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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Laser-Mikroskopsystem mit einem Mikroskoptisch zur Aufnahme einer Probe und einem Objektiv, das eine optische Achse und eine hintere Brennebene des Objektivs definiert, sowie mit einem Laser und einer nachgeschalteten Laseroptik, die den vom Laser erzeugten Laserstrahl derart in das Mikroskop einkoppelt, dass dieser die hintere Brennebene des Objektivs an einem festen Punkt durchläuft und das Objektiv den Laserstrahl auf eine Objektebene des Mikroskops fokussiert.
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Stand der Technik
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Unter dem Begriff ”Laser-Mikroskopsystem” soll vorliegend beispielsweise ein Lasermikrodissektionssystem verstanden werden, aber auch andere Systeme, die ein Mikroskop und einen in das Objektiv des Mikroskops eingekoppelten Laserstrahl einsetzen, beispielsweise für Laseranregungen (z. B. ”Optogenetics”) eingesetzte Systeme. Der Einfachheit halber wird im Weiteren insbesondere auf Lasermikrodissektionssysteme Bezug genommen, ohne die vorliegende Erfindung hierauf zu beschränken.
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Verfahren zur Bearbeitung biologischer Proben durch Lasermikrodissektion existieren bereits seit Mitte der 1970er Jahre und wurden seitdem kontinuierlich weiterentwickelt. Bei der Lasermikrodissektion können Zellen, Geweberegionen usw. aus einer biologischen Probe (”Objekt”) isoliert und als sogenannte Dissektate gewonnen werden. Ein besonderer Vorteil der Lasermikrodissektion ist der kurze Kontakt der Probe mit dem Laserstrahl, durch den diese kaum verändert wird. Die Gewinnung der Dissektate kann auf unterschiedliche Weise erfolgen.
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Beispielsweise kann in bekannten Verfahren aus einer Probe mittels eines Ultraviolettlaserstrahls durch eine mit dem Laserstrahl erzeugte Schnittlinie ein Dissektat isoliert werden, das unter dem Einfluss der Schwerkraft in einen geeigneten Dissektatauffangbehälter fällt. Das Dissektat kann dabei aus der Probe auch zusammen mit einer an der Probe anheftenden Membran ausgeschnitten werden. Bei der sogenannten ”Laser Capture Microdissection” wird hingegen eine thermoplastische Membran mittels eines entsprechenden Infrarot-Laserstrahls erwärmt. Dabei verschmilzt die Membran mit dem gewünschten Bereich der Probe und kann in einem darauffolgenden Schritt durch Reißen entfernt werden. Eine weitere Alternative besteht darin, das Dissektat mittels des Laserstrahls an einen Deckel eines Dissektatauffangbehälters anzuheften. Bei bekannten inversen Mikroskopsystemen zur Lasermikrodissektion können mittels eines Transportpulses nach oben transportierte Dissektate auch an den Boden eines Dissektatauffangbehälters, der mit einer adhäsiven Beschichtung versehen ist, angeheftet werden.
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Bekannte Mikroskopsysteme zur Lasermikrodissektion weisen eine Auflichteinrichtung auf, in deren Strahlengang ein Laserstrahl eingekoppelt wird. Der Laserstrahl wird durch das jeweils verwendete Mikroskopobjektiv auf die Probe fokussiert, die auf einem motorisch verfahrbaren Mikroskoptisch aufliegt. Eine Schnittlinie kann dadurch erzeugt werden, dass der Mikroskoptisch beim Schneiden verfahren wird, um die Probe relativ zu dem feststehenden Laserstrahl zu bewegen. Dies hat jedoch unter Anderem den Nachteil, dass die Probe während des Erzeugens der Schnittlinie nicht ohne weiteres betrachtet werden kann, da sich die Probe im Gesichtsfeld bewegt und das Bild ohne weitere Kompensationsmaßnahmen verschwommen bzw. verschmiert erscheint.
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Vorteilhafter sind daher Lasermikrodissektionssysteme, die Laserablenk- bzw. Laserscaneinrichtungen aufweisen, die dazu eingerichtet sind, den Laserstrahl bzw. dessen Auftreffpunkt auf der zu dissektierenden feststehenden Probe zu bewegen. Derartige Lasermikrodissektionssysteme, die auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung zum Einsatz kommen sollen und dort besondere Vorteile bieten, werden unten im Detail erläutert. Ein besonders vorteilhaftes Laser-Mikroskopsystem, das eine Laserablenkeinrichtung mit gegeneinander verstellbaren Glaskeilen im Laserstrahlengang aufweist, ist beispielsweise in der
EP 1 276 586 B1 beschrieben.
