-
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Reaktionsgemisch zur Bereitstellung eines Reaktionsansatzes zur Durchführung einer quantitativen Echtzeit-PCR sowie ein Verfahren zur Durchführung einer quantitativen Echtzeit-PCR und einen Kit.
-
Stand der Technik
-
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine sehr sensitive Methode der Bioanalytik. Mithilfe des Enzyms DNA-Polymerase wird auf der Grundlage einer DNA-Sequenz als Vorlage DNA amplifiziert. Die in jedem Zyklus gebildeten Produkte dienen dabei als Vorlage für den jeweils nächsten Zyklus. Die zu vervielfältigende DNA wird dabei als template (Template-DNA) bezeichnet. Weiterhin sind sogenannte Primer erforderlich, die auf den Einzelsträngen der DNA jeweils den Startpunkt der DNA-Synthese festlegen. Die DNA-Synthese wird durch die temperaturstabile DNA-Polymerase unter Verwendung von Desoxy-Nukleotiden katalysiert. Für jeden PCR-Zyklus wird die doppelsträngige DNA zunächst denaturiert (melting), bevor die Primer-Hybridisierung, also die Bindung der Primer an den komplementäre Sequenzabschnitt der einzelsträngigen DNA (primer annealing) stattfinden kann. Anschließend lagert sich die DNA-Polymerase an und es kommt zur komplementäre Verlängerung der Primer in dem sogenannten Elongationsschritt (extending). Diese einzelnen Schritte werden durch Temperaturzyklen gesteuert.
-
Eine Ausführungsform der PCR ist die Echtzeit-PCR (qPCR), bei welcher der Reaktionsverlauf mittels Fluoreszenzsonden verfolgt werden kann. Die Echtzeit-PCR erlaubt dabei eine Quantifizierung der Ausgangsmenge der Template-DNA.
-
In der Regel sind hierfür Referenzmessungen, die in parallelen Reaktionsansätzen mitgeführt werden, erforderlich. Neben quantitativen Referenzmessungen werden standardmäßig auch qualitative Kontrollen mitgeführt, um falsch-positive oder falsch-negative Resultate ausschließen zu können.
-
Offenbarung der Erfindung
-
Vorteile der Erfindung
-
Die Erfindung stellt ein Reaktionsgemisch zur Verfügung, das zur Bereitstellung eines Reaktionsansatzes für die Durchführung einer quantitativen Echtzeit-PCR vorgesehen ist. Mit diesem Reaktionsgemisch kann die Quantifizierung einer DNA-Sequenz, beispielsweise einer DNA-Sequenz eines Genabschnittes, erfolgen, wobei in den jeweiligen Reaktionsansatz bzw. in das Reaktionsgemisch bereits parallele Standardreaktionen integriert sind, so dass es nicht erforderlich ist, parallele Standard- und Kontrollreaktionen mitzuführen. Der besondere Vorteil dabei ist, dass die Quantifizierung und eine Qualitätskontrolle in ein und demselben Reaktionsansatz (PCR-Ansatz) gemessen werden können. Unter einem Reaktionsansatz ist in diesem Zusammenhang zu verstehen, dass die Reaktion in einem Reaktionsgefäß abläuft. Es ist also nicht erforderlich, dass Referenzmessungen parallel mitgeführt werden, wodurch erhebliche Einsparungen bei dem Aufwand für die PCR-Ansätze möglich sind. Dies kann beispielsweise insbesondere bei Point-of-Care (PoC)-Anwendungen erhebliche Vorteile bieten, da bei solchen Anwendungen in der Regel Untersuchungen direkt für einen Patienten ausgeführt werden. Es ist dafür in der Regel bei herkömmlichen Verfahren erforderlich, für jeden Patienten entsprechende Referenzmessungen anzusetzen und parallel mitzuführen. Dies entfällt bei der Verwendung des Reaktionsgemisches der vorliegenden Erfindung. Das Reaktionsgemisch der vorliegenden Erfindung und das damit durchführbare Verfahren sind daher besonders in der Medizinaldiagnostik mit Vorteil einsetzbar.
-
Das Reaktionsgemisch der vorliegenden Erfindung umfasst wenigstens eine Ziel-DNA, die zumindest in Teilen der zu quantifizierenden DNA-Sequenz entspricht. Im Folgenden wird diese Ziel-DNA auch als Quanticon bezeichnet. Weiterhin enthält das Reaktionsgemisch wenigstens eine Referenz-DNA, die eine definierte, artifizielle Sequenz aufweist, und die in definierter Menge in dem Reaktionsgemisch vorliegt. Diese Referenz-DNA wird im Folgenden auch als Articon bezeichnet. Weiterhin sind wenigstens zwei verschiedene Fluoreszenzsonden mit unterschiedlicher Sequenz vorgesehen, die bei unterschiedlichen Wellenlängen ein Signal generieren. Darüber hinaus sind Primer, Desoxy-Nukleotide und eine hitzestabile DNA-Polymerase enthalten. Bei dem Primern handelt es sich, je nach Anwendung, um ein oder mehrere Primerpaare. Die Ziel-DNA und die Referenz-DNA weisen die gleichen Primer-Bindungsstellen (Primer-Hybridisierungsstellen) auf. Weiterhin sind unterschiedliche Sonden-Bindungsstellen auf der Ziel-DNA und der Referenz-DNA vorgesehen, wobei die Sonden-Bindungsstellen außerhalb der Primer-Bindungsstellen im jeweiligen Amplikon liegen. Der Begriff Amplikon bezeichnet hierbei allgemein die DNA, die vervielfältigt werden soll. Wenigstens eine der Fluoreszenzsonden ist zur Hybridisierung bzw. Bindung mit einem Abschnitt der Ziel-DNA außerhalb der Primer-Bindungsstellen im Amplikon vorgesehen. Wenigstens eine der Fluoreszenzsonden ist zur Hybridisierung bzw. Bindung mit einem Abschnitt der Referenz-DNA außerhalb der Primer-Bindungsstellen im Amplikon vorgesehen. Eine der Fluoreszenzsonden bindet also an die Ziel-DNA und die andere Fluoreszenzsonde bindet an die Referenz-DNA. Bei den Fluoreszenzsonden handelt es sich vorzugsweise um einzelsträngige DNA-Sequenzabschnitte, die jeweils an wenigstens ein Reporter-Farbstoffmolekül und an wenigstens ein Quencher-Molekül gekoppelt sind. Das Funktionsprinzip derartiger, an sich bekannter Fluoreszenzsonden basiert darauf, dass das Fluoreszenzsignal bei intakter Fluoreszenzsonde bzw. bei intaktem DNA-Molekül der Fluoreszenzsonde durch die räumliche Nähe des Reporter-Farbstoffmoleküls und des Quencher-Moleküls ausgelöscht ist. Während der PCR-Reaktion lagern sich die Fluoreszenzsonden an die jeweils komplementären Abschnitte der Template-DNA (außerhalb der Primer- Bindungsstellen) an. Während der Amplifizierung wandert die DNA-Polymerase an dem zu kopierenden Strang der Template-DNA entlang und stößt dabei zwangsläufig auf die angelagerte Fluoreszenzsonde. Durch eine 5'-3'-Exonuklease-Aktivität der DNA-Polymerase werden die Fluoreszenzsonden geschnitten, so dass die räumliche Nähe der Reporter-Farbstoffmoleküle und der Quencher-Farbstoffmoleküle aufgehoben wird, wodurch ein Fluoreszenzsignal entsteht. Dieses messbare Fluoreszenzsignal lässt daher auf die erfolgte Amplifikation rückschließen. Durch die Verwendung von zwei verschiedenen Fluoreszenzsonden, von denen die eine mit der Ziel-DNA oder die andere mit der Referenz-DNA wechselwirken, kann daher in einem Reaktionsansatz sowohl die Amplifikation auf der Basis der Ziel-DNA als auch die Amplifikation auf der Basis der Referenz-DNA durch die unterschiedlichen Fluoreszenzsignale verfolgt werden. Zweckmäßigerweise werden die Fluorophore der Sonden dabei so gewählt, dass die Farben bzw. Fluoreszenzsignale mittels einer Detektoreinrichtung und einem geeigneten Filterset voneinander unterscheidbar sind.
