DE10216160A1

DE10216160A1 - Method for the detection of diseases based on defects in the protein cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)

Info

Publication number: DE10216160A1
Application number: DE10216160A
Authority: DE
Inventors: Hans Oberleithner; Hermann Schillers
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-02-26
Filing date: 2002-04-12
Publication date: 2003-09-25
Also published as: DE50313597D1; ES2389102T3; ATE504835T1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose von Membrankanaldefekten in Zellen durch Vergleich von defekten mit nicht defekten Zellen mit folgenden Schritten: Beeinflussung der Volumenregulation der Zellen, Erfassen einer daraus resultierenden veränderten Volumenregulation bei nicht defekten Zellen, Ermitteln des Vorhandenseins von defekten Zellen mit abweichender Änderung des Volumens, um eine geeignete Methode zur Verfügung zu stellen, die Erkrankungen, die auf Defekte des CFTR beruhen, insbesondere die zystische Fibrose, zu einem möglichst frühen Zeitpunkt zuverlässig nachweisen.The invention relates to a method for diagnosing membrane channel defects in cells by comparing defective to non-defective cells with the following steps: influencing the volume regulation of the cells, detecting a resulting changed volume regulation in the case of non-defective cells, determining the presence of defective cells with a different change in the Volume, in order to provide a suitable method that reliably proves diseases based on defects of the CFTR, in particular cystic fibrosis, as early as possible.

Description

Die Erfindung betrifft nicht-genetische Nachweisverfahren und -mittel für Erkrankungen, die auf Defekte des CFTR beruhen, insbesondere für die Erkrankung der Mukoviszidose resp. zystischen Fibrose (engl.: cystic fibrosis oder CF). The invention relates to non-genetic detection methods and agents for Diseases that are based on defects in the CFTR, especially for the Disease of cystic fibrosis resp. cystic fibrosis (English: cystic fibrosis or CF).

Verschiedene auf Defekte des CFTR basierende Krankheiten, wie beispielsweise die zystische Fibrose, das kongenitale Fehlen des Vas Deferenz und einige Formen der Pankreatitis sind bekannt. Die zystische Fibrose - auch Mukoviszidose genannt - stellt eine der am häufigsten vorkommenden genetisch-bedingten Erkrankungen dar. Die Krankheit tritt in regional unterschiedlicher Häufigkeit bei ca. 1 : 2500 der Neugeborenen auf. Various diseases based on defects of the CFTR, such as for example cystic fibrosis, congenital absence of vas deficiency and some forms of pancreatitis are known. Cystic fibrosis - too Called cystic fibrosis - represents one of the most common genetic diseases. The disease occurs in regional different frequencies in about 1: 2500 newborns.

Mukoviszidose wird autosomal rezessiv vererbt und geht auf einen Defekt am langen Arm des Chromosoms 7 zurück. Betroffen ist das Gen, das für das Protein CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), ein Membrantransportprotein kodiert. Das Hauptmerkmal dieser schwerwiegenden Erkrankung ist eine allgemeine Fehlfunktion von Epithelien, aller exokrinen Drüsen, der Lunge und des Verdauungstraktes. Die Krankheit äußert sich durch eine erhöhte Viskosität des Sekrets der mukösen Drüsen in der Lunge und in der Bauchspeicheldrüse. Im fortschreitenden Krankheitsverlauf kommt es zu erheblichen anatomischen Veränderungen, die schwere Komplikationen im Bereich der Atemwege, wie zum Beispiel chronische Infektionen mit Emphysem der Lunge und schwerwiegende Störungen der Verdauung (Malabsorption) mit Flüssigkeits- und Elektrolytverlusten zur Folge haben. Die Behandlung der zystischen Fibrose erfolgt durch Enzymsubstitution, gezielte Antibiotikagaben und physiotherapeutische Behandlung (Klopfmassage). Die Krankheit ist nicht heilbar. Mukoviszidose-Kranke leiden unter einer erheblichen Einschränkung ihrer Lebensqualität und erreichen trotz der heute guten medizinischen Betreuung in der Regel nur ein Lebensalter von ca. 40 Jahren. Cystic fibrosis is inherited in an autosomal recessive manner and leads to a defect on the long arm of chromosome 7. The gene affected for the protein CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), encodes a membrane transport protein. The main feature of this serious illness is a common malfunction of epithelia, all exocrine glands, the lungs and the digestive tract. The disease is expressed by an increased viscosity of the secretions of the mucous glands in the lungs and in the pancreas. In the progressive The course of the disease results in significant anatomical changes serious respiratory complications, such as chronic infections with emphysema of the lungs and serious disorders digestion (malabsorption) with loss of fluids and electrolytes Consequence. The treatment of cystic fibrosis is carried out by Enzyme substitution, targeted antibiotic administration and physiotherapy treatment (Tapping massage). The disease is not curable. Suffer from cystic fibrosis under a significant restriction on their quality of life and achieve despite the good medical care available today, usually only one Age of about 40 years.

Die Krankheitsentstehung ist noch nicht eindeutig geklärt. Das betroffene Gen kodiert für einen in der Membran vorwiegend epithelialer Zellen lokalisierten Chlorid-Kanal. Eine Vielzahl unterschiedlicher Mutationen, die zu erhöhter Schleimviskosität und einer veränderten Zusammensetzung der Sekrete führen, ist beschrieben (Pschyrembel, Klinisches Wörterbuch, 258. Auflage). Die häufigste Mutation ist die Deletion von Phenylalanin an Position 508 (ΔF508). Neben der homozygoten Form der Mukoviszidose kann sich die Krankheit auch bei heterozygoten Genträgern mit unterschiedlichem Schweregrad und auch noch im fortgeschrittenen Lebensalter entwickeln. Etwa 4% der weißen Bevölkerung Europas und der USA tragen eine heterozygote CFTR-Mutation. The development of the disease has not yet been clearly clarified. The affected Gene codes for a predominantly epithelial cell in the membrane localized chloride channel. A variety of different mutations that lead to increased mucus viscosity and a changed composition of the Keeping secretions is described (Pschyrembel, Klinisches Wörterbuch, 258. Edition). The most common mutation is the deletion of phenylalanine Position 508 (ΔF508). In addition to the homozygous form of cystic fibrosis the disease is also different in heterozygous carriers Severity and also develop in advanced age. About 4% of the white population in Europe and the United States have one heterozygous CFTR mutation.

Aus der Literatur ist bekannt, daß bei CF-Patienten mit der homozygoten Mutation ΔF508 das CFTR-Protein die Plasmamembran der Zellen entweder nicht erreicht oder nur in unzureichendem Maße in der Membran verankert wird. Ein solches CFTR-Protein ist dann funktionsunfähig. From the literature it is known that in CF patients with the homozygous Mutation ΔF508 the CFTR protein either the plasma membrane of the cells not reached or only insufficiently anchored in the membrane becomes. Such a CFTR protein is then unable to function.