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In beiden Fällen, also in Systemen mit bewegter oder feststehender Probe, wird in der Regel mit gepulsten Lasern gearbeitet, wobei durch jeden Laserpuls ein Loch bzw. eine Vertiefung in der Probe erzeugt wird. Eine Schnittlinie entsteht durch eine Aneinanderreihung derartiger Löcher bzw. Vertiefungen, gegebenenfalls mit Überlappung.
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Die Lasermikrodissektion kann zur Gewinnung von Einzelzellen, Zellkompartimenten oder definierten Gewebebereichen mit beispielsweise einem Durchmesser von etwa 500 μm genutzt werden. Bei geeigneter Ansteuerung kann der Laserstrahl auch deutlich größere Bereiche ausschneiden, die lediglich durch die Größe des Objektträgers begrenzt sind, auf welchem die zu schneidende Probe angeordnet ist.
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In der Regel haben die Dissektate jedoch nur eine Größe im μm-Bereich, beispielsweise um die 20 μm oder darunter, die mit einem Laserstrahl vom umliegenden Gewebe separiert und anschließend beispielsweise unterschiedlichen diagnostischen Analyseverfahren unterworfen werden. In der Onkologie kann die Lasermikrodissektion beispielsweise dafür eingesetzt werden, um spezifische (Tumor-)Zellen aus einem mikroskopischen Schnitt zu isolieren und diese auf spezifische Metaboliten, RNA-Expressionslevel, DNA-Mutationen oder Proteine zu untersuchen.
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Bei dem oben erwähnten Lasermikrodissektionssystem gemäß
EP 1 276 586 B1 kommt eine Scaneinrichtung zum Einsatz, um den Laserstrahlfokus senkrecht zur optischen Achse in der Objektebene zu verschieben. Diese Scaneinrichtung arbeitet mit zwei optischen Keilen (Prismen, Glas-Keilplatten), deren Flächen gegen die optische Achse geneigt sind (Keilwinkel) und die um die optische Achse drehbar gelagert sind. Durch Drehung der optischen Keile gegeneinander wird eine Strahlablenkung des Laserstrahls erzeugt, sodass der Laserstrahlfokus auf definierte Weise in der Objektebene verschoben werden kann, um eine dort befindliche Probe zu dissektieren. Bezüglich Aufbau- und Funktionsweise dieser Scaneinrichtung sei ausdrücklich auf die genannte europäische Patentschrift
EP 1 276 586 B1 verwiesen. In der Praxis zeichnen sich entsprechende Systeme durch ein aufrechtes Grundstativ mit festem, nicht in z-Richtung (senkrecht zur Objektebene) beweglichen Objektivrevolver aus, wobei zur Fokuseinstellung der Mikroskoptisch in besagte z-Richtung bewegt wird. Während der Dissektion ist der Mikroskoptisch in x- und y-Richtung (also in der Objektebene) fest.
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Andere Lasermikrodissektionssysteme basieren in der Regel auf inversen Mikroskopen und bedienen sich eines fixen Laserstrahls (ohne Scaneinrichtung), sodass die Probe mittels Bewegung des Mikroskoptisches in x- und y-Richtung geschnitten wird. Die Fokuseinstellung erfolgt bei solchen Systemen durch Bewegen des Objektivrevolvers in z-Richtung, der Mikroskoptisch selbst kann in z-Richtung dann in der Regel nicht bewegt werden.
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Die Druckschrift
DE 10 2012 207 240 A1 offenbart ein Laser-Mikrodissektionsgerät mit einem Mikroskop mit einem Mikroskoptisch zur Aufnahme einer Probe und einem Objektiv, das eine optische Achse und eine hintere Brennebene des Objektivs definiert und mit einem Laser und einer Laser-Scaneinrichtung, die den vom Laser erzeugten Laserstrahl derart in das Mikroskop einkoppelt, dass dieser die hintere Brennebene des Objektivs an einem festen Punkt durchläuft und von dem Objektiv auf eine Objektebene des Mikroskops fokussiert wird. Mittels einer zusätzlichen Laserfokus-Verschiebeeinrichtung lässt sich der Laserstrahl-Fokus entlang einer dreidimensionalen Schnittlinie im Präparat bewegen.
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Die Druckschrift
US 2016/0062 112 A1 offenbart einen Aufbau zum Ausgleich einer Verschiebung eines Objektivs durch Vorsehen einer verschiebbaren Ausgleichslinse in einem konfokalen Mikroskopsystem. Die Druckschrift
DE 103 55 523 A1 offenbart einen Schlitten zum Verschieben optischer Elemente zur Erzielung einer optimalen optischen Stereodarstellung.
