DE10201540A1

DE10201540A1 - Production of D-pantothenic acid, useful e.g. as a feed additive for livestock, comprises fermentation of Enterobacteriaceae strain in which specific nucleotide sequences have been amplified

Info

Publication number: DE10201540A1
Application number: DE10201540A
Authority: DE
Inventors: Thomas Hermann; Mechthild Rieping
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2002-01-17
Filing date: 2002-01-17
Publication date: 2003-07-31

Abstract

Production of D-pantothenic acid (I) involves fermenting a microorganism (A) of the Enterobacteriaceae family (preferably already producing (I)) in which one or more of nucleotide sequences encoding yccJ-ORF, ptgA-gene and yeaA-ORF has been amplified (preferably over-expressed). Production of D-pantothenic acid (I) or its salt (or a feed additive containing (I) or its salt) involves fermenting a microorganism (A) of the Enterobacteriaceae family (preferably already producing (I)) in which one or more of nucleotide sequences encoding yccJ-ORF, ptgA-gene and yeaA-ORF has been amplified (preferably over-expressed). Production of (I) is under conditions suitable for amplification or over-expression of the intracellular activity of the corresponding proteins (enzymes). An Independent claim is also included for the microorganisms (A).

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen oder diese enthaltende Mischungen unter Verwendung von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen eines oder mehrere der Gene oder offenen Leserahmen (ORF) ausgewählt aus der Gruppe yccJ, ptgA und yeaA verstärkt wird. This invention relates to a method of fermentative Production of D-pantothenic acid and / or its salts or mixtures containing them using Microorganisms of the Enterobacteriaceae family, in which one or more of the genes or open reading frames (ORF) selected from the group yccJ, ptgA and yeaA reinforced becomes.

Stand der TechnikState of the art

Pantothensäure wird weltweit in einer Größenordnung von mehreren tausend Tonnen pro Jahr produziert. Es wird unter anderem in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie und in der Lebensmittelindustrie verwendet. Ein großer Teil der produzierten Pantothensäure wird für die Ernährung von Nutztieren wie Geflügel und Schweine verwendet. Der Bedarf steigt. Pantothenic acid is of the order of magnitude worldwide produced several thousand tons a year. It gets under other in human medicine, in pharmaceutical Industry and used in the food industry. On Much of the pantothenic acid produced is used for Feeding livestock such as poultry and pigs used. The demand is increasing.

Pantothensäure kann durch chemische Synthese oder biotechnisch durch Fermentation geeigneter Mikroorganismen in geeigneten Nährlösungen hergestellt werden. Bei der chemischen Synthese ist das DL-Pantolacton eine wichtige Vorstufe. Es wird in einem mehrstufigen Verfahren aus Formaldehyd, Isobutylaldehyd und Cyanid hergestellt, in weiteren Verfahrensschritten das racemische Gemisch aufgetrennt, das D-Pantolacton mit β-Alanin kondensiert und so D-Pantothensäure erhalten. Pantothenic acid can be by chemical synthesis or biotechnical through fermentation of suitable microorganisms be prepared in suitable nutrient solutions. In the chemical synthesis, DL-pantolactone is an important one Precursor. It is made in a multi-step process Formaldehyde, isobutyl aldehyde and cyanide are produced in further process steps the racemic mixture separated, the D-pantolactone condensed with β-alanine and so get D-pantothenic acid.

Die typische Handelsform ist das Calcium-Salz der D- Pantothensäure. Das Calcium-Salz des racemischen Gemisches der D,L-Pantothensäure ist ebenfalls gebräuchlich. The typical commercial form is the calcium salt of D- Pantothenic acid. The calcium salt of the racemic mixture D, L-pantothenic acid is also common.

Der Vorteil der fermentativen Herstellung durch Mikroorganismen liegt in der direkten Bildung der gewünschten stereoisomeren Form, nämlich der D-Form, die frei von L-Pantothensäure ist. The advantage of fermentative production through Microorganisms lie in the direct formation of the desired stereoisomeric form, namely the D form, the is free of L-pantothenic acid.

Verschiedene Arten von Bakterien, wie z. B. Escherichia coli (E. coli), Arthrobacter ureafaciens, Corynebacterium erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes und auch Hefen, wie z. B. Debaromyces castellii können wie in EP-A 0 493 060 gezeigt, in einer Nährlösung, die Glucose, DL-Pantoinsäure und β-Alanin enthält, D-Pantothensäure produzieren. EP-A 0 493 060 zeigt weiterhin, dass bei E. coli durch Amplifikation von Pantothensäure-Biosynthesegenen aus E. coli, die auf den Plasmiden pFV3 und pFV5 enthalten sind, in einer Nährlösung, die Glucose, DL-Pantoinsäure und β- Alanin enthält, die Bildung von D-Pantothensäure verbessert wird. Different types of bacteria, such as B. Escherichia coli (E. coli), Arthrobacter ureafaciens, Corynebacterium erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes and also yeasts, such as B. Debaromyces castellii can as in EP-A 0 493 060 shown in a nutrient solution, the glucose, DL-pantoic acid and contains β-alanine to produce D-pantothenic acid. EP-A 0 493 060 further shows that in E. coli Amplification of pantothenic acid biosynthetic genes from E. coli contained on the plasmids pFV3 and pFV5, in a nutrient solution containing glucose, DL-pantoic acid and β- Contains alanine, which improves the formation of D-pantothenic acid becomes.

