DE10225394A1 - Method of inducing apoptosis in cells by increasing C1D levels and inhibiting C1D degradation - Google Patents
Method of inducing apoptosis in cells by increasing C1D levels and inhibiting C1D degradationInfo
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Abstract
Beschrieben wird ein Verfahren zur Auslösung von Apoptose in einer Zelle, vorzugsweise einer Tumorzelle, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die intrazelluläre C1D-Konzentration über einen kritischen Schwellenwert erhöht wird und der Abbau von C1D gehemmt wird.A method is described for inducing apoptosis in a cell, preferably a tumor cell, which is characterized in that the intracellular C1D concentration is increased above a critical threshold value and the breakdown of C1D is inhibited.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Auslösung von Apoptose in einer Zelle, vorzugsweise einer Tumorzelle, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Konzentration von C1D in der Zelle über einen kritischen Schwellenwert erhöht wird und außerdem der Abbau von C1D gehemmt wird. The present invention relates to a method for Induction of apoptosis in a cell, preferably one Tumor cell, which is characterized in that the Concentration of C1D in the cell above a critical level Threshold is increased and also the reduction of C1D is inhibited.
Apoptose ist der programmierte Zelltod. Dieser unterliegt einer genauen Regulation, wobei Apoptose induziert bzw. inhibiert werden kann. Die Induktion von Apoptose kann zum Beispiel über eine Reihe von sog. Todesrezeptoren, d. h. Rezeptoren, die eine "Death Domain" (DD) enthalten, wie CD95, TNF-RI, DR3, DR4 oder DR5, erfolgen, die nach Bindung ihrer Liganden Apoptose-Signalwege induzieren. Beispielsweise interagiert nach Bindung des CD95-Liganden der CD95-Rezeptor mit dem Adapterprotein FADD/MORT1, wodurch das "Recruitment" und die Aktivierung der Protease FLICE/Caspase-8, am DISC "Death Inducing Signalling Complex" induziert werden. FADD und FLICE enthalten jeweils "Death Effector Domains" (DED). Die Induktion der Apoptose über diese Apoptose-Signalwege ist von außen beispielsweise durch die Gabe von Zellgiften (cytotoxischen Substanzen), Bestrahlung, Viren, Entzug von Wachstumsfaktoren oder mechanische Zellverletzung möglich. Diese Möglichkeiten der Apoptose-Induktion sind allerdings von bestimmten Nachteilen begleitet. So führt die Gabe von Zellgiften, wie Zytostatika, oder die Bestrahlung bei Krebszellen zur Resistenzentwicklung und darüberhinaus zu einer Schädigung normaler Zellen, bei denen eigentlich keine Apoptose ausgelöst werden sollte. Apoptosis is programmed cell death. This is subject to precise regulation, whereby apoptosis induces or can be inhibited. The induction of apoptosis can lead to Example of a series of so-called death receptors, i. H. Receptors that contain a "death domain" (DD), such as CD95, TNF-RI, DR3, DR4 or DR5, take place after binding their Ligands induce apoptosis signaling pathways. For example the CD95 receptor interacts after binding of the CD95 ligand with the adapter protein FADD / MORT1, whereby the "recruitment" and activation of the protease FLICE / Caspase-8, at DISC "Death Inducing Signaling Complex" can be induced. FADD and FLICE each contain "Death Effector Domains" (DED). The induction of apoptosis via these apoptosis signaling pathways is from the outside, for example, by giving cell toxins (cytotoxic substances), radiation, viruses, withdrawal of Growth factors or mechanical cell injury possible. However, these possibilities of apoptosis induction are accompanied by certain disadvantages. So the gift of Cell poisons, such as cytostatics, or radiation Cancer cells for resistance development and beyond damage to normal cells, in which none actually Apoptosis should be triggered.
Alternativ kann Apoptose auch durch andere Prozesse ausgelöst werden, z. B. durch Überexpression eines definierten Gens, wobei eine andere Signalkette aktiviert wird, die zum programmierten Zelltod führt. In diesem Fall wird eine ansonsten DNA-abhängige Proteinkinase (DNA-PK) auf DNA- abhängige Weise aktiviert (Yavuzer et al., Genes and Development 12 (1998), 2188-2199) was zu einer Erhöhung des p21 (CIP1, WAF1)-Spiegels in der Zelle und letztlich zur Auslösung von apoptotischem Zelltod führt (Rothbarth et al., J. Cell. Science 112 (1999), 2223-2232). Alternatively, apoptosis can also be triggered by other processes be, e.g. B. by overexpression of a defined gene, another signal chain is activated, which leads to programmed cell death. In this case, a otherwise DNA-dependent protein kinase (DNA-PK) on DNA dependent manner activated (Yavuzer et al., Genes and Development 12 (1998), 2188-2199) resulting in an increase in p21 (CIP1, WAF1) level in the cell and ultimately to Triggers apoptotic cell death (Rothbarth et al., J. Cell. Science 112 (1999), 2223-2232).
In der deutschen Patentschrift DE 198 24 811 C2 wird beschrieben, dass in Tieren ein Protein (C1D) vorliegt, das sich zur Induktion von Apoptose eignet. Dieses weist eine Größe von ca. 16 kD auf und wurde bisher als DNA-bindendes Protein charakterisiert (Nehls et al., Nucleic Acids Research 26, S. 1160-1166 (1998)). Es wurde erkannt, daß C1D zur Induktion von Apoptose geeignet ist und in jeder Zelle, auch in Tumorzellen vorhanden ist, und dort in einer vom Organismus vorgegebenen Menge exprimiert wird. Kommt es zu einer Überexpression des C1D-Genprodukts, wird in den überexprimierenden Zellen Apoptose ausgelöst, was im Fall von Tumorzellen therapeutisch wünschenswert ist, da diese Überexpression per se die Tumorzellen abtöten kann. In der deutschen Patentschrift DE 198 24 811 C2 wird schließlich beschrieben, dass in Tumorzellen tatsächlich Apoptose dadurch erreicht werden kann, dass das C1D-Gen zur Überexpression gebracht wird, d. h. die Konzentration des zellulären C1D-Genprodukts erhöht wird. Dies kann dadurch erreicht werden, dass die Zellen mit Expressionskonstrukten transfiziert werden, die das C1D-Gen exprimieren oder das endogene C1D-Gen zur Überexpression stimuliert wird. In the German patent DE 198 24 811 C2 described that a protein (C1D) is present in animals that is suitable for induction of apoptosis. This has one Size of about 16 kD and has so far been used as a DNA-binding Protein characterized (Nehls et al., Nucleic Acids Research 26, pp. 1160-1166 (1998)). It was recognized that C1D Induction of apoptosis is appropriate and in every cell, too is present in tumor cells, and there in one of the Organism is expressed predetermined amount. It comes to overexpression of the C1D gene product is described in the overexpressing cells triggered apoptosis, which in the case of Tumor cells are therapeutically desirable because of this Overexpression per se can kill the tumor cells. In the German patent DE 198 24 811 C2 is finally described that in tumor cells it actually caused apoptosis can be achieved using the C1D gene for overexpression brought, d. H. the concentration of the cellular C1D gene product is increased. This can be achieved in that the cells are transfected with expression constructs, that express the C1D gene or the endogenous C1D gene for Overexpression is stimulated.