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Nachteil des Standes der Technik ist, dass die auf optischen Keilen basierenden Scaneinrichtungen zur Verschiebung des Laserstrahlfokus in der Objektebene nicht ohne weiteres auf inverse Mikroskope oder solche mit in z-Richtung nicht bewegbaren Mikroskoptischen (”Fixed Stage Systeme”) übertragen werden können, welche über das Mikroskopobjektiv bzw. den Objektivrevolver und nicht über die z-Bewegung des Mikroskoptisches die Fokuseinstellung vornehmen. Zur Ablenkung des Laserstrahlfokus ist es bei der auf optischen Keilen beruhenden Scaneinrichtung nämlich notwendig, dass der Laserstrahl immer die hintere Brennebene des Objektivs (”Back Focal Plane”) an derselben Stelle durchläuft, um ein zuverlässiges Schneiden und Auftreffen des Laserfokus auf die Probe zu garantieren. Bei einer Bewegung des Mikroskopobjektivs zur Fokuseinstellung in z-Richtung verändert sich zugleich die Position der hinteren Brennebene, sodass der Laserstrahl eine andere Stelle in dieser Ebene durchtritt.
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Aufgabe vorliegender Erfindung ist es deshalb, ein Laser-Mikroskopsystem anzugeben, das die Möglichkeit bietet, ein zur Fokuseinstellung in Richtung der optischen Achse verschiebbares Objektiv einzusetzen, ohne die oben genannten Nachteile in Kauf nehmen zu müssen. Insbesondere soll das Laser-Mikroskopsystem zur Lasermikrodissektion mit einer Scaneinrichtung verwendet werden, die den Laserstrahlfokus senkrecht zur optischen Achse in der Objektebene des Mikroskops verschiebt.
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Kurzfassung der Erfindung
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Erfindungsgemäß wird ein Laser-Mikroskopsystem mit den Merkmalen der unabhängigen Patentansprüche vorgeschlagen. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der jeweiligen Unteransprüche sowie der nachfolgenden Beschreibung.
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Vorteile der Erfindung
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Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein Laser-Mikroskopsystem vorgeschlagen, welches über ein Mikroskop mit einem Mikroskoptisch zur Aufnahme einer Probe und mindestens einem Objektiv, das eine optische Achse und eine hintere Brennebene des Objektivs definiert, verfügt sowie über einen Laser und einer nachgeschalteten Laseroptik, die den vom Laser erzeugten Laserstrahl derart in das Mikroskop einkoppelt, dass der Laserstrahl die hintere Brennebene des Objektivs an einem festen Punkt durchläuft und das Objektiv den Laserstrahl auf eine Objektebene des Mikroskops fokussiert, wobei das Objektiv bzw. der gesamte Objektivrevolver im vorliegenden Fall zur Fokuseinstellung in Richtung der optischen Achse verschiebbar ausgebildet ist. Die Laseroptik weist eine im Laserstrahlengang angeordnete und entlang der Achse des Laserstrahlengangs verschiebbare Ausgleichslinse auf. Weiterhin ist eine Steuereinrichtung und/oder eine mechanische Kopplungseinrichtung vorgesehen, die eine Verschiebung dieser Ausgleichslinse entlang der Achse des Laserstrahlengangs vornimmt, wenn zur Fokuseinstellung eine Verschiebung des Objektivs in Richtung der optischen Achse vorgenommen wird, sodass der Laserstrahl weiterhin, also auch nach Fokuseinstellung durch den festen Punkt der hinteren Brennebene des Objektivs verläuft.
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Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Laser-Mikroskopsystem vorgeschlagen, welches über ein Mikroskop mit einem Mikroskoptisch zur Aufnahme einer Probe und mindestens einem Objektiv, das eine optische Achse und eine hintere Brennebene des Objektivs definiert, verfügt, sowie über einen Laser und eine nachgeschaltete Laseroptik, die den vom Laser erzeugten Laserstrahl derart in das Mikroskop einkoppelt, dass der Laser die hintere Brennebene des Objektivs an einem festen Punkt durchläuft und das Objektiv den Laserstrahl auf eine Objektebene des Mikroskops fokussiert, wobei wiederum in diesem Fall das Objektiv zur Fokuseinstellung in Richtung der optischen Achse verschiebbar ausgebildet ist. Nunmehr ist die Laseroptik zumindest zum Teil auf einem entlang der Achse des Laserstrahlengangs verschiebbaren Schlitten montiert, und es ist eine Steuereinrichtung und/oder eine mechanische Kopplungseinrichtung vorgesehen, die eine Verschiebung dieses Schlittens vornimmt, wenn zur Fokuseinstellung eine Verschiebung des Objektivs in Richtung der optischen Achse vorgenommen wird, sodass der Laserstrahl weiterhin, also auch nach Fokuseinstellung durch den festen Punkt der hinteren Brennebene des Objektivs verläuft.