EP-A 0 590 857 und US-Patent 5,518,906 beschreiben von E. coli Stamm IFO3547 abgeleitete Mutanten, wie FV5714, FV525, FV814, FV521, FV221, FV6051 und FV5069, die Resistenzen gegen verschiedene Antimetabolite wie Salizylsäure, α- Ketobuttersäure, β-Hydroxyasparaginsäure, O-Methylthreonin und α-Ketoisovaleriansäure tragen. Sie produzieren in einer Nährlösung, die Glucose enthält, Pantoinsäure, und in einer Glucose- und β-Alanin-haltigen Nährlösung D-Pantothensäure. In EP-A 0 590 857 und US-Patent 5,518,906 wird weiterhin angegeben, dass nach Amplifikation der Pantothensäure- Biosynthesegene panB, panC und panD, die auf dem Plasmid pFV31 enthalten sein sollen, in den oben genannten Stämmen in Glucose-haltigen Nährlösungen, die Produktion von D- Pantoinsäure und in einer Nährlösung, die Glucose und β- Alanin enthält, die Produktion von D-Pantothensäure verbessert wird. EP-A 0 590 857 and U.S. Patent 5,518,906 describe from E. coli strain IFO3547 derived mutants such as FV5714, FV525, FV814, FV521, FV221, FV6051 and FV5069, the resistances against various antimetabolites such as salicylic acid, α- Ketobutyric acid, β-hydroxyaspartic acid, O-methylthreonine and carry α-ketoisovaleric acid. You produce in one Nutrient solution containing glucose, pantoic acid, and in one Nutrient solution D-pantothenic acid containing glucose and β-alanine. In EP-A 0 590 857 and US Patent 5,518,906 further indicated that after amplification of pantothenic acid BBsynthesis genes panB, panC and panD on the plasmid pFV31 should be included in the above strains in nutrient solutions containing glucose, the production of D- Pantoic acid and in a nutrient solution, the glucose and β- Contains alanine, the production of D-pantothenic acid is improved.

Weiterhin wird in der WO 97/10340 über die förderliche Wirkung der Verstärkung des ilvGM-Operons auf die Produktion von D-Pantothensäure berichtet. In der EP-A-1001027 wird schließlich über die Wirkung der Verstärkung des panE-Gens auf die Bildung der D-Pantothensäure berichtet. Furthermore, WO 97/10340 describes the beneficial Effect of the amplification of the ilvGM operon on the Production of D-pantothenic acid is reported. In EP-A-1001027 will eventually have the effect of reinforcement of the panE gene for the formation of D-pantothenic acid reported.

Nach dem Stand der Technik wird die D-Pantothensäure oder das entsprechende Salz aus der Fermentationsbrühe isoliert und gereinigt (EP-A-0590857 und WO 96/33283) und dementsprechend in gereinigter Form verwendet oder die D- Pantothensäure-haltige Fermentationsbrühe wird insgesamt getrocknet (EP-A-1050219) und insbesondere als Futtermitteladditiv verwendet. According to the prior art, D-pantothenic acid or the corresponding salt is isolated from the fermentation broth and cleaned (EP-A-0590857 and WO 96/33283) and accordingly used in purified form or the D- Fermentation broth containing pantothenic acid is total dried (EP-A-1050219) and especially as Feed additive used.

Object of the invention

Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von D- Pantothensäure und/oder deren Salzen bzw. diese enthaltende Tierfuttermittel-Additive bereitzustellen. The inventors set themselves the task of creating new ones Measures to improve fermentative production of D- Pantothenic acid and / or its salts or containing them To provide animal feed additives.

Beschreibung der ErfindungDescription of the invention

Wenn im Folgenden D-Pantothensäure oder Pantothensäure oder Pantothenat erwähnt werden, sind damit nicht nur die freien Säuren, sondern auch die Salze der D-Pantothensäure wie z. B. das Calcium-, Natrium-, Ammonium- oder Kaliumsalz gemeint. If in the following D-pantothenic acid or pantothenic acid or Pantothenate mentioned are not only the free ones Acids, but also the salts of D-pantothenic acid like z. B. the calcium, sodium, ammonium or potassium salt meant.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und deren Salzen oder deren Salzen oder diese enthaltende Futtermitteladditive durch Fermentation von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, insbesondere solchen, die bereits D-Pantothensäure produzieren, bei dem man

a) mindestens eine der für die (ORF) yccJ, ptgA-Gen, yeaA-ORF kodierende(n) Nukleotidsequenzen oder deren Allele verstärkt, insbesondere überexprimiert, unter Bedingungen, die für die Verstärkung oder Überexpression der intrazellulären Aktivität der entsprechenden Proteine (Enzyme) geeignet sind, gegebenenfalls in Kombination mit der Abschwächung oder Verstärkung weiterer Gene, und
b) gegebenenfalls in Gegenwart von Erdalkaliverbindungen, wobei diese in vorzugsweise stöchiometrischen Mengen kontinuierlich oder diskontinuierlich hinzugefügt werden, fermentiert,
c) D-Pantothensäure bzw. das entsprechende Salz im Medium bzw. der Fermentationsbrühe oder in den Zellen der Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae anreichert und
d) die gewünschten Produkte nach Abschluss der Fermentation isoliert, wobei man die Biomasse und/oder weitere Bestandteile der Fermentationsbrühe in einer Menge von ≥ 0 bis 100% abtrennt.