Allerdings zeigte sich in Vorexperimenten zu der vorliegenden Erfindung, dass die bisher angewendeten Verfahren zur Erhöhung des C1D-Spiegels in Zellen (z. B. Transfektion mit Expressionskonstrukten) immer nur in einem relativ kleinen Anteil der behandelten Zellen zur Auslösung von Apoptose führen. Es stellte sich heraus, dass dies daran liegt, dass Zellen einen kryptischen Rettungsmechanismus aktivieren können. Es besteht ein Schwellenwert, und nur dann, wenn die intrazelluläre Konzentration des C1D-Gen-Produkts diesen Schwellenwert übersteigt, wird die Apoptose ausgelöst. Ist die initiale intrazelluläre Konzentration des C1D-Gen- Produkts zwar erhöht, liegt aber unter diesem Schwellenwert, kann die Zelle diesen Rettungsmechanismus aktivieren. Da aber für therapeutische Zwecke letztendlich alle Zielzellen abgetötet werden sollen, besteht der Nachteil in dem bisher angewendeten Verfahren, dass die Behandlungen z. B. solange wiederholt werden müssen, bis alle Zielzellen abgetötet sind. Dieser Nachteil ist von Bedeutung, weil die Zellen, die bei der ersten Behandlung nicht abgetötet werden, sich bis zur weiteren Behandlung vermehren. Bleibt die Rate der bei einer Behandlung tödlich getroffenen Zellen unter der Vermehrungsrate, wird es nicht gelingen die gesamte Population der Tumorzellen abzutöten. However, this was shown in preliminary experiments Invention that the previously used methods for Increasing the C1D level in cells (e.g. transfection with Expression constructs) only ever in a relatively small one Proportion of cells treated to trigger apoptosis to lead. It turned out that this is because Cells activate a cryptic rescue mechanism can. There is a threshold, and only if the intracellular concentration of the C1D gene product Apoptosis is triggered. is the initial intracellular concentration of the C1D gene Product increases but is below this threshold, the cell can activate this rescue mechanism. Here but ultimately all target cells for therapeutic purposes the disadvantage is that so far applied procedures that the treatments z. B. as long must be repeated until all target cells have been killed. This disadvantage is significant because the cells involved in it the first treatment does not kill itself until increase further treatment. Remains the rate of one Treatment of deadly cells under the Propagation rate, the whole will not succeed Kill population of tumor cells.
Somit besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein Verfahren bereitzustellen, mit denen der initiale C1D- Genprodukt-Spiegel in möglichst vielen Zellen, insbesondere Tumorzellen, derart erhöht werden kann, dass in möglichst vielen Zellen der Schwellenwert und damit des "points of no return" erreicht wird. The object of the present invention is therefore to to provide a process by which the initial C1D Gene product levels in as many cells as possible, especially Tumor cells can be increased in such a way that if possible many cells the threshold and thus the "points of no return "is reached.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände der Patentansprüche erreicht. According to the invention this is the subject of Claims reached.
Die Erfindung basiert auf der Identifikation des "Rettungs"- Prozesses, der auf einem raschen Abbau des kryptisch cytotoxischen C1D-Gen-Produkts beruht. Dabei wird das C1D- Gen-Produkt durch Proteasomen abgebaut. Proteasomen stellen ein zelluläres Überwachungssystem dar, das u. a. regulatorische Proteine bei Erreichung eines bestimmten Niveaus rasch abbauen kann. Erfindungsgemäß kann der Abbau des Apoptose auslösenden C1D-Genprodukts durch Vermeidung dieses Proteasomen-abhängigen Abbaus gehemmt und damit dessen intrazelluläre Konzentration und somit seine Wirkung hinsichtlich der Auslösung der Apoptose in möglichst vielen Zellen verstärkt werden. Dabei kann die Vermeidung dieses Abbaus prinzipiell durch zwei Verfahren erreicht werden: (a) Hemmung des Abbaus durch spezifische Proteasomen-Inhibitoren, und (b) Identifizierung des C1D-Zielsequenz-Abschnitts, der den Abbau anregt, und gezielte genetische Veränderung der entsprechenden Nukleinsäuresequenz, wodurch dem produzierten Protein Substrateigenschaften hinsichtlich des spezifischen Abbaus verloren gehen. The invention is based on the identification of the "rescue" - Process based on a rapid breakdown of the cryptic cytotoxic C1D gene product. The C1D Gene product broken down by proteasomes. Proteasomes is a cellular surveillance system that u. a. regulatory proteins when a certain one is reached Levels can decrease rapidly. According to the breakdown of the apoptosis-inducing C1D gene product by avoidance inhibited this proteasome-dependent degradation and thus its intracellular concentration and thus its effect with regard to triggering apoptosis in as many as possible Cells are strengthened. Avoiding this In principle, degradation can be achieved by two methods: (a) Inhibition of degradation by specific proteasome inhibitors, and (b) identifying the C1D target sequence portion that stimulates the breakdown, and targeted genetic modification of the corresponding nucleic acid sequence, whereby the produced Protein substrate properties with regard to the specific Degradation get lost.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur
Auslösung von Apoptose in einer Zelle, das durch folgende
Schritte gekennzeichnet ist:
- a) Erhöhen der intrazellulären C1D-Konzentration über einen kritischen Schwellenwert; und
- b) Hemmung des Abbaus von C1D.
- a) increasing intracellular C1D concentration above a critical threshold; and
- b) Inhibition of C1D degradation.
Die Erhöhung der intrazellulären C1D-Konzentration über einen kritischen Schwellenwert kann durch verschiedene Maßnahmen erfolgen. Dies kann beispielsweise durch Überexpression einer das C1D-Genprodukt kodierenden Nukleinsäuresequenz in der Zelle oder durch Einbringen von C1D-Protein in die Zelle geschehen. The increase in intracellular C1D concentration over one critical threshold can be achieved through various measures respectively. This can be done, for example, by overexpressing a the nucleic acid sequence encoding the C1D gene product in the Cell or by introducing C1D protein into the cell happen.
Verfahren zur Überexpression einer das C1D-Genprodukt kodierenden Nukleinsäuresequenz sind in der deutschen Patentschrift DE 198 24 811 C2 beschrieben. Dabei umfaßt der Begriff "C1D-Genprodukt" ein Protein mit der in den Fig. 1 bzw. 2 der deutschen Patentschrift DE 198 24 811 C2 gezeigten Aminosäuresequenz oder einer hiervon durch eine oder mehrere Aminosäuren unterschiedlichen Aminosäuresequenz, wobei in diesem Fall das Protein noch apoptotische Aktivität besitzt und zu den in den dortigen Figuren gezeigten Sequenzen noch mindestens 70%, bevorzugt 80%, ganz bevorzugt 90 oder 95% Homologie aufweist. Der Ausdruck "eine durch eine oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz" umfaßt jegliche Aminosäuresequenz eines C1D-(verwandten) Proteins, wobei die entsprechende DNA-Sequenz mit der DNA dieser Figuren hybridisiert. Bezüglich der Definition des Begriffs "hybridisiert" wird auf die Definition in der deutschen Patentschrift DE 198 24 811 C2 verwiesen. Methods for overexpressing a nucleic acid sequence encoding the C1D gene product are described in German patent DE 198 24 811 C2. The term “C1D gene product” encompasses a protein with the amino acid sequence shown in FIGS . 1 and 2 of German patent DE 198 24 811 C2 or an amino acid sequence different therefrom by one or more amino acids, in which case the protein is still apoptotic Has activity and still has at least 70%, preferably 80%, very preferably 90 or 95% homology to the sequences shown in the figures there. The term "an amino acid sequence different from one or more amino acids" encompasses any amino acid sequence of a C1D (related) protein, the corresponding DNA sequence hybridizing with the DNA of these figures. With regard to the definition of the term "hybridized", reference is made to the definition in German patent DE 198 24 811 C2.