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Die entsprechenden Merkmale gemäß erstem oder zweitem Aspekt der Erfindung führen beide zu dem Ziel, dass der in das Mikroskop eingekoppelte Laserstrahl unverändert durch den festen Punkt der hinteren Brennebene des Objektivs verläuft, auch wenn eine Verschiebung des Objektivs entlang der optischen Achse zur Fokuseinstellung vorgenommen wird. Dieses Ziel kann durch zwei verschiedene Maßnahmen erreicht werden. Gemäß einem ersten Aspekt wird die genannte Ausgleichslinse in der Laseroptik entlang der Achse des Laserstrahlengangs verschoben, um die Verschiebung der hinteren Austrittpupillenebene des Objektivs bei einer Fokuseinstellung zu kompensieren. Die für diese Kompensation notwendige Größe der Verschiebung der Ausgleichslinse kann in der Praxis beispielsweise empirisch ermittelt werden. Der entsprechende Zusammenhang kann beispielsweise in einer Lookup-Tabelle hinterlegt werden, auf die die Steuereinrichtung zugreift. Alternativ kann eine mechanische Kopplungseinrichtung vorgesehen sein, die auf mechanische Art beispielsweise mittels mechanischer Zwangskopplung bei einer Verschiebung des Objektivs die notwendige Verschiebung der Ausgleichslinse vornimmt.
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Gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung wird eine Bewegung des Objektivs in Richtung der optischen Achse zur Fokuseinstellung durch eine entsprechende Bewegung des Schlittens vorgenommen, auf dem die Laseroptik zumindest zum Teil, eventuell auch zusammen mit dem Laser, montiert ist. In der Praxis kann der Schlitten bei Bewegung des Objektivs in Richtung der optischen Achse in dieselbe Richtung mitverfahren werden, sodass der Abstand der Laseroptik, speziell der Scaneinrichtung, zur hinteren Brennebene beibehalten wird.
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Bei dem Laser-Mikroskopsystem gemäß zweitem Aspekt der Erfindung ist es vorteilhaft, wenn eine Verschiebung des Schlittens entlang der Achse des Laserstrahlengangs mit einer Verschiebung des Objektivs entlang der optischen Achse mechanisch, insbesondere im Größenverhältnis 1:1, über eine mechanische Kopplungseinrichtung gekoppelt ist. Eine Verschiebung des Objektivs zur Fokuseinstellung führt dann zwangsweise zu einer entsprechenden Verschiebung des Schlittens entlang der Achse des Laserstrahlengangs, sodass der genannte Abstand zur hinteren Brennebene des Objektivs immer konstant bleibt.
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Wie bereits erwähnt, sind verschiedene Einsatzmöglichkeiten eines erfindungsgemäßen Laser-Mikroskopsystems gemäß erstem und zweitem Aspekt denkbar, insbesondere aber solche, bei denen die Laseroptik eine Scaneinrichtung enthält, um den Laserstrahlfokus senkrecht zur optischen Achse in der Objektebene zu verschieben. Solche Scaneinrichtungen kommen bei Lasermikrodissektionssystemen zum Einsatz, können aber auch für Systeme zur Laseranregung Verwendung finden, bei denen ein Laserstrahl eine Probe abscannt, um diese beispielsweise zur Fluoreszenzstrahlung anzuregen. Unter ”Achse des Laserstrahlengangs” sei in diesem Fall die Achse des nicht abgelenkten Laserstrahlengangs verstanden.
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Erfindungsgemäß wird eine Scaneinrichtung verwendet, die zwei um die Achse des Laserstrahlengangs drehbare optische Keile aufweist, wobei durch die relative Drehung der optischen Keile zueinander der resultierende Ablenkwinkel des Laserstrahls gegenüber der optischen Achse variabel ist und wobei der Laserstrahl für alle Ablenkwinkel den oben erwähnten festen Punkt der hinteren Austrittspupille des Objektivs durchtritt, wobei die Austrittspupille mit der hinteren Brennebene zusammenfällt.. Eine solche Scaneinrichtung ist insbesondere aus der bereits genannten
EP 1 276 586 B1 bekannt. Die optischen Keile sind dort als Glas-Keilplatten realisiert, welche durch ihre Keilwinkel eine Strahlablenkung erzeugen, wobei durch die Drehung der Glas-Keilplatten relativ zueinander der resultierende Ablenkwinkel des Laserstrahls gegenüber der Achse des Laserstrahlengangs variabel ist. Hierbei durchtritt der Laserstrahl für alle Ablenkwinkel einen festen Punkt der hinteren Brennebene des Objektivs. Der erwähnte feste Punkt wird vorzugsweise in der Mitte der Austrittspupille gewählt. Dies hat den Vorteil, dass der Laserstrahl senkrecht auf die Probe trifft. Zu Aufbau- und Funktionsweise einer solchen Scaneinrichtung sei ausdrücklich und voll umfänglich auf die genannte europäische Patentschrift verwiesen. Eine solche Scaneinrichtung ist insbesondere als Bestandteil eines Lasermikrodissektionssystems ausgeführt, wie in den Ausführungsbeispielen beschrieben.