The invention relates to a process for the fermentative production of D-pantothenic acid and its salts or their salts or feed additives containing them by fermentation of microorganisms of the Enterobacteriaceae family, in particular those which already produce D-pantothenic acid, in which

a) at least one of the nucleotide sequences coding for the (ORF) yccJ, ptgA gene, yeaA-ORF or their alleles are amplified, in particular overexpressed, under conditions which are necessary for the amplification or overexpression of the intracellular activity of the corresponding proteins (enzymes) are suitable, optionally in combination with the weakening or amplification of further genes, and
b) optionally fermented in the presence of alkaline earth metal compounds, these being added in preferably stoichiometric amounts continuously or batchwise,
c) enriches D-pantothenic acid or the corresponding salt in the medium or the fermentation broth or in the cells of the microorganisms of the Enterobacteriaceae family and
d) the desired products are isolated after completion of the fermentation, the biomass and / or further constituents of the fermentation broth being separated off in an amount of 0 0 to 100%.

Gegenstand der Erfindung ist ebenso ein Verfahren, bei dem nach Abschluss der Fermentation die Biomasse teilweise oder insgesamt in der Fermentationsbrühe verbleibt, und die so erhaltene Brühe gegebenenfalls nach dem Aufkonzentrieren zu einer festen D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltenden Mischung, die bevorzugt weitere Bestandteile der Fermentationsbrühe enthält, verarbeitet wird. The invention also relates to a method in which after the fermentation is complete, the biomass is partially or remains overall in the fermentation broth, and so obtained broth, if necessary after concentrating a solid D-pantothenic acid and / or its salts containing mixture, preferably other ingredients which contains fermentation broth is processed.

Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang insbesondere die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene, des ORFs bzw. der ORFs erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen oder Allel oder ORF verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert. The term "reinforcement" describes in this context especially the increase in intracellular activity one or more enzymes or proteins in one Microorganism encoded by the corresponding DNA by, for example, the number of copies of the gene or the genes, ORFs or ORFs increased, a strong one Promoter or a gene or allele or ORF used that for a corresponding enzyme or protein with a high Activity encodes and, if necessary, these measures combined.

Als offener Leserahmen (ORF, open reading frame) wird ein Abschnitt einer Nukleotidsequenz bezeichnet, der für ein Protein beziehungsweise Polypeptid oder Ribonukleinsäure kodiert oder kodieren kann, dem (der) nach dem Stand der Technik keine Funktion zugeordnet werden kann. Nach Zuordnung einer Funktion zu dem betreffenden Abschnitt der Nukleotidsequenz wird im allgemeinen von einem Gen gesprochen. As an open reading frame (ORF), a Section of a nucleotide sequence designated for a Protein or polypeptide or ribonucleic acid encoded or can encode according to the state of the Technology no function can be assigned. To Assignment of a function to the relevant section of the Nucleotide sequence is generally from a gene spoken.

Durch die Maßnahmen der Verstärkung, insbesondere Überexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis 1000% oder 2000% bezogen auf die des Wildtyp- Proteins beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht. Through the measures of reinforcement, in particular Overexpression, the activity or concentration of the corresponding protein in general by at least 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% or 500%, up to 1000% or 2000% based on that of the wild type Protein or the activity or concentration of the protein in the starting microorganism increased.

Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können D-Pantothensäure aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es handelt sich um Vertreter der Enterobacteriaceae, insbesondere der Gattung Escherichia. Bei der Gattung Escherichia ist insbesondere die Art Escherichia coli zu nennen. Innerhalb der Art Escherichia coli sind die sogenannten K-12-Stämme, wie z. B. die Stämme MG1655 oder W3110 (Neidhard et al.: Escherichia coli and Salmonella. Cellular and Molecular Biology (ASM Press, Washington D. C.)) oder der Escherichia coli Wildtypstamm IFO3547 (Institut für Fermentation, Osaka, Japan) und davon abgeleitete Mutanten geeignet, die die Fähigkeit besitzen D-Pantothensäure zu produzieren. The microorganisms that are the subject of the present Invention, D-pantothenic acid can be obtained from glucose, Sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch, Produce cellulose or from glycerin and ethanol. It are representatives of Enterobacteriaceae, especially the genus Escherichia. In the genus Escherichia is particularly the species Escherichia coli too call. Within the species Escherichia coli they are so-called K-12 strains, such as. B. the strains MG1655 or W3110 (Neidhard et al .: Escherichia coli and Salmonella. Cellular and Molecular Biology (ASM Press, Washington D. C.)) or the Escherichia coli wild-type strain IFO3547 (Institute of Fermentation, Osaka, Japan) and the like derived mutants that have the ability To produce D-pantothenic acid.