-
Die definierte, artifizielle Sequenz der Referenz-DNA ist zweckmäßigerweise ungleich (orthogonal), d.h. also nicht homolog, zu der Sequenz der Ziel-DNA, wobei der GC-Gehalt, also der Gesamtanteil an Guanin (G) und Cytosin (C) in der Sequenz, unabhängig von deren Positionen in der Sequenz selbst, vorzugsweise möglichst identisch mit dem GC-Gehalt der Ziel-DNA ist. Unter „möglichst identisch“ ist hierbei zu verstehen, dass eine Abweichung des prozentualen GC-Gehalts der Ziel-DNA und der Referenz-DNA von beispielsweise bis zu 15%, vorzugsweise von bis zu 10%, vorliegen kann. Weiterhin ist es bevorzugt, dass die Basenpaarlänge der Ziel-DNA-Sequenz und der Referenz-DNA-Sequenz möglichst gleich ist, wobei Abweichungen von beispielsweise bis zu 15%, vorzugsweise von bis zu 10%, akzeptabel sein können.
-
Das dem beschriebenen Reaktionsgemisch zugrundeliegende Konzept für die Durchführung einer quantitativen Echtzeit-PCR liegt darin, dass eine artifizielle Referenz-DNA in definierter Zusammensetzung und Menge dem Reaktionsansatz beigegeben wird. Die Referenz-DNA erlaubt eine interne Kalibrierung und kann darüber hinaus die Aufgaben von Positiv- und Negativ-Kontrollen erfüllen. Dabei wird im Prinzip eine Multi-Template-PCR durchgeführt, wobei in der Amplifikationsreaktion parallel mehrere verschiedene, spezifische Amplifikate entstehen. Es sind dabei mindestens zwei Templates, also die Ziel-DNA und die Referenz-DNA vorgesehen. Die Amplifikation der unterschiedlichen Templates erfolgt dabei im Prinzip mit nur einem Primerpaar, das mit der Ziel-DNA und der Referenz-DNA hybridisiert. Durch die Verwendung von verschiedenen Sonden, wobei eine Sonde für die Ziel-DNA und eine Sonde für die Referenz-DNA spezifisch ist (oder gegebenenfalls mehrere Sonden), können unterschiedliche Fluoreszenzsignale bzw. Fluoreszenzfarben detektiert werden, wobei aus den Verhältnissen der verschiedenen Fluoreszenzsignale zueinander das Testergebnis erhalten werden kann.
-
Ein PCR-Prozess, der mit dem beschriebenen Reaktionsgemisch durchgeführt wird, eignet sich aufgrund der integrierten Referenzen und Kontrollen in besonderer Weise für eine Automatisierung und eine Miniaturisierung, insbesondere im Rahmen einer mikrofluidischen Anwendung. Hierbei kann es besonders vorteilhaft sein, wenn die verschiedenen Komponenten des Reaktionsgemisches in lyophilisierter Form bereitgestellt werden. So können insbesondere die Ziel-DNA und/oder die Referenz-DNA und/oder die Primer und/oder die Desoxy-Nukleotide und/oder die DNA-Polymerase in lyophilisierter Form bereitgestellt und vorgelegt werden. Dies kann beispielsweise in Form von einem oder mehreren sogenannten Lyobeads realisiert werden. Unter einem Lyobead ist im Allgemeinen ein Lyophilisat zu verstehen, das nach der Herstellung, nach der die Substanzen in der Regel als Pulver vorliegen, in eine sphärische Form gepresst ist. So können beispielsweise die für den PCR-Ansatz erforderlichen Komponenten in lyophilisierter Form bereitgestellt werden, insbesondere die DNA-Polymerase, die Desoxy-Nukleotide, die Ziel-DNA und die Referenz-DNA und die Reaktionspufferkomponenten und gegebenenfalls auch die Primer und/oder die Sonden. Auf diese Weise kann in sehr anwenderfreundlicher Weise durch Zugabe der zu quantifizierenden Probe und gegebenenfalls von weiteren erforderlichen Komponenten der PCR-Prozess direkt gestartet werden. Die Bereitstellung in lyophilisierter Form ist insbesondere für automatisierte Anwendungen sehr vorteilhaft.
-
Die Bereitstellung des Reaktionsgemisches oder zumindest von Teilen des Reaktionsgemisches als Lyobead hat weiterhin den Vorteil, dass durch die Integration von Standards und/oder Kontrollen in einem Reaktionsansatz der Herstellungsaufwand und auch der Entwicklungsaufwand für die Lyobeads erheblich reduziert werden kann. Durch die Verringerung der Anzahl der erforderlichen Reaktionsansätze ist auch die Integration in ein mikrofluidisches System besonders vorteilhaft, da weniger Reaktionskammern als bei herkömmlichen PCR-Prozessen erforderlich sind, und die mikrofluidische Plattform nicht um weitere Kammern erweitert werden muss. Weiterhin kann die Laufzeit der Echtzeit-PCR verkürzt werden, da das der Erfindung zugrundeliegende Konzept es ermöglicht, dass die Reaktionsbedingungen durch vordefinierte Mengen der Templates in einen besonders effizienten bzw. idealen Reaktionsbereich gebracht werden, so dass immer Fluroeszenzsignale erwartet werden können.
-
Ein weiterer besonderer Vorteil des hier beschriebenen PCR-Prozesses ist, dass durch die Integration von Standards und/oder Kontrollen in einem Reaktionsansatz die Bedingungen für die Standards, Kontrollen und die eigentliche Probe mit der zu quantifizierenden DNA identisch sind. Wenn beispielsweise eine Luftblase in dem Reaktionsansatz vorliegt, was in seltenen Fällen beispielsweise in mikrofluidischen Systemen der Fall sein kann, so sind die damit verbundenen Auswirkungen auf die Reaktionseffizienz für alle Templates identisch, also beispielsweise für die Qualitätskontrolle, die Kalibrierung und für die eigentliche Probenreaktion, so dass das gesamte Experiment in jedem Fall vergleich- und auswertbar ist.
-
Herkömmlicherweise wird im Rahmen einer quantitativen Echtzeit-PCR oft eine Standardgerade erstellt, wobei hierfür oftmals mindestens drei unterschiedliche Konzentrationen für die Standardgerade vorausgesetzt werden, die im Bereich der zu erwartenden Probenkonzentration liegen. Aus statistischen Gründen werden oftmals mehr Konzentrationen für die Standardreaktionen gewählt und diese Standardreaktionen zudem in Mehrfachausführung prozessiert. Bei dem vorliegend beschriebenen Konzept für die Echtzeit-PCR erfolgt die Kalibrierung mithilfe eines Mehrsignalkonzeptes der unterschiedlichen Fluoreszenzsonden und deren Verhältnis zueinander, weshalb nur eine Reaktion benötigt wird und dennoch eine Quantifizierung möglich ist. Dies hat erhebliche Vorteile im Hinblick auf den hierfür erforderlichen Arbeits- und Prozessaufwand sowie auch im Hinblick auf eine vorteilhafte Minimierung von kostspieligen Chemikalien und den Probenbedarf bzw. die erforderliche geringe Probenmenge.
-
In einer bevorzugten Ausgestaltung des Reaktionsgemisches kann die Menge der Referenz-DNA in einer Konzentration vorliegen, die einer Nachweisgrenze für den zu quantifizierende DNA-Abschnitt entspricht. Weiterhin kann es je nach Anwendung vorgesehen sein, dass die Ziel-DNA und die Referenz-DNA in einem Verhältnis von 1:1 und darüber hinaus in definierten Mengen vorliegen.