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Ein Laser-Mikroskopsystem gemäß dem erstem Aspekt der Erfindung weist mit Vorteil eine Laseroptik auf, bei der die in Richtung Achse des Laserstrahlengangs verschiebbare Ausgleichslinse der Scaneinrichtung nachgeschaltet bzw. nachgeordnet ist – bezogen auf die Richtung des Laserstrahlengangs. Häufig steht die Achse des in das Mikroskop einzukoppelnden Laserstrahlengangs senkrecht zur optischen Achse des Mikroskopobjektivs. Mittels eines Umlenkspiegels wird der Laserstrahlengang in das Mikroskop eingekoppelt und zum Mikroskopobjektiv geführt, von dem der Laserstrahl dann auf die Objektebene des Mikroskops fokussiert wird. Bei dem Umlenkspiegel handelt es sich in der Regel um einen Strahlteiler, der von der Probe durch das Mikroskopobjektiv kommendes Licht des Beobachtungsstrahlengangs in Richtung des Mikroskoptubus durchlässt, während er Licht des Laserstrahlengangs möglichst vollständig reflektiert.
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Die für das Laser-Mikroskopsystem gemäß erstem Aspekt der Erfindung eingesetzte Ausgleichslinse ist bei einem solchen Aufbau mit Vorteil zwischen Scaneinrichtung und Umlenkspiegel angeordnet. Bei einem Laser-Mikroskopsystem gemäß zweitem Aspekt der Erfindung kann ebenfalls ein Umlenkspiegel zur Einkopplung des Laserstrahlengangs in die optische Achse des Objektivs vorgesehen sein, wobei der Umlenkspiegel zweckmäßigerweise der Scaneinrichtung nachgeschaltet ist. Es ist bei einem solchen Aufbau vorteilhaft, wenn der Schlitten diejenigen Elemente der Laseroptik trägt, die dem Umlenkspiegel vorgeschaltet sind. Dies können insbesondere sämtliche Elemente der Laseroptik einschließlich des Lasers selbst mit Ausnahme des Umlenkspiegels sein.
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Die Laseroptik des Laser-Mikroskopsystems gemäß erstem oder zweitem Aspekt der Erfindung weist eine Offset-Linse auf, die entlang der Achse des Laserstrahlengangs verschiebbar ist, um den Laserstrahlfokus in Richtung optischer Achse des Objektivs zu verschieben. Auf diese Weise ist es beispielsweise möglich, den Laserstrahlfokus in Übereinstimmung mit dem Fokus des Beleuchtungsstrahlengangs im Mikroskop zu bringen. Dies ist von Vorteil, wenn das Objekt bzw. die Probe parallel zur Beaufschlagung mit dem Laserstrahl beispielsweise mit sichtbarem Licht beleuchtet und beobachtet werden soll.
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Die Erfindung gemäß erstem und zweitem Aspekt erlaubt insbesondere die Verwendung eines Lasermikrodissektionssystems mit einer Scaneinrichtung basierend auf den oben beschriebenen drehbaren optischen Keilen in Kombination mit einem zur Fokuseinstellung verschiebbaren Objektiv, wie es üblicherweise bei inversen Mikroskopen oder dem bereits erwähntem Fixed Stage Mikroskopen zum Einsatz kommt. Diesbezüglich sei insbesondere auch auf die Ausführungsbeispiele verwiesen.
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Weitere Vorteile und Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung und der beiliegenden Zeichnung.
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Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
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Die Erfindung ist anhand eines Ausführungsbeispieles in der Zeichnung schematisch dargestellt und wird im Folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnung beschrieben.
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Figurenbeschreibung
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1 zeigt schematisch eine Ausführungsform eines Laser-Mikroskopsystems gemäß erstem Aspekt der Erfindung vor einer Fokuseinstellung,
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2 zeigt die Ausführungsform gemäß 1 nach Fokuseinstellung,
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3 zeigt schematisch eine Ausführungsform eines Laser-Mikroskopsystems gemäß zweitem Aspekt der Erfindung vor Fokuseinstellung und
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4 zeigt die Ausführungsform gemäß 3 nach Fokuseinstellung.
