cholan-24-säure(2) Synthesis of 3β- (2-hydroxyethoxy) -5β-cholan-24-acid

Zu einer Lösung von 10 g 3α-Hydroxy-5β-cholan-24-säure (26,6 mMole) in 10 ml getrocknetem und frisch destilliertem Pyridin wurden unter Argonatmosphäre 2,6 ml Methansulfonsäurechlorid (32 mMole) langsam zugetropft. Während dieser Zeit und noch weitere 30 min lang wurde der Reaktionsansatz auf 0°C gekühlt. Anschließend wurde noch 2 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Der gebildete Methansulfonsäurester wurde ohne Reinigung in einem Gemisch aus 40 ml wasserfreiem Glycol und 10 ml frisch destilliertem Pyridin gelöst und 2 h lang bei 100 °C gerührt. Nach dem Abkühlen wurde diese Lösung in 500 ml 0,1 N HCl gegeben und die organischen Bestandteile wurden drei Mal mit jeweils 500 ml Ether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt. Die Reinigung des Rohproduktes wurde auf chromatograsphischem Wege mit dem Laufmittel Cyclohexan/Essigester/Essigsäure 70/30/1 (v/v/v) durchgeführt. Ausbeute: 3,8 g (9,0 mMole, 38%).To a solution of 10 g of 3α-hydroxy-5β-cholan-24-acid (26.6 mmol) in 10 ml of dried and freshly distilled pyridine under an argon atmosphere 2.6 ml methanesulfonic acid chloride (32 mmol) was slowly added dropwise. While During this time and for a further 30 minutes, the reaction mixture was to 0 ° C cooled. Then was Stirred for a further 2 h at room temperature. The methanesulfonic acid ester formed was in a mixture of 40 ml of anhydrous glycol and 10 ml of freshly distilled pyridine and stirred at 100 ° C for 2 hours. To cooling became this solution added to 500 ml of 0.1 N HCl and the organics were extracted three times with 500 ml of ether each time. The combined organic phases were about Dried sodium sulfate and the solvent was on a rotary evaporator away. The purification of the crude product was carried out on chromatographic Ways with the mobile phase cyclohexane / ethyl acetate / acetic acid 70/30/1 (v / v / v) performed. Yield: 3.8 g (9.0 mmol, 38%).

(3) Herstellung der Natrium-3-(2-hydroxyethoxy)-5β-cholan-24-oyl)-2'-aminoethansulfonate(3) Preparation of sodium 3- (2-hydroxyethoxy) -5β-cholan-24-oyl) -2'-aminoethanesulfonate

(3-1) Synthese der 3-(2-Acetyl-ethoxy)-5β-cholan-24-säuren(3-1) Synthesis of 3- (2-acetyl-ethoxy) -5β-cholan-24-acids

Zu einer Lösung von 1 g 3-(2-Hydroxyethoxy)-5β-cholan-24-säure (2,4 mMole) in 15 ml getrocknetem und frisch destilliertem Pyridin wurden 4 ml Acetanhydrid gegeben und der Reaktionsansatz wurde 1 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Um überschüssiges Acetanhydrid und eventuell gebildetes gemischtes Anhydrid zu hydrolysieren wurden 8 ml Wasser zugegeben. Pyridin, Wasser und Essigsäure wurden anschließend azeotrop mit Toluol im Vakuum entfernt. Die Reinigung des Produktes erfolgte durch Chromatographie unter erhöhtem Druck im Laufmittel Cyclohexan/Essigester/Essigsäure 80/20/1 (v/v/v).
3α-(2-Acetyl-ethoxy)-5β-cholan-24-säure:
Ausbeute: 870 mg (1,9 mMole, 79 %); Schmelzpunkt: 107 °C
3β-(2-Acetyl-ethoxy)-5β-cholan-24-säure:
Ausbeute: 980 mg (2,1 mMole, 88 o); Schmelzpunkt: 109 °C4 ml of acetic anhydride were added to a solution of 1 g of 3- (2-hydroxyethoxy) -5β-cholan-24-acid (2.4 mmol) in 15 ml of dried and freshly distilled pyridine and the reaction mixture was stirred at room temperature for 1 h , In order to hydrolyze excess acetic anhydride and any mixed anhydride formed, 8 ml of water were added. Pyridine, water and acetic acid were then aze Removed otropically with toluene in vacuo. The product was purified by chromatography under elevated pressure in the mobile phase cyclohexane / ethyl acetate / acetic acid 80/20/1 (v / v / v).
3α- (2-acetyl-ethoxy) -5β-cholan-24-oic acid:
Yield: 870 mg (1.9 mmol, 79%); Melting point: 107 ° C
3β- (2-acetyl-ethoxy) -5β-cholan-24-oic acid:
Yield: 980 mg (2.1 mmol, 88 o); Melting point: 109 ° C

(3-2) Synthese der Natrium-3-(2-hydroxyethoxy)-5β-cholan-24-oyl-2'-aminoethansulfonate(3-2) Synthesis of sodium 3- (2-hydroxyethoxy) -5β-cholan-24-oyl-2'-aminoethanesulfonate

In 10 ml getrocknetem Dioxan wurden unter Schutzgasatmosphäre 660 mg (1,4 mMole) 3-(2-Acetylethoxy)-5β-cholan-24-säure, 430 mg (2,1 mMole) DCCI und 240 mg (2,1 mMole) N-Hydroxysuccinimid gelöst, und der Reaktionsansatz wurde bei Raumtemperatur 12 h lang gerührt. Der während der Reaktion ausfallende N,N-Dicyclohexanharnstoff wurde abfiltriert und das klare Filtrat mit einer Lösung aus 263 mg Taurin (2,1 mMole) und 177 mg Natriumhydrogencarbonat (2,1 mMole) in 5 ml Wasser versetzt. Dieser Reaktionsansatz wurde erneut 12 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Der während der Reaktion ausgefallene N,N- Dicyclohexanharnstoff wurde wiederum abfiltriert, und Dioxan und Wasser wurden unter vermindertem Druck entfernft.In 10 ml of dried dioxane in a protective gas atmosphere 660 mg (1.4 mmol) of 3- (2-acetylethoxy) -5β-cholan-24-acid, 430 mg (2.1 mmol) of DCCI and 240 mg (2.1 mmol) of N-hydroxysuccinimide dissolved, and the reaction mixture was stirred at room temperature for 12 hours. The N, N-dicyclohexane urea which precipitates during the reaction was filtered off and the clear filtrate was filtered out with a solution 263 mg taurine (2.1 mmol) and 177 mg sodium hydrogen carbonate (2.1 mmol) in 5 ml of water. This approach was repeated Stirred at room temperature for 12 h. The while the reaction failed N, N-dicyclohexane urea was filtered off again, and dioxane and water were reduced Pressure removed.

Die Abspaltung der Acetylschutzgruppe erfolgte durch 2-stündiges Erhitzen in 50 ml 1 N NaOH unter Rückfluss. Das Produkt wurde durch Adsorptionschromatographie an Serdolit® PAD-1 aus der Reaktionsmischung entfernt und säulenchromatographisch bei erhöhtem Druck im Laufmittel CHCl₃/MeOH 3/1 (v/v) gereinigt.
Natrium-(3α-(2-hydroxyethoxy)-5β-cholan-24-oyl)-2'aminoethansulfonat:
Ausbeute: 550 mg (1,0 mMole, 72 %); Schmelzpunkt: 223 °C.
Natrium-(3β-(2-hydroxyethoxy)-5β-cholan-24-oyl)-2'aminoethansulfonat:
Ausbeute: 650 mg (1,2 mMole, 85 %); Schmelzpunkt: 214 °C.The acetyl protective group was split off by heating under reflux in 50 ml of 1N NaOH for 2 hours. The product was removed from the reaction mixture by adsorption chromatography on Serdolit® PAD-1 and purified by column chromatography at elevated pressure in a CHCl ₃ / MeOH 3/1 (v / v) solvent.
Sodium (3α- (2-hydroxyethoxy) -5β-cholan-24-oyl) -2'aminoethansulfonat:
Yield: 550 mg (1.0 mmol, 72%); Melting point: 223 ° C.
Sodium (3β- (2-hydroxyethoxy) -5β-cholan-24-oyl) -2'aminoethansulfonat:
Yield: 650 mg (1.2 mmol, 85%); Melting point: 214 ° C.