-
Die Erfindung umfasst weiterhin ein Verfahren zur Durchführung einer quantitativen Echtzeit-PCR, wobei bei diesem Verfahren wenigstens ein Reaktionsgemisch, wie es oben beschrieben ist, verwendet wird. Zu diesem Reaktionsgemisch wird in der Regel noch die eigentliche Probe mit dem Nukleinsäurematerial, das den zu quantifizierenden DNA-Abschnitt (gegebenenfalls) umfasst, hinzugegeben. Mit diesem vervollständigten Reaktionsansatz wird der PCR-Prozess gewissermaßen als Duplexreaktion durchgeführt, wobei in an sich bekannter Weise die PCR-Zyklen durch Variation der Temperatur in einem an sich bekannten thermocycling-Prozess durchgeführt werden. Dabei wird zum einen die Ziel-DNA und der zu quantifizierende DNA-Abschnitt, sofern in der Probe vorhanden, als auch die Referenz-DNA amplifiziert. Durch Erfassung und Auswertung der Fluoreszenzsignale der verschiedenen Fluoreszenzsonden, die jeweils spezifisch für die Ziel-DNA (und gleichzeitig für den zu quantifizierenden DNA-Abschnitt) und die Referenz-DNA sind, kann die Amplifikation der Ziel-DNA und gleichzeitig der eigentlichen Probe mit dem zu quantifizierenden DNA-Abschnitt als auch die Amplifikation der Referenz-DNA erfasst und unterscheidbar nachverfolgt werden. Aus dem Verhältnis dieser Signale zueinander kann ein Testergebnis und insbesondere ein quantitatives Testergebnis ermittelt werden.
-
In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens wird das Verfahren in einem PCR-Array mit einer Mehrzahl von Arraygefäßen durchgeführt. Dies kann mit besonderem Vorteil in mikrofluidischen Anwendungen erfolgen, die insbesondere auch einer Automatisierung zugänglich sind. Hierbei kann jedes Arraygefäß des PCR-Arrays mit unterschiedlichen Reaktionsgemischen bestückt werden, so dass ein maximaler Multiplexgrad möglich ist. Die Bestückung kann beispielsweise durch ein Bespotten jedes Arraygefäßes mit einem anderen Reaktionsgemisch erfolgen. Hierdurch ist es möglich, dass insbesondere in einem mikrofluidischen PCR-Array die Probenlösung mit dem zu quantifizierenden DNA-Abschnitt bzw. dem zu untersuchenden Nukleinsäurematerial beispielsweise als Ganzes über den Array gegeben werden kann. Auf diese Weise gelangt die Probenlösung in jedes einzelne Arraygefäß und bildet mit dem jeweils unterschiedlichen Reaktionsgemisch einen jeweiligen Reaktionsansatz. Der besondere Vorteil hierbei ist, dass die einzelnen Reaktionskammern nicht einzeln befüllt und angesteuert werden müssen. Bei herkömmlichen Verfahren besteht das Problem, dass bei einem PCR-Array die Arraygefäße, die für die Standardreaktionen vorgesehen sind, nicht mit Probenmaterial beladen werden dürfen. Insofern ist es bei herkömmlichen PCR-Arrays in der Regel erforderlich, dass die einzelnen Reaktionskammern einzeln befüllt und angesteuert werden müssen, wobei die Reaktionsgefäße für die Standardreaktionen anders befüllt werden als die Reaktionskammern, die für die PCR-Prozesse mit der eigentlichen Probe vorgesehen sind. Der PCR-Array, mit dem ein PCR-Prozess gemäß dem vorliegend beschriebenen Konzept durchgeführt wird, erlaubt hingegen zum einen eine wesentlich größere Anzahl von PCR-Ansätzen mit der zu messenden Probe in einem Array, weil für die Standardreaktionen keine separaten Reaktionsansätze bereitgestellt werden müssen. Zum anderen erlaubt das Konzept der vorliegenden Anmeldung darüber hinaus, wie oben beschrieben, dass der gesamte Array als Ganzes mit der Probelösung befüllt wird.
-
Ein weiterer besonderer Vorteil des vorliegend beschriebenen Konzeptes für eine Echtzeit-PCR ist, dass das Reaktionssystem nicht für jede Lichtquelle kalibriert werden muss, da die Testergebnisse aus dem Verhältnis der Signale, das auf den konservierten Verhältnissen bei den einzelnen Amplifikationsabläufen beruht, gefällt wird. Lichtquellen und optische Detektoren sind oftmals bei verschiedenen Gerätetypen unterschiedlich. Daher sind herkömmlicherweise Kalibrierungsmessungen für jeden Gerätetyp erforderlich. Selbst in einem Gerät, bei dem zwei gleiche LED-Lichtquellen verbaut sind, müssen herkömmlicherweise beide Lichtquellen kalibriert werden, damit diese dieselben absoluten Zahlen, welche für die Auswertung über Standardgeraden erforderlich sind, liefern. Bei dem Konzept für eine Echtzeit-PCR gemäß der vorliegenden Erfindung entfallen diese aufwendigen Kalibrierungsmessungen, da mit relativen Verhältnissen innerhalb eines Ansatzes gearbeitet wird.
-
Bei medizinischen Anwendungen und insbesondere in der medizinischen Diagnostik sind die Probenmengen, die von dem Patienten gewonnen werden, oft klein. Weiterhin sind Analysesysteme, die in Point-of-Care-Anwendungen eingesetzt werden, für einen kleinen Platzbedarf vorgesehen und sollten einen möglichst hohen Automatisierungsgrad aufweisen, um den Bedienungsaufwand zu reduzieren. Insofern eignen sich insbesondere mikrofluidische Realisierungen des vorliegend beschriebenen PCR-Ansatzes in besonderer Weise für diese Anwendungen, wobei eine Automatisierung, eine Miniaturisierung und eine Parallelisierung möglich sind, was zum einen den Aufwand bei der Anwendung verringert und auch das Fehlerpotenzial bei Fehlbedienungen minimiert. Weiterhin können kleine Probenmengen in kleine Volumina überführt werden, so dass die Reaktionskonzentration größer wird. Bei herkömmlichen Verfahren ist eine Parallelisierung mit Herausforderungen an das Handling verbunden, da in der Regel die Verteilung von Reaktionsgemischen und die Vorlagerung und Aufbereitung der erforderlichen Chemikalien durch die Miniaturisierung schwierig ist. Die Echtzeit-PCR gemäß dem vorliegend beschriebenen Konzept minimiert den Aufwand bei dem Handling des PCR-Prozesses, da zum einen die Anzahl der Reaktionsansätze auf im Wesentlichen einen Ansatz reduziert wird. Hierbei können die erforderlichen Reagenzien ohne weiteres vorgelagert werden, beispielsweise in einem Lab-on-Chip-System. Durch die Möglichkeit der Lyophilisierung können die Reagenzien beispielsweise auch bei Raumtemperatur und auf kleinstem Raum bereitgestellt werden, beispielsweise in Form von Lyobeads.
-
In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens kann das Verfahren für einen verschachtelten PCR-Prozess genutzt werden. Ein verschachtelter PCR-Prozess umfasst in an sich bekannter Weise eine Präamplifikation und wenigstens eine nachgeschaltete Nachweisreaktion. Hierbei kann das vorliegend beschriebene Konzept unter Verwendung einer Ziel-DNA und einer Referenz-DNA in einem Ansatz für eine Abschätzung der PCR-Produktmenge der Präamplifikation genutzt werden. Hierbei können die Ziel-DNA und die Referenz-DNA so entworfen werden, dass ein erstes Primerpaar für die Präamplifikation und wenigstens ein zweites Primerpaar für die Nachweisreaktion(en) eingesetzt werden. Die Ziel-DNA und die Referenz-DNA weisen jeweils komplementäre Sequenzabschnitte zu den Primersequenzen auf (Primer-Bindungsstellen), wobei die komplementären Sequenzabschnitte für das zweite Primerpaar (Primer-Bindungsstellen für das Primerpaar der Nachweisreaktion(en)) innerhalb der komplementären Sequenzabschnitte für das erste Primerpaar (Primer-Bindungsstellen für das Primerpaar der Präamplifikation) liegen. Das heißt, die Primer-Bindungsstellen für die einzelnen Primerpaare sind auf der Ziel-DNA und der Referenz-DNA gewissermaßen ineinander verschachtelt.