Für die Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist insbesondere eine für C1D kodierende Nukleinsäuresequenz in Form einer DNA, insbesondere cDNA, geeignet. For the execution of the method according to the invention in particular a nucleic acid sequence coding for C1D in Form of a DNA, especially cDNA, suitable.
Der Ausdruck "C1D-Genprodukt" umfaßt das (native) Protein und auch ein Fragment des ursprünglichen Proteins, wobei dieses noch die Apoptose auslösenden Eigenschaften von C1D aufweist. Der Fachmann ist auch in der Lage zu bestimmen, ob ein C1D- Genprodukt, das sich von dem ursprünglichen unterscheidet, noch über die biologische Aktivität der Apoptose-Induktion verfügt, z. B. durch Nachweis von Apoptose-typischem Zelltod gekennzeichnet durch z. B. Morphologie, multizentrische Chromatinkondensation, typische Membranveränderungen und endogene DNA-Degradation. The term "C1D gene product" includes the (native) protein and also a fragment of the original protein, this one still has the apoptosis-inducing properties of C1D. One skilled in the art is also able to determine whether a C1D Gene product that is different from the original one, still about the biological activity of apoptosis induction has, e.g. B. by detection of apoptosis-typical cell death characterized by z. B. Morphology, multicenter Chromatin condensation, typical membrane changes and endogenous DNA degradation.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die C1D überexprimierende Zelle eine Tumorzelle. In a preferred embodiment of the invention The C1D overexpressing cell is a method Tumor cell.
In einer mehr bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die C1D kodierende Nukleinsäuresequenz in einen Vektor oder Expressionsvektor inseriert, z. B. pBlueScript, pQE8, pUC- oder pBR322-Derivate. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz im Vektor mit regulatorischen Elementen funktionell verknüpft, die deren Expression in eukaryotischen Wirtszellen erlauben. Solche Vektoren enthalten neben den regulatorischen Elementen, beispielsweise einem Promotor, typischerweise einen Replikationsursprung und spezifische Gene, die die phänotypische Selektion einer transformierten Wirtszelle erlauben. Zu den regulatorischen Elementen für die Expression in Eukaryonten zählen der CMV-, SV40-, RVS-40- Promotor, sowie CMV- oder SV40-Enhancer. Weitere Beispiele für geeignete Promotoren sind der Metallothionein I- und der Polyhedrin-Promotor. In a more preferred embodiment of the The inventive method is the C1D coding Nucleic acid sequence in a vector or expression vector advertises, e.g. B. pBlueScript, pQE8, pUC or pBR322 derivatives. In a preferred embodiment, the Nucleic acid sequence in vector with regulatory elements functionally linked, their expression in eukaryotic Allow host cells. Such vectors contain in addition to regulatory elements, for example a promoter, typically an origin of replication and specific Genes that transform the phenotypic selection of a Allow host cell. The regulatory elements for the Expression in eukaryotes include the CMV, SV40, RVS-40 Promoter, as well as CMV or SV40 enhancers. Further examples for suitable promoters are the metallothionein I and the Polyhedrin promoter.
In einer für gentherapeutische Zwecke bevorzugten Ausführungsform ist der die C1D-DNA enthaltende Vektor ein Virus, beispielsweise ein Adenovirus, Vaccinia-Virus oder Adeno-abhängige Parvoviren (AAV). Besonders bevorzugt sind Retroviren. Beispiele für geeignete Retroviren sind MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GaLV. Für Zwecke der Gentherapie können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle auch in Form von kolloidalen Dispersionen zu den Zielzellen transportiert werden. Dazu zählen beispielsweise Lipososmen oder Lipoplexe (Mannino et al., Biotechniques 6 (1988), 682). In one preferred for gene therapy purposes One embodiment is the vector containing the C1D DNA Virus, for example an adenovirus, vaccinia virus or Adeno-dependent parvoviruses (AAV). Are particularly preferred Retroviruses. Examples of suitable retroviruses are MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV or GaLV. For gene therapy purposes the nucleic acid molecules according to the invention can also be used in Form of colloidal dispersions to the target cells be transported. These include, for example, lipososms or Lipoplexe (Mannino et al., Biotechniques 6 (1988), 682).
Allgemeine auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion von Expressions- und insbesondere Gentherapievektoren, die die oben genannten Nukleinsäuremoleküle und geeignete Kontrollsequenzen enthalten, verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise in vitro- Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren, sowie in vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie in der Fachliteratur beschrieben sind. Der Fachmann weiß somit, in welcher Weise eine C1D-DNA in einen Expressionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß diese DNA in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid kodierenden DNA inseriert werden kann, so daß die C1D kodierende DNA in Form eines Fusionsproteins exprimiert werden kann, beispielsweise in Form eines Fusionsproteins, bei dem der andere Teil GFP (das grün fluoreszierende Protein von Aequorea Victoria) ist. General methods known in the art can be used to Construction of expression and in particular Gene therapy vectors that match the above Contain nucleic acid molecules and suitable control sequences used become. These methods include, for example, in vitro Recombination techniques, synthetic processes, as well as in vivo recombination methods, as described in the specialist literature are described. The person skilled in the art thus knows how a C1D DNA must be inserted into an expression vector. He is also aware that this DNA is associated with a DNA encoding another protein or peptide can be so that the C1D encoding DNA in the form of a Fusion protein can be expressed, for example in the form a fusion protein in which the other part GFP (the green fluorescent protein from Aequorea Victoria).
Für die Expression des C1D-Gens werden die oben genannten Expressionsvektoren in Wirtszellen eingeführt. Zu diesen Wirtszellen zählen Tierzellen, vorzugsweise Säugerzellen, sowohl in Kultur wie auch im lebenden Organismus. Bevorzugt sind die tierischen Zellen L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero und HeLa. Verfahren zur Transformation dieser Wirtszellen, zur Erkennung erfolgter Transformation und Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt. For the expression of the C1D gene, the above are Expression vectors introduced in host cells. To this Host cells include animal cells, preferably mammalian cells, both in culture and in the living organism. Prefers are the animal cells L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero and HeLa. Process for transforming these host cells Detection of transformation and expression of the nucleic acid molecules according to the invention using the Vectors described above are in the art known.
Des weiteren kennt der Fachmann Bedingungen, transformierte bzw. transfizierte Zellen zu kultivieren. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das durch die erfindungsgemäße DNA exprimierte Protein bzw. Fusionsprotein zu isolieren und zu reinigen. Furthermore, the person skilled in the art knows conditions, transformed or to transfect cells. Are him too Method known by the DNA of the invention to isolate and to express expressed protein or fusion protein clean.
Um das erfindungsgemäße Verfahren auszuführen, wird in einer bevorzugten Ausführungsform die C1D-DNA in einen Expressionsvektor, insbesondere einen Gentherapievektor, inseriert und in Zellen, bevorzugt Tumorzellen, eingeführt. Dort kommt es zur Expression von C1D-Protein, das zusätzlich zum zelleigenen Protein, zur Auslösung von Apoptose führt. Das Einbringen der Vektoren in die Zellen erfolgt unter den dem Fachmann bekannten Bedingungen. Hinsichtlich der in-vivo Gentherapie wird insbesondere auf "K. W. Culver, Gene Therapy, A Handbook for Physicans, Mary Ann Libert, Inc., New York, 1994" und "P. L. Chang, Sonatic Gene Therapy, CRC Press, London, 1995" verwiesen. In order to carry out the method according to the invention, in a preferred embodiment, the C1D-DNA in a Expression vector, in particular a gene therapy vector, inserted and introduced into cells, preferably tumor cells. There is expression of C1D protein, which also to the cell's own protein, which triggers apoptosis. The vectors are introduced into the cells under the conditions known to those skilled in the art. With regard to in vivo Gene therapy is particularly focused on "K.W. Culver, Gene Therapy, A Handbook for Physicans, Mary Ann Libert, Inc., New York, 1994 "and" P. L. Chang, Sonatic Gene Therapy, CRC Press, London, 1995 ".