(4) Herstellung der Dinatrium-3-(1,2-O-distearoyl-sn-glycero-3-phospho-2'-ethanolamidosuccinyl)-ethoxy-5β-cholan-24-oyl-2'aminoethansulfonate(4) Preparation of disodium 3- (1,2-O-distearoyl-sn-glycero-3-phospho-2'-ethanolamidosuccinyl) ethoxy-5β-cholan-24-oyl-2'aminoethanesulfonate

(4-1) Synthese der Natrium-3-succinylethoxy-5β-cholan-24-oyl-2'-aminoethansulfonate(4-1) Synthesis of sodium 3-succinylethoxy-5β-cholan-24-oyl-2'-aminoethanesulfonate

Zu einer Lösung von 200 mg (0,38 mMole) Natrium-3-(2-Hydroxyethoxy)-5β-cholan-24-oyl-2'-aminoethansulfonat in 5 ml getrocknetem und frisch destilliertem Pyridin wurden 120 mg (1,2 mMole) Bernsteinsäureanhydrid gegeben und 12 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Überschüssiges Bernsteinsäureanhydrid und eventuell gebildetes gemischtes Anhydrid wurden durch einstündiges Rühren nach Zugabe von 2 ml Wasser hydrolysiert. Pyridin und Wasser wurden nach Beendigung der Reaktion azeotrop mit Toluol am Rotationsverdampfer entfernt. Das erhaltene Rohprodukt wurde über eine Säulenchromatographie im Laufmittel CHCl₃/MeOH 2/1 (v/v) gereinigt.
Natrium-3α-(succinyl-ethoxy)-5β-cholan-24-oyl-2'aminoethansulfonat:
Ausbeute: 170 mg (0,27 mMole, 71 %); Schmelzpunkt: 178 °C.
Natrium-3β-(succinyl-ethoxy)-5β-cholan-24-oyl-2'aminoethansulfonat:
Ausbeute: 190 mg (0,30 mMole, 79 %); Schmelzpunkt: 176 °C.To a solution of 200 mg (0.38 mmol) of sodium 3- (2-hydroxyethoxy) -5β-cholan-24-oyl-2'-aminoethanesulfonate in 5 ml of dried and freshly distilled pyridine was added 120 mg (1.2 mmol ) Succinic anhydride and stirred at room temperature for 12 h. Excess succinic anhydride and any mixed anhydride formed were hydrolyzed by stirring for 1 hour after adding 2 ml of water. After the reaction, pyridine and water were removed azeotropically with toluene on a rotary evaporator. The crude product obtained was purified by column chromatography in CHCl ₃ / MeOH 2/1 (v / v).
Sodium 3α- (succinyl-ethoxy) -5β-cholan-24-oyl-2'aminoethansulfonat:
Yield: 170 mg (0.27 mmol, 71%); Melting point: 178 ° C.
Sodium 3β- (succinyl-ethoxy) -5β-cholan-24-oyl-2'aminoethansulfonat:
Yield: 190 mg (0.30 mmol, 79%); Melting point: 176 ° C.

(4-2) Synthese der Dinatrium-3-(1,2-O-distearoyl-sn-glycero-3-phospho-2'-ethanolamidosuccinyl)-ethoxy-5β-cholan-24-oyl-2'aminoethansulfonate (1)(4-2) Synthesis of disodium 3- (1,2-O-distearoyl-sn-glycero-3-phospho-2'-ethanolamidosuccinyl) ethoxy-5β-cholan-24-oyl-2'aminoethanesulfonate ( 1 )

Eine Lösung von 250 mg (0,39 mMol) Natrium-3-(2-ethoxy)-5βcholan-24-oyl-2'-aminoethansulfonat in 3 ml wasserfreiem DMF wurde unter Argonatmosphäre mit 116 mg DCCI (0,58 mMole) und 65 mg (0,58 mMol) N-Hydroxysuccinimid versetzt und 16 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Der ausgefallene Niederschlag wur= de abgesaugt und mit 2 ml kaltem DMF gewaschen. Das aktivierte Gallensalzderivat wurde durch Zugabe von 50 ml Ether ausgefällt, der Niederschlag nach kurzer Zentrifugation vom Überstand getrennt und in einem Gemisch aus 10 ml CHCl₃, 5 ml MeOH und 200 μl Wasser gelöst.A solution of 250 mg (0.39 mmol) of sodium 3- (2-ethoxy) -5βcholan-24-oyl-2'-aminoethanesulfonate in 3 ml of anhydrous DMF was added under an argon atmosphere with 116 mg of DCCI (0.58 mmol) and 65 mg (0.58 mmol) of N-hydroxysuccinimide were added and the mixture was stirred at room temperature for 16 h. The precipitate was filtered off and washed with 2 ml of cold DMF. The activated bile salt derivative was precipitated by adding 50 ml of ether, the precipitate was separated from the supernatant after a short centrifugation and dissolved in a mixture of 10 ml of CHCl ₃ , 5 ml of MeOH and 200 μl of water.