Aus der Literatur ist weiterhin bekannt, daß der CFTR einen erheblichen Einfluß auf die Regulation des Zellvolumens hat. In Zellen, in denen die CFTR- Funktion nicht gestört ist, greift dieser in einen autokrinen Mechanismus ein, der durch die Freisetzung von und die Signalübertragung durch ATP (Adenosintriphosphat) über einen separaten Ionenkanal gesteuert wird. Ein hypotones Medium bewirkt einen zelleinwärts gerichteten Wassereinstrom. Die daraus resultierende Zellschwellung aktiviert den CFTR, der wiederum einen ATP-Transport aus der Zelle heraus auslöst. Das extrazelluläre ATP aktiviert purinerge Rezeptoren, die in der Zelle die Phospolipase C (PLC) zur Bildung von Inositoltriphosphat (IP₃) anregen. Das Inositoltriphosphat erhöht die intrazelluläre Konzentration an Kalziumionen (Ca²⁺). Eine erhöhte intrazelluläre Kalziumionenkonzentration aktiviert die kalziumabhängigen Kalium- und Chlorid-Kanäle sowie Kanäle für Osmolyte, wie beispielsweise Taurin. Daraufhin verlassen Kalium- und Chloridionen die Zelle. Durch diesen Nettosalzverlust strömt Wasser osmotisch hinterher. In der Folge schrumpft die Zelle (Braunstein, G. B. et al., The Journal of Biological Chemistry, Vol. 276, No. 9, Issue of March 2, pp. 6621-6630, 2001). Dieser Vorgang wird als regulierte Volumenverminderung, engl.: regulatory volume decrease (RVD) bezeichnet. Es wurde gezeigt, dass humane rote Blutzellen nach mechanischer Deformation CFTR-abh. ATP freisetzen (Sprague RS, Ellsworth ML, Stephenson AH, Kleinhenz ME, Lonigro AJ, Deformation-induced ATP release from red blood cell requires cystic fibrosis transmembrane conductance regulator activity. American Journal of Physiology, 275: H1726-H1732, 1998). Es wurde gezeigt, dass in hypotonen Medien die roten Blutzellen einiger Spezies ihr Volumen ATP abhängig regulieren, humane rote Blutzellen jedoch nicht. (Light DB, Capes TL, Gronau RT, Adler MR. Extracellular ATP stimulates volume decrease in Necturus red blood cell. American Journal of Physiology, Sep; 277(3 Pt 1): C480-91, 1999). It is also known from the literature that the CFTR has a considerable influence on the regulation of the cell volume. In cells in which the CFTR function is not disturbed, this intervenes in an autocrine mechanism which is controlled by the release of and the signal transmission by ATP (adenosine triphosphate) via a separate ion channel. A hypotonic medium causes water to flow inwards. The resulting cell swelling activates the CFTR, which in turn triggers ATP transport out of the cell. The extracellular ATP activates purinergic receptors, which stimulate the phospholipase C (PLC) in the cell to form inositol triphosphate (IP ₃ ). The inositol triphosphate increases the intracellular concentration of calcium ions (Ca ²⁺ ). An increased intracellular calcium ion concentration activates the calcium-dependent potassium and chloride channels as well as channels for osmolytes, such as taurine. Potassium and chloride ions then leave the cell. This net salt loss causes water to flow osmotically. As a result, the cell shrinks (Braunstein, GB et al., The Journal of Biological Chemistry, Vol. 276, No. 9, Issue of March 2, pp. 6621-6630, 2001). This process is known as regulatory volume decrease (RVD). It has been shown that human red blood cells are CFTR-dependent after mechanical deformation. ATP release (Sprague RS, Ellsworth ML, Stephenson AH, Kleinhenz ME, Lonigro AJ, Deformation-induced ATP release from red blood cell requires cystic fibrosis transmembrane conductance regulator activity. American Journal of Physiology, 275: H1726-H1732, 1998). It has been shown that in hypotonic media the red blood cells of some species regulate their volume depending on ATP, but not human red blood cells. (Light DB, Capes TL, Gronau RT, Adler MR. Extracellular ATP stimulates volume decrease in Necturus red blood cell. American Journal of Physiology, Sep; 277 (3 Pt 1): C480-91, 1999).

Methods of CF diagnostics

1. The diagnosis of cystic fibrosis has been carried out, among other things due to a sweat examination, in which the CFTR-dependent Chloride absorption of the epithelial cells of the weld through Determination of the chloride concentration in sweat is determined (patent no .: WO 00/13713 title: Macroscopic sweat test for cystic fibrosis). With CF- Patients are found to have an increased chloride concentration. The Sweat test can only be carried out and delivered from the 4th month of life often unclear results. It is also very timely and labor intensive and therefore expensive.
2. Other methods include measuring the by Pancreatic insufficiency in CF patients got into the blood immunoreactive trypsins (Patent No .: AU 6445186, title: Detection of immunreactive trypsin and cystic fibrosis using monoclonal antibody) and
3. Evidence of an increase in the albumin content in the meconium (Kindspech) of infants (patent no .: US 3,902,847, title: Diagnostic device and method for the diagnosis of mucoviscidosis (cystic fibrosis)).
4. In addition, the CF diagnosis can be made by examining the Salivary secretions and through
5. The exact, but complex and thus little used so far Transepithelial potential measurement on the nasal mucosa be made.
6. Another way of diagnosing cystic fibrosis is in the detection of the mutation via direct gene analysis (patent no .: WO 94/15218, title: Detection of cystic fibrosis or a gene mutation). The however, genetic testing is very limited infer functional disorders. So far there are many hundreds Various CFTR mutations are known that lead to more or less trained clinical images. However, in the genetic analysis only examined for approx. 15 different mutations, which are only approx. 80% cause all CF diseases.
7. A CF test was initiated using mechanical Deformation of erythrocyte-released ATP with the luciferin luciferase Assay to be measured. This is based on the observation a relationship between CFTR and ATP secretion. (Verloo, P. et al., Pediatric Pulmonology, Suppl. 20: 72 (2000)).
8. Other methods are based on differences between CF and non- CF in the kinetics of some enzymes, such as B. the NADH dehydrogenase the mitochondria (patent no .: PCT / US 80/00370, title: Cystic fibrosis detection method), the z. B. measured in the lymphocyte homogenate can be.
9. The enzyme hydrolase from CF patients shows under certain Test conditions faster inactivation kinetics than hydrolase from healthy volunteers (patent no .: US 4,469,788, title: In vitro diagnosis of cycstic fibrosis).

Die bekannten Nachweisverfahren sind z. T. teuer und zeigen den Nachteil, daß sie wenig zuverlässig und somit kein zuverlässiges Neugeborenen- Screening auf Mukoviszidose erlauben. Die genetische Untersuchung ist bei Neugeborenen möglich, erlaubt aber bei heterozygoter Mutation keine Aussage über das funktionelle Ausmaß des CFTR-Defektes. Der Schweißtest ist erst ab dem 4. Lebensmonat durchführbar und mit erheblichen Schwankungen verbunden, die Messung des immunreaktiven Trypsins und die Messung des Albumins im Mekonium sind wenig verläßlich. The known detection methods are e.g. T. expensive and show the disadvantage that they are not reliable and therefore not a reliable newborn Allow screening for cystic fibrosis. The genetic test is on Newborns possible, but do not allow for heterozygous mutations Statement about the functional extent of the CFTR defect. The sweat test is only feasible from the 4th month of life and with considerable Variations connected, the measurement of the immunoreactive trypsin and the measurement of albumins in the meconium are not very reliable.

Durch eine möglichst frühzeitige - am effektivsten beim Neugeborenen - durchgeführte verläßliche Diagnose der zystischen Fibrose könnte eine zielgerichtete Behandlung ab dem ersten Lebenstag die gesundheitliche Situation der Patienten verbessern und damit die Lebenserwartung deutlich erhöhen, da sich in diesem Fall die schwerwiegenden, krankheitsbedingten anatomischen Veränderungen weniger stark ausprägen würden. By as early as possible - most effective for the newborn - A reliable diagnosis of cystic fibrosis could be made targeted treatment from the first day of life the health Improve patient situation and thus life expectancy significantly increase, because in this case the serious, disease-related anatomical changes would be less pronounced.