Geeignete D-Pantothensäure produzierende Stämme der Gattung Escherichia, insbesondere der Art Escherichia coli sind beispielsweise
Escherichia coli FV5069/pFV31
Escherichia coli FV5069/pFV202
Escherichia coli FE6/pFE80 und
Escherichia coli KE3 Suitable strains of the genus Escherichia, in particular of the type Escherichia coli, which produce D-pantothenic acid are, for example
Escherichia coli FV5069 / pFV31
Escherichia coli FV5069 / pFV202
Escherichia coli FE6 / pFE80 and
Escherichia coli KE3

Es wurde gefunden, dass Enterobacteriaceae nach Verstärkung, insbesondere Überexpression eines oder mehrerer der Gene oder offenen Leserahmen (ORF), ausgewählt aus der Gruppe yccJ, ptgA und yeaA in verbesserter Weise D- Pantothensäure produzieren. It has been found that Enterobacteriaceae after Amplification, especially overexpression of one or several of the genes or open reading frames (ORF) selected from the group yccJ, ptgA and yeaA in an improved manner D- Produce pantothenic acid.

Die Nukleotidsequenzen der Gene oder offenen Leserahmen (ORF) von Escherichia coli gehören zum Stand der Technik und können ebenfalls der von Blattner et al. (Science 277, 1453-1462 (1997) publizierten Genomsequenz von Escherichia coli entnommen werden. yccJ-Gen Bezeichnung: offener Leserahmen unbekannter Funktion
Referenz: Blattner et al., Science 277 (5331), 1453-1474 (1997)
Accession No.: AE000202 ptgA-Gen Bezeichnung: Glucose-spezifische IIA Komponente des PTS- Systems alternativer Genname: crr, gsr, iex, tgs, treD
Referenz: Reizer et al., Protein Science 3: 440-450 (1994)
Accession No.: AE000329.1 yeaA-Gen Bezeichnung: offener Leserahmen unbekannter Funktion
Referenz: Blattner et al., Science 277 (5331), 1453-1474 (1997)
Accession No.: AE000272 The nucleotide sequences of the genes or open reading frames (ORF) of Escherichia coli belong to the prior art and can also be described by Blattner et al. (Science 277, 1453-1462 (1997) published genome sequence of Escherichia coli. YccJ gene Name: open reading frame of unknown function
Reference: Blattner et al., Science 277 (5331), 1453-1474 (1997)
Accession No .: AE000202 ptgA gene Name: glucose-specific IIA component of the PTS system alternative gene name: crr, gsr, iex, tgs, treD
Reference: Reizer et al., Protein Science 3: 440-450 (1994)
Accession No .: AE000329.1 yeaA gene Name: open reading frame of unknown function
Reference: Blattner et al., Science 277 (5331), 1453-1474 (1997)
Accession No .: AE000272

Die in den angegebenen Textstellen beschriebenen Gene oder offenen Leserahmen können erfindungsgemäß verwendet werden. Weiterhin können Allele der Gene oder offene Leserahmen verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen (sense mutations) ergeben, wobei die Aktivität des Proteins im wesentlichen nicht verändert wird. The genes described in the specified passages or open reading frames can be used according to the invention. Furthermore, alleles of the genes or open reading frames be used, resulting from the degeneracy of the genetic codes or through functionally neutral Sense mutations result, whereby the Protein activity essentially unchanged becomes.

Zur Erzielung einer Überexpression kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Verlaufe der fermentativen D-Pantothensäure-Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden. To achieve overexpression, the number of copies of the corresponding genes can be increased, or it can Promoter and regulatory region or the Ribosome binding site located upstream of the Structural gene located to be mutated. In the same way expression cassettes act upstream of the Structural gene can be installed. By inducible It is also possible for promoters to express in History of fermentative D-pantothenic acid production increase. Through measures to extend the lifespan expression of the m-RNA is also improved. Furthermore, by preventing the degradation of the Enzyme protein also increases enzyme activity. The Genes or gene constructs can either be found in plasmids different number of copies are present or in the chromosome be integrated and amplified. Alternatively, you can continue to overexpress the genes in question Change in media composition and culture management can be achieved.

Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Chang und Cohen (Journal of Bacteriology 134: 1141-1156 (1978)), bei Hartley und Gregori (Gene 13: 347-353 (1981)), bei Amann und Brosius (Gene 40: 183-190 (1985)), bei de Broer et al. (Proceedings of the National of Sciences of the United States of America 80: 21-25 (1983)), bei LaVallie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11, 187-193 (1993)), in PCT/US97/13359, bei Llosa et al. (Plasmid 26: 222-224 (1991)), bei Quandt und Klipp (Gene 80: 161-169 (1989)), bei Hamilton (Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989), bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie. The expert can find instructions on this among others Chang and Cohen (Journal of Bacteriology 134: 1141-1156 (1978)), by Hartley and Gregori (Gene 13: 347-353 (1981)), in Amann and Brosius (Gene 40: 183-190 (1985)), in de Broer et al. (Proceedings of the National of Sciences of the United States of America 80: 21-25 (1983)), at LaVallie et al. (BIO / TECHNOLOGY 11, 187-193 (1993)), in PCT / US97 / 13359, by Llosa et al. (Plasmid 26: 222-224 (1991)), by Quandt and Klipp (Gene 80: 161-169 (1989)), by Hamilton (Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)) Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998) and in well-known textbooks of genetics and Molecular biology.