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das zelleigene C1D-Gen zu einer vermehrten Expression stimuliert, z. B. durch exogene Stimulation des endogenen C1D-Promoters. Als Promoter bezeichnet man 5'-Nachbarsequenzen eines Gens, die als Startpunkte der RNA Polymerase II dienen, welche im Zusammenwirken mit Transkriptionsfaktoren die Expression des Gens bewirkt. Bei vielen Genen, wie auch bei C1D, ist dieser Prozeß durch exogene Faktoren induzierbar bzw. stimulierbar. Faktoren, die die spezifische Expression eines Gens bewirken sind sehr zahlreich und reichen von physikalischen Faktoren (wie Licht, Wärme, Kälte), über niedermolekulare anorganische Stoffe (wie Salze, Metallionen) und niedermolekulare organische Stoffe (Peptide, Nukleinsäurebausteine, biogene Amine, Steroide) bis zu höhermolekularen Stoffen (Serum, Wachstumsfaktoren, Immun-Stimulantien). Die für das C1D-Gen spezifischen Stimulantien werden dadurch erkannt, daß 5'- Nachbarsequenzen, vorhanden auf z. B. den BAC (bacterial arteficial chromosome) Klonen mit einem Reportergen, z. B. CAT oder EGFP, kombiniert und hinsichtlich der Reportergen- Expression bzw. deren Stimulation durch exogene Faktoren, ggf. mit einem "high-throughput"-Verfahren, untersucht werden. In a further preferred embodiment, the stimulates the cell's own C1D gene to increase expression, z. B. by exogenous stimulation of the endogenous C1D promoter. A promoter is a 5 ′ neighboring sequence of a gene which serve as starting points for RNA polymerase II, which Interaction with transcription factors the expression of Gene causes. For many genes, like C1D, this is Process inducible or stimulable by exogenous factors. Factors that cause the specific expression of a gene are very numerous and range from physical factors (like light, heat, cold), about low-molecular inorganic Substances (such as salts, metal ions) and low molecular weight organic substances (peptides, nucleic acid building blocks, biogenic Amines, steroids) up to higher molecular weight substances (serum, Growth factors, immune stimulants). The one for the C1D gene specific stimulants are recognized by the fact that 5'- Neighboring sequences, present on e.g. B. the BAC (bacterial arteficial chromosome) cloning with a reporter gene, e.g. B. CAT or EGFP, combined and regarding the reporter gene Expression or its stimulation by exogenous factors, possibly with a "high-throughput" method become.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird C1D- Protein über geeignete Maßnahmen, z. B. eingeschlossen in Liposomen oder Viruskapside, in die Zelle eingebracht. Das C1D-Protein wird beispielsweise in Prokaryonten (z. B. E.coli) oder Eukaryonten (z. B. tierischen Zellen) exprimiert und entsprechend aufgereinigt, bevor es verabreicht wird. In a further preferred embodiment, C1D Protein through appropriate measures, e.g. B. included in Liposomes or viral capsids, introduced into the cell. The C1D protein is, for example, in prokaryotes (e.g. E. coli) or eukaryotes (e.g. animal cells) and cleaned up accordingly before it is administered.
Die Hemmung des Abbaus des C1D-Genprodukts kann, wie bereits vorstehend angedeutet, prinzipiell auf zwei Ebenen erfolgen, (a) Hemmung des proteolytischen Abbaus des C1D-Genprodukts, d. h. des C1D-Proteins (z. B. durch Proteasomen-Inhibitoren) und/oder (b) Veränderung der Aminosäuresequenz des C1D- Genprodukts so, dass dieses resistent gegenüber einem proteolytischen Abbau wird ohne dabei die apoptotische Aktivität zu verlieren. Andererseits ist auch denkbar, dass eine Hemmung dadurch erfolgen kann, dass ein Ligand, z. B. ein Antikörper, so an das C1D-Genprodukt bindet, dass es vor Abbau geschützt ist, nicht jedoch seine biologische (apoptotische) Aktivität verliert. The inhibition of the degradation of the C1D gene product can, as already indicated above, basically take place on two levels, (a) inhibition of proteolytic degradation of the C1D gene product, d. H. of the C1D protein (e.g. by proteasome inhibitors) and / or (b) change in the amino acid sequence of the C1D Gene product so that it is resistant to one proteolytic degradation is without doing the apoptotic Losing activity. On the other hand, it is also conceivable that inhibition can take place in that a ligand, for. B. a Antibody so binds to the C1D gene product that it does Degradation is protected, but not its biological (apoptotic) activity loses.
Somit erfolgt in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die Hemmung des Abbaus des C1D- Genprodukts durch mindestens einen Proteasomen-Inhibitor. Geeignete Proteasomen-Inhibitoren sind dem Fachmann bekannt und dazu zählt, vorzugsweise, Benzyloxycarbonyl-leu-leu- norvalinal (MG115; Calbiochem-Novablochem GmbH, Bad Soden, Deutschland). Ein geeigneter Proteasomen-Inhibitor ist außerdem ein Polypeptid, das die C1D-Aminosäuresequenz von den Positionen 50 bis 90 umfaßt oder ein Fragment davon, das noch Ubiquitin-Reste binden kann. Dieses kann, vorzugsweise wenn im Überschuß vorhanden, die Proteasomen absättigen, so dass keine freien Proteasomen für den C1D-Abbau mehr in der Zelle zur Verfügung stehen. Die Zugabe des Inhibitors erfolgt vorzugsweise gleichzeitig mit der Transfektion. Falls es sich bei dem Inhibitor um ein Protein oder Peptid handelt, kann dessen Verabreichung auch dadurch erfolgen, dass die Zelle mit einem Vektor gemäß dem vorstehend beschriebenen Vorgehen transfiziert wird, der die entsprechende Nukleinsäuresequenz exprimiert. Bei diesem Vektor kann es sich auch um den Vektor handeln, der zur Überexpression von C1D verwendet wird. Thus, in a preferred embodiment, the method inhibiting the degradation of C1D Gene product by at least one proteasome inhibitor. Suitable proteasome inhibitors are known to the person skilled in the art and this includes, preferably, benzyloxycarbonyl-leu-leu norvalinal (MG115; Calbiochem-Novablochem GmbH, Bad Soden, Germany). A suitable proteasome inhibitor is also a polypeptide that the C1D amino acid sequence of positions 50 to 90 or a fragment thereof which can still bind ubiquitin residues. This can, preferably if present in excess, saturate the proteasomes, so that there are no more free proteasomes for C1D degradation in the Cell are available. The inhibitor is added preferably simultaneously with the transfection. If it is the inhibitor is a protein or peptide, can its administration also takes place in that the cell with a vector according to the procedure described above is transfected, the corresponding nucleic acid sequence expressed. This vector can also be the vector act that is used to overexpress C1D.