Da die Standardverfahren keine frühzeitige Diagnose der zystischen Fibrose erlauben, können CF-Erkrankungen aber erst zu einem späten Zeitpunkt sicher erkannt werden. In der klinischen Praxis werden Säuglinge in begründeten Verdachtsfällen insbesondere mit Antibiotika behandelt, was Kosten verursacht und zu gesundheitlichen Beeinträchtigungen führen kann. Bei den heterozygoten CF-Mutationen kann sich das Krankheitsbild in den verschiedenen Schweregraden erst in der Jugend oder noch später im Erwachsenenalter manifestieren und ist somit einer erfolgreichen Frühbehandlung nicht zugänglich. Des weiteren existieren Krankheitsbilder, wie zum Beispiel bestimmte Pankreas-Erkrankungen, die mit Mutationen des CFTR-Gens in Zusammenhang gebracht werden. Because the standard procedure does not diagnose cystic fibrosis early allow, but can only CF diseases late be recognized safely. In clinical practice, infants are in substantiated suspected cases treated in particular with antibiotics, which costs caused and can lead to health problems. at The heterozygous CF mutations can change the clinical picture in the different degrees of severity only in youth or later in Manifest adulthood and is therefore a successful early treatment inaccessible. There are also clinical pictures, such as certain pancreatic diseases associated with mutations in the CFTR gene Be related.

Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, eine geeignete Methode zur Verfügung zu stellen, die Erkrankungen, die auf Defekte des CFTR beruhen, insbesondere die zystische Fibrose, zu einem möglichst frühen Zeitpunkt zuverlässig nachzuweisen. The invention is based on the object of a suitable method for To make available the diseases that are based on defects in the CFTR, especially cystic fibrosis, as early as possible reliable evidence.

Die Aufgabe wird gelöst durch Nachweisverfahren gemäß Anspruch 1 und 2, die geeignet sind, auf einen Defekt des CFTR beruhende Krankheiten durch Zelllyse nicht defekter Zellen zu bestimmen. Die Bestimmung erfolgt nach Anspruch 1 durch Verhinderung der CFTR-abh. Volumenregulation durch z. B. Blockade der ATP-Freisetzung und nach Anspruch 2 durch Aktivierung (Öffnung) von CFTR-abh. Ionenkanälen der nicht defekten Zellen. The object is achieved by detection methods according to claims 1 and 2, which are likely to result from diseases based on a defect in the CFTR Determine cell lysis of non-defective cells. The determination follows Claim 1 by preventing the CFTR-dependent. Volume regulation by z. B. block the ATP release and according to claim 2 by activation (Opening) of CFTR-dependent Ion channels of the non-defective cells.

Example of a detection method according to claim 1 for blood cells

Eine nicht defekte Zelle ist in der Lage, unter physiologischen Bedingungen ihr Zellvolumen durch ineinandergreifende Mechanismen über den Einstrom und den Ausstrom von Ionen und Wasser zu kontrollieren und zu steuern. In nicht defekten Blutzellen strömt Chlorid nach Einbringen in ein 155 mM Kaliumchlorid-Medium unter anderem über den funktionsfähigen CFTR in die Zelle. Der Erfindung gemäß Anspruch 1 liegt nun der Gedanke zugrunde, durch die Beeinflussung, z. B. Blockade, in der Zellmembran exprimierter, CFTR-abhängiger ATP-transportierender Kanäle die regulierte Volumenverminderung (RVD) zu verhindern. Einströmende Kalium- und Chloridionen akkumulieren in der funktionsfähigen nicht defekten Zelle, was durch den damit einhergehenden Wassereinstrom zur Lyse der Blutzellen führt, während die Lyse bei defekten Blutzellen, denen es bereits an dem Einwärtstransport der Ionen fehlt, ausbleibt. Dies ist insbesondere für CF- Blutzellen der Fall, bei denen durch den CFTR-Defekt keine Chlorid-Ionen über den CFTR in die Blutzellen einströmen und deren RVD CFTR-unabhängig ist. Infolgedessen kann sich in der Zelle auch kein Überdruck aufbauen; die Blutzellen mit defekten Ionenkanälen, insbesondere die Blutzellen von CF-Patienten unterliegen keiner Lyse. A non-defective cell is able to work under physiological conditions their cell volume through interlocking mechanisms via the inflow and to control and control the outflow of ions and water. In non-defective blood cells, chloride flows after introduction into a 155 mM Potassium chloride medium, among other things, via the functional CFTR in the Cell. The invention according to claim 1 is based on the idea by influencing, e.g. B. blockade, expressed in the cell membrane, CFTR-dependent ATP-transporting channels the regulated Prevent volume reduction (RVD). Incoming potassium and chloride ions accumulate in the functional non-defective cell, which is caused by the the accompanying influx of water leads to the lysis of the blood cells, while the lysis in the case of defective blood cells that already have the Inward transport of the ions is missing, does not occur. This is especially true for CF Blood cells the case where there is no chloride ion due to the CFTR defect flow into the blood cells via the CFTR and their RVD CFTR is independent. As a result, there can be no excess pressure in the cell build up; the blood cells with defective ion channels, especially the blood cells CF patients are not subject to lysis.

Bei den Mukoviszidose-Kranken mit einer homozygoten ΔF508 Mutation befindet sich das CFTR nicht in der Zellmembran. Bei heterozygoten Mutationen und anderen Mutationen als ΔF508 können sich kleine Mengen funktionsfähigen CFTR in der Membran befinden, die Chlorid transportieren und an der Volumenregulation beteiligt sind. Dabei ist die Menge der in der Zellmembran vorhandenen funktionsfähigen CFTR-Moleküle umgekehrt proportional zum Schweregrad der Erkrankung. Durch die Blockade der CFTR-abhängigen ATP-transportierenden Kanäle wird die CFTR-abhängige RVD verhindert. Der Beitrag der CFTR-abhängigen RVD zur gesamten RVD ist proportional zur Menge der in der Membran vorhandenen funktionsfähigen CFTR-Moleküle. Je mehr funktionsfähiger CFTR in der Membran ist, desto größer ist der Beitrag der CFTR-abhängigen RVD zur gesamten RVD und desto größer ist die Hämolyse nach Blockade der CFTR-abhängigen RVD. Daher ist das Maß der Hämolyse nach Blockade der CFTR-abhängigen RVD ein Maß für die in der Zellmembran vorhandenen funktionsfähigen CFTR- Moleküle. Da bei den Mukoviszidose-Kranken die Menge der in der Zellmembran vorhandenen funktionsfähigen CFTR-Moleküle umgekehrt proportional zum Schweregrad der Erkrankung ist, ist das Maß der Hämolyse nach Blockade der CFTR-abhängigen RVD ein Maß für den Schweregrad der Erkrankung. Dementsprechend erlaubt die Messung der Hämolyse nach Blockade der CFTR-abhängigen RVD eine Bestimmung des Schweregrades der Mukoviszidose. In cystic fibrosis patients with a homozygous ΔF508 mutation the CFTR is not in the cell membrane. In heterozygotes Mutations and mutations other than ΔF508 can result in small amounts functional CFTR are located in the membrane that transport and chloride are involved in volume regulation. The amount in the Reverse existing cell membrane functional CFTR molecules proportional to the severity of the disease. By blocking the CFTR-dependent ATP-transporting channels becomes the CFTR-dependent RVD prevented. The contribution of the CFTR-dependent RVD to the overall RVD is proportional to the amount of functional in the membrane CFTR molecules. The more functional CFTR is in the membrane, the more the contribution of the CFTR-dependent RVD to the entire RVD and the greater the hemolysis after blocking the CFTR-dependent RVD. Therefore, the degree of hemolysis after blockade is the CFTR-dependent RVD a measure of the functional CFTR- in the cell membrane Molecules. Because in the case of cystic fibrosis patients the amount of in Reverse existing cell membrane functional CFTR molecules is proportional to the severity of the disease, the degree of hemolysis is according to Blocking the CFTR-dependent RVD is a measure of the severity of the Illness. Accordingly, the measurement of hemolysis allows after Block the CFTR-dependent RVD by determining the severity of the Cystic fibrosis.