Zu dieser Lösung wurden 300 mg DSPE (0,4 mMole) und 400 μl 1 N NaOH (0,4 mMole) gegeben und der Reaktionsansatz wurde anschließend 2 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde nach Beendigung der Reaktion im Vakuum entfernt und das erhaltene Produkt wurde mittels einer Säulenchromatographie mit dem Laufmittel CHCl₃/MeOH/H₂O 9/3/0,1 (v/v/v) gereinigt.
Dinatrium-3α-(1,2-O-distearoyl-sn-glycero-3-phospho-2'ethanolamidosuccinyl)-ethoxy-5β-cholan-24-oyl-2'aminoethansulfonat:
Ausbeute: 170 mg (0,12 mMole, 31%); Schmelzpunkt: 211 °C.
R_f-Werte : 0,08 CHCl₃/MeOH/H₂O 9/3/0,1 (v/v/v)
0,10 CHCl₃/MeOH 2/1 (v/v)
¹H-NMR: δ = 0,69 (s, 3H, CH₃-18); 0,90 (t, J = 8, 6H, 2 × H₃C-CH₂-); 0,95 (s, 3H, CH₃-19); 0,95 (d, J = 7 Hz, 3H, CH₃- 21); 2,32 (dd, J = 7, 4 H, 2 × -CH₂-CH₂-CH₂-O-CO-); 2,56 (t , J = 7, 2H, -CO-CH₂-CH₂-CO-O-); 2,69 (t, J = 7, 2H, -NH-CO-CH₂-CH₂-CO-); 3,01 (t, J = 7 Hz, 2H, -CH₂-SO₃ ^–); 3,35 (m, 1H, CH-3); 3,44 (m, 2H, -O-CH₂-CH₂-NH-); 3,61 (t, J = 7 Hz, 2H, -HN-CH₂-CH₂-SO₃Na); 3,70 (t, 2H, J = 6 Hz, -CH₂-O-CH-); 3,81–4,18 (m b, 6H) ; 4,21 (t, 2H, J = 6 Hz, -CO-O-CH₂-); 5,23 (m, -0-CH₂-HCOH-CH₂-O-);
(Lösungsmittel: CDCl₃/CD₃OD/D₂O 2/1/0,1 (v/v/v) )
Massenspektrum: m/z = 1424 (M+Na)⁺, 1402 (M+H)⁺, 1380 (M-Na+2H)⁺, 1378 (M-Na)^–, 677 (M-2Na)^2–
Dinatrium-3β-(1,2-O-distearoyl-sn-glycero-3-phospho-2'ethanolamidosuccinyl)-ethoxy-5β-cholan-24-oyl-2'aminoethansulfonat:
Ausbeute: 220 mg (0,16 mMol, 41%); Schmelzpunkt: 206 °C.
R_f-Werte : 0,08 CHCl₃/MeOH/H₂O 9/3/0,1 (v/v/v)
0,03 CHCl₃/MeOH/H₂O 8/2/0,1 (v/v/v)
¹H-NMR: δ = 0,68 (s, 3H, CH₃-18); 0,92 (t, J = 8, 6H, 2 × H₃C-CH₂-); 0,96 (d, J = 7 Hz, 3H, CH₃-21); 0,97 (s, 3H, CH₃-19); 2,35 (dd, J = 7 , 4H, 2 × -CH₂-CH₂-CH₂-O-CO-); 2,56 (t, J = 7, 2H, -CO-CH₂-CH₂-CO-O-); 2,68 (t, J = 7, 2H, -NH-CO-CH₂-CH₂-CO-); 3,01 (t, J = 7 Hz, 2H, -CH₂-SO₃ ^–); 3,44 (m, 2H, -O-CH₂-CH₂-NH-); 3,58 (t, J = 7 Hz, 2H, -HN-CH₂-CH₂-SO₃Na); 3,62 (t, 2H, J = 6 Hz, -CH₂-O-CH-); 3,67 (m, 1H, CH-3); 3,92 –4,21 (m b, 6H); 4,21 (t, 2H, J = 6 Hz, -CO-O-CH₂-); 5,27 (m, -O-CH₂-HCOH-CH₂-O-);
(Lösungsmittel: CDCl₃/CD₃OD/D₂O 2/1/0,1 (v/v/v))
Massenspektrum: m/z = 1424 (M+Na)⁺, 1402 (M+H)⁺, 1380 (M- Na+2H)⁺, 1378 (M-Na)^–, 677 (M-2Na)^2– 300 mg of DSPE (0.4 mmol) and 400 μl of 1N NaOH (0.4 mmol) were added to this solution and the reaction mixture was then stirred at room temperature for 2 h. After the reaction had ended, the solvent was removed in vacuo and the product obtained was purified by means of column chromatography with the mobile phase CHCl ₃ / MeOH / H ₂ O 9/3 / 0.1 (v / v / v).
Disodium 3α- (1.2-O-distearoyl-sn-glycero-3-phospho-2'ethanolamidosuccinyl) -ethoxy-5β-cholan-24-oyl-2'aminoethansulfonat:
Yield: 170 mg (0.12 mmol, 31%); Melting point: 211 ° C.
R _f values: 0.08 CHCl ₃ / MeOH / H ₂ O 9/3 / 0.1 (v / v / v)
0.10 CHCl ₃ / MeOH 2/1 (v / v)
¹ H NMR: δ = 0.69 (s, 3H, CH ₃ -18); 0.90 (t, J = 8.6H, 2 x H ₃ C-CH ₂ -); 0.95 (s, 3H, CH ₃ -19); 0.95 (d, J = 7 Hz, 3H, CH _3-21); 2.32 (dd, J = 7.4 H, 2 x -CH ₂ -CH ₂ -CH ₂ -O-CO-); 2.56 (t, J = 7, 2H, -CO-CH ₂ -CH ₂ -CO-O-); 2.69 (t, J = 7, 2H, -NH-CO-CH ₂ -CH ₂ -CO-); 3.01 (t, J = 7 Hz, 2H, -CH ₂ -SO ₃ ^- ); 3.35 (m, 1H, CH-3); 3.44 (m, 2H, -O-CH ₂ -CH ₂ -NH-); 3.61 (t, J = 7 Hz, 2H, -HN-CH ₂ -CH ₂ -SO ₃ Na); 3.70 (t, 2H, J = 6 Hz, -CH ₂ -O-CH-); 3.81-4.18 (m b, 6H); 4.21 (t, 2H, J = 6 Hz, -CO-O-CH ₂ -); 5.23 (m, -0-CH ₂ -HCOH-CH ₂ -O-);
(Solvent: CDCl ₃ / CD ₃ OD / D ₂ O 2/1 / 0.1 (v / v / v))
Mass spectrum: m / z = 1424 (M + Na) ⁺ , 1402 (M + H) ⁺ , 1380 (M-Na + 2H) ⁺ , 1378 (M-Na) ^- , 677 (M-2Na) ^2–
Disodium 3β- (1,2-O-distearoyl-sn-glycero-3-phospho-2'ethanolamidosuccinyl) -ethoxy-5β-cholan-24-oyl-2'aminoethansulfonat:
Yield: 220 mg (0.16 mmol, 41%); Melting point: 206 ° C.
R _f values: 0.08 CHCl ₃ / MeOH / H ₂ O 9/3 / 0.1 (v / v / v)
0.03 CHCl ₃ / MeOH / H ₂ O 8/2 / 0.1 (v / v / v)
¹ H NMR: δ = 0.68 (s, 3H, CH ₃ -18); 0.92 (t, J = 8.6H, 2 x H ₃ C-CH ₂ -); 0.96 (d, J = 7 Hz, 3H, CH ₃ -21); 0.97 (s, 3H, CH ₃ -19); 2.35 (dd, J = 7.4H, 2 x -CH ₂ -CH ₂ -CH ₂ -O-CO-); 2.56 (t, J = 7, 2H, -CO-CH ₂ -CH ₂ -CO-O-); 2.68 (t, J = 7, 2H, -NH-CO-CH ₂ -CH ₂ -CO-); 3.01 (t, J = 7 Hz, 2H, -CH ₂ -SO ₃ ^- ); 3.44 (m, 2H, -O-CH ₂ -CH ₂ -NH-); 3.58 (t, J = 7 Hz, 2H, -HN-CH ₂ -CH ₂ -SO ₃ Na); 3.62 (t, 2H, J = 6 Hz, -CH ₂ -O-CH-); 3.67 (m, 1H, CH-3); 3.92 -4.21 (mb, 6H); 4.21 (t, 2H, J = 6 Hz, -CO-O-CH ₂ -); 5.27 (m, -O-CH ₂ -HCOH-CH ₂ -O-);
(Solvent: CDCl ₃ / CD ₃ OD / D ₂ O 2/1 / 0.1 (v / v / v))
Mass spectrum: m / z = 1424 (M + Na) ⁺ , 1402 (M + H) ⁺ , 1380 (M- Na + 2H) ⁺ , 1378 (M-Na) ^- , 677 (M-2Na) ^2–

Beispiel 2:Example 2:

Herstellung von erfindungsgemäßen Partikeln am Beispiel von LiposomenProduction of particles according to the invention using the example of liposomes

Die Herstellung von Liposomen erfolgte in einer modifizierten Form nach der Extrusionsmethode von MacDonald et al., Biochim. Biophys. Acta. 1061, 297–303. (1991).Liposomes were produced in a modified form using the MacDonald extrusion method et al., Biochim. Biophys. Acta. 1061, 297-303. (1991).