In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Hemmung des Abbaus des C1D-Genprodukts dadurch bewirkt, dass für die C1D- Überexpression eine Nukleinsäuresequenz verwendet wird, die so verändert ist, dass das davon kodierte Genprodukt resistent gegenüber einem Abbau durch Proteasomen ist, jedoch noch apoptotische Aktivität aufweist, wobei der in diesem Zusammenhang verwendete Ausdruck "resistent" sich auch auf C1D-Varianten bezieht, deren Abbau (gegenüber der ursprünglichen Form) zumindest verringert ist. Der Fachmann kann eine so veränderte Nukleinsäuresequenz gemäß üblicher Verfahren, z. B. in-vitro-Mutagenese, erzeugen und die Bestimmung der Proteasomen-Resistenz bzw. der apoptotischen Aktivität des davon kodierten Genprodukts z. B. über die in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Assays durchführen. In an alternative preferred embodiment of the inventive method is the inhibition of the degradation of C1D gene product causes that for the C1D Overexpression a nucleic acid sequence is used that is so modified that the gene product encoded by it is resistant to degradation by proteasomes, however still has apoptotic activity, the in this The term "resistant" used in the context also refers to C1D variants relates, their degradation (compared to the original form) is at least reduced. The expert a nucleic acid sequence modified in this way according to the usual Process, e.g. B. in vitro mutagenesis, and generate Determination of proteasome resistance or apoptotic Activity of the gene product encoded thereby z. B. on the in the assays described below carry out.
Vorzugsweise ist die C1D kodierende Nukleinsäuresequenz so verändert, dass die Aminosäuresequenz des C1D-Genprodukts zwischen den Positionen 50 bis 90 verändert ist, da in diesem Bereich die Signale für den proteolytischen Abbau liegen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Aminosäuresequenz des C1D-Genprodukts so verändert, dass ein, zwei oder drei Lysinreste an den Positionen 54, 79 und/oder 84 gegen andere Aminosäurereste, vorzugsweise Argininreste, ausgetauscht sind. Diese Lysinreste stellen offensichtlich Bindungsstellen für Ubiquitin-Moleküle des Ubiquitin-Proteasomen-Systems dar und deren Ersatz durch andere Aminosäurereste verhindert die Ubiquitinierung, die den Abbau durch Proteasomen einleitet. The nucleic acid sequence coding for C1D is preferably such that changed the amino acid sequence of the C1D gene product between positions 50 to 90 is changed because in this The range of signals for proteolytic degradation. In a particularly preferred embodiment of the The inventive method is the amino acid sequence of the C1D gene product changes so that one, two or three Lysine residues at positions 54, 79 and / or 84 against others Amino acid residues, preferably arginine residues, exchanged are. These lysine residues are obviously binding sites for ubiquitin molecules of the ubiquitin-proteasome system and their replacement by other amino acid residues prevents the Ubiquitination, which initiates degradation by proteasomes.
Somit stellt die vorliegende Erfindung erstmalig eine Möglichkeit bereit, Apoptose (z. B. von Tumorzellen) nicht über die üblichen Signalwege auszulösen, sondern durch Überexpression des C1G-Gens und der Hemmung des proteolytischen Abbaus des C1D-Genprodukts durch Proteasomen. Dies kann eine besondere Bedeutung bei vielen Erkrankungen haben, insbesondere Tumorerkrankungen. Insbesondere hat sich als vorteilhaft herausgestellt, daß Tumorzellen auf eine Überexpression von C1D sehr viel empfindlicher als normale Zellen reagieren. Für normale Zellen bestehen deshalb keinerlei Nebenwirkungen, während Tumorzellen den sicheren Zelltod erleiden. Thus, the present invention provides for the first time Possibility not ready apoptosis (e.g. of tumor cells) trigger via the usual signal paths, but through Overexpression of the C1G gene and the inhibition of the proteolytic degradation of the C1D gene product by proteasomes. This can be of particular importance in many diseases have, especially tumor diseases. In particular has found to be advantageous that tumor cells on a Overexpression of C1D is much more sensitive than normal Cells react. Therefore exist for normal cells no side effects, while tumor cells are safe Suffer cell death.
Eine Fraktion transfektierter Zellen enthält einen hohen Level an C1D-EGFP-Fusionsprotein, welches durch kurze Expositionszeiten angezeigt wird (510 nm Fluoreszenzmodus; ungefähr 100 Millisekunden Expositionszeit). Bilder in der ersten Reihe sind im Phasenkontrastmodus aufgenommen. Bilder in der zweiten Reihe zeigen DNA-spezifische Fluoreszenz- Anfärbung (456 nm Fluoreszenzmodus). Bilder in der dritten Reihe zeigen C1D-EGFP-Expression (510 nm Fluoreszenzmodus). Balken: 10 µm A fraction of transfected cells contains a high one Level of C1D-EGFP fusion protein, which is characterized by short Exposure times is displayed (510 nm fluorescence mode; approximately 100 milliseconds exposure time). Pictures in the first row are recorded in phase contrast mode. pictures the second row shows DNA-specific fluorescence Staining (456 nm fluorescence mode). Pictures in the third Series show C1D-EGFP expression (510 nm fluorescence mode). Bars: 10 µm
Eine Fraktion von Zellen mit mittleren Mengen an Fusionsprotein (mittlere Expositionszeiten, die für 510 nm Fluoreszenzmodusbilder benötigt werden, sind 2-3 Sekunden). Das linke Bild ist im Phasenkontrastmodus aufgenommen, das rechte Bild zeigt C1D-EGFP exprimierende Zellen im Fluoreszenzmodus. Balken: 10 µm A fraction of cells with medium amounts of Fusion protein (mean exposure times for 510 nm Fluorescence mode pictures are needed are 2-3 seconds). The left image is taken in phase contrast mode, the right picture shows cells expressing C1D-EGFP in the Fluorescence mode. Bars: 10 µm
- A) Prozent Typ A-Zellen, apoptotische Zellen. A) Percent Type A cells, apoptotic cells.
-
B) Prozent Typ B-Zellen; transfizierte, aber nicht-
apoptotische Zellen.
Blanke Säulen: ohne Inhibitor
Gestrichelte Säulen: mit Inhibitor. B) percent type B cells; transfected but non-apoptotic cells.
Bare columns: without inhibitor
Dashed columns: with inhibitor.
Die Bahn M ist mit Größenmarkern beladen und dient zur Bestimmung der Größe des Fusionsproteins. The web M is loaded with size markers and is used for Determination of the size of the fusion protein.
Oberer Teil: Darstellung der getesteten Deletionskonstrukte Unterer Teil: Relative Fluoreszenz nach Transfektionsverlauf Upper part: representation of the deletion constructs tested Lower part: Relative fluorescence after transfection
Linkes Bild, Fluoreszenzaufnahme; rechtes Bild, Durchlicht. Die Vergrößerung ist in der Abbildung angegeben. Der vegrößerte Bildausschnitt rechts zeigt eine durch mt54/84- MC1D induzierte apoptotische Zelle. Der vergrößerte Bildausschnitt links zeigt die Expression des Genkonstrukts in zwei CT26-Zellen vor Beginn der Apoptose. Left picture, fluorescence picture; right picture, transmitted light. The magnification is shown in the picture. The enlarged image section on the right shows one by mt54 / 84- MC1D induced apoptotic cell. The enlarged Image section on the left shows the expression of the gene construct in two CT26 cells before apoptosis.
Linkes Bild, Fluoreszenzaufnahme; rechtes Bild, Durchlicht. Die Vergrößerung ist in der Abbildung angegeben. Der vergrößerte Bildausschnitt zeigt eine durch MC1D induzierte apoptotische Zelle. Left picture, fluorescence picture; right picture, transmitted light. The magnification is shown in the picture. The enlarged image section shows an MC1D induced apoptotic cell.