Untersuchungen des Blutes von gesunden Personen, Mukoviszidose-Patienten und postnatal aus der Nabelschnur entnommenen Blutproben von Neugeborenen (Nabelschnur-Blut) bestätigen die einfache Durchführbarkeit und die gute Aussagekraft des erfindungsgemäßen Testverfahrens, bei dem Gd³⁺ zur Blockade der Volumenregulation eingesetzt wird. Die statistische Auswertung der bisherigen Untersuchungsergebnisse mit 22 CF-Patienten und 87 gesunden Probanden sowie 59 Neugeborenen (Nabelschnur-Blut) zeigt eine eindeutige Zunahme des Hämolysegrades nach Zugabe von Gd³⁺ bei den gesunden Probanden und beim Nabelschnur-Blut. Bei den CF-Patienten wird eine nur geringfügige Zunahme des Hämolysegrades nach Gd³⁺- Applikation verzeichnet. Von den 87 gesunden Probanden wurden 75 als nicht-CF erkannt, d. h. richtig negativ (86%), und 12 wurden als CF erkannt, d. h. falsch positiv (14%). Von den 22 CF-Patienten wurden 18 als CF erkannt, d. h. richtig positiv (82%), und 4 wurden als nicht-CF erkannt, d. h. falsch negativ (18%). Von den 59 Neugeborenen wurden 57 als nicht-CF erkannt, d. h. richtig negativ (97%), und 2 wurden als CF erkannt, d. h. falsch positiv (3%) (Fig. 1). Examinations of the blood of healthy persons, cystic fibrosis patients and postnatally taken blood samples from newborns (umbilical cord blood) confirm the simple feasibility and the meaningfulness of the test method ^according to the invention, in which Gd ^{3+ is used} to block the volume regulation. The statistical evaluation of the results of the previous investigation with 22 CF patients and 87 healthy volunteers and 59 newborns (umbilical cord blood) shows a clear increase in the degree of hemolysis after the addition of Gd ³⁺ in the healthy subjects and in the umbilical cord blood. There was only a slight increase in the degree of hemolysis after Gd ³⁺ application in CF patients. Of the 87 healthy volunteers, 75 were recognized as non-CF, ie true negative (86%), and 12 were identified as CF, ie false positive (14%). Of the 22 CF patients, 18 were recognized as CF, ie really positive (82%), and 4 were recognized as non-CF, ie false negative (18%). Of the 59 newborns, 57 were recognized as non-CF, ie really negative (97%), and 2 were recognized as CF, ie false positive (3%) ( Fig. 1).

Example of a detection method according to claim 2 for blood cells

Die Aufgabe wird gelöst durch ein Nachweisverfahren gemäß Anspruch 2, das insbesondere geeignet ist, auf einen Defekt des CFTR beruhende Krankheiten durch eine auf einer Zelllyse nicht defekter Blutzellen basierende Ermittlung von defekten Blutzellen durch Aktivierung (Öffnung) von bestimmten Ionenkanälen der nicht defekten Blutzellen zu diagnostizieren. Der Erfindung gemäß Anspruch 2 liegt nun der Gedanke zugrunde, insbesondere durch Aktivierung von bestimmten CFTR-abhängigen Ionenkanälen in nicht defekten Blutzellen, durch die Anionen wie z. B.: Iodid (I^-), Bromid (Br^-), Chlorid (Cl^-), Fluorid (F^-), Gluconat (Gluconsäure-Anion), Rhodanid (SCN^-) und Taurin in die nicht defekten Blutzellen einströmen, eine Lyse der nicht defekten Blutzellen hervorzurufen. In defekten Blutzellen sind diese CFTR-abhängigen Ionenkanäle nicht vorhanden oder nicht aktivierbar. Deshalb kommt es nicht zum Einstrom von Anionen wie z. B.: Iodid, Bromid, Chlorid, Fluorid, Gluconat, Rhodanid und Taurin in die defekte Zelle. Infolgedessen kann sich in der Zelle auch kein Überdruck aufbauen; die Blutzellen mit defekten CFTR, insbesondere die Blutzellen von CF-Patienten unterliegen keiner Lyse. The object is achieved by a detection method according to claim 2, which is particularly suitable for diagnosing diseases based on a defect of the CFTR by determining defective blood cells based on cell lysis of non-defective blood cells by activating (opening) certain ion channels of the non-defective blood cells , The invention according to claim 2 is based on the idea, in particular by activating certain CFTR-dependent ion channels in non-defective blood cells through which anions such. For example: iodide (I ^- ), bromide (Br ^- ), chloride (Cl ^- ), fluoride (F ^- ), gluconate (gluconic acid anion), rhodanide (SCN ^- ) and taurine flow into the non-defective blood cells, a lysis of the non-defective blood cells. These CFTR-dependent ion channels are not present or cannot be activated in defective blood cells. Therefore, there is no influx of anions such. For example: iodide, bromide, chloride, fluoride, gluconate, rhodanide and taurine in the defective cell. As a result, no excess pressure can build up in the cell; the blood cells with defective CFTR, in particular the blood cells of CF patients, are not subject to lysis.

Da dieser CFTR-abhängige Ionenkanal in nicht defekten Blutzellen Anionen wie z. B.: Iodid, Bromid, Chlorid, Fluorid, Gluconat und Rhodanid sowie Taurin durchläßt, kann die Unterscheidung zwischen defekten und nicht defekten Blutzellen auch in 155 mM Lösungen erfolgen, die als Anion Iodid, Bromid, Fluorid, Gluconat, Rhodanid oder Taurin enthalten. Because this CFTR-dependent ion channel in non-defective blood cells, anions such as For example: iodide, bromide, chloride, fluoride, gluconate and rhodanide as well Passing through taurine can make the distinction between broken and not defective blood cells also take place in 155 mM solutions, which as an anion iodide, Contain bromide, fluoride, gluconate, rhodanide or taurine.

Die Blutzellen mit defekten Ionenkanälen, insbesondere die Blutzellen von CF-Patienten unterliegen keiner Lyse. The blood cells with defective ion channels, especially the blood cells from CF patients are not subject to lysis.

Die statistische Auswertung der Untersuchungsergebnisse mit 48 CF-Patienten und 148 gesunden Probanden sowie 82 Neugeborenen (Nabelschnur- Blut), zeigt eine eindeutige Zunahme des Hämolysegrades nach Zugabe von sDIDS (4-Amino-4'-Isothiocyanato-Stilben-2,2'-Disulfonsäure wird im folgenden sDIDS genannt) bei den gesunden Probanden und beim Nabelschnur- Blut. Bei den CF-Patienten kann eine nur geringfügige Zunahme des Hämolysegrades nach sDIDS-Applikation verzeichnet werden. Von den 148 gesunden Probanden wurden 119 als nicht-CF erkannt, d. h. richtig negativ (80,4%), und 29 wurden als CF erkannt, d. h. falsch positiv (19,6%). Von den 48 CF-Patienten wurden alle 48 als CF erkannt, d. h. richtig positiv (100%). Von den 82 Neugeborenen wurden 80 als nicht-CF erkannt, d. h. richtig negativ (97,5%), und 2 wurden als CF erkannt, d. h. falsch positiv (2,5%) (Fig. 2). The statistical evaluation of the test results with 48 CF patients and 148 healthy volunteers and 82 newborns (umbilical cord blood) shows a clear increase in the degree of hemolysis after the addition of sDIDS (4-amino-4'-isothiocyanato-stilbene-2,2'- Disulfonic acid is hereinafter referred to as sDIDS) in healthy subjects and in umbilical cord blood. In CF patients, there was only a slight increase in the degree of hemolysis after sDIDS application. Of the 148 healthy volunteers, 119 were recognized as non-CF, ie true negative (80.4%), and 29 were recognized as CF, ie false positive (19.6%). Of the 48 CF patients, all 48 were recognized as CF, ie really positive (100%). Of the 82 newborns, 80 were recognized as non-CF, ie really negative (97.5%), and 2 were recognized as CF, ie false positive (2.5%) ( Fig. 2).