-
Der verschachtelte PCR-Prozess kann insbesondere für einen Punktmutationsnachweis eingesetzt werden. Hierbei kann nach der Präamplifikation, deren PCR-Produktmenge gemäß dem vorliegend beschriebenen Konzept bestimmt wird, die Nachweisreaktion unter Verwendung eines mutationssensitiven Primers und/oder einer mutationssensitiven Fluoreszenzsonde durchgeführt werden.
-
Der verschachtelte PCR-Prozess kann ein Multiplex-Prozess sein, bei dem wenigstens zwei bestimmte Genabschnitte in einem Genom nachgewiesen werden sollen. Hierbei kann für eine Quantifizierung der Präamplifikation eine Kontrollreaktion durchgeführt werden, bei der parallel ein Kontroll-Exon aus dem Genom amplifiziert wird. Die Ziel-DNA und die Referenz-DNA sind in diesem Fall an das Kontroll-Exon angepasst, wobei aus der Quantifizierung der Amplifikation des Kontroll-Exons gemäß dem vorliegend beschriebenen Konzept auf die Mengen bei der Amplifikation der nachzuweisenden Genabschnitte während der Präamplifikation rückgeschlossen wird.
-
Insgesamt kann das vorliegend beschriebene Konzept für einen PCR-Prozess nicht nur quantitative Standardgeraden und Qualitätsreaktionen integrieren, sondern auch Referenz- und Schwellwertmessungen, welche z. B. bei Punktmutationsassays in der Onkologie benötigt werden. Obwohl pro zu untersuchendem DNA-Abschnitt zwei Farbkanäle bei der Detektion benötigt werden, erlaubt das Konzept ein Multiplexing und es können mehrere verschiedene DNA-Abschnitte (Targets) in einem Ansatz adressiert werden. Insbesondere im Rahmen einer verschachtelten PCR mit Präamplifikation und einer nachgeschalteten qualitativen Messung, beispielsweise einer Analyse einer Punktmutation, kann das Verfahren so angewendet werden, dass die Ausgangsmenge für die zweite Reaktion durch eine Quantifizierung der Präamplifikation abgeschätzt wird. Dabei können die beiden PCR-Prozesse, also die Präamplifikation und die nachgeschaltete Nachweisreaktion, in einem mikrofluidischen System vollautomatisch miteinander verknüpft werden, ohne dass in einem Zwischenschritt separat die DNA-Konzentration gemessen werden müsste oder dass bei der Präamplifikation entstandene PCR-Produkte aufgereinigt werden müssten. Der verschachtelte PCR-Prozess kann beispielsweise so ausgestaltet werden, dass nach der Abschätzung der PCR-Produktmenge aus der Präamplifikation eine optimale DNA-Konzentration für die nachfolgende(n) Nachweisreaktion(en) durch Verdünnung eingestellt wird. Dies kann beispielsweise in-situ, auch in automatisierter Weise, durchgeführt werden.
-
Die Erfindung umfasst schließlich einen Kit zur Durchführung einer quantitativen Echtzeit-PCR. Der Kit umfasst wenigstens eine Ziel-DNA, die zumindest in Teilen der zu quantifizierenden DNA-Sequenz entspricht. Weiterhin umfasst der Kit wenigstens eine Referenz-DNA mit definierter, artifizieller Sequenz und in definierter Menge. Weiterhin sind wenigstens zwei verschiedene Fluoreszenzsonden mit unterschiedlicher Sequenz vorhanden, die bei unterschiedlichen Wellenlängen ein Signal generieren. Gegebenenfalls können Primer und/oder Desoxy-Nukleotide und/oder eine DNA-Polymerase und/oder Pufferkomponenten vorgesehen sein. Die Ziel-DNA und die Referenz-DNA weisen die gleichen Primer-Bindungsstellen, aber unterschiedliche Sonden-Bindungsstellen auf, wobei die Sonden-Bindungsstellen außerhalb der Primer-Bindungsstellen im jeweiligen Amplikon liegen. Wenigstens eine der Fluoreszenzsonden ist zur Hybridisierung (Bindung) mit einem Abschnitt der Ziel-DNA außerhalb der Primer-Bindungsstellen im Amplikon und wenigstens eine der Fluoreszenzsonden ist zur Hybridisierung (Bindung) mit einem Abschnitt der Referenz-DNA außerhalb der Primer-Bindungsstellen im Amplikon vorgesehen. Die Bestandteile des Kits können insbesondere in lyophilisierter Form bereitgestellt werden, z.B. in Form von Lyobeads. Bezüglich weiterer Merkmale dieses Kits wird auf die obige Beschreibung verweisen.
-
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich oder in Kombination miteinander verwirklicht werden.
-
In den Figuren zeigen:
- 1 schematische Darstellung des Designs der Ziel-DNA und der Referenz-DNA zur Illustrierung des Grundprinzips des Konzeptes zur Durchführung einer quantitativen Echtzeit-PCR;
- 2 schematische Darstellung der für die quantitative Echtzeit-PCR verwendeten Template-DNAs und schematische Darstellung von möglichen Versuchsergebnissen bei der Quantifizierung eines bestimmten DNA-Abschnitts in einer Probe;
- 3 schematische Darstellung der für eine quantitative Echtzeit-PCR verwendeten DNA-Templates (3A) und schematische Darstellung von möglichen Versuchsergebnissen (3B) bei Anwendung des Konzeptes im Rahmen einer quantitativen verschachtelten PCR;
- 4 schematische Darstellung von möglichen Designs für eine Referenz-DNA im Rahmen eines Punktmutationsassays;
- 5 schematische Darstellung der verwendeten Template-DNAs zur Erläuterung einer Multiplexausführung einer verschachtelten PCR und
- 6 schematische Darstellung der Implementierung der quantitativen Echtzeit-PCR in einem mikrofluidischen PCR-Array.