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Die Figuren werden nachfolgend übergreifend erläutert. Gleiche Bezugszeichen bezeichnen gleiche Elemente. Die Figuren zeigen in schematischer Darstellung Ausführungsformen eines Laser-Mikroskopsystems gemäß erstem und zweitem Aspekt der Erfindung. Das Laser-Mikroskopsystem ist jeweils mit 1 bezeichnet und als Lasermikrodissektionssystem ausgeführt.
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Allen 1 bis 4 ist der Grundaufbau eines Laser-Mikroskopsystems 1 gemeinsam, der im Folgenden kurz erläutert wird. Das Laser-Mikroskopsystem 1 weist ein Mikroskop 10 sowie einen Laser 30 mit nachgeschalteter Laseroptik 20 auf. Die Laseroptik 20 dient zum Einkoppeln des vom Laser 30 erzeugten Laserstrahls 31 in das Mikroskop 10.
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Das Mikroskop 10 verfügt in bekannter Weise über ein Objektiv 11 und einen Tubus 16, an dem schematisch dargestellte optische und/oder elektronische Ausgänge für ein Okular und/oder eine Kamera angebracht sein können.
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Der von dem Laser
30 erzeugte Laserstrahl
31 wird über eine nachgeschaltete Laseroptik
20 in das Mikroskop
10 eingekoppelt. Hierzu weist die Laseroptik
20 zunächst eine Negativlinse
21 und eine Positivlinse
22, welche den Laserstrahl
31 aufweiten und kollimieren, sowie entsprechende Umlenkeinrichtungen
23 auf, um den Laserstrahl mit dem aufgeweiteten Laserstrahlquerschnitt den nachfolgenden Elementen der Laseroptik
20 zuzuführen. Der Laserstrahl
31 durchläuft als nächstes einen Abschwächer
24, mittels dessen die Energie des Laserstrahls einstellbar ist. Dem Abschwächer
24 folgt die Offset-Linse
25, die den Laserstrahlfokus mit dem Fokus des Beleuchtungsstrahlengangs (nicht dargestellt) zur Deckung bringt. Hierzu kann die Offset-Linse
25 entlang der Achse
32 des Laserstrahlengangs verschoben werden. Der Offset-Linse
25 ist die Laserstrahl-Aperturblende
26 nachgeschaltet. Die Öffnung der Laserstrahl-Aperturblende
26 bestimmt den Durchmesser des Laserstrahls
31 und somit die Schnittbreite des Laserstrahls. Der Laserstrahl
31 tritt anschließend in eine Scaneinrichtung
27, die zwei um die Achse
32 des Laserstrahlengangs drehbare optische Keile
271 und
272 aufweist, wobei durch Drehung dieser optischen Keile
271,
272 relativ zueinander der resultierende Ablenkwinkel α des Laserstrahls
31 gegenüber der optischen Achse
12 variiert werden kann. Wie bereits mehrfach erwähnt, sind Einzelheiten zur Funktionsweise und zum Aufbau einer Scaneinrichtung
27 der
EP 1 276 586 B1 zu entnehmen und sollen daher vorliegend nicht näher erläutert werden.
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Der Laserstrahl 31 wird von einem Umlenkspiegel 28, der in einem Strahlteiler ausgebildet ist, in das Mikroskop 10 derart eingekoppelt, dass er durch das Objektiv 11 verläuft und von dem Objektiv 11 in eine Fokusebene 15 (vordere Brennebene) fokussiert wird. Der Laserstrahl 31 tritt für alle möglichen Ablenkwinkel α durch denselben festen Punkt 13 der hinteren Brennebene 17, der vorzugsweise in der Mitte, d. h. auf der optischen Achse 12, liegen kann. Von dort tritt er durch das Objektiv 11 und wird von diesem in die Fokusebene 15 fokussiert. Zur Laser-Mikrodissektion muss die Objektebene 14 mit der Fokusebene 15 zusammenfallen, damit eine auf der Objektebene 14 befindliche Probe (hier nicht dargestellt) geschnitten werden kann. Zum Schneiden wird der Laserstrahlfokus in der Objektebene 14, also auf der zu schneidenden Probe, mittels der Scaneinrichtung 27 durch Einstellung entsprechender Ablenkwinkel α verschoben. Durch geeignetes Verfahren des Laserstrahlfokus auf der Probe wird dann eine Schnittlinie erzeugt und eine gewünschte Region der Probe mit dem Laserstrahl ausgeschnitten.