Die Aktivierung eines bestimmten CFTR-abhängigen Ionenkanals, der Anionen wie z. B.: Iodid, Bromid, Chlorid, Fluorid, Gluconat, Rhodanid und Taurin durchläßt, gelingt mit einer Substanz, die durch besondere Behandlung von DIDS (4,4'-Diisothiocyanato-Stilben-2,2'-Disulfonsäure, Natriumsalz) entsteht. DIDS wird in DMSO gelöst (0,1 M) und für 4 Wochen bei 4°C im Kühlschrank gelagert. Durch diese Lagerung von DIDS entsteht ein Hydrolyseprodukt von DIDS durch in DMSO enthaltenem Restwasser. Untersuchungen dieser Lösung mit massenspektrometrischen Methoden zeigen, dass neben DIDS auch 4,4'-Diamino-Stilben-2,2'-Disulfonsäure (DADS) und 4- Amino-4'-Isothiocyanato-Stilben-2,2'-Disulfonsäure in der Lösung vorhanden sind (Fig. 3). The activation of a specific CFTR-dependent ion channel, the anions such. For example, iodide, bromide, chloride, fluoride, gluconate, rhodanide and taurine can pass through with a substance that results from the special treatment of DIDS (4,4'-diisothiocyanato-stilbene-2,2'-disulfonic acid, sodium salt). DIDS is dissolved in DMSO (0.1 M) and stored in the refrigerator for 4 weeks at 4 ° C. This storage of DIDS creates a hydrolysis product of DIDS from residual water contained in DMSO. Investigations of this solution using mass spectrometric methods show that in addition to DIDS, 4,4'-diamino-stilbene-2,2'-disulfonic acid (DADS) and 4-amino-4'-isothiocyanato-stilbene-2,2'-disulfonic acid are also in the Solution are available ( Fig. 3).

Durch partielle Hydrolyse von DIDS entsteht die 4-Amino-4'-Isothiocyanato- Stilben-2,2'-Disulfonsäure, H₂S und CO₂ (Fig. 4):
4,4'-Diisothiocyanato-Stilben-2,2'-Disulfonsäure, Na⁺-Salz (DIDS) + 2H₂O → 4-Amino-4'-Isothiocyanato-Stilben-2,2'-Disulfonsäure, Na⁺-Salz + H₂S + CO₂. Partial hydrolysis of DIDS produces the 4-amino-4'-isothiocyanato-stilbene-2,2'-disulfonic acid, H ₂ S and CO ₂ ( FIG. 4):
4,4'-diisothiocyanato-stilbene-2,2'-disulfonic acid, Na ⁺ salt (DIDS) + 2H ₂ O → 4-amino-4'-isothiocyanato-stilbene-2,2'-disulfonic acid, Na ⁺ salt + H ₂ S + CO ₂ .

Ebenso führt eine Lagerung von 4-Acetamido-4'-Isothiocyanato-Stilben-2,2'- Disulfonsäure (SITS) in wasserhaltigem DMSO bei 4°C über Wochen zu Hydrolyseprodukten, so dass in einer solchen Lösung neben SITS auch DADS und 4-Amino-4'-Isothiocyanato-Stilben-2,2'-Disulfonsäure zu finden sind. Durch partielle Hydrolyse von SITS entsteht die 4-Amino-4'-Isothiocyanato- Stilben-2,2'-Disulfonsäure und Essigsäure (Fig. 5):
4-Acetamido-4'-Isothiocyanato-Stilben-2,2'-Disulfonsäure, (SITS) + H₂O → 4-Amino-4'-Isothiocyanato-Stilben-2,2'-Disulfonsäure + Essigsäure
4-Amino-4'-Isothiocyanato-Stilben-2,2'-Disulfonsäure wird für die vorliegende Erfindung als sDIDS bezeichnet. Likewise, storage of 4-acetamido-4'-isothiocyanato-stilbene-2,2'-disulfonic acid (SITS) in water-containing DMSO at 4 ° C for weeks leads to hydrolysis products, so that in such a solution, besides SITS, DADS and 4- Amino-4'-isothiocyanato-stilbene-2,2'-disulfonic acid can be found. Partial hydrolysis of SITS produces 4-amino-4'-isothiocyanato-stilbene-2,2'-disulfonic acid and acetic acid ( Fig. 5):
4-acetamido-4'-isothiocyanato-stilbene-2,2'-disulfonic acid, (SITS) + H ₂ O → 4-amino-4'-isothiocyanato-stilbene-2,2'-disulfonic acid + acetic acid
4-Amino-4'-isothiocyanato-stilbene-2,2'-disulfonic acid is referred to as sDIDS for the present invention.

Auch das Produkt der partiellen Hydrolyse von 4,4'-Diisothiocyanato-Dihydrostilben-2,2'-disulfonsäure, Natriumsalz (H₂DIDS) wirkt wie sDIDS. Es unterscheidet sich von sDIDS nur durch eine Einfachbindung der Kohlenstoffatome zwischen den Phenylringen im Gegensatz zu einer Doppelbindung bei sDIDS.
4,4'-Diisothiocyanato-Dihydrostilben-2,2'-disulfonsäure, Na⁺-Salz (H₂DIDS) + 2H₂O → 4-Amino-4'-Isothiocyanato-Dihydrostilben-2,2'-disulfonsäure, Na⁺-Salz + H₂S + CO₂ The product of the partial hydrolysis of 4,4'-diisothiocyanato-dihydrostilbene-2,2'-disulfonic acid, sodium salt (H ₂ DIDS) also acts like sDIDS. It differs from sDIDS only by a single bond of the carbon atoms between the phenyl rings as opposed to a double bond in sDIDS.
4,4'-diisothiocyanato-dihydrostilbene-2,2'-disulfonic acid, Na ⁺ salt (H ₂ DIDS) + 2H ₂ O → 4-amino-4'-isothiocyanato-dihydrostilbene-2,2'-disulfonic acid, Na ⁺ -Salt + H ₂ S + CO ₂

Die Strukturformel ist in Fig. 7 gezeigt. The structural formula is shown in FIG. 7.

Bereits 1987 wurde von Horobin, Payne und Jakobsen (Horobin RW, Payne JN, Jakobsen P, Histochemical implications of the biological properties of SITS and some related compounds. Journal of Microscopy, 1987 Apr; 146(1): 87-96) beschrieben, dass sich SITS und DIDS in wässriger Lösung durch Hydrolyse der Acetamido-Gruppe bzw. einer Isothiocyanat-Gruppe zu 4-Amino-4'-Isothiocyanato-Stilben-2,2'-Disulfonsäure umsetzen. Dieses geschieht bei Raumtemperatur in einer Woche. Nach drei Wochen hat sich durch Hydrolyse der verbleibenden Isothiocyanat-Gruppe das DADS gebildet. Bei Lagerung von DIDS oder SITS in DMSO über mehrere Tage bei Raumtemperatur bilden sich durch Reaktion der Isothiocyanat-Gruppen mit Amino-Gruppen Polymere (Fig. 6). In der Literatur wird die Polymerbildung vom DIDS bereits beschrieben (Schultz BD, Singh AK, Devor DC, Bridges RJ. Pharmacology of CFTR chloride channel activity. Physiol Rev. 1999 Jan; 79(1 Suppl): S 109-44. Review). As early as 1987, Horobin, Payne and Jakobsen (Horobin RW, Payne JN, Jakobsen P, Histochemical implications of the biological properties of SITS and some related compounds. Journal of Microscopy, 1987 Apr; 146 (1): 87-96) described that SITS and DIDS are converted into 4-amino-4'-isothiocyanato-stilbene-2,2'-disulfonic acid by hydrolysis of the acetamido group or an isothiocyanate group in aqueous solution. This happens in one week at room temperature. After three weeks the DADS was formed by hydrolysis of the remaining isothiocyanate group. When DIDS or SITS are stored in DMSO for several days at room temperature, polymers are formed by reaction of the isothiocyanate groups with amino groups ( FIG. 6). Polymer formation from DIDS has already been described in the literature (Schultz BD, Singh AK, Devor DC, Bridges RJ. Pharmacology of CFTR chloride channel activity. Physiol Rev. 1999 Jan; 79 (1 Suppl): S 109-44. Review).