-
Beschreibung von Ausführungsbeispielen
-
Anhand von
1 wird das Grundprinzip des Designs der verwendeten Template-DNAs, also der Ziel-DNA
11 und der Referenz-DNA
12 erläutert. Als Grundlage für den PCR-Reaktionsansatz kann ein klassisches TaqMan
®-System eingesetzt werden, wobei zwei verschiedene Fluoreszenzsonden, wie eingangs erläutert, verwendet werden. Dabei entspricht die Ziel-DNA der eigentlich zu analysierenden bzw. zu quantifizierenden DNA-Sequenz, beispielsweise der DNA-Sequenz eines Genabschnitts. Die Ziel-DNA
11 wird mit einer artifiziellen Referenz-DNA, die eine definierte Sequenz aufweist und die in definierter Menge eingesetzt wird, ergänzt. Die Ziel-DNA
11 und die Referenz-DNA
12 besitzen dieselben Primer-Bindungsstellen, also jeweils eine Bindungsstelle
13 für den Forward-Primer und jeweils eine Bindungsstelle
14 für den Reverse-Primer. In der restlichen Basenpaarsequenz
15,
16 unterscheiden sich diese Template-DNAs
11,
12. Insbesondere weisen sie unterschiedliche Bindungsstellen
17,
18 für die verwendeten Sonden auf. Die beiden Template-DNAs
11 und
12 werden auch als Quanticon
11 für das zu quantifizierende Amplikon und als Articon
12 für das artifizielle Amplikon bezeichnet. Die folgende Tabelle fasst das Design des Quanticon (Ziel-DNA)
11 und des Articon (Referenz-DNA)
12 zusammen:
| | Quanticon | Articon |
| Forward Primer | Target-spezifisch | Target-spezifisch |
| Sonde | Target-Sequenz, Fluorophor Farbe A | Orthogonale Sequenz, Fluorophor Farbe B |
| Sequenz | Target-Sequenz | Orthogonale Sequenz |
| Reverse Primer | Target-spezifisch | Target -spezifisch |
-
Die Fluorophore der Fluoreszenzsonden sind so gewählt, dass die beiden Farben mittels Detektor (Filterset) voneinander unterscheidbar sind. Die orthogonale Sequenz 16 der Referenz-DNA 12 ist zweckmäßiger ungleich zur Target-Sequenz 15 der Ziel-DNA 11. Der GC-Gehalt sollte möglichst identisch mit dem GC-Gehalt der Target-Sequenz 15 der Ziel-DNA sein. Auch die Basenpaarlänge von Quanticon, also Ziel-DNA 11, und Articon, also Referenz-DNA 12, sollte gleichlang sein. Dadurch sind die Schmelztemperaturen der beiden Amplikons 11, 12 sehr ähnlich, so dass bei einer effizienten PCR im Prinzip die gleichen Mengen an Amplifikat entstehen. Mit diesen Template-DNAs wird eine quantitative Echtzeit-PCR durchgeführt, wobei Quanticon 11 und Articon 12 als Quasi-Duplexreaktion im gleichen Reaktionsgefäß amplifiziert werden. Währenddessen werden beide Sonden aufgezeichnet, beispielsweise nach jedem PCR-Zyklus oder kontinuierlich. Das Articon 12 kann dabei in einer vordefinierten Menge im Bereich oder über der Nachweisgrenze vorgelegt werden und muss bei einer erfolgreichen PCR als Signale der Sonde B detektiert werden. Das Articon 12 dient in diesem Fall als Reaktionskontrolle. Die Amplifikation des Quanticons 11 und des gegebenenfalls zusätzlich im Reaktionsansatz vorhandenen zu quantifizierenden Genabschnitts (Target) ist als Signal von Sonde A detektierbar. Die Signale von Sonde A und B stehen nun in definierten Verhältnissen. Ist die gleiche Startmenge von Articon 12 und Quanticon 11 vorhanden, so sind die beiden Amplifikationskurven kongruent. Ist mehr Quanticon 11 vorhanden, dann wird dieses früher detektiert und die Kurve des Articons 12 folgt abhängig von dessen Konzentration. Dies lässt sich durch die Reaktionseffizienz und aus der fest definierten Menge des Articons 12 berechnen. Die vorgelegte Menge Articon 12 ist dabei ein absoluter Referenzpunkt, dessen Menge bekannt ist. Die Effizienz der Reaktion kann mittels der Kurvenform der exponentiellen Phasen ermittelt werden. Dadurch kann mit dem absoluten Referenzpunkt die unbekannte Startmenge des Quanticons 11 berechnet werden.
-
2 zeigt die Implementation des Reaktionssystems für den Fall, dass das Probenmaterial (Sample) als Genom vorliegt. Dies kann beispielsweise zur Anwendung kommen, wenn bestimmte Genabschnitte aus einem Lysat nachgewiesen werden sollen. Vergleichbar mit dem Prinzip aus 1 wird hier ein Quanticon 11 (Q) und ein Articon 12 (A) eingesetzt. Zusätzlich befindet sich im Reaktionsansatz der zu amplifizierende Genabschnitt 20 (S) als Zelllysat mit genetischem Material, das von dem Genom der Zelle(n) gebildet wird. In diesem Fall werden das Quanticon 11 und das Articon 12 in einer vordefinierten Menge in einem Verhältnis von 1:1 vorgelegt. Die gewählte Menge kann beispielsweise in der Nähe oberhalb der Nachweisgrenze liegen. Eine andere Möglichkeit ist, die Menge an einen für die PCR-Reaktion ideal funktionalen Bereich anzupassen, so dass die PCR besonders effizient abläuft. Im Allgemeinen hat jede quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) Grenzen, innerhalb derer die Reaktion effizient abläuft. Dabei stehen die detektierten CT-Werte, die den Anfang des exponentiellen Wachstums einer Kurve beschreiben, in einem linearen Verhältnis zur eingesetzten, logarithmierten Startmenge. Wenn die eingesetzte Menge des Quanticons 11 und des Articons 12 in diesem Bereich gewählt wird, sollte bei jedem erfolgreichen PCR-Prozess ein Signal detektiert werden. Das Signal des Articons 12 ist das Signal, welches in der zeitlichen Reihenfolge als Letztes gemessen werden muss. Fehlt dieses, ist die Reaktionskontrolle negativ. Wird zeitgleich mit dem Signal für das Articon 12 das Signal des Quanticons 11 detektiert, bedeutet dies, dass in der Reaktionsmischung nur Quanticon 11 und Articon 12 vorhanden war und keine Probe 20. Dieser Fall ist in dem Diagramm A der 2 dargestellt und dient als Nachweiskontrolle für die prinzipielle Funktion des PCR-Ansatzes. Hierbei repräsentieren die Linien 11 und 12 die jeweiligen Fluoreszenzsignale des Quanticons 11 (Fluorophor A) und des Articons 12 (Fluorophor B). Wenn in dem Genom bzw. in der Probe 20 der gleiche DNA-Abschnitt wie im Quanticon 11 vorhanden war, so wird dieser Abschnitt aus der Probe 20 mit hochamplifiziert. Dies führt dazu, dass das Signal des Quanticons 11 (Diagramm B in 2) früher detektiert wird, wobei sich das detektierte Signal aus der Amplifizierung des Quanticons 11 und der Probe 20 zusammensetzt. Wie im Prinzip anhand der 1 bereits erläutert, kann nun die Startmenge des zu untersuchenden DNA-Abschnitts aus der Probe 20 (Sample) berechnet werden. Die vordefinierten Mengen von Articon 12 und Quanticon 11 bieten dabei nicht nur den absoluten Referenzpunkt zur Berechnung der Quantifizierung, sondern gewährleisten auch Signale und dienen als Kontrolle.
-
In einer weiteren Ausgestaltung des PCR-Prozess kann der Prozess dynamisch durchgeführt werden, indem das Signal des Quanticons 11 ein Abbruchkriterium für die Reaktion darstellt, so dass nach dem Auftreten des Signals des Quanticons 11 der PCR-Prozess beendet werden kann. Da die Menge des Quanticons 11 in einen effizienten Bereich für den PCR-Prozess transferiert werden kann, ist eine Detektion etwa in der zeitlichen Mitte der geplanten Prozessdauer, also bei mittleren Zyklenzahlen, möglich. Bei einer positiven Probe, das heißt der gesuchte DNA-Abschnitt in der Probe 20 ist vorhanden, liegt das Signal des Quanticons 11 (zusammen mit dem Signal der Probe 20) vor dem Signal des Articons 12, so dass sich die Prozesszeit zur Messung verkürzen kann. In diesem Fall ist nach dem Abbruch der Reaktion lediglich eine qualitative Aussage möglich.