Linkes Bild, Fluoreszenzaufnahme; rechtes Bild, Durchlicht. Die Vergrößerung ist in der Abbildung angegeben Left picture, fluorescence picture; right picture, transmitted light. The magnification is shown in the picture
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert. Diese Beispiele zeigen, dass der durch das Ubiquitin-Proteasomen-System vermittelte Abbau des C1D- Proteins in Säugerzellen auf zwei Ebenen deutlich gehemmt werden kann: i) durch die Verwendung niedermolekularer Substanzen, die die proteolytische Aktivität von Proteasomen spezifisch hemmen, und ii) durch den Austausch bestimmter Aminosäuren, die den enzymatischen Einbau von Ubiqitinmolekülen in das C1D-Protein als Voraussetzung für den Proteasomenabbau weitgehend verhindern. The present invention is accomplished by the following Examples explained. These examples show that by the ubiquitin proteasome system mediated degradation of the C1D Proteins in mammalian cells are significantly inhibited at two levels can be: i) by using low molecular weight Substances affecting the proteolytic activity of proteasomes specifically inhibit, and ii) by exchanging certain Amino acids that facilitate the enzymatic incorporation of Ubiqitin molecules in the C1D protein as a prerequisite for largely prevent proteasome degradation.
Das C1D-Genprodukt gehört zu den Substraten von Proteasomen, da sein Abbau durch spezifische Proteasomen-Inhibitoren gehemmt wird. Es ist deshalb möglich die durch natürliche Expression und die durch Transfektion mit C1D- Expressionskonstrukten erhöhte intrazelluläre Konzentration durch gleichzeitiger Gabe von spezifischen Inhibitoren des proteolytischen Abbaus durch Proteasomen das C1D-Genprodukts in transfizierten Zellen derart zu erhöhen, dass der Schwellenwert in einem signifikant höheren Anteil der Zellen überschritten wird und diese apoptotisch verenden. Dazu wurden Zellen mit Expressionskonstrukten transfiziert, die die Protein-kodierende Sequenz der Mensch C1D cDNA (Genbank X95592) oder der Maus C1D cDNA (Genbank X95591) ohne oder in Fusion mit einem Reportergen (z. B. EGFP) enthalten, und die in den Zielzellen das C1D-Protein zur Überexpression bringen. Die Transfektion wurde kombiniert mit einer oder mehreren Gaben (vor, während oder nach der Transfektion) eines spezifischen Proteasomeninhibitors (MG115; Benzyloxycarbonylleu-leu-norvalinal). The C1D gene product is one of the substrates of proteasomes, since its degradation by specific proteasome inhibitors is inhibited. It is therefore possible through natural Expression and by transfection with C1D Expression constructs increased intracellular concentration by simultaneous administration of specific inhibitors of proteolytic degradation by proteasomes of the C1D gene product in transfected cells so that the Threshold in a significantly higher proportion of cells is exceeded and these die apoptotically. To cells were transfected with expression constructs that the protein coding sequence of the human C1D cDNA (Genbank X95592) or the mouse C1D cDNA (Genbank X95591) without or in Fusion with a reporter gene (e.g. EGFP) included, and the overexpress the C1D protein in the target cells. The transfection was combined with one or more Gifts (before, during or after transfection) one specific proteasome inhibitor (MG115; Benzyloxycarbonylleu-leu-norvalinal).
Ehrlich Ascites Tumorzellen (EAT) wurden mit dem Reportergen- Konstrukt pcDNA3-MC1D-EGFP transfiziert (20 µg/ml, Zelldichte 107 pro ml, Biorad Gene Pulser II, Elektrodenabstand D = 4 mm, 366 V/950 µF). Zur Bestimmung des Proteasomen-Inhibitor- Effekts wurde die transfizierte Zellkultur geteilt und ohne bzw. nach Zusatz von MG 115 (10 µM) kultiviert. Ehrlich ascites tumor cells (EAT) were transfected with the reporter gene construct pcDNA3-MC1D-EGFP (20 µg / ml, cell density 10 7 per ml, Biorad Gene Pulser II, electrode spacing D = 4 mm, 366 V / 950 µF). To determine the proteasome inhibitor effect, the transfected cell culture was divided and cultured without or after adding MG 115 (10 μM).
Die Auswertung erfolgte qualitativ und quantitativ mittels
des Openlab Imaging Sytems (Improvision, Warwick, UK).
Fluoreszenzmikroskopisch würden qualitativ zwei Typen von
transfizierten Zellen unterschieden:
Typ A, sehr hoher MC1D-EGFP Gehalt, erkennbar an sehr starker
Fluoreszenz, apoptotische Zellen, absterbend (Fig. 1).
Typ B, relativ niedriger aber erkennbarer MC1D-EGFP Gehalt,
nicht absterbend, Fusionsprotein "verschwindet" aber
innerhalb von 120 Stunden nach Transfektion durch Abbau ohne
dass diese Zellen absterben (Fig. 2).
The evaluation was carried out qualitatively and quantitatively using the Openlab Imaging System (Improvision, Warwick, UK). Fluorescence microscopy would qualitatively differentiate between two types of transfected cells:
Type A, very high MC1D-EGFP content, recognizable by very strong fluorescence, apoptotic cells, dying ( Fig. 1).
Type B, relatively low but recognizable MC1D-EGFP content, not dying, fusion protein "disappears" but within 120 hours after transfection by degradation without these cells dying ( FIG. 2).
Eine quantitative Auswertung (24 Stunden nach Transfektion) von drei unabhängigen Experimenten (Fig. 3, Experiment 1, 2, 3) zeigt, dass der Anteil an apoptotischen Typ A-Zellen in Anwesenheit des Proteasomen-Inhibitors (durchschnittlich 15x) erhöht wird. Dies zeigt, dass durch die Hemmung des Proteasomen-abhängigen Abbaus von C1D der Schwellenwert (point of no return) in einem signifikant höheren Anteil der Zellen überschritten wird. A quantitative evaluation (24 hours after transfection) of three independent experiments ( FIG. 3, experiment 1, 2, 3) shows that the proportion of apoptotic type A cells is increased in the presence of the proteasome inhibitor (15x on average). This shows that the inhibition of proteasome-dependent degradation of C1D exceeds the threshold (point of no return) in a significantly higher proportion of the cells.
Die signifikante Erhöhung des C1D-Gen-Produkts in Anwesenheit eines Hemmstoffs für den Abbau durch Proteasomen kann auch durch das in Fig. 4 dargestellte Experiment belegt werden. Fig. 4 zeigt einen Western-Blot, eine Methode, die geeignet ist um die intrazelluläre Konzentration eines Proteins anzuzeigen. Die linken Bahnen eines SDS-Polyacrylamid-Gels wurden mit gleichen Mengen Proteinlysat aus mit pcDNA3-MC1D- EGFP transfizierten Zellen beladen. Das Lysat (-) stammt von Zellen, die nur transfiziert wurden und das Lysat (+) stammt von Zellen, die transfiziert und mit 10 µM Proteasomen- Inhibitor (MG115) behandelt wurden. Der rechte Teil der Figur zeigt den immunochemischen Nachweis des Fusionsproteins mit einem anti-C1D-Antikörper (Nehls et al., Nucleic Acid Res. 26, S. 1160-1166 (1998)). Man sieht, dass die Menge des Fusionsproteins im Lysat (+) um ein Vielfaches (10-20x) erhöht ist. The significant increase in the C1D gene product in the presence of an inhibitor for degradation by proteasomes can also be demonstrated by the experiment shown in FIG. 4. FIG. 4 shows a Western blot, a method which is suitable for indicating the intracellular concentration of a protein. The left lanes of an SDS-polyacrylamide gel were loaded with equal amounts of protein lysate from cells transfected with pcDNA3-MC1D-EGFP. The lysate (-) is from cells that have only been transfected and the lysate (+) is from cells that have been transfected and treated with 10 µM proteasome inhibitor (MG115). The right part of the figure shows the immunochemical detection of the fusion protein with an anti-C1D antibody (Nehls et al., Nucleic Acid Res. 26, pp. 1160-1166 (1998)). It can be seen that the amount of the fusion protein in the lysate (+) is increased by a multiple (10-20x).