Bei den Experimenten zur Entwicklung des Test zeigte sich, dass die beobachtete Reaktion der roten Blutzellen sich nicht mit literaturbekannten Mechanismen erklären läßt. Die Blutzellreaktionen sind nur durch die Existenz eines bislang nicht literaturbekannten Kanalproteins erklärbar. Mittels patchclamp Technik konnte an einer humanen Atemwegsepithelzelllinie (Calu-3) in der whole-cell-Konfiguration die reversible Aktivierbarkeit einer Leitfähigkeit (Kanalprotein) durch sDIDS beobachtet werden (Fig. 8). Experiments to develop the test showed that the observed reaction of the red blood cells cannot be explained by mechanisms known from the literature. The blood cell reactions can only be explained by the existence of a channel protein that is not yet known from the literature. Using patchclamp technology, the reversible activation of a conductivity (channel protein) by sDIDS could be observed on a human airway epithelial cell line (Calu-3) in the whole-cell configuration ( FIG. 8).

Mit der whole-cell-Konfiguration der patch-clamp Technik wird der transmembranäre Strom einer Zelle bei vorgegebener Spannung gemessen. Die intrazelluläre Spannung wurde für jeweils 0,5 s auf Werte zwischen von -90 bis +10 mV gehalten und in 10 mV Schritten erhöht (8d). Die bei diesem Spannungsverlauf auftretenden Strömen einer Zelle sind in 8a-8c dargestellt. In 8a ist der Grundstrom einer unbehandelten Zelle gezeigt (Kontrolle). Durch Behandlung mit sDIDS steigt die Leitfähigkeit der Zellmembran dieser Zelle und damit der Strom (8b). Nachdem sDIDS aus dem Experiment entfernt wurde (Nachkontrolle), sinkt die Leitfähigkeit der Zellmembran dieser Zelle und damit der Strom (8c). In 8e ist der Strom in Abhängigkeit von der angelegten Spannung aufgetragen, wobei die Steigung der Kurve ein Maß für die Leitfähigkeit ist. With the whole-cell configuration of the patch-clamp technology, the transmembrane current of a cell measured at a given voltage. The intracellular tension was set to between -90 for 0.5 s each held to +10 mV and increased in 10 mV steps (8d). The one at this Currents occurring in a cell are shown in FIGS. 8a-8c shown. 8a shows the basic current of an untreated cell (control). Treatment with sDIDS increases the conductivity of the cell membrane Cell and thus the current (8b). After sDIDS from the experiment has been removed (follow-up check), the conductivity of the cell membrane decreases Cell and thus the current (8c). In Figure 8e the current is dependent on the applied voltage, the slope of the curve being a measure for conductivity.

Das neue Kanalprotein lässt Ionen wie z. B.: Iodid, Bromid, Chlorid, Fluorid, Gluconat, Rhodanid und Taurin passieren. Zudem ist dieses Kanalprotein vom CFTR abhängig, da in Blutzellen von CF-Patienten mit sDIDS keine Leitfähigkeit von Ionen wie z. B.: Iodid, Bromid, Chlorid, Fluorid, Gluconat, Rhodanid und Taurin aktivierbar ist. The new channel protein allows ions such as E.g .: iodide, bromide, chloride, fluoride, Gluconate, rhodanide and taurine pass through. This is also a channel protein dependent on the CFTR as there are none in the blood cells of CF patients with sDIDS Conductivity of ions such. E.g .: iodide, bromide, chloride, fluoride, gluconate, Rhodanide and taurine can be activated.

Diese Leitfähigkeit wird hier als "sDIDS activatable anion channel", kurz SDAC, bezeichnet und im folgenden SDAC genannt. This conductivity is called "sDIDS activatable anion channel", in short SDAC, referred to and hereinafter referred to as SDAC.

Die bisherigen Untersuchungen des Blutes von gesunden Personen, Mukoviszidose-Patienten und postnatal aus der Nabelschnur entnommenen Blutproben von Neugeborenen (Nabelschnur-Blut) bestätigen die einfache Durchführbarkeit und die gute Aussagekraft des erfindungsgemäßen Testverfahrens. The blood tests of healthy people so far, Cystic fibrosis patients and those taken postnatally from the umbilical cord Blood samples from newborns (umbilical cord blood) confirm the simple Feasibility and the good value of the invention Test procedure.

Das erfindungsgemäße Nachweisverfahren ist vorzugsweise mit Blutzellen einsetzbar. Besonders vorteilhaft zeigt sich der Einsatz von Retikulozyten und jungen Erythrozyten. The detection method according to the invention is preferably with blood cells used. The use of reticulocytes is particularly advantageous and young erythrocytes.

Retikulozyten sind die Vorläuferzellen der roten Blutkörperchen, der Erythrozyten. Sie werden im Knochenmark gebildet und ab dem Moment, in dem sie in den Blutkreislauf übertreten, Retikulozyten genannt. Sie verfügen über Zellorganellen und membranäre Transportsysteme. Nach ca. drei Tagen sind die Retikulozyten unter Verlust ihrer Zellorganellen und eines Teils ihrer membranären Transportsysteme zu jungen Erythrozyten gereift. Erythrozyten verweilen ca. 100 Tage im Blutkreislauf und verlieren im Laufe dieser Zeit immer mehr ihrer membranständigen Proteine. Da die Erythrozyten keinen Zellkern haben, ist die Neusynthese von Proteinen nicht möglich. Der Anteil der Retikulozyten im Vollblut beträgt 0,4 bis 2% der Blutzellen beim Erwachsenen und bis zu 10% beim Neugeborenen. Reticulocytes are the precursor cells of the red blood cells, the Erythrocytes. They are formed in the bone marrow and from the moment they are enter the bloodstream, called reticulocytes. You have Cell organelles and membrane transport systems. After about three days the reticulocytes with the loss of their cell organelles and part of them membrane transport systems matured into young erythrocytes. Erythrocytes remain in the bloodstream for about 100 days and lose in the course of this Time more and more of their membrane-bound proteins. Because the erythrocytes have no cell nucleus, the new synthesis of proteins is not possible. The The percentage of reticulocytes in whole blood is 0.4 to 2% of the blood cells in Adults and up to 10% in newborns.

Das erfindungsgemäße Verfahren, die Volumenregulation von Blutzellen durch die Blockade transmembranärer Proteine zu beeinflussen oder durch Aktivierung CFTR-abhängiger Ionenkanäle eine starke Volumenaufnahme und Lyse nicht defekter Blutzellen zu verursachen, läßt sich für eine Vielzahl weiterer Untersuchungsmethoden zum Auffinden anderer Kanaldefekte, wie z. B. das Bartter-Syndrom, einsetzen. Beim Bartter-Syndrom handelt es sich um eine erbliche, nierenschädigende Erkrankung, die zu Lähmungen, Überwässerung und allgemeiner Schwächung des Körpers führen kann. The method according to the invention, the volume regulation of blood cells by blocking transmembrane proteins or by Activation of CFTR-dependent ion channels leads to strong volume uptake and causing lysis of non-defective blood cells can be done for a variety other methods of investigation to find other channel defects, such as z. B. Bartter syndrome. Bartter syndrome is an inherited, kidney-damaging disease that leads to paralysis, Overhydration and general weakening of the body can result.