In Enterobacteriaceae replizierbare Plasmidvektoren wie z. B. von pACYC184 abgeleitete Kloniervektoren (Bartolome et al.; Gene 102, 75-78 (1991)), pTrc99A (Amann et al.; Gene 69: 301-315 (1988)) oder pSC101-Derivate (Vocke und Bastia, Proceedings of the National Academy of Science USA 80 (21): 6557-6561 (1983)) können verwendet werden. In einem erfindungsgemäßen Verfahren kann man einen mit einem Plasmidvektor transformierten Stamm einsetzen, wobei der Plasmidvektor mindestens die für das serC-Gen kodierende Nucleotidsequenz trägt. Plasmids vectors replicable in Enterobacteriaceae such as z. B. cloning vectors derived from pACYC184 (Bartolome et al .; Gene 102: 75-78 (1991)), pTrc99A (Amann et al .; Gene 69: 301-315 (1988)) or pSC101 derivatives (Vocke and Bastia, Proceedings of the National Academy of Science USA 80 (21): 6557-6561 (1983)) can be used. In one The method according to the invention can be used with a Use plasmid vector transformed strain, the Plasmid vector at least that coding for the serC gene Nucleotide sequence.

Weiterhin kann es für die Produktion von D-Pantothensäure mit Stämmen der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft sein zusätzlich zur Verstärkung eines oder mehrerer der Gene oder offenen Leserahmen (ORF), ausgewählt aus der Gruppe yccJ, ptgA und yeaA, ein oder mehrere der insbesondere endogenen Gene, ausgewählt aus der Gruppe

- das für die Acetohydroxysäure-Synthase II kodierende ilvGM-Operon (WO 97/10340)
- das für die Ketopantoat-Hydroxymethyltransferase kodierende panB-Gen (US-A-5,518,906),
- das für die Ketopantoat-Reduktase kodierende panE-Gen (EP-A-1001027)
- das für die Aspartat-Decarboxylase kodierende panD-Gen (US-A-5,518,906)
- das für die Pantothenat-Synthetase kodierende panC-Gen (US-A-5,518,906),
- das für die Serinhydroxymethyltransferase kodierende glyA-Gen (Plamann et al (Nucleic Acids Research 11(7): 2065-2075(1983))),
- die für das Glycin-Spaltungssystem (glycine-cleavage system) kodierenden Gene gcvT, gcvH und gcvP (Okamura- Ikeda et al., European Journal of Biochemistry 216, 539-548 (1993)), einzeln oder gemeinsam und
- das für die Phosphoserin-Transaminase kodierende serC- Gen (Duncan und Coggins, Biochemical Journal 234: 49-57 (1986))

einzeln oder gemeinsam zu verstärken, insbesondere zu überexprimieren. Furthermore, it may be advantageous for the production of D-pantothenic acid with strains of the Enterobacteriaceae family, in addition to enhancing one or more of the genes or open reading frames (ORF) selected from the group yccJ, ptgA and yeaA, one or more of the in particular endogenous genes, selected from the group

- The ilvGM operon coding for acetohydroxy acid synthase II (WO 97/10340)
the panB gene coding for the ketopantoate hydroxymethyltransferase (US Pat. No. 5,518,906),
- The panE gene coding for the ketopantoate reductase (EP-A-1001027)
the panD gene coding for the aspartate decarboxylase (US Pat. No. 5,518,906)
the panC gene coding for pantothenate synthetase (US Pat. No. 5,518,906),
the glyA gene coding for the serine hydroxymethyltransferase (Plamann et al (Nucleic Acids Research 11 (7): 2065-2075 (1983))),
- The genes gcvT, gcvH and gcvP coding for the glycine cleavage system (Okamura-Ikeda et al., European Journal of Biochemistry 216, 539-548 (1993)), individually or together and
- the serC gene coding for the phosphoserine transaminase (Duncan and Coggins, Biochemical Journal 234: 49-57 (1986))

to amplify individually or together, in particular to overexpress.

Schließlich kann es für die Produktion von D-Pantothensäure mit Stämmen der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft sein, zusätzlich zur Verstärkung eines oder mehrerer der Gene oder offenen Leserahmen (ORF), ausgewählt aus der Gruppe yccJ, ptgA und yeaA eines oder mehrere der insbesondere endogenen Gene, ausgewählt aus der Gruppe

- das für die Transaminase C kodierende avtA-Gen (EP-A-1001027)
- das für die Pyruvat Oxidase kodierende poxB-Gen (Grabau und Cronan, Nucleic Acids Research. 14 (13), 5449-5460 (1986))
- das für die PEP-Carboxykinase kodierende pckA-Gen (Medina et al., Journal of Bacteriology 172, 7151-7156 (1990))

einzeln oder gemeinsam abzuschwächen, insbesondere auszuschalten oder auf niedrigem Niveau zu exprimieren. Finally, it can be advantageous for the production of D-pantothenic acid with strains of the Enterobacteriaceae family, in addition to enhancing one or more of the genes or open reading frames (ORF) selected from the group yccJ, ptgA and yeaA one or more of the particularly endogenous genes, selected from the group

the avtA gene coding for the transaminase C (EP-A-1001027)
- the poxB gene coding for pyruvate oxidase (Grabau and Cronan, Nucleic Acids Research. 14 (13), 5449-5460 (1986))
- the pckA gene coding for the PEP carboxykinase (Medina et al., Journal of Bacteriology 172, 7151-7156 (1990))

weaken individually or together, in particular switch off or express at a low level.

Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) oder Ribonukleinsäure in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym (Protein) oder eine entsprechende Ribonukleinsäure mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) oder Ribonukleinsäure inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert. The term "weakening" describes in this Related to reducing or eliminating the intracellular activity of one or more enzymes (Proteins) or ribonucleic acid in a microorganism, which are encoded by the corresponding DNA by for example, uses a weak promoter or a Gene or allele used that for a corresponding enzyme (Protein) or a corresponding ribonucleic acid encodes a low activity or the corresponding one Gene or enzyme (protein) or ribonucleic acid inactivated and combined these measures if necessary.

Durch die Maßnahmen der Abschwächung einschließlich der Verringerung der Expression wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp-Proteins, beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, herabgesenkt. Through the mitigation measures including the Decreasing expression will activity or Concentration of the corresponding protein in general to 0 to 75%, 0 to 50%, 0 to 25%, 0 to 10% or 0 to 5% of the activity or concentration of the wild-type protein, or the activity or concentration of the Protein in the starting microorganism, lowered.

Weiterhin kann es für die Produktion von D-Pantothensäure vorteilhaft sein neben der Überexpression eines oder mehrere der Gene oder offenen Leserahmen (ORF), ausgewählt aus der Gruppe yccJ, ptgA und yeaA unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982). In dem erfindungsgemäßen Verfahren können Bakterien eingesetzt werden in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung des D-Pantothensäures verringern. It can also be used for the production of D-pantothenic acid in addition to overexpressing one or several of the genes or open reading frames (ORF) are selected undesirable from the group yccJ, ptgA and yeaA Switch off side reactions (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms ", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982). By doing The method according to the invention can be used with bacteria in which the metabolic pathways are at least partially are switched off, which the formation of D-pantothenic acid reduce.

Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können im batch - Verfahren (Satzkultivierung), im fed batch (Zulaufverfahren) oder im repeated fed batch - Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben. The microorganisms produced according to the invention can in batch process (batch cultivation), in fed batch (Feed process) or in the repeated fed batch process (repetitive feed process) can be cultivated. A Summary of known cultivation methods are in the Textbook by Chmiel (Bioprocess Engineering 1. Introduction to bioprocess engineering (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) or in the textbook by Storhas (bioreactors and peripheral facilities (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)).

Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden. The culture medium to be used must be suitable meet the requirements of the respective tribes. Descriptions of cultural media from various Microorganisms are described in the manual "Manual of Methods for General Bacteriology "of the American Society for Bacteriology (Washington DC, USA, 1981). As Carbon source can be sugar and carbohydrates such as. B. Glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, Starch and cellulose, oils and fats such as B. soybean oil, Sunflower oil, peanut oil and coconut fat, fatty acids such as z. As palmitic acid, stearic acid and linoleic acid, alcohols such as B. glycerin and ethanol and organic acids such as z. B. acetic acid can be used. These substances can used individually or as a mixture.

Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Organic nitrogen-containing can be used as the nitrogen source Compounds such as peptones, yeast extract, meat extract, Malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, Ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and Ammonium nitrate can be used. The nitrogen sources can be used individually or as a mixture.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies Vorstufen der D- Pantothensäure wie Aspartat, β-Alanin, Ketoisovalerat, Ketopantoinsäure oder Pantoinsäure und gegebenenfalls deren Salze zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden. Phosphoric acid, Potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium salts are used. The culture medium must continue to salts of metals included, such as B. magnesium sulfate or iron sulfate, the are necessary for growth. Finally, you can essential growth substances such as amino acids and vitamins in addition to the substances mentioned above. Precursors of the D- Pantothenic acid such as aspartate, β-alanine, ketoisovalerate, Ketopantoic acid or pantoic acid and optionally their Salts are added. The feedstocks mentioned can added to the culture in the form of a unique approach or appropriately during cultivation be fed.

Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Basic compounds are used to control the pH of the culture such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or Ammonia water or acidic compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid used in a suitable manner.

Es ist gleichfalls möglich, zur Darstellung der Erdalkalisalze der Pantothensäure, insbesondere des Calciumsalzes, während der Fermentation die Suspension oder Lösung einer Erdalkali-haltigen anorganischen Verbindung wie beispielsweise Calciumhydroxid oder einer organischen Verbindung wie dem Erdalkalisalz einer organischen Säure beispielsweise Calciumacetat, kontinuierlich oder diskontinuierlich zu versetzen. Auf diese Weise wird das zur Darstellung des gewünschten Erdalkalisalzes der D- Pantothensäure nötige Kation direkt in der gewünschten Menge, bevorzugt in stöchiometrischen Mengen, in die Fermentationsbrühe eingetragen. It is also possible to represent the Alkaline earth metal salts of pantothenic acid, especially the Calcium salt, during the fermentation the suspension or Solution of an alkaline earth-containing inorganic compound such as calcium hydroxide or an organic Compound like the alkaline earth salt of an organic acid for example calcium acetate, continuous or to move discontinuously. That way it will to represent the desired alkaline earth salt of the D- Pantothenic acid necessary cation directly in the desired Amount, preferably in stoichiometric amounts, in the Fermentation broth entered.

Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 25°C bis 45°C und vorzugsweise bei 30°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt bis sich ein Maximum an D- Pantothensäure gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht. Anti-foam agents can be used to control the development of foam such as B. fatty acid polyglycol esters. to Maintaining the stability of plasmids can do that Medium suitable selectively acting substances such. B. Antibiotics to be added. To aerobic conditions maintain oxygen or oxygen containing gas mixtures such. B. Air into culture entered. The temperature of the culture is usually at 25 ° C to 45 ° C and preferably at 30 ° C to 40 ° C. The Culture continues until a maximum of D- Has formed pantothenic acid. This goal is usually reached within 10 hours to 160 hours.

Die in der Fermentationsbrühe enthaltene D-Pantothensäure bzw. die entsprechenden Salze der D-Pantothensäure können anschließend nach dem Stand der Technik isoliert und gereinigt werden. The D-pantothenic acid contained in the fermentation broth or the corresponding salts of D-pantothenic acid then isolated according to the prior art and getting cleaned.

Es ist ebenso möglich, die D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltenden Fermentationsbrühen vorzugsweise zunächst durch bekannte Separationsmethoden wie zum Beispiel der Zentrifugation, der Filtration, dem Dekantieren oder einer Kombination hieraus vollständig oder zum Teil von der Biomasse zu befreien. Es ist jedoch auch möglich, die Biomasse gänzlich in der Fermentationsbrühe zu belassen. Im allgemeinen wird die Suspension oder Lösung vorzugsweise aufkonzentriert und beispielsweise mit Hilfe eines Sprühtrockners oder einer Gefriertrocknungsanlage zu einem Pulver aufgearbeitet. Anschließend wird dieses Pulver im allgemeinen durch geeignete Kompaktier- oder Granulier- Verfahren z. B. auch Aufbaugranulation in ein gröberkörniges, gut rieselfähiges, lagerbares und weitgehend staubfreies Produkt mit einer Korngrößenverteilung von bevorzugt 20 bis 2000 µm, insbesondere 100 bis 1400 µm überführt. Vorteilhaft bei der Granulation oder Kompaktierung ist der Einsatz von üblichen organischen oder anorganischen Hilfsstoffen, beziehungsweise Trägern wie Stärke, Gelatine, Cellulosederivaten oder ähnlichen Stoffen, wie sie üblicherweise in der Lebensmittel- oder Futterverarbeitung als Binde-, Gelier-, oder Verdickungsmittel Verwendung finden, oder von weiteren Stoffen wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikaten oder Stearaten. It is also possible to use D-pantothenic acid and / or its Fermentation broths containing salts are preferred first by known separation methods such as Example of centrifugation, filtration, the Decant or a combination thereof completely or to get rid of some of the biomass. However, it is also possible to completely absorb the biomass in the fermentation broth leave. Generally the suspension or solution preferably concentrated and for example with the help a spray dryer or a freeze dryer worked up a powder. Then this powder generally by means of suitable compacting or granulating Process z. B. also granulation in a coarser-grained, free-flowing, storable and largely dust-free product with a Grain size distribution of preferably 20 to 2000 μm, transferred in particular 100 to 1400 microns. Advantageous at the Granulation or compacting is the use of usual ones organic or inorganic auxiliaries, or carriers such as starch, gelatin, Cellulose derivatives or similar substances as they usually in food or feed processing as a binding, gelling or thickening agent find, or of other substances such as Silicas, silicates or stearates.

Alternativ kann das Fermentationsprodukt mit oder ohne weitere der üblichen Fermentationsbestandteile auf einen in der Futtermittelverarbeitung bekannten und üblichen organischen oder anorganischen Trägerstoff wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikate, Schrote, Kleien, Mehle, Stärken Zucker oder andere aufgezogen, zu einem Produkt mit der gewünschten Korngrößenverteilung verarbeitet werden, und/oder mit üblichen Verdickungs- oder Bindemitteln stabilisiert werden. Anwendungsbeispiele und Verfahren hierzu sind in der Literatur (Die Mühle + Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, Seite 817) beschrieben. Alternatively, the fermentation product can be with or without more of the usual fermentation components on a in known and customary in feed processing organic or inorganic carrier such as, for example Silicas, silicates, grist, bran, flours, starches Sugar or other raised to a product with the desired grain size distribution are processed, and / or with conventional thickeners or binders be stabilized. Application examples and procedures the literature (Die Mühle + Compound feed technology 132 (1995) 49, page 817).

Gegebenenfalls wird in einer geeigneten Verfahrensstufe D-Pantothensäure und/oder das gewünschte Salz der D-Pantothensäure oder eine diese Verbindungen enthaltende Zubereitung dem Produkt hinzugefügt, um den gewünschten Gehalt an Pantothensäure oder dem gewünschten Salz zu erzielen bzw. einzustellen. If necessary, in a suitable process stage D-pantothenic acid and / or the desired salt of D-pantothenic acid or one containing these compounds Preparation added to the product to the desired one Content of pantothenic acid or the desired salt achieve or adjust.

Der gewünschte Gehalt an den genannten Verbindungen liegt im allgemeinen im Bereich von 20 bis 80 Gew.-% (Trockenmasse). The desired content of the compounds mentioned is generally in the range of 20 to 80% by weight (Dry matter).