Es ist bekannt, dass Proteine, die durch Proteasomen abgebaut werden, zunächst an spezifischen Sub-Sequenzen mit Ubiquitin- Resten versehen werden (Ubiquitinierung) und dass die dermaßen veränderten Stellen im Protein dadurch zum Ziel für den proteolytischen Angriff durch Proteasomen werden. Der Proteasomen-abhängige Abbau eines Proteins wird also nicht durch das Protein insgesamt angeregt, sondern nur von Teilsequenzen des Proteins. Kennt man die Teilsequenz, die den proteolytischen Abbau anregt, kann man diese Sequenz auf der Nukleotidebene derart mutieren, dass das resultierende Protein kein Substrat oder zumindest nur noch ein schwächeres Substrat für den proteolytischen Abbau darstellt. It is known that proteins are broken down by proteasomes first, on specific sub-sequences with ubiquitin Residues are provided (ubiquitination) and that the thus changed places in the protein to the target for the proteolytic attack by proteasomes. The Proteasome-dependent breakdown of a protein will not stimulated by the protein as a whole, but only by Partial sequences of the protein. Do you know the partial sequence that this sequence can be stimulated to proteolytic degradation mutate the nucleotide level such that the resulting Protein is not a substrate or at least only a weaker one Represents substrate for proteolytic degradation.
Die Erfinder konnten in einem in der Literatur noch nicht
beschriebenen Ansatz den Bereich des C1D-Gen-Produkts
identifizieren, der den proteolytischen Abbau anregt. Dieser
Ansatz basierte auf folgenden Erkenntnissen:
- 1. Das Reportergen EGFP an sich persistiert in transfizierten Zellen, während das C1D-Fusionsprotein aus transfizierten Kulturen 120 Stunden nach Transfektion in den Zellen nicht mehr nachweisbar ist (Fig. 5). Letzteres ist bedingt durch den Zelltod der Typ A-Zellen einerseits und durch den Proteasomen-abhängigen Abbau des Fusionsproteins in Typ B-Zellen. Dieses Ergebnis belegt, dass die C1D-Sequenz und nicht das Indikator- bzw. Reportergen-Produkt EGFP das Substrat für den raschen Abbau des Fusionsproteins darstellt.
- 2. Die Intensität der Reportergen-bedingten Fluoreszenz kann als Maß des jeweils vorhandenen Fusionsproteins dienen.
- 3. Die jeweilige Menge des Fusionsproteins ergibt sich aus der Bilanz zwischen Neusynthese und Abbau. Da die in der Folge beschriebenen Expressionskonstrukte alle unter der Regulation des gleichen Promotors stehen (CMV), ist ihre Syntheserate konstant. Relativ niedrige Fluoreszenz in transfizierten Zellen bedeutet deshalb hohe Abbaurate, relativ hohe Fluoreszenz bedeutet niedrige Abbaurate.
- 1. The reporter gene EGFP per se persists in transfected cells, while the C1D fusion protein from transfected cultures is no longer detectable in the cells 120 hours after transfection ( FIG. 5). The latter is caused by the cell death of type A cells on the one hand and by the proteasome-dependent breakdown of the fusion protein in type B cells. This result shows that the C1D sequence and not the indicator or reporter gene product EGFP is the substrate for the rapid breakdown of the fusion protein.
- 2. The intensity of the reporter gene-related fluorescence can serve as a measure of the fusion protein present in each case.
- 3. The respective amount of the fusion protein results from the balance between new synthesis and degradation. Since the expression constructs described below are all regulated by the same promoter (CMV), their synthesis rate is constant. Relatively low fluorescence in transfected cells therefore means high degradation rate, relatively high fluorescence means low degradation rate.
Es wurden deshalb 5' und 3' deletierte Expressions-Konstrukte hergestellt, und die Menge des jeweiligen Fusionsproteins wurde nach Transfektion (siehe Beispiel 1) in den transfizierten Zellen unter identischen Bedingungen mittels des "Openlab Imaging Systems" (siehe Beispiel 1) bestimmt (Fig. 6). 5 'and 3' deleted expression constructs were therefore prepared and the amount of the respective fusion protein was determined after transfection (see Example 1) in the transfected cells under identical conditions using the "Openlab Imaging System" (see Example 1) ( FIG . 6).
Die Gesamtsequenz des C1D-Gen-Produkts beträgt 141 Aminosäuren. Bei Deletionen am 5' Ende findet man zunächst relative niedrige Fluoreszenz (Positionen 1-50), d. h. die entsprechenden Fusionsproteine werden mit hoher Rate abgebaut. Daraus folgt, dass in diesem Sequenzbereiche keine Signale deletiert wurden, die für den proteolytischen Abbau Maßgebend sind. Bei weiteren Deletionen (Positionen 50-80) steigt die gemessene Fluoreszenz an, was anzeigt, dass die Fusionsproteine in geringerem Maße abgebaut werden und dass hier zunehmend Sub-Sequenzen deletiert werden, die als Erkennungssignal für den proteolytischen Abbau durch Proteasomen dienen. Die Ergebnisse der Deletionen am 3' Ende zeigen, dass das Ende der Gesamtsequenz (Positionen 90-141) ebenfalls nicht als Signal für den proteolytischen Abbau dienen kann. Zusammenfassend wurde erkannt, dass die Signale für den proteolytischen Abbau des C1D-Gen-Produkts zwischen den Positionen 50-90 liegen müssen und dass somit Mutationen in diesem Bereich bei Erhalt der apoptotischen Wirkung eine Herabsetzung der Abbaurate bewirken sollten. The overall sequence of the C1D gene product is 141 Amino acids. Deletions at the 5 'end are found first relatively low fluorescence (positions 1-50), i.e. H. the Corresponding fusion proteins are made at a high rate reduced. It follows that none in this sequence areas Signals were deleted for proteolytic degradation Are decisive. For further deletions (positions 50-80) the measured fluorescence increases, indicating that the Fusion proteins are broken down to a lesser extent and that here sub-sequences are increasingly being deleted that as Detection signal for the proteolytic degradation by Proteasomes serve. The results of the deletions at the 3 'end show that the end of the overall sequence (positions 90-141) also not as a signal for proteolytic degradation can serve. In summary, it was recognized that the signals for the proteolytic degradation of the C1D gene product between positions 50-90 and must therefore be mutations in this area while maintaining the apoptotic effect Should bring about a reduction in the degradation rate.