-
3A und 3B illustrieren das beschriebene Konzept im Rahmen einer qualitativen verschachtelten PCR (nested PCR). Eine solche PCR-Methode kann z. B. zum Nachweis von Mutationen eingesetzt werden. Dafür wird aus der genomischen DNA 30 von Zellen die Zielregion, in der die Mutation liegt, hochkopiert. Anschließend wird das Verhältnis von Wildtyp zu Mutation gemessen. Hierfür wird der eigentlichen Nachweisreaktion eine Präamplifikation vorangestellt, um sicherzugehen, dass genügend Material für einen Nachweis vorhanden ist. Dies ist insbesondere dann von großer Bedeutung, wenn wenig Zellmaterial vorhanden ist, wie z. B. bei einer Flüssigbiopsie mit zirkulierenden Tumorzellen. Wie in 3A illustriert, erfolgt die Implementierung des vorliegend beschriebenen Konzeptes in ein solches System so, dass zunächst der Lokus der Mutation 35 (Target-DNA) in einem genügend großen Abschnitt mit einem definierten Primerpaar hoch kopiert wird. Auf der genomischen DNA der Probe 30 sind für dieses erste Primerpaar entsprechende Bindungsstellen 33, 34 für einen Forward-Primer und einen Reverse-Primer vorhanden. Zur Kontrolle, Überwachung und Quantifizierung des Prozesses wird eine Sonden-Bindungsstelle 37 für eine erste Fluoreszenzsonde A in unmittelbarer Nähe der Primer-Bindungsstelle 33 gewählt. Kongruent zu diesem Amplikon in der Probe 30 wird ein Quanticon 21, also eine Ziel-DNA 21 entworfen, die entsprechende Primer-Bindungsstellen 23 und 24 und eine entsprechende Sonden-Bindungsstelle 27 für die Fluoreszenzsonde A aufweist. Weiterhin wird ein Articon 22 (Referenz-DNA) mit den gleichen Primer-Bindungsstellen 23, 24 und einer abweichenden Sonden-Bindungsstelle 28 für eine Fluoreszenzsonde B entworfen. Diese Komponenten 30, 21, 22 stellen die Basis für die Präamplifikation bereit, die gemäß des anhand von 2 erläuterten Prinzips quantifizierbar ist. Darüber hinaus sind für die nachfolgende Nachweisreaktion 102 weitere Primer-Bindungsstellen 43, 44 für ein weiteres Primerpaar mit einem zweiten Forward-Primer und einem zweiten Reverse-Primer vorgesehen, wobei sich bei dem genomischen Genabschnitt 30 die Bindungsstelle 43 für den zweiten Forward-Primer an die Bindungsstelle 37 für die Fluoreszenzsonde A anschließt. Die Bindungsstelle 44 für den zweiten Reverse-Primer befindet sich stromabwärts der eigentlichen Target-DNA 35, die den nachzuweisenden Genabschnitt darstellt. Auf der Referenz-DNA 22 (Articon für die Präamplifikation) befinden sich entsprechende Primer-Bindungsstellen 43, 44. Auf der Ziel-DNA 21 (Quanticon für die Präamplifikation) sind an den Positionen 143, 144, die den Primer-Bindungsstellen 43, 44 der Articon-Sequenz 22 entsprechen, abweichende, also orthogonale Sequenzen, vorgesehen. Die Sequenz zwischen den Sequenzen 143, 144 auf der Quanticon-Sequenz 21 entspricht der Target-DNA-Sequenz 35 des zu quantifizierenden DNA-Abschnitts der Probe 30.
-
Nach der Präamplifikation 100, die nach Zugabe des ersten Primerpaares erfolgt, ist als PCR-Produkt der amplifizierte, zu quantifizierende Genabschnitt 30' (amplifizierte Probe) vorhanden. Weiterhin ist das amplifizierte Articon 22' vorhanden. Das ebenfalls amplifizierte Quanticon 21 entspricht von der Sequenz her im Wesentlichen der amplifizierten Probe 30'. Innerhalb der Primer-Bindungsstellen 43, 44 für das zweite Primerpaar der nachfolgenden Nachweisreaktion 102 befinden sich im Anschluss an die Primer-Bindungsstelle 43 für den Forward-Primer eine Bindungsstelle 47 für eine weitere Fluoreszenzsonde A', die in der nachfolgenden Nachweisreaktion 102 eingesetzt wird. Das Articon 22 bzw. das amplifizierte Articon 22' weist in entsprechender Weise nach der Primer-Bindungsstelle 43 eine andere Sonden-Bindungsstelle 48 für eine weitere Fluoreszenzsonde B' auf, ebenfalls für die nachfolgende Nachweisreaktion 102. Auf dem Articon 22 bzw. dem amplifizierten Articon 22' schließt sich eine orthogonale Sequenz 26 an, die orthogonal zu der Zielsequenz 35 der zu untersuchenden Probe 30 ist. Es schließen sich die Bindungsstelle 44 für den Reverse-Primer der nachfolgenden Nachweisreaktion 102 und die Bindungsstelle 24 für den Reverse-Primer aus der Präamplifikation an. Der GC-Gehalt und die Länge der Basenpaarsequenzen zwischen Articon 22 und dem entsprechenden Abschnitt in der Probe 30 und dem Quanticon 21 sollten sich in etwa entsprechen, wie oben bereits ausgeführt.
-
Die Quantifizierung der Präamplifikation 100 erfolgt im Prinzip wie bereits anhand von 2 erläutert und ist im oberen Teil von 3B illustriert. Hierbei sind jeweils die Signale der Sonden A und B dargestellt. Diagramm A zeigt den Fall, dass das Signal des Quanticons 21 (Sonde A) und das Signal des Articons 22 (Sonde B) übereinanderliegen. In diesem Fall ist kein nachzuweisender DNA-Abschnitt in der Probe 30 vorhanden. Diagramm B zeigt den Fall, dass das Signal des amplifizierten Quanticons 21 zusammen mit dem amplifizierten Genabschnitt aus der Probe 30 zeitlich vor dem Signal des amplifizierten Articons 22 auftritt. In diesem Fall ist der gesuchte Genabschnitt in der Probe 30 vorhanden. Wenn keine Probe (Sample) detektiert werden kann (Diagramm A), kann der Gesamtablauf gestoppt und die Ausgabe erfolgen, dass kein Nachweis stattfand (negatives Testergebnis). Wird gemäß Diagramm B Probe detektiert, kann der PCR-Prozess so lange weitergeführt werden, bis das Articon 22 detektiert wird. Dann kann gegebenenfalls der Prozess abgebrochen werden.
-
Alternativ kann auch eine vordefinierte Anzahl an PCR-Zyklen abgearbeitet werden. Aus der Amplifikationskurve der Probe 30 zusammen mit dem Quanticon 21 kann die Effizienz berechnet werden. Mittels des vordefinierten Articons 22 kann die Endkonzentration sowie die Startkonzentration aller Amplifikate berechnet werden. Auf dieser Basis kann der Ansatz so verdünnt werden und mit einem neuen Mastermix angesetzt werden (Schritt 101), dass der Ansatz den idealen Eingangskonzentrationen für den oder die nachfolgenden Nachweisassays (Schritt 102) entspricht. Die Verdünnung kann händisch erfolgen, beispielsweise wenn die Reaktionen in einem Bulksystem, beispielsweise einem klassischen qPCR-Cycler, stattfinden. In bevorzugter Weise wird der Prozess in einem vollautomatisierten Fluidhandler ausgeführt, wobei sich mikrofluidische Systeme besonders eignen. Hier kann das Verdünnen und Verteilen von Flüssigkeiten mithilfe von mikrofluidischen Pump- und Aliquotiersystemen erfolgen.