Die einzelnen Lipide, die in der Liposomenmembran enthalten sein sollten, wurden in definierter Konzentration in Chloroform (POPO, DPPC, DNPC, DMPC, DMyPC, Cholesterol) oder in einem Gemisch aus Chloroform, Methanol und dest. Wasser im Verhältnis 1/1/0,02 (v/v/v) (DSPG, DMPG, 3-LCT-DSPE) gelöst. Diese Stammlösungen wurden bei –20°C gelagert. Zur Herstellung von Liposomen gewünschter Lipidzusammensetzung wurden die entsprechenden Aliquoten der Lipidstammlösungen in einen 25-ml-Rundkolben überführt. Die Lipidzusammensetzung der verwendeten Liposomen in Mol-% ist in Tab. 1 angegeben.The individual lipids that are in the Liposome membrane should be contained in a defined concentration in chloroform (POPO, DPPC, DNPC, DMPC, DMyPC, cholesterol) or in a mixture of chloroform, methanol and dist. Water in the ratio 1/1 / 0.02 (v / v / v) (DSPG, DMPG, 3-LCT-DSPE) solved. These stock solutions were stored at –20 ° C. For the production of liposomes of the desired lipid composition the corresponding aliquots of the lipid stock solutions in transferred a 25 ml round bottom flask. The The lipid composition of the liposomes used in mol% is shown in Tab. 1 specified.

Tabelle 1. Lipidzusammensetzung der verwendeten Liposomen in Mol-%.

Table 1. Lipid composition of the liposomes used in mol%.

Die resultierende Lipidmischung wurde im Vakuum vom Lösungsmittel befreit und anschließend 45 min lang im Ölpumpenvakuum getrocknet. Für die Liposomenpräparation wurde folgender Puffer (pH 7,4) verwendet (Liposomenpuffer):

The resulting lipid mixture was freed from the solvent in vacuo and then dried in an oil pump vacuum for 45 min. The following buffer (pH 7.4) was used for the liposome preparation (liposome buffer):

Der verwendete Puffer entsprach in seiner Zusammensetzung dem für die Hepatocytenisolierung verwendeten Perfusionspuffer. Auf Glucose wurde verzichtet, um die Lagerfähigkeit der Liposomen zu erhöhen. Vor seiner Verwendung wurde der Liposomenpuffer durch eine Membran mit einem Porendurchmesser von 220 um filtriert. Um die Lipide zu resuspendieren wurde die gewünschte Menge an Liposomenpuffer zur getrockneten Lipidmischung gegeben und es wurde 15 min lang bei 40 °C und 50 Upm mit Hilfe eines Rotationsverdampfers gerührt. Durch die Zugabe von 10–20 Glasperlen (710–1018 microns) konnte das Resuspen dieren der Lipide erheblich beschleunigt weden. Die zugegebene Menge an Liposomenpuffer wurde so gewählt, dass die erhaltene Suspension 10 – 40 mg Lipid/ml enthielt. Die Lipidsuspension wurde 30 s lang bei 1000 × g zentrifugiert und danach 2 h lang bei Raumtemperatur ruhen gelassen. Schließlich wurden die entstandenen multilamellaren Vesikel mit Hilfe einer Extrusionsapparatur LiposoFast^® (Milsch-Equipment, Laudenbach, Deutschland) 13-mal durch eine Polycarbonatmembran (LFM-200, Milsch-Equipment) mit einem Porendurchmesser von 200 nm gedrückt und anschließend 21-mal durch zwei übereinanderliegende Polycarbonatmembranen (LFM-100, Milsch-Equipment) mit einem Porendurchmesser von 100 nm gedrückt. Die Liposomen wurden bei 4°C gelagert und nicht länger als 7 Tage nach ihrer Herstellung benutzt.The composition of the buffer used corresponded to that of the perfusion buffer used for hepatocyte isolation. No glucose was used to increase the shelf life of the liposomes. Before use, the liposome buffer was filtered through a membrane with a pore diameter of 220 µm. In order to resuspend the lipids, the desired amount of liposome buffer was added to the dried lipid mixture and the mixture was stirred for 15 minutes at 40 ° C. and 50 rpm using a rotary evaporator. The addition of 10–20 glass beads (710–1018 microns) significantly accelerated the resuspension of the lipids. The amount of liposome buffer added was chosen so that the suspension obtained contained 10-40 mg lipid / ml. The lipid suspension was centrifuged at 1000 × g for 30 s and then left at room temperature for 2 hours. Finally, the resulting multilamellar vesicles were pressed 13 times through a polycarbonate membrane (LFM-200, Milsch equipment) with a pore diameter of 200 nm using a LiposoFast ^® extrusion apparatus (Milsch-Equipment, Laudenbach, Germany) and then 21 times through two superimposed polycarbonate membranes (LFM-100, milk equipment) with a pore diameter of 100 nm. The liposomes were stored at 4 ° C and used no longer than 7 days after their preparation.

Die Größenbestimmung der hergestellten Liposomen erfolgte mittels der PCS (Photonen-Korrelations-Spektroskopie) (C. Washington, 1992, in M.H. Rubinstein, ed., Ellis Horwood, Ltd., London, England.). Die Ergebnisse mittleren Durchmesser (gemessen aus jeweils 9 individuellen Präparationen, angegeben sind die Mittelwerte und die Standardabweichung) für die Gallensalz tragenden Liposomen und die Kontroll-Liposomen sind in Tab. 2 gezeigt.Sizing the manufactured Liposomes were carried out using PCS (photon correlation spectroscopy) (C. Washington, 1992, in M.H. Rubinstein, ed., Ellis Horwood, Ltd., London, England.). The results mean diameter (measured from 9 individual preparations each, the mean values and the standard deviation) are given for the bile salt carrying liposomes and the control liposomes are shown in Table 2.

Tabelle 2.

Table 2.

Die hergestellten Liposomen mit einem mittleren Durchmesser von etwa 120 nm sind für die Untersuchung der Bindung von gallensalztragenden Liposomen an Hepatozyten sowohl in vitro als auch in vivo sehr gut verwendbar.The liposomes produced with a average diameters of about 120 nm are for the investigation of the binding of bile salt-bearing liposomes on hepatocytes both in vitro as well as usable in vivo.

Die mögliche Struktur für das Gallensalz tragende Liposom ist in 2A gezeigt, um die Größenverhältnisse zu veranschaulichen (die gezeigte Größe soll einem Liposomendurchmesser von 100 nm entsprechen). Die Liposomenmembran 1 weist so genannte Gallensalzschichten 2 auf. 2B zeigt einen modellhaften, vergrößerten Ausschnitt aus der Membran eines solchen Gallensalz tragenden Liposoms.The possible structure for the bile salt-bearing liposome is in 2A shown to illustrate the size relationships (the size shown should correspond to a liposome diameter of 100 nm). The liposome membrane 1 has so-called bile salt layers 2 on. 2 B shows a model, enlarged section of the membrane of such a bile salt-bearing liposome.

Beispiel 3:Example 3:

Inhibierung des Gallensalztransports in Hepatocyten durch das erfindungsgemäße Konjugat tragende PartikelInhibition of bile salt transport in hepatocytes by the conjugate carrying particles according to the invention