Das erfindungsgemäße Nachweisverfahren hat gegenüber den bislang eingesetzten Standardmethoden den Vorteil, dass es schnell, einfach, mit großem Probendurchsatz und somit kostengünstig einsetzbar ist. Das Untersuchungsmaterial, in Form von geringen Mengen Patientenblut, ist leicht verfügbar und mit den üblichen Einrichtungen und Gerätschaften eines Krankenhauslabors problemlos zu beschaffen und zu bearbeiten. Mit postnatal entnommenem Nabelblut kann ein Neugeborenen-Screening ohne invasiven Eingriff erfolgen. The detection method according to the invention has so far compared to Standard methods used have the advantage that it is quick, easy, with large sample throughput and is therefore inexpensive to use. The Exam material, in the form of small amounts of patient blood, is light available and with the usual facilities and equipment one Easy to procure and edit hospital laboratories. With postnatal Withdrawn umbilical blood can be a newborn screening without invasive Intervention.

Preferred embodiment according to method 1

Erfindungsgemäß werden zunächst Blutzellen aus Vollblut durch Zentrifugation gewonnen. Die Blutzellen werden einmalig mit isotoner Kochsalz-Lösung gewaschen und anschließend in einer Lösung, bestehend aus 155 mM KCl, 10 mM HEPES-Puffer (4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid) (pH 7,4) und 100 mM GdCl₃, resuspendiert. Diese Lösung wird für 60 min unter Schütteln bei 37°C inkubiert und das freigesetzte Hämoglobin anschließend in der Lösung bestimmt. Die Retikulozyten und die jungen Erythrozyten aus dem Blut gesunder Probanden platzen und setzen ihr Hämoglobin frei; sie hämolysieren unter den gewählten Bedingungen. Die Hämolyse wird durch Sichtprüfung bestimmt und durch Absorptionsmessung bei einer Wellenlänge von 546 nm quantifiziert. Darüber hinaus kann auch eine Retikulozytenzählung im Ausstrich erfolgen. Dadurch wird der Test auch von jedem niedergelassenen Arzt durchführbar, der möglicherweise nicht über die Geräteausstattung eines Krankenhauslabors verfügt. According to the invention, blood cells are first obtained from whole blood by centrifugation. The blood cells are washed once with isotonic saline solution and then in a solution consisting of 155 mM KCl, 10 mM HEPES buffer (4- (2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid) (pH 7.4) and 100 mM GdCl ₃ , resuspended. This solution is incubated for 60 min with shaking at 37 ° C. and the hemoglobin released is then determined in the solution. The reticulocytes and the young erythrocytes burst from the blood of healthy volunteers and release their hemoglobin; they hemolyze under the chosen conditions. Hemolysis is determined by visual inspection and quantified by absorption measurement at a wavelength of 546 nm. A reticulocyte count can also be made in the smear. This means that the test can also be carried out by any resident doctor who may not have the equipment of a hospital laboratory.

Durch den beschriebenen Einsatz des Gd³⁺ als Hemmstoff der ATP-Freisetzung steht eine preiswerte und einfach zu handhabende Chemikalie zur Verfügung. Der Test kann innerhalb einer Stunde ein zuverlässiges Ergebnis liefern. Der Arbeitszeit- und Materialaufwand ist in diesem Fall besonders gering. The described use of Gd ³⁺ as an ATP release inhibitor provides an inexpensive and easy-to-use chemical. The test can give a reliable result within an hour. In this case, the labor and material costs are particularly low.

Durch die in dem bevorzugten Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens gewählten Testbedingungen strömen Chlorid-Ionen in die Blutzelle ein. Gesunde Blutzellen reagieren darauf mit einer autokrinen Signalkaskade, die durch CFTR-abhängige ATP-Freisetzung gestartet wird und zur Abgabe von Osmolyten führt. Influx und Efflux stehen im Gleichgewicht. Diese CFTR-abhängige ATP-Freisetzung ist durch die Zugabe der Chemikalie Gadoliniumchlorid (GdCl₃) hemmbar, was eine Akkumulation von Chloridlonen in der Zelle zur Folge hat. Alternativ lassen sich auch andere Hemmstoffe dieser ATP-Freisetzung, z. B. Lanthan-Ionen (La³⁺) in Form von Lanthanchlorid (LaCl₃) und andere Hemmstoffe von deformations-aktivierbaren Kationenkanälen (stretch activatable cation channel, SAC) einsetzen. Der mit dem Ioneneinstrom verbundene Wassereinstrom führt zum Platzen der gesunden Blutzellen. Die Hämolyse kann photometrisch detektiert werden. Due to the test conditions chosen in the preferred embodiment of the method according to the invention, chloride ions flow into the blood cell. Healthy blood cells react to this with an autocrine signaling cascade, which is started by CFTR-dependent ATP release and leads to the release of osmolytes. Influx and efflux are in balance. This CFTR-dependent ATP release can be inhibited by the addition of the chemical gadolinium chloride (GdCl ₃ ), which results in the accumulation of chloride ions in the cell. Alternatively, other inhibitors of this ATP release, e.g. B. Use lanthanum ions (La ³⁺ ) in the form of lanthanum chloride (LaCl ₃ ) and other inhibitors of deformation-activatable cation channels (stretch activatable cation channel, SAC). The water influx associated with the ion influx leads to the bursting of the healthy blood cells. Hemolysis can be detected photometrically.

Preferred embodiment according to method 2

Das Verfahren gemäß Verfahren 2 wird analog zum Ausführungsbeispiel gemäß Verfahren 1 durchgeführt, nur werden die Blutzellen in einer Lösung, bestehend aus 155 mM KCl, 10 mM HEPES-Puffer (pH 7,4) und 100 µM sDIDS resuspendiert. Diese Lösung wird für 60 min unter Schütteln bei 37°C inkubiert und das freigesetzte Hämoglobin anschließend in der Lösung bestimmt. The method according to method 2 becomes analogous to the exemplary embodiment performed according to method 1, only the blood cells are in a solution, consisting of 155 mM KCl, 10 mM HEPES buffer (pH 7.4) and 100 µM sDIDS resuspended. This solution is shaken at 37 ° C for 60 min incubated and the released hemoglobin then in the solution certainly.

Durch die in dem bevorzugten Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens gewählten Testbedingungen strömen Chlorid-Ionen in nichtdefekten Blutzellen durch den durch sDIDS aktivierten Anionenkanal in die Blutzelle ein. Das führt zur Akkumulation von Chlorid-Ionen in der Blutzelle und der mit dem Ioneneinstrom verbundene Wassereinstrom führt zum Platzen der gesunden Blutzellen. Die Hämolyse kann photometrisch detektiert werden. Dieses Verfahren lässt sich auch mit 10 mM HEPES-gepufferter Lösung (pH 7,4) durchführen, die 155 mM Iodid, Bromid, Fluorid, Gluconat oder Rhodanid als Anion enthalten. By in the preferred embodiment of the invention Test conditions selected in the process flow in chloride ions non-defective blood cells through the anion channel activated by sDIDS into the Blood cell. This leads to the accumulation of chloride ions in the blood cell and the water inflow associated with the ion inflow leads to Burst of healthy blood cells. Hemolysis can be detected photometrically become. This method can also be buffered with 10 mM HEPES Carry out solution (pH 7.4) containing 155 mM iodide, bromide, fluoride, gluconate or rhodanide as an anion.