-
Für die eigentliche Nachweisreaktion 102, beispielsweise für einen Punktmutationsnachweis, wird der Reaktionsansatz mit den hierfür erforderlichen Primern (zweites Primerpaar) amplifiziert und der Signalverlauf der Sonde A' (Kurve 470) und der Sonde B' (Kurve 480) beobachtet und ausgewertet. Das Articon 22' befindet sich gemäß dem Reaktionskonzept in der Unterzahl, das heißt, es ist weniger Startmaterial des Articons 22' vorhanden als Startmaterial der Probe 30'. Dies liegt daran, dass bei der Präamplifikation 100 mehr Proben-Amplikon, bestehend aus der amplifizierten Probe 30' und dem amplifizierten Quanticon 21 entsteht. Daher ist ein dynamischer Abbruch der PCR nach unmittelbarer Detektion von großem Vorteil, denn das Articon 22' und die Probe 30' in der exponentiellen Phase machen das Abschätzen der Amplikonmengen genauer als bei einer Detektion in der Sättigungsphase. Da nun wieder das Articon 22' in definierten Mengen vorliegt und die Probe 30' als neues Quanticon wirkt, kann auch die zweite qPCR, also die Nachweisreaktion 102, vollständig quantifiziert werden. Die Anzahl der Kopien von Beginn bis zum Ende des Prozesses ist somit bekannt. Das amplifizierte Quanticon 21 der ersten Reaktion (Präamplifikation 100) fällt bei der zweiten Reaktion (Nachweisreaktion 102) außer Betracht, da die entsprechenden Positionen 143, 144 zu den Primer-Bindungsstellen 43, 44 auf der Ziel-DNA-Sequenz 21 der Präamplifikation orthogonal, also abweichend gewählt wurden.
-
Für die Nachweisreaktion 102 kann in dessen Mastermix zusätzlich ein weiteres Articon beigemischt werden. Hierbei wird anstelle des Articons aus der ersten Voramplifikation ein neues Articon für die zweite Nachweisreaktion zugegeben. Dies ist sinnvoll, da die erste Reaktionsmischung in der Regel verdünnt wird und somit das Articon (nicht aber die vermehrte eigentliche Probe) nachgewiesen wird. Daher wird nach dem Verdünnen nochmals eine definierte Menge Articon für eine genauere Bestimmung beigegeben. Dieses weitere Articon kann beispielsweise in einem für die Nachweisreaktion benötigten (zweiten) Lyobead vorgelagert werden. Dies ist insbesondere von Vorteil, um das Verhältnis von Wild- und Mutationstyp bei einem Punktmutationsnachweis zu bestimmen. Es wird auch ein weiteres Quanticon eingesetzt, das die gleichen Primer-Bindungssequenzen aufweist. Das Amplifikat der ersten Reaktion 100 muss dann so verdünnt werden, dass diese der Konzentration des vorgelegten, zweiten Quanticons entspricht.
-
In 4 sind Ausführungsformen für ein mögliches Design der Articons (Referenz-DNA) 52, 62 für einen Punktmutationsnachweis gezeigt. Diese Articons 52, 62 sind für die Anwendung einer verschachtelten PCR im Rahmen eines Punktmutationsassays vorgesehen. Generell werden bei Punktmutationsnachweisen zwei allgemeine PCR-Nachweisstrategien eingesetzt. Hierbei werden entweder mutationssensitive Primer (a) oder mutationssensitive Sonden oder Blocker (b) gewählt. Im Verfahren (a) wird der Primer so entworfen, dass dieser nur binden kann, wenn die Mutation vorhanden ist. Beispiele hierfür sind sogenannte ARMS (Amplification Refractory Mutation System)-Systeme. In dem Verfahren (b) wird eine mutationssensitive Sonde oder Blocker verwendet, die bzw. der nur bindet, wenn die Mutation vorhanden ist (z.B. PNA-CLAMP-Systeme - Peptide nucleic acid (PNA)-mediated PCR clamping; H. Ørum et al., Nucleic Acids Res. 21:5332-5336, 1993). Da jedoch diese Bindungen nicht zu 100% effizient sind, wird ein Referenzsignal zum Wildtyp mit gemessen. Daher ist es für die Implementierung des erfindungsgemäßen Konzeptes für einen solchen Nachweis sinnvoll, ein zweites Quanticon einzubinden. Für die Implementierung wird für das Articon 52, 62 die Mutation 301 in die orthogonalen Sequenzen eingebaut. Die Bindungsstelle der Mutation sollte somit eingeschlossen werden. In der Version 62 mit einem mutationssensitiven Primer umfasst das Articon 62 daher folgende Abschnitte: Bindungsstelle 23 für den ersten Forward-Primer, Bindungsstelle 28 für die Sonde B, Bindungsstelle 63 für einen mutationsspezifischen Primer, der den Forward-Primer des zweiten Primerpaares für die Nachweisreaktion 102 darstellt, eine orthogonale Sequenz 26, eine Bindestelle 44 für den Reverse-Primer der Nachweisreaktion 102 und eine Bindungsstelle 24 für den Reverse-Primer der Präamplifikation. Für ein Nachweissystem mit einem mutationssensitiven Blocker oder einer mutationssensitiven Sonde wird das Articon 52 so entworfen, dass die Bindungsstelle für diese Sonde oder den Blocker die Mutationsstelle 301 an exakt derselben Stelle wie im Mutationstyp umfasst. Im Übrigen entspricht das Articon 52 dem Articon 62 bzw. dem Articon 22. Mit einem solchen Konstrukt kann nun in der Reaktion ein Signal für eine Reaktion mit 100% Wildtyp (zweites Quanticon) und ein Signal für 100% Mutation (Articon 52 oder 62) gemessen werden und mit der Probe abgeglichen werden. Dies ist alles innerhalb eines Reaktionsansatzes möglich, wodurch eine extreme Vereinfachung einer Vollautomatisierung beispielsweise in einer Point-of-Care-Anwendung möglich ist. Besonders vorteilhaft ist es hierbei, wenn die entsprechenden Mastermixe als Lyophilisate vorgelegt werden.
-
In 5 ist eine Multiplexausführung einer verschachtelten PCR gezeigt, wobei zwei Nachweisreaktionen in einem Ansatz durchgeführt werden können. Bei dieser Ausführung wird von einem Lysat aus wenigen Zellen, beispielsweise 10 bis 1000 Zellen, ausgegangen. In diesem Lysat können sich beispielsweise Zellen aus einer Anreicherung befinden, beispielsweise aus einer Anreicherung von zirkulierenden Tumorzellen oder aus einer Anreicherung von Immunzellen, beispielsweise spezifischen T-Zellen, aus einer Körperflüssigkeit, wie Blut, Urin, Spinalfluid oder Anderem. Diese Zellen werden in einem kleinen Volumen lysiert und stellen die Probe für die Durchführung des Verfahrens bereit. In diesem Zelllysat sollen zwei Genabschnitte 70, 80 nachgewiesen werden, also beispielsweise ein Exon A (Genabschnitt 70) und ein Exon B (Genabschnitt 80). Zunächst werden die Genabschnitte 70, 80 amplifiziert (Präamplifikation), so dass in dem nachgeschalteten Schritt in ein oder mehreren Nachweisreaktionen Anomalien auf diesen Genabschnitten wie Mutationen oder funktionstypische Gensequenzen, beispielsweise die genetische Codierung eines Antigen-Epitops, nachgewiesen werden können. In dem ersten Schritt der Präamplifikation werden aus dem genetischen Material der lysierten Zellen zuerst die zwei Zielexone, also die Genabschnitte 70 und 80, amplifiziert. Zusätzlich wird eine Probenkontrolle gefahren. Für die Probenkontrolle wird ein Kontroll-Exon C als Genabschnitt 90 amplifiziert. Hierbei kann es sich beispielsweise um ein Exon des gesuchten Gens handeln, auf welchem die Anomalie nicht vorliegt. Wird dieses amplifiziert, gilt die Reaktion als erfolgreich und als Nachweis, dass das Probenmaterial, also genetisches Material, in der Probe vorhanden war. Zum Nachweis und zur Quantifizierung der Amplifikation des Kontroll-Exons 90 werden in entsprechender Weise wie bereits beschrieben eine Ziel-DNA (Quanticon) 21 und eine Referenz-DNA (Articon) 22 eingesetzt, die gemäß den oben beschriebenen Prinzipien von ihrer Struktur und ihren Komponenten her an das Kontroll-Exon 90 angepasst sind. Besitzen die Amplikone 70, 80 und 90 alle in etwa die gleiche Länge und den gleichen GC-Gehalt, dann sollten in dem Reaktionsansatz in einer Triplex-Reaktion etwa gleich viele Kopien für jedes Template entstehen. Sofern Abweichungen bei der Länge und bei dem GC-Gehalt vorhanden sind, stellen sich konservierte Verhältnisse der amplifizierten Amplikone ein, wobei die Verhältnisse zusätzlich durch die DNA-Struktur und epigenetische Modifikationen beeinflusst werden können. Das heißt, auch wenn die Reaktion bei der Amplifikation eines der Exons möglicherweise weniger effizient ist, sind die Verhältnisse der entstandenen Amplikon-Kopien dennoch konstant. Dies erlaubt, nur ein Amplikon, nämlich das Kontroll-Exon C, im Hinblick auf eine Quantifizierung zu messen, woraus die Amplikonanzahl für alle Exons bestimmt werden kann. Es ist also kein aufwendiges Dreisondendesign erforderlich, sondern im Allgemeinen ist es ausreichend, nur ein Zweisondensystem für die Quantifizierung des Kontroll-Exons C (Genabschnitt 90) einzusetzen. Somit wird zunächst die Präamplifikation durch das Kontroll-Exon 90 quantifiziert, so dass die Amplifikate für die nachfolgende Nachweisreaktion wie oben beschrieben abgeschätzt und für optimale Reaktionsbedingungen in der Nachweisreaktion gegebenenfalls in-situ verteilt und verdünnt werden können. Nach dem Verteilen und Verdünnen wird ein neuer Mastermix zugesetzt, der für den spezifischen Assay der Nachweisreaktion vorgesehen ist und der gemäß den Ausführungen zu 2 ebenfalls quantifiziert werden kann.