Zu dieser Untersuchung wurde die Aufnahme von radioaktiv markierten Substanzen in frisch isolierte Hepatozyten mit Hilfe der Zentrifugalfiltrationstechnik durch eine Silikonölschicht bestimmt (Klingenberg, M. & Pfaff, E., Methods Enzymol. 10, 680-684). Für die Bestimmung der Aufnahmegeschwindigkeit in Anwesenheit von Liposomen wurden Kontroll-Liposomen oder 3-β- LCT-DSPE tragende Liposomen in Konzentrationen von 0,5, 2 und 5 mM liposomalem PC verwendet. Für jede Liposomensorte und jede Liposomenkonzentration wurden jeweils drei Messreihen durchgeführt. Bei den Versuchen mit Liposomen wurden entsprechende Mengen Liposomenstammlösung zu der CT-Lösung gegeben und die CT und Liposomen enthaltenden Inkubationsansätze wurden vor Zugabe der Zellen mindestens 15 min lang auf 37 °C temperiert. Durch Zugabe von jeweils 400 μl der Zellstammlösung, die eine Konzentration von ungefähr 2,5 × 10⁶ Zellen/ml (5 mg/ml) aufwies, wurde die Messung der CT-Aufnahme gestartet. Über einen Zeitraum von 60 s wurden alle 10 s jeweils 100 μl aus dem Inkubationsansatz entnommen und in ein Zentrifugenröhrchen überführt, das zuvor mit 10 μl 0,77 M Perchlorsäure und 150 μl einer Silikonölmischung (AR 20:AR 200 = 1:1 (v/v) blasenfrei gefüllt worden war. Die Aufnahme wurde durch Zentrifugalfiltration gestoppt (Microfuge^® B, Beckman Instruments, München, Deutschland), wobei die Zellen aus dem wässrigen Medium durch die Silikonölschicht hindurch in die Perchlorsäurelösung überführt und dort denaturiert werden.For this investigation, the uptake of radioactively labeled substances in freshly isolated hepatocytes was determined using a centrifugal filtration technique through a layer of silicone oil (Klingenberg, M. & Pfaff, E., Methods Enzymol. 10, 680-684). Control liposomes or liposomes carrying 3-β-LCT-DSPE in concentrations of 0.5, 2 and 5 mM liposomal PC were used to determine the uptake rate in the presence of liposomes. Three series of measurements were carried out for each liposome type and each liposome concentration. Appropriate amounts were obtained in the experiments with liposomes Liposome stock solution was added to the CT solution and the incubation mixtures containing CT and liposomes were heated to 37 ° C. for at least 15 minutes before the cells were added. The measurement of the CT recording was started by adding 400 μl of the cell stock solution, which had a concentration of approximately 2.5 × 10 ⁶ cells / ml (5 mg / ml). Over a period of 60 s, 100 μl were removed from the incubation batch every 10 s and transferred to a centrifuge tube which had previously been filled with 10 μl 0.77 M perchloric acid and 150 μl of a silicone oil mixture (AR 20: AR 200 = 1: 1 (v / had been v filled) free of bubbles. uptake was stopped by centrifugal filtration (microfuge ^® B, Beckman Instruments, Munich, Germany), wherein the cells from the aqueous medium passing transferred through the silicone oil layer in the perchloric acid solution and are denatured there.

Nach Beendigung der Messung wurden die Zentrifugenröhrchen in flüssigem Stickstoff eingefroren und an der Phasengrenze zwischen Perchlorsäure und Silikonöl durchtrennt. Die Spitzen, in denen sich die denaturierten Zellen befanden, wurden einzeln in ein Szintillationsgefäß überführt und mit 250 μl einer 1:2-Mischung (v/v) von Biolute® S (Zinsser Analytik) und Xylol versetzt.After the measurement was finished the centrifuge tubes in liquid Nitrogen frozen and on the phase boundary between perchloric acid and silicone oil severed. The tips in which the denatured cells were individually transferred to a scintillation vial and with 250 μl a 1: 2 mixture (v / v) from Biolute® S (Zinsser Analytics) and xylene added.

Zur Bestimmung der eingesetzten Gesamtradioaktivität wurden jedem Ansatz zweimal 50 μl entnommen und in Flüssigkeitsszintillationsgefäße überführt. Zur Bestimmung der Radioaktivität wurden die Proben genauso behandelt wie die Spitzen, welche die denaturierten Zellen enthielten. Die Ermittlung der Proteinkonzentration bei den Aufnahmeuntersuchungen erfolgte durch sechsfache Bestimmung der Proteinkonzentration in der Zellstammlösung.To determine the total radioactivity used 50 μl twice each approach removed and transferred to liquid scintillation vials. to Determination of radioactivity the samples were treated in the same way as the tips which the denatured cells. The determination of the protein concentration the admission examinations were carried out by six-fold determination the protein concentration in the cell stock solution.

Die Auswertung der Meßwerte erfolgte gemäß folgender Gleichung:

The measured values were evaluated according to the following equation:

In dieser Gleichung bedeuten:
J : Flussrate [nMole/(min·mg Protein)]
A : Steigung der Regressionsgeraden [dpm/min]; aus 100 μl Probe
B : Gesamtradioaktivität im Ansatz [dpm]
C : Menge des Substrats [nMole]
D : Menge an Protein in 100 u1 des Inkubationsansatzes [mg/100 μl]In this equation:
J: flow rate [nmoles / (min · mg protein)]
A: slope of the regression line [dpm / min]; from 100 μl sample
B: total radioactivity in approach [dpm]
C: amount of substrate [nmoles]
D: Amount of protein in 100 μl of the incubation batch [mg / 100 μl]

Bei einer Konzentration von 2 mM liposomalem PC und gleichzeitiger Zugabe von Liposomen und CT konnte bei frisch isolierten Hepatozyten eine deutlich signifikante Gallensalz vermittelte Inhibition des CT-Transportes festgestellt werden. Bei frisch isolierten Hepatozyten zeigten 3-β-LCT-DSPE tragende Liposomen deutlich ausgeprägtere Wechselwirkungen mit den Hepatozyten als 3-α-LCT-DSPE tragende Liposomen. Ein typisches Ergebnis ist in 3 dargestellt. Sowohl die Aufnahme von radioaktivem CT in Abwesenheit als auch in Anwesenheit von Liposomen steigt im beobachteten Intervall linear mit der Zeit an. Kontroll-Liposomen üben praktisch keinen Einfluss auf die Transportgeschwindigkeit von CT aus, während 3-α-LCT-DSPE tragende Liposomen die Aufnahme von CT geringfügig, 3-β-LCT-DSPE tragende Liposomen die Aufnahme von CT deutlich inhibieren.With a concentration of 2 mM liposomal PC and simultaneous addition of liposomes and CT, a clearly significant bile salt mediated inhibition of CT transport was found in freshly isolated hepatocytes. In freshly isolated hepatocytes, liposomes bearing 3-β-LCT-DSPE showed significantly more pronounced interactions with the hepatocytes than liposomes bearing 3-α-LCT-DSPE. A typical result is in 3 shown. Both the uptake of radioactive CT in the absence and in the presence of liposomes increases linearly with time in the observed interval. Control liposomes have practically no influence on the transport speed of CT, while liposomes bearing 3-α-LCT-DSPE slightly inhibit the uptake of CT, liposomes bearing 3-β-LCT-DSPE significantly inhibit the absorption of CT.

Die Ergebnisse verdeutlichen eine spezifische Bindung der Gallensalz tragenden Liposomen an Gallensalz transportierende Proteine der Hepatozyten. Eine Aufnahme der erfindungsgemäß modifizierten Liposomen über eine Rezeptor vermittelte Endocytose wurde praktisch nicht beobachtet. Somit kann ein lysosomaler Abbauweg verhindert oder zumindest stark unterdrückt werden.The results illustrate one specific binding of the bile salt-bearing liposomes to bile salt transporting proteins of the hepatocytes. A picture of the modified according to the invention Liposomes over a receptor-mediated endocytosis was practically not observed. A lysosomal pathway can thus be prevented or at least severely repressed become.

Beispiel 4:Example 4:

Langlebige, Gallensalz tragende Partikel am Beispiel von LiposomenLong lasting, bile salt carrying particles using the example of liposomes

(1) Herstellung(1) Manufacturing

Die Präparation der langlebigen Liposomen erfolgte wie im Beispiel 2 beschrieben, wobei jedoch die in Tabelle 3 angegebene Lipidzusammensetzung verwendet wurde.Preparation of long-lived liposomes was carried out as described in Example 2, except that in Table 3 specified lipid composition was used.