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1 zeigt nun eine Ausführungsform eines Lasermikrodissektionssystems 1, bei der das Objektiv 11 bzw. ein Objektivrevolver, der das Objektiv 11 trägt, zur Fokuseinstellung in Richtung der optischen Achse 12 verschiebbar ausgebildet ist (angedeutet durch den Doppelpfeil). In bisher üblichen Ausführungsformen wurde die Fokuseinstellung durch Verschiebung des Mikroskoptisches in Richtung optischer Achse 12 vorgenommen. Da dies nicht zu einer Verschiebung der hinteren Brennebene 17 des Objektivs 11 führte, war sichergestellt, dass der abgelenkte Laserstrahl 31 immer durch den festen Punkt 13 verläuft. In der vorliegenden Ausführungsform ist jedoch das Objektiv 11 zur Fokuseinstellung in Richtung der optischen Achse 12 verschiebbar ausgebildet. Zur Fokuseinstellung wird das Objektiv 11 in der dargestellten Situation gemäß 1 nach unten verschoben, bis die Fokusebene 15 mit der Objektebene 14 übereinstimmt. Hierdurch verlagert sich jedoch die hintere Brennebene 17 in entsprechender Weise, sodass nicht mehr gewährleistet ist, dass der Laserstrahl 31 durch besagten Punkt 13 der hinteren Brennebene 17 verläuft. Durch die mit 29 bezeichnete Ausgleichslinse, die als Bestandteil der Laseroptik 20 verschiebbar entlang der Achse 32 des Laserstrahlengangs ausgebildet ist, kann eine Verschiebung des Auftreffpunktes des Laserstrahls 31 auf die hintere Brennebene 17 bei einer Verschiebung des Objektivs 11 kompensiert werden. In einer Grundstellung befindet sich die Ausgleichslinse 29 in der in 1 dargestellten Position.
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Aus 1 ist ersichtlich, dass die Objektebene 14 nicht mit der Fokusebene 15 übereinstimmt. Mit 15 ist streng genommen nur der Fokus des Mikroskopobjektivs 11 für den verwendeten Beleuchtungs- bzw. Beobachtungsstrahlengang bezeichnet. Der Beleuchtungsstrahlengang 19 ist nur schematisch dargestellt. Die eigentliche Fokusebene verläuft in bekannter Weise durch den mit 15 bezeichneten Punkt parallel zur Objektebene 14 sowie parallel zur hinteren Objektivbrennebene 17. Zur Fokuseinstellung wird nun das Objektiv 11 in Richtung der optischen Achse 12 auf die Objektebene 14 hinbewegt, bis die Fokusebene 15 mit der Objektebene 14 zusammenfällt. Diese Situation ist in 2 dargestellt.
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2 zeigt die Situation, in der das Objektiv 11 den Laserstrahl 31 auf die Fokusebene 15 fokussiert, die mit der Objektebene 14 des Mikroskops 10 zusammenfällt. Aus 2 ebenfalls ersichtlich ist, dass der Laserstrahl 31 weiterhin durch besagten festen Punkt 13 der hinteren Brennebene 17 verläuft. Dies ist durch entsprechende Verschiebung der Ausgleichslinse 29 der Laseroptik 20 erreicht. Die Ausgleichslinse 29 wurde hierzu gegenläufig zur Objektivverschiebung zur Fokuseinstellung (also gleichsam vom Objekt weg), also in Richtung Scaneinrichtung 27 entlang der Achse 32 des Laserstrahlengangs geringfügig verschoben. Die Verschiebung der Ausgleichslinse 29 wird von einer Steuereinrichtung 60 gesteuert, die als Eingangssignal die Verschiebung des Objektivs 11 erhält. Der Zusammenhang mit der daraus resultierenden notwendigen Verschiebung der Ausgleichslinse 29 kann in der Steuereinrichtung 60 als Lookup-Tabelle oder als funktionaler Zusammenhang hinterlegt sein. Die Verschiebung der Ausgleichslinse 29 kann auch mechanisch mit der Verschiebung des Objektivs 11 über eine mechanische Kopplungseinrichtung, die ebenfalls mit 60 bezeichnet sein kann, erfolgen.
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Die 1 und 2 machen deutlich, dass durch Verschieben der Ausgleichslinse 29 das dargestellte Lasermikrodissektionssystem 1 auch mit einem fokussierbaren Objektiv 11 verwendet werden kann. Auf diese Weise ist es auch möglich, innerhalb einer zu schneidenden Probe in verschiedene Probenbereiche (parallel zur optischen Achse 12) zu fokussieren. Dies ist zum Schneiden von dicken Proben besonders zweckmäßig. Nach Abschluss des Schneidvorgangs wird das ausgeschnittene Mikrodissektat von einem Aufnahmebehälter 50 aufgefangen und kann dann der weiteren Analyse zugeführt werden.