Hemmung des Abbaus des C1D-Genprodukts durch Modifikation der AminosäuresequenzInhibition of degradation of the C1D gene product by modification of the amino acid sequence
Auf der Basis der Befunde von Beispiel 2(A) wurden in dem Bereich aa 50 bis 90 auf Nukleotidebene verschiedene Mutationen eingeführt, die auf der Proteinebene zu Aminosäureaustauschen führen, wodurch eine geringere Abbaurate und eine höhere Effizienz im Hinblick auf die Auslösung von Apoptose erzielt werden konnte. Based on the findings of Example 2 (A), the Range aa 50 to 90 different at the nucleotide level Mutations introduced at the protein level too Amino acid exchanges result in a lower Degradation rate and greater efficiency in terms of Triggering of apoptosis could be achieved.
In der Teilsequenz, die für den Proteasomen-vermittelten Abbau des C1D-Proteins verantwortlich ist, befinden sich drei Lysinreste (Positionen 54, 79 und 84), die als Ziele für die Bindung von Ubiqitinmolekülen in Frage kommen. Durch die gezielte Einführung von Mutationen auf der Nukleotid-Ebene wurde erreicht, dass diese Lysinreste in dem Genprodukt entweder einzeln oder in Kombination durch die Aminosäure Arginin ersetzt wurden. Für die Mutagenese-Experimente wurde das in der deutschen Patentschrift DE 198 24 811 C2 beschriebene Plasmid pcDNA3-MC1D-EGFP verwendet. Die Veränderung der Nukleotidsequenz wurde mit einem Kit der Firma Stratagene (QuickChange Site-Directed Mutagenesis-Kit; Amsterdam, Niederlande) und nach deren Protokoll durchgeführt. In the partial sequence that is mediated for the proteasome Degradation of the C1D protein is responsible, there are three Lysine residues (positions 54, 79 and 84) used as targets for the Binding of ubiqitin molecules come into question. Through the targeted introduction of mutations at the nucleotide level was achieved that these lysine residues in the gene product either individually or in combination by the amino acid Arginine have been replaced. For the mutagenesis experiments that in the German patent DE 198 24 811 C2 described plasmid pcDNA3-MC1D-EGFP used. The The nucleotide sequence was changed using a kit Stratagene (QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit; Amsterdam, Netherlands) and according to their protocol carried out.
Auf diese Weise wurden insgesamt 7 unterschiedlich mutierte DNA-Konstrukte erhalten. In den daraus resultierenden C1D- Proteinen sind die Lysinreste an den Positionen 54, 79 und 84 jeweils einzeln oder in Kombination (54/79, 54/84, 79/84 und 54/79/84) durch Argininreste ersetzt. In this way, a total of 7 different mutations were made Preserved DNA constructs. In the resulting C1D Proteins are the lysine residues at positions 54, 79 and 84 individually or in combination (54/79, 54/84, 79/84 and 54/79/84) replaced by arginine residues.
Der Effekt der genetischen Veränderungen auf den Abbau des C1D-Proteins wurde durch Transfektion der entsprechenden DNA- Konstrukte in CT26-Tumorzellen überprüft. Als Kontrollen dienten das genetisch unveränderte pcDNA3-MC1D-EGFP und das in der deutschen Patentschrift DE 198 24 811 C2 beschriebene Reporter-Genkonstrukt pcDNA3-EGFP, dessen Genprodukt (EGFP) nicht durch Proteasomen abgebaut wird (siehe oben). CT26- Zellen wurden über Nacht in Mikrotiter-Platten (2,5 × 104 Zellen/well, 24 wells/Platte) bei 37°C in Medium (DMEM/10% FKS) kultiviert. Für die Transfektion wurde die Plasmid-DNA mit einem liposomalen Transfektionsmittel (DMRIE-C, Gibco- BRL, Karlsruhe, Deutschland) komplexiert und zu den Zellen hinzugefügt. Nach 5 h Inkubation wurde die Transfektionslösung durch Medium ersetzt. Die Auswertung der Experimente erfolgte 24 h später. The effect of the genetic changes on the degradation of the C1D protein was checked by transfection of the corresponding DNA constructs in CT26 tumor cells. The genetically unchanged pcDNA3-MC1D-EGFP and the reporter gene construct pcDNA3-EGFP described in German patent DE 198 24 811 C2 served as controls, the gene product (EGFP) of which is not degraded by proteasomes (see above). CT26 cells were cultivated overnight in microtiter plates (2.5 × 10 4 cells / well, 24 wells / plate) at 37 ° C. in medium (DMEM / 10% FCS). For the transfection, the plasmid DNA was complexed with a liposomal transfection agent (DMRIE-C, Gibco-BRL, Karlsruhe, Germany) and added to the cells. After 5 h of incubation, the transfection solution was replaced by medium. The experiments were evaluated 24 hours later.
In Fig. 7 sind Zellen abgebildet, die das mutierte Genprodukt mt54/84-MC1D-EGFP (Fig. 7a) und vergleichend dazu das unveränderte Genprodukt MC1D-EGFP (Fig. 7b) sowie das Reporter-Genprodukt EGFP (Fig. 7c) unter gleichen experimentellen Bedingungen exprimieren. In Zellen, die mit dem mutierten C1D-Plasmid transfiziert wurden, ist der Anteil der fluoreszierenden Zellen zwar etwas geringer als in den mit dem Reportergen transfizierten Zellen. Er ist aber deutlich sichtbar höher als in den Zellen, die das genetisch unveränderte C1D-Protein produzieren. Auch ist die Menge des Genprodukts in den mit dem mutierten C1D-Plasmid transfizierten Zellen annähernd gleich groß wie in den mit dem Reportergen transfizierten Zellen. Sie ist aber eindeutig größer als in den Zellen, die mit der unveränderten Plasmid- DNA transfiziert wurden. FIG. 7 shows cells which contain the mutated gene product mt54 / 84-MC1D-EGFP ( FIG. 7a) and, in comparison, the unchanged gene product MC1D-EGFP ( FIG. 7b) and the reporter gene product EGFP ( FIG. 7c) express the same experimental conditions. In cells that were transfected with the mutant C1D plasmid, the proportion of fluorescent cells is somewhat lower than in the cells transfected with the reporter gene. However, it is clearly noticeably higher than in the cells that produce the genetically unchanged C1D protein. The amount of the gene product in the cells transfected with the mutant C1D plasmid is approximately the same as in the cells transfected with the reporter gene. However, it is clearly larger than in the cells that were transfected with the unchanged plasmid DNA.
Gemäß den zuvor erwähnten Befunden bedeutet dies, dass der Austausch bestimmter Aminosäuren einen deutlich verringerten Abbau des Genprodukts zur Folge hat. Ein Schutz vor dem Abbau durch Proteasomen wurde auch im Falle der Einzelmutanten mt54-MC1D-EGFP und mt84-MC1D-EGFP beobachtet. Im Vergleich zur Doppelmutante ist die Schutzwirkung allerdings etwas geringer. Die anderen Mutanten zeigten keine protektive Wirkung. Die Tatsache, dass das genetisch veränderte C1D- Protein seine Apoptose-induzierende Aktivität behalten hat, ist an den für diesen Prozeß typischen zellmorphologischen Veränderungen zu erkennen (siehe Fig. 7a, b). According to the findings mentioned above, this means that the exchange of certain amino acids results in a significantly reduced breakdown of the gene product. Protection against degradation by proteasomes was also observed in the case of the single mutants mt54-MC1D-EGFP and mt84-MC1D-EGFP. However, the protective effect is somewhat less than that of the double mutant. The other mutants showed no protective effect. The fact that the genetically modified C1D protein has retained its apoptosis-inducing activity can be recognized from the cell morphological changes typical of this process (see FIGS . 7a, b).
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