Tabelle 3 Lipidzusammensetzung der langlebigen Liposomen in Mol-%

Table 3 Lipid composition of the long-lived liposomes in mol%

(2) Untersuchung der Organverteilung von langlebigen Liposomen in vivo(2) Examination of organ distribution of long-lived liposomes in vivo

Für Untersuchung der Organverteilung von langlebigen Liposomen wurden Liposomen verwendet, die mit [³H]Cholesterylhexadecylether markiert waren. Männliche Albinoratten vom Stamm Wistar S 300 (ca. 200 g) wurden durch eine intraperitoneale Injektion einer 2%igen Nembutal^®-Lösung (1,5 ml/kg Körpergewicht) narkotisiert. Die injizierte Menge an langlebigen Liposomen wurde so berechnet, dass die PC-Konzentration im Serum der Ratten 2 mM liposomales PC betrug. Die entsprechende Menge Liposomenstammlösung wurde mit 1 Vol% einer sterilen 125 mM CaCl₂-Lösung versetzt und mit Hilfe einer Kanüle über einen Zeitraum von etwa 1 min in die Vene des Hinterbeines injiziert. Nach 90 min wurde der Bauchraum der Ratten geöffnet und die Nieren und die Milz wurden entfernt. Aus dem Herzen wurde eine Blutprobe entnommen und in ein vorbereitetes 1,5-ml-Reaktionsgefäß gefüllt, das zur Vermeidung der Gerinnung EDTA enthielt. Zum Abtrennen der Erythrozyten wurde die Blutprobe bei 2000 × g 2 min lang zentrifugiert. Vom Überstand wurden 3 Aliquoten zu je 200 μl in 20-ml-Flüssigkeitsscintillationsgefäße überführt. Die Leber wurde mit 10 ml des nachfolgend angegebenen Zellpuffers perfundiert und anschließend entfernt. Nieren und Milz wurden jeweils mit 10 ml eiskaltem Zellpuffer versetzt, die Leber wurde mit 15 ml eiskaltem Zellpuffer versetzt, und die Organe wurden anschließend homogenisiert. Das Gesamtvolumen des Homogenisats wurde bestimmt und jeweils 3 Aliquoten zu je 200 μl wurden in 20-ml-Flüssigkeitsscintillationsgefäße überführt. In jedes der 20-ml-Flüssigkeitsscintillationsgefäße wurden 1 ml Biotute S^® (Zinnser) gegeben und die Proben wurden wie beschrieben der Flüssigkeitsscintillationsmessung zugeführt.Liposomes labeled with [ ³ H] cholesteryl hexadecyl ether were used to study the organ distribution of long-lived liposomes. Male albino rats of the Wistar S 300 strain (approx. 200 g) were anesthetized by intraperitoneal injection of a 2% Nembutal ^® solution (1.5 ml / kg body weight). The amount of long-lived liposomes injected was calculated so that the PC concentration in the serum of the rats was 2 mM liposomal PC. The corresponding amount of stock liposome solution was mixed with 1% by volume of a sterile 125 mM CaCl ₂ solution and injected into the vein of the hind leg over a period of about 1 min using a cannula. After 90 minutes, the rats' abdominal cavity was opened and the kidneys and spleen were removed. A blood sample was taken from the heart and placed in a prepared 1.5 ml reaction tube containing EDTA to prevent coagulation. To separate the erythrocytes, the blood sample was centrifuged at 2000 × g for 2 min. 3 aliquots of 200 μl each were transferred from the supernatant to 20 ml liquid scintillation vials. The liver was perfused with 10 ml of the cell buffer indicated below and then removed. Kidneys and spleen were each treated with 10 ml of ice-cold cell buffer, the liver was mixed with 15 ml of ice-cold cell buffer, and the organs were then homogenized. The total volume of the homogenate was determined and 3 aliquots of 200 μl each were transferred to 20 ml liquid scintillation vials. 1 ml of Biotute S ^® (tin) was added to each of the 20 ml liquid scintillation vials and the samples were fed to the liquid scintillation measurement as described.

Zellpuffer:

Cell buffer:

Das Ergebnis der Organverteilung nach 90 minütiger Infusion ist in 4 gezeigt. Die langlebigen, Gallensalz tragenden Liposomen (schraffierte Säulen) sind wesentlich spezifischer in der Leber vorhanden als die Kontroll-Liposomen (schwarze Spalte). Milz und Niere sind wie bei der Kontrolle praktisch nicht betroffen.The result of organ distribution after 90 minutes of infusion is in 4 shown. The long-lived, bile salt-bearing liposomes (hatched columns) are much more specifically present in the liver than the control liposomes (black column). As in the control, the spleen and kidney are practically not affected.

(3) Anreicherung der erfindungsgemäßen Liposomen auf der Hepatocytenoberfläche(3) Enrichment of the liposomes according to the invention on the hepatocyte surface

Für die Untersuchung der Anreicherung von langlebigen Liposomen an Leberhepatocygten wurden Liposomen verwendet, die 0,3 Mol-% des fluoreszierenden Farbstoffes Ph₂-DiOC18 (erhältlich von Molecular Probes Europe, Leiden, Holland) enthielten.Liposomes containing 0.3 mol% of the fluorescent dye Ph ₂ -DiOC18 (available from Molecular Probes Europe, Leiden, Holland) were used to investigate the accumulation of long-lived liposomes on liver hepatocytes.

Die Fluoreszenzintensitäten der Liposomenpräparationen wurden fluoreszenzspektroskopisch bestimmt, und für die Untersuchungen mit Hilfe der konfokalen Laser-scanning-Mikroskopie wurden immer Suspensionen von Kontroll-Liposomen und Gallensalz tragende Liposomen mit gleicher Fluoreszenzintensität eingesetzt. Die Anregung der Ph₂-DiOC18 tragenden Liposomen erfolgte mit Hilfe eines Argon Lasers bei einer Wellenlänge von 488 nm, die Detektion des Fluoreszenzsignals erfolgte bei einer Wellenlänge von 505 nm.The fluorescence intensities of the liposome preparations were determined by fluorescence spectroscopy, and Sus was always used for the investigations using confocal laser scanning microscopy pensions of control liposomes and bile salt-bearing liposomes with the same fluorescence intensity. The excitation of the Ph ₂ -DiOC18-carrying liposomes was carried out using an argon laser at a wavelength of 488 nm, the fluorescence signal was detected at a wavelength of 505 nm.

Die Kultivierung der Hepatozyten erfolgte auf mit Kollagen Typ I beschichteten Objektträgern mit einem Durchmesser von 30 mm, die in 35-mm-Kulturschalen eingelegt wurden. Die den Zellrasen tragenden Objektträger wurden am Rande mit Silikon beschichtet und auf die Objektträger wurde eine temperierbare Durchflusskammer aufgelegt, die über einen Zulauf und einen Ablauf verfügte.Cultivation of the hepatocytes was carried out on slides coated with type I collagen a diameter of 30 mm, placed in 35 mm culture dishes were. The slides supporting the cell lawn were bordered with silicone coated and on the slides a temperature-controlled flow chamber was placed, which is connected to a Inlet and an outlet had.