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Die 3 und 4 zeigen eine Ausführungsform eines Laser-Mikroskopsystems gemäß zweitem Aspekt der Erfindung. Wiederum ist das Laser-Mikroskopsystem als Laser-Mikrodissektionssystem 1 ausgeführt. Bezüglich des Aufbaus und der Funktionsweise sei auf die obigen Schilderungen verwiesen.
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3 zeigt einen Aufbau, bei dem die wesentlichen Bestandteile der Laseroptik 20 auf einem Schlitten 40 montiert sind. Zusätzlich kann auch der Laser 30 mit dem Schlitten 40 verfahrbar angeordnet sein. Folgende Elemente der Laseroptik 20 befinden sich auf dem Schlitten 40: Die Umlenkeinrichtungen 23 sowie die Negativlinse 21 und die Positivlinse 22; weiterhin die hintereinander geschalteten Elemente Abschwächer 24, Offset-Linse 25, Laserstrahl-Aperturblende 26 und Scaneinrichtung 27. Dem Fachmann sind andere Realisierungsmöglichkeiten ersichtlich. Insbesondere können Elemente zwischen denen ein paralleler Laserstrahlengang verläuft, auseinandergezogen werden, ohne den Strahlenverlauf zu beeinflussen. Die entsprechenden vorangehenden Elemente der Laseroptik brauchen in einem solchen Fall nicht auf den Schlitten 40 montiert zu werden, während nur die nachfolgenden Elemente der Laseroptik 20 auf den Schlitten 40 zu montieren sind. [
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3 zeigt analog zu 1 eine Situation, in der die Fokusebene 15 nicht mit der Objektebene 14 des Mikroskops 10 zusammenfällt. Zur Fokuseinstellung wird das Objektiv 11 entlang der optischen Achse 12 verschoben, bis die Fokusebene 15 mit der Objektebene 14 zusammenfällt. Diese Situation ist in 4 dargestellt. 4 zeigt ein in Richtung optischer Achse 12 verschobenes Objektiv 11 (die Verschiebung ist wiederum durch den Doppelpfeil angedeutet). Eine derartige Verschiebung hat eine entsprechende Verschiebung der hinteren Brennebene 17 zur Folge, wodurch ohne Gegenmaßnahmen der Laserstrahl 31 nicht mehr durch denselben Punkt 13 der hinteren Brennebene 17 verlaufen würde wie in 3. Um sicherzustellen, dass der Punkt 13 der hinteren Brennebene 17 auch bei Verschiebung des Objektivs 11 entlang der optischen Achse 12 beibehalten wird, wird der Schlitten 40 und mit ihm sämtliche auf dem Schlitten 40 befindlichen Elemente der Laseroptik 20 entsprechend verschoben. Im dargestellten Beispiel ist eine Verschiebung des Schlittens 40 mit einer Verschiebung des Objektivs 11 gekoppelt. Diese Kopplung kann über eine Steuereinrichtung 60 oder alternativ auch mechanisch durch eine mechanische Kopplungseinrichtung, die ebenfalls mit 60 bezeichnet sein kann, erfolgen. Die Verschiebung des Schlittens 40 erfolgt gleichsinnig zur Verschiebung des Objektivs 11. Dabei wird die Verschiebung vorzugsweise im Verhältnis 1:1 vorgenommen.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Laser-Mikroskopsystem, Lasermikrodissektionssystem
- 10
- Mikroskop
- 11
- Objektiv
- 12
- optische Achse
- 13
- Punkt der hinteren Objektivbrennebene
- 14
- Objektebene
- 15
- Fokusebene, vordere Brennebene
- 16
- Tubus
- 17
- hintere Objektivbrennebene
- 18
- Mikroskoptisch
- 19
- Beleuchtungsstrahlengang
- 20
- Laseroptik
- 21
- Negativlinse
- 22
- Positivlinse
- 23
- Umlenkeinrichtung
- 24
- Abschwächer
- 25
- Offset-Linse
- 26
- Laserstrahl-Aperturblende
- 27
- Scaneinrichtung
- 28
- Umlenkspiegel
- 29
- Ausgleichslinse
- 30
- Laser
- 31
- Laserstrahl
- 32
- Achse des Laserstrahlengangs
- 40
- Schlitten
- 50
- Aufnahmebehälter
- 60
- Steuereinrichtung
- 271
- optischer Keil
- 272
- optischer Keil
- α
- Ablenkwinkel