Die Anwendung des CF-Tests ist auch im Vollblut möglich. Dadurch gewinnt das Testverfahren weitere Einsatzmöglichkeiten, da es noch einfacher und schneller in der Durchführung wird. The CF test can also be used in whole blood. Thereby wins the test procedure has other uses as it is even easier and faster in execution.

Ein besonderer Vorteil des beschriebenen Tests besteht in der erstmalig gegebenen Möglichkeit, ein gesundes CFTR-Protein von einem mutierten kranken CFTR-Protein funktionell unterscheidbar zu machen und so auch heterozygote CFTR-Mutationen, die zu physiologischen Veränderungen führen, zuverlässig nachzuweisen. Im Vergleich zur genetischen Analyse ist das erfindungsgemäße Verfahren ein funktioneller Test, preiswerter und erlaubt aufgrund seiner schnellen Durchführbarkeit einen hohen Probendurchsatz, der besonders beim Screening von großer Bedeutung ist. A particular advantage of the test described is that it is the first time given the possibility of a healthy CFTR protein from a mutant to make sick CFTR protein functionally distinguishable and so too heterozygous CFTR mutations that lead to physiological changes lead to reliably demonstrate. Compared to genetic analysis, that is The inventive method a functional test, cheaper and allows due to its quick feasibility, a high sample throughput, which is particularly important for screening.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren im Rahmen eines Neugeborenen- Screenings lassen sich beispielsweise die Folgeschäden und dadurch bedingt die Folgekosten der zystischen Fibrose einschränken und sinnvolle Risikoabschätzungen für die betroffenen Patienten vornehmen. Durch die frühestmögliche Diagnose können krankhafte Veränderungen der Lunge und des Verdauungstraktes vermieden oder zumindest in ihrer Ausprägung positiv beeinflußt werden, da gerade im ersten Lebensjahr schwere Komplikationen infolge intestinaler Störungen mit letalem Ausgang häufig zu verzeichnen sind. Im fortgeschrittenen Alter tritt der Tod vermehrt als Folge des Lungenbefalls, einschließlich Herzversagens, durch die Überlastung des Lungenkreislaufes ein. Darüber hinaus erlaubt eine rechtzeitig eingeleitete sinnvolle Therapie und die Vermeidung der Verabreichung ungeeigneter Antibiotika eine deutliche Verbesserung der Lebensqualität und in der Folge eine Erhöhung der Lebenserwartung der CF-Patienten. By the method according to the invention in the context of a newborn Screenings can, for example, the consequential damage and thereby limits the consequential costs of cystic fibrosis and makes sense Make risk assessments for affected patients. Through the Earliest possible diagnosis can cause pathological changes in the lungs and of the digestive tract avoided or at least in their expression be positively influenced, especially in the first year of life Complications from intestinal disorders with fatal outcome often increase are listed. In advanced age death occurs increasingly as a result of Lung infestation, including heart failure, from overloading the Pulmonary circulation. It also allows a timely initiation sensible therapy and avoidance of unsuitable administration Antibiotics significantly improve the quality of life and consequently one Increase the life expectancy of CF patients.

In den Zeichnungen zeigen: The drawings show:

Fig. 1 statistische Auswertung der Experimente gemäß Anspruch 1, Fig. 1 Statistical analysis of the experiments according to claim 1,

Fig. 2 statistische Auswertung der Experimente gemäß Anspruch 2, Fig. 2 statistical analysis of the experiments according to claim 2,

Fig. 3 Massenspektrum der unsachgemäß gelagerten Lösung von DIDS in DMSO (0,1 M), Fig. 3 mass spectrum of the improperly stored solution of DIDS in DMSO (0.1 M),

Fig. 4 partielle Hydrolyse von DIDS, Fig. 4 partial hydrolysis of DIDS,

Fig. 5 partielle Hydrolyse von SITS, Fig. 5 partial hydrolysis of SITS,

Fig. 6 Polymerisierung von DIDS und 4-Amino-4'-Isothiocyanato-Stilben- 2,2'-Disulfonsäure, Fig. 6 Polymerization of DIDS and 4-amino-4'-isothiocyanato-stilbene 2,2'-disulfonic acid,

Fig. 7 4-Amino-4'-Isothiocyanato-Dihydrostilben-2,2'-disulfonsäure, Dinatriumsalz, Figure 7 4-amino-4'-isothiocyanato-dihydrostilbene-2,2'-disulfonic acid. Disodium salt,

Fig. 8 Strom-Spannungs-Beziehung von Calu-3 Zellen, gemessen mit der patch-clamp-Technik in der whole-cell-Konfiguration. Fig. 8 current-voltage relationship of Calu-3 cells, measured with the patch-clamp technique in the whole-cell configuration.

Claims

1. Method for diagnosing membrane channel defects in cells by comparing defective with non-defective cells with the following steps:

Influencing the volume regulation of the cells,

Detection of a resulting change in volume regulation in the case of non-defective cells,

- Determine the presence of defective cells with a different change in volume.

2. Method for diagnosing membrane channel defects by comparing defective with non-defective cells with the following steps:

- activation (opening) or inhibition of certain membrane channels,

- Determine the presence of defective cells with a different change in volume.

3. The method according to claim 1, characterized by the use an inhibitor of ATP release to inhibit the Volume regulation.

4. The method according to claim 1 or 2, characterized by the lysis of cells.

5. The method according to claim 1 or 2, characterized by the Use of blood cells.

6. The method according to claim 5, characterized by hemolysis the non-defective blood cells and non-hemolysis CFTR-defective Blood cells.

7. The method according to any one of claims 4 to 6, characterized by an optical method to quantify hemolysis.

8. The method according to any one of claims 5 or 6, characterized by a reticulocyte count in the smear to record the Hemolysis.

9. Diagnostic kit containing a blocking agent according to the procedure Claim 6, which for the hemolysis of healthy blood cells and leads to non-hemolysis of CFTR-defective blood cells.

10. The method according to claim 3, characterized by a representative from the group of inhibitors for stretch activatable cation channels (SAC).

11. The method according to claim 10, characterized by Gd ³⁺ as an inhibitor.

12. Diagnostic kit containing an activating agent according to the method Claim 2, which for hemolysis of healthy blood cells and non- Hemolysis leads to CFTR-defective blood cells.

13. The method according to claim 2, characterized by a means for Activation (opening) of the CFTR-dependent ion channel SDAC.

14. The method according to claim 2 or 13, characterized by a Stilbene derivative as an activating agent.

15. The method according to claim 14, characterized by 4-amino-4'- Isothiocyanato-stilbene-2,2'-disulfonic acid or its derivatives as an activating agent.

16. The method according to claim 14, characterized by 4-amino-4'- Isothiocyanato-Dihydrostilben-2,2'-disulfonic acid or derivatives of which as activating agents.

17. Using a stilbene derivative to activate the CFTR-dependent ion channel SDAC such as B. 4-amino-4'-isothiocyanato stilbene 2,2'-disulfonic acid or 4-amino-4'-isothiocyanato-dihydrostilbene 2,2'-disulfonic

18. Use of a stilbene derivative according to one of claims 13 to 16 for the detection of defects based on the CFTR Diseases.

19. Use of a stilbene derivative for the preparation of an agent for Detection of diseases based on defects in the CFTR.

20. Use of a stilbene derivative or other activating agent for Activation of the CFTR-dependent ion channel SDAC for production a means of diagnosing defects based on CFTR Diseases in newborn screening.

21. Use a stilbene derivative or other activating agent for Production of an agent for the diagnosis of cystic fibrosis in the Newborn screening.

22. The method according to any one of the preceding claims Testing of potentially therapeutically active substances or Gene therapies for those based on defects in the CFTR Diseases.

23. Method according to one of the preceding method claims, characterized by determining the severity of the cystic Fibrosis based on quantitative comparisons.