Anschließend wurde das über den Zellen befindliche Zellkulturmedium möglichst vollständig entfernt, und 150 μl einer wie im Beispiel 2 beschrieben hergestellten, erfindungsgemäßen Liposomensuspension, die 2 mM liposomales PC enthielt, wurden zu den Zellen gegeben. Nach 5-minütiger Inkubation der Zellen bei 37 C wurde die Liposomensuspension möglichst vollständig abgesaugt, und die Zellen wurden vorsichtig 3-mal mit je 150 μl Zellpuffer gewaschen. Dann wurden 150 μl Zellkulturmedium zu den Zellen gegeben und die Durchflusskammer wurde in das konfokale Lasermikroskop eingesetzt. Die Aufnahme erfolgte mit einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskop (LSM 510 UV; ZEISS, Jena, Deutschland; Aufnahmegeschwindigkeit: 2,24 μs/Pixel; Pixelgröße in x- und y-Richtung: 0,2–0,4 μm; Abstand der Schnittebenen in z-Richtung: 0,05 μm bis 0,15 μm; Einstellung des Pinhole so, dass die halb maximale z-Auflösung bei voller Weite zwischen 0,5 und 1 μm lag).The cell culture medium located above the cells was then removed as completely as possible, and 150 μl of one as in the example 2 The described liposome suspension according to the invention, which contained 2 mM liposomal PC, was added to the cells. After the cells had been incubated for 5 minutes at 37 ° C., the liposome suspension was aspirated as completely as possible, and the cells were carefully washed 3 times with 150 μl of cell buffer. Then 150 ul cell culture medium was added to the cells and the flow chamber was inserted into the confocal laser microscope. The image was taken with a confocal laser scanning microscope (LSM 510 UV; ZEISS, Jena, Germany; recording speed: 2.24 μs / pixel; pixel size in the x and y direction: 0.2–0.4 μm; distance the cutting planes in the z-direction: 0.05 μm to 0.15 μm; setting the pinhole so that the half-maximum z-resolution with full width was between 0.5 and 1 μm).

Zur längeren Inkubation wurden die Hepatozyten zur Kultivierung in der Kulturschale belassen und vorsichtig 3-mal mit je 2 ml Zellpuffer gespült. Anschließend wurden 2 ml einer 2 mM liposomales PC enthaltenden, erfindungsgemäßen Liposomensuspension zugegeben, und die Hepatozyten wurden unter den üblichen Bedingungen für weitere 6h in einem Brutschrank kultiviert. Anschließend wurden die Liposomensuspensionen entfernt, und die Hepatozyten 3-mal mit je 2 ml Zellpuffer sehr vorsichtig gewaschen. Die Objektträger wurden wie beschrieben in die Durchflusskammer eingebracht und wie oben beschrieben unter dem konfokalen Lasermikroskop betrachtet.For longer incubation, the Leave hepatocytes for cultivation in the culture dish and be careful Rinsed 3 times with 2 ml cell buffer. Then were 2 ml of a liposome suspension according to the invention containing 2 mM liposomal PC added and the hepatocytes were added under the usual conditions for further Cultivated in an incubator for 6 hours. Then the liposome suspensions removed, and the hepatocytes 3 times with 2 ml cell buffer very washed carefully. The slides were as described introduced into the flow chamber and under as described above viewed with the confocal laser microscope.

5 zeigt die Ergebnisse der Bindung von Liposomenaggregaten an der Hepatocytenoberfläche, wobei 5A die Bindung Gallensalz tragender Liposomen nach 5 min, 5B die Bindung Gallensalz tragender Liposomen nach 6 h, 5C einen vergrößerten Ausschnitt aus 5B und 5D den Vergleich mit Kontrollliposomen nach 6 h zeigt. Fluoreszierende Liposomenaggregate erscheinen in Form von hell fluoreszierenden Punkten (s. Pfeile in 5B und 5C). Die spezifische Bindung an Hepatozyten ist deutlich sichtbar (vgl. 5B und C im Vergleich zu 5D). 5 shows the results of the binding of liposome aggregates to the hepatocyte surface, wherein 5A the binding of bile salt bearing liposomes after 5 min, 5B the binding of bile salt bearing liposomes after 6 h, 5C an enlarged section 5B and 5D shows the comparison with control liposomes after 6 h. Fluorescent liposome aggregates appear in the form of brightly fluorescent spots (see arrows in 5B and 5C ). The specific binding to hepatocytes is clearly visible (cf. 5B and C compared to 5D ).

(4) Lokalisierung der erfindungsgemäßen Liposomen in der Leber Die Infusion der Liposomen erfolgte analog wie im Beispiel 4 beschrieben. Nach Perfusion der Leber wurden mit einem Skalpell kleine Stücke der einzelnen Leberlappen entfernt. Die entnommenen Leberstücke wurden auf eine dünne Korkscheibe verbracht und sofort in flüssigem N₂ tiefgefroren. Von den tiefgefrorenen Leberstücken wurden mit einem Mikrotom Ultradünnschnitte des Lebergewebes angefertigt. Diese wurden unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet.(4) Localization of the Liposomes According to the Invention in the Liver The liposomes were infused analogously to the example 4 described. After perfusion of the liver, small pieces of the individual liver lobes were removed with a scalpel. The removed pieces of liver were placed on a thin cork disc and immediately frozen in liquid N ₂ . Ultrathin sections of the liver tissue were made from the frozen pieces of liver using a microtome. These were viewed under the fluorescence microscope.

Langlebige Gallensalz tragende Liposomen zeigten im Gegensatz zu Kontroll-Liposomen 90 min nach Injektion eine deutliche Fluoreszenzintensität in weiten Teilen des Lebergewebe. Langlebige Kontroll-Liposomen dagegen zeigten nur an einige Stellen eine sporadische Fluoreszenzintensität. Die starke Anreicherung der erfindungsgemäß aufgebauten Liposomen entlang der Sinusoide der Leber zeigt, dass die erfindungsgemäß aufgebauten Liposomen auch in vivo eine Gallensalz vermittelte Wechselwirkung mit Hepatozyten vermitteln.Long-lasting bile salt-bearing liposomes showed in contrast to control liposomes 90 min after injection a clear fluorescence intensity in large parts of the liver tissue. Long-lived control liposomes, on the other hand, showed only in a few places a sporadic fluorescence intensity. The strong enrichment of the constructed according to the invention Liposomes along the sinusoids of the liver show that those constructed according to the invention Liposomes also mediate a bile salt-mediated interaction in vivo mediate with hepatocytes.

Beispiel 5:Example 5:

Fusion von mit einer Modellsubstanz beladenen Liposomen mit Hepatozyten in PrimärkulturFusion of with a model substance loaded liposomes with hepatocytes in primary culture

Um die Fusion von Liposomen mit Hepatozyten zu erleichtern bzw. zu beschleunigen wurden Liposomen verwendet, die ein geeignetes Fusionspeptid (SBP25) enthielten (WO 99/39742 A). Das Peptid SBP25 wurde chemisch synthetisiert, durch Highperformance-liquid-chromatographie gereinigt und besitzt die folgende Aminosäuresequenz: Ac-Phe-Pro-Ile-Pro-Leu-Pro-Tyr-Cys-Trp-Leu-Ala-Arg-Ala-Leu-Ile-Lys-Arg-Ile-Gln-Ala-Met-Ile-Pro-Lys-Gly-NH₂ (HPLC-Reinheit 87%).In order to facilitate or accelerate the fusion of liposomes with hepatocytes, liposomes were used which contained a suitable fusion peptide (SBP25) (WO 99/39742 A). The SBP25 peptide was chemically synthesized, purified by high-performance liquid chromatography and has the following amino acid sequence: Ac-Phe-Pro-Ile-Pro-Leu-Pro-Tyr-Cys-Trp-Leu-Ala-Arg-Ala-Leu- Ile-Lys-Arg-Ile-Gln-Ala-Met-Ile-Pro-Lys-Gly-NH ₂ (HPLC purity 87%).

Die Präparation der Liposomen erfolgte wie im Beispiel 2 beschrieben durch Extrusion, wobei die in Tabelle 4 angegebene Lipidzusammensetzung verwendet wurde. SBP25 wurde in Methanol gelöst, und zur Präparation von SBP25 tragenden Liposomen wurden 0,04 μmole SBP25 je μmol Phospholipid zu der jeweiligen Mischung aus in organischen Lösungsmitteln gelösten Lipiden gegeben. Das organische Lösungsmittel wurde dann entfernt.The liposomes were prepared as described in Example 2 by extrusion, with the in Table 4 specified lipid composition was used. SBP25 was in Methanol dissolved, and for preparation of SBP25-bearing liposomes became 0.04 μmole SBP25 per μmol phospholipid to the respective mixture of lipids dissolved in organic solvents given. The organic solvent was then removed.