-
Das Design für die einzelnen Amplikone sieht bevorzugt folgendermaßen aus: Exon A (Genabschnitt 70) besitzt an der Peripherie des Amplikons die Bindungsstellen 71, 72 für die Primer der Präamplifikation. Exon B (Genabschnitt 80) und das Kontroll-Exon C (Genabschnitt 90) besitzen entsprechende Primer-Bindungsstellen 81, 82 bzw. 91, 92, aber mit anderen Sequenzen. Bei den in der nachfolgenden Nachweisreaktion zu untersuchenden Exons A und B folgt jeweils die Bindungsstelle für die Primer der zweiten Reaktion (Nachweisreaktion) 73, 74 bzw. 83, 84 auf den Genabschnitten 70 bzw. 80. Ist eine Sonde für die Nachweisreaktion vorgesehen, ist deren Bindungsstelle in dieser Sequenz inkludiert. Das Kontroll-Exon C (Genabschnitt 90) weist nach der Primer-Bindungsstelle 91 die Bindungsstelle 97 für eine Fluoreszenzsonde A auf. Entsprechend wie anhand von 2 erläutert, werden zur Quantifizierung des Kontroll-Exons C (Genabschnitt 90) ein Quanticon bzw. eine Ziel-DNA 21 und ein Articon bzw. eine Referenz-DNA 22 ergänzt, die mit den gleichen Primer-Bindungsstellen 91, 92 wie das Kontroll-Exon C (Genabschnitt 90) versehen sind. Die Ziel-DNA 21 weist darüber hinaus die gleiche Bindungsstelle 97 für die Sonde A auf. Die Referenz-DNA 22 weist ebenfalls eine Sonden-Bindungsstelle 98 auf, aber mit anderer Sequenz zur Bindung einer Fluoreszenzsonde B. Aus den mit diesem Reaktionsansatz zu generierenden Signalen wird auf die entstandenen Kopien NC sowie auf die Ausgangsmenge No zurückgeschlossen. Aus den konservierten Verhältnissen werden die Mengen der Exone A und B (Genabschnitte 70 und 80) berechnet. Die Verhältnisse können dabei im Rahmen der Assayentwicklung herausgefahren werden. Die Verhältnisse sind spezifisch für den jeweiligen Assay. Die Verhältnisse sind intrinsisch konstant, müssen aber für jede Anwendung gemessen, d.h. parametrisiert werden. Gemäß dem anhand der 2 erläuterten Verfahren können die Mastermixe der nachfolgenden zwei separaten und parallel prozessierbaren spezifischen Nachweise für das Exon A und für das Exon B jeweils ein Quanticon und ein Articon aufweisen, welche die gleichen Primer-Bindungsstellen wie das jeweilige Ziel-Exon A bzw. B aufweisen. Zum Nachweis von Punktmutationen kann wie anhand von 4 erläutert, das Quanticon die Wildtypsequenz und das Articon die Mutantensequenz aufweisen. In dem mittleren Teil der Darstellung in 5 ist der gesamte Reaktionsablauf schematisch dargestellt. Zunächst erfolgt die Präamplifikation 200, wobei Exon A, Exon B, Kontroll-Exon C und das Quanticon und das Articon als Templates in dem Ansatz vorhanden sind. Nach der Durchführung der Amplifikationsreaktionen wird das Quantifizierungsergebnis 210 erhalten (No Kontroll-Exon C, NC Kontroll-Exon C, daraus errechenbar Nc, No Exon A; NC, N0 Exon B). Um optimale Startbedingungen für die nachfolgende Nachweisreaktion für das Exon A und das Exon B zu erreichen, werden im Schritt 220 durch Verteilen und gegebenenfalls Verdünnen der Ansätze die optimalen Konzentrationen von Exon A (NS,2 Exon A) und Exon B (NS, 2 Exon B) eingestellt. Anschließend wird durch Zugabe der Mastermixe für die jeweiligen Nachweisreaktionen im Schritt 230 beispielsweise der jeweils spezifische Mutationsnachweis durchführt, wobei hierfür neben dem Exon A bzw. dem Exon B jeweils ein entsprechend entworfenes Quanticon A und Articon A bzw. Quanticon B und Articon B zugesetzt werden, wie im unteren Teil der 5 illustriert ist.
-
6 illustriert die Implementierung des beschriebenen PCR-Konzeptes in einem mikrofluidischen qPCR-Array 500. Der Array 500 ist beispielsweise in einen Chip aus strukturiertem Silizium integriert, wobei sich der Array 500 in einer mikrofluidischen Kammer befindet, die mit einem Zufluss 501 und einem Abfluss 502 versehen ist. In einer möglichen Ausführung können einzelne Reaktionsgefäße des Arrays 500 global angesteuert bzw. mit Flüssigkeiten versetzt werden. Beispielsweise kann eine voramplifizierte Probe über das Array 500 gespült werden, so dass sich die einzelnen Reaktionsgefäße des Arrays 500 befüllen. Durch eine Versiegelung kann die Kommunikation via Diffusion zwischen den einzelnen Reaktionsgefäßen in einem zweiten fluidischen Schritt verhindert werden. Ist nun jedes Reaktionsgefäß des Arrays 500 beispielsweise mit einem lyophilisierten Mastermix und/oder mit den Primern und den Sondensequenzen vorgespottet, ist durch das Verfahren mit einem n x m Array ein maximaler n x m Multiplexing-Grad einschließlich einer Quantifizierung und Qualitätskontrolle möglich. Die Reaktionsansätze gemäß dem erfindungsgemäßen Konzept können vorzugsweise auf der Basis von TaqMan®-Systemen entwickelt werden. Die Synthese der einzelnen Template-DNAs, insbesondere der Quanticons und der Articons, kann mit üblicher Nukleinsäuresynthese erfolgen. Vorzugsweise können die Mastermixe einschließlich der Template-DNAs als Lyophilisate vorgelagert werden. Für eine Automatisierung der Prozesse sind insbesondere mikrooptofluidische Systeme geeignet.