Für die Resuspension der Lipide wurde folgender Puffer (pH 7,6) verwendet:

The following buffer (pH 7.6) was used for the resuspension of the lipids:

In diesem Puffer wurden 25 mg/ml Dextran gelöst, das mit Fluorescein derivatisiert worden war (erhältlich von Molecular Probes, Inc.; die mittlere Molmasse des Dextrans betrug 10000 g/mol, so dass Konzentration der an Dextran gebundenen Fluoresceinmoleküle: 2,5–5 mM Fluorescein).In this buffer, 25 mg / ml Dissolved dextran, which had been derivatized with fluorescein (available from Molecular Probes, Inc .; the average molecular weight of the dextran was 10000 g / mol, so that concentration of the fluorescein molecules bound to dextran: 2.5-5 mM fluorescein).

Tabelle 4 Zusammensetzung der für die Untersuchungen zur Fusion von Liposomen mit Hepatozyten verwendeten Liposomen in Mol-%

Table 4 Composition of the liposomes used for the studies on the fusion of liposomes with hepatocytes in mol%

Die Abtrennung des nicht verkapselten Lipides erfolgte mit Hilfe einer Gelpermeationschromatographie. Für die Gelpermeationschromatographie wurde eine Chromatographiesäule mit einem Durchmesser von 15 mm und einer Länge von 55 mm verwendet, die mit Sephadex 5-500 (Pharmacia) gefüllt war. Die Liposomensuspensionen wurden auf ein Volumen von 1 ml gebracht, und die anschließende Trennung der Liposomen und des nicht verkapselten fluoreszierende Dextrans erfolgte unter hydrostatischem Druck.The separation of the not encapsulated Lipides were carried out using gel permeation chromatography. For the Gel permeation chromatography was using a chromatography column a diameter of 15 mm and a length of 55 mm are used was filled with Sephadex 5-500 (Pharmacia). The liposome suspensions were brought to a volume of 1 ml, and the subsequent separation of the liposomes and the unencapsulated fluorescent dextran took place under hydrostatic pressure.

Zur Fusion der modifizierten Liposomen mit den Hepatozyten in Primärkultur enthielten die Liposomensuspensionen 2 mM liposomales PC. Nach 2 h, 5 h oder 20 h wurden die Liposomensuspensionen entfernt, die Zellen gewaschen und anschließend unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet.For the fusion of the modified liposomes with the hepatocytes in primary culture the liposome suspensions contained 2 mM liposomal PC. After 2 h, 5 h or 20 h the liposome suspensions were removed Cells washed and then viewed under the fluorescence microscope.

Nach 2,5 und 20 h wurden die Liposomen von den Zellen entfernt und die Hepatozyten wurden unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Nach 2 h konnte keine Fluoreszenzfärbung der Hepatozyten beobachtet werden. Nach 5 h zeigten SBP25 tragende Liposomen und SBP25 und Gallensalz tragende Liposomen eine geringe Fluoreszenzfärbung der Hepatozyten. Nach 20 h zeigten SBP25 tragende Liposomen und SBP25 und Gallensalz tragende Liposomen im Gegensatz zu Kontroll-Liposomen eine deutliche Fluoreszenzfärbung des Zytosols der Hepatozyten.After 2.5 and 20 h the liposomes became removed from the cells and the hepatocytes were examined under the fluorescence microscope considered. After 2 h no fluorescent staining of the hepatocytes was observed become. After 5 h, SBP25 showed carrying liposomes and SBP25 and Bile salt-bearing liposomes have a low fluorescent stain Hepatocytes. After 20 h, SBP25 showed carrying liposomes and SBP25 and Bile salt-bearing liposomes in contrast to control liposomes a clear fluorescence staining of the Cytosol of the hepatocytes.

Die Anwesenheit von SBP25 und Gallensalz tragenden Liposomen führte zu einer deutlich intensiveren Färbung des Zytoplasmas der Hepatozyten, als die Anwesenheit von SBP25 tragenden Liposomen. Die Gallensalz vermittelte Bindung der Gallensalz und SBP25 tragenden Liposomen ist somit in der Lage, den durch SBP25 vermittelten Fusionsprozess zu beschleunigen.The presence of SBP25 and bile salt carrying liposomes to a much more intense coloring of the cytoplasm of the hepatocytes, as the presence of SBP25-bearing Liposomes. The bile salt mediates binding of the bile salt and SBP25-bearing liposomes are thus able to carry the SBP25 accelerate mediated merger process.

Claims

Conjugate with the following components: (a) a lipid structural unit, (b) a bile acid or bile salt structural unit, the structural units (a) and (b) being covalent, optionally via an intermediate component (c) a linker structural unit.

Conjugate according to claim 1, the lipid structural unit (a) is derived from fat or fat-like substances found in cells.

Conjugate according to claim 1 or 2, wherein the lipid structural unit (a) is a phosphoglyceride which is covalent on (b) or (c) with a phosphodiester linkage is bound.

Conjugate according to one of the preceding claims, wherein the lipid structural unit (a) is a C12 to C18 fatty acid residue contains.

Conjugate according to claim 3, the phosphoglyceride having a diacyl radical, the Acyl residues independently have a C12 to C18 chain from one another.

Conjugate according to one of the preceding claims, where the bile acid or bile salt structural unit (b) is a 5β-cholanic acid derivative.

Conjugate according to claim 1 or 6, the structural unit (b) being derivatized with a tauryl group is.

Conjugate according to claim 1, 6 or 7, the link the structural unit (b) at (a) or (c) via the 3-position of the steroid structure of the bile or the bile salt.

Conjugate according to claim 8, the link to the 3 position of the steroid framework in the β configuration is present.

Conjugate according to one of the preceding claims, wherein the linker structural unit (c) is a polyalkylene glycol and / or is an alkyl diacarboxylate group.

Conjugate according to one of the preceding claims for use in the medical field.

Particle, which is a conjugate according to a of claims 1 to 11 comprises.

Particles according to claim 12 with the property of proteins transporting bile acid or bile salt to be able to bind.

Particles according to claim 12 or 13, the proportion of the conjugate being 0.5-5% by weight, based on Particle total amount, is.

Particles according to a of claims 12 to 14, constructed in the form of a liposome, which is the conjugate wearing.

Particles according to claim 15, wherein the liposome contains phospholipids in addition to the conjugate, the are selected from the following group with respective proportions: 20 up to 40 mol% of phospholipids with long-chain saturated fatty acids from C16 and above, 10 up to 30 mol% phospholipids with long-chain unsaturated fatty acids from C16 and above, and 10 to 40 mole% phospholipids with medium chain saturated fatty acids from C8 to C14, and 40 to 90 mole% phospholipids with medium chain unsaturated fatty acids from C8 to C14.

Particles according to claim 15 or 16, the liposome also containing cholesterol.

Particles according to claim 17, the cholesterol content being 20 to 60 mol%.

Particles according to a of claims 15 to 17, the liposome further comprising a negatively charged lipid component contains.

Particles according to claim 19, the content of the negatively charged lipid component being 5 to Is 15 mol%.

Particles according to one of claims 12 to 20, wherein the average particle size of the particle in the loading ranges from 10nm to 500nm.

Particles according to a of claims 12 to 21, it being additional comprises a fusion peptide.

Particles according to a of claims 12 to 22, it being additional includes a stealth component.

Particles according to a of claims 12 to 23, being additional a therapeutic or diagnostic agent.

Use of a conjugate according to any one of claims 1 to 11 or a particle according to one of the Expectations 12 to 24 in medical therapy or diagnostics.

Kit with the following components: - one Particles according to a of claims 12 to 23 and - on therapeutic or diagnostic agent.