Die Konzentration an Pantothensäure kann mit bekannten chemischen (Velisek; Chromatographic Science 60, 515-560 (1992)) oder mikrobiologischen Verfahren wie z. B. dem Lactobacillus plantarum Test (DIFCO MANUAL, 10^th Edition, S. 1100-1102; Michigan, USA) bestimmt werden. The concentration of pantothenic acid can with known chemical (Velisek; Chromatographic Science 60, 515-560 (1992)) or microbiological methods such as. As the Lactobacillus plantarum test (DIFCO MANUAL, 10 ^th Edition, pp 1100-1102; Michigan, USA) are determined.

Claims

1. Process for the preparation of D-pantothenic acid and their salts or their salts or containing them Feed additives through fermentation of Microorganisms of the Enterbacteriaceae family, especially those that already have D-pantothenic acid produce in which you have at least one of the yccJ-ORF, ptgA gene and yeaA-ORF encoding (s) Nucleotide sequences enhanced, in particular overexpressed, under conditions necessary for the Enhancement or overexpression of the intracellular Activity of the corresponding proteins (enzymes) suitable are.

2. The method according to claim 1, in which

a) the D-pantothenic acid and / or its salts are concentrated in the medium or in the cells of the microorganisms, and,

b) the desired products are isolated after completion of the fermentation, the biomass and / or further constituents of the fermentation broth being separated off in an amount of 0 0 to 100%

3. The method according to claim 1, in which further genes strengthened and / or weakened.

4. The method according to claim 1, characterized in that the fermentation in the presence of Carries out alkaline earth salts, these being continuous or discontinuously in the desired amount be fed, and an alkaline earth salt of D- Containing or consisting of pantothenic acid Product wins.

5. The method according to claim 1, characterized in that microorganisms of the genus Escherichia starts.

6. The method according to claim 5, characterized in that that the microorganisms of the genus Escherichia of the species Escherichia coli.

7. The method according to claim 3, in which, in addition to amplifying or overexpressing said nucleotide sequences, one or more of the genes selected from the group:

1. 7.1 the ilvGM operon coding for acetohydroxy acid synthase II,

2. 7.2 the panB gene coding for the ketopantoate hydroxymethyltransferase,

3. 7.3 the panE gene coding for the ketopantoate reductase,

4. 7.4 the panD gene coding for the aspartate decarboxylase,

5. 7.5 the panC gene coding for the pantothenate synthetase,

6. 7.6 the sere gene coding for the phosphoserine transaminase,

7. 7.7 the genes coding for the glycine cleavage system, gcvT, gcvH and gcvP, individually or together (Okamura-Ikeda et al., European Journal of Biochemistry 216, 539-548 (1993)), and

8. 7.8 the glyA gene coding for the serine hydroxymethyltransferase

amplified, especially overexpressed.

8. The method according to claim 1, in which microorganisms uses in which the metabolic pathways at least are partially switched off, which the formation of the D- Reduce pantothenic acid.

9. The method according to claim 1, in which, in addition to the weakening or switching off of the nucleotide sequences mentioned, one or more of the genes selected from the group:

1. 9.1 the avamin gene encoding the transaminase C,

2. 9.2 the poxB gene coding for the pyruvate oxidase, and

3. 9.3 weakens the pckA gene coding for the PEP carboxykinase individually or jointly, in particular switches it off or expresses it at a low level.

10. The method according to claim 1, wherein the number of copies of genes increased or expression cassettes upstream of genes.

11. microorganisms of the Enterobactericeae family, especially the genus Escherichia, in which at least the intracellular activities of the Polypeptides are raised for which the yccJ ORF, ptgA gene or encode the yeaA ORF.

12. Microorganisms of the genus Escherichia according to claim 11, in particular of the species Escherichia coli, in which the described activities are increased.

13. Process for the preparation of D-pantothenic acid and their salts or their salts by fermentation of Microorganisms according to claims 11 or 12.

14. The method according to claim 1, wherein

a) from a D-pantothenic acid obtained by fermentation and its salts, or fermentation broth containing salts thereof, which separates the biomass and / or optionally the ingredients of the fermentation broth in an amount of ≥ 0 to 100%,

b) water is optionally removed from the fermentation broth (concentration),

c) the mixture containing the pantothenic acid and / or the pantothenate is converted into a finely divided, free-flowing form by suitable measures, in particular spray drying, if appropriate in the presence of known inorganic auxiliaries, and

d) it produces a free-flowing animal feed additive with a particle size distribution of 20 to 2000 μm, in particular 100 to 1400 μm.

15. A process for the production of feed additives according to claim 2 containing D-pantothenic acid and / or its salts, selected from the group consisting of magnesium or calcium salt, in which

a) optionally removing water from the fermentation broth (concentration),

b) the biomass formed during the fermentation is separated off in an amount of ≥ 0 to 100,

c) optionally adding one or more of the compounds mentioned to the fermentation broths treated according to a) and b), the amount of the compounds added being such that their total concentration in the animal feed additive is in the range from about 20 to 80% by weight ( Dry matter), and

d) the animal feed additive in the desired powder or preferably granule form with a grain size distribution of 20 to 2000 microns, in particular 100 to 1400 microns.

16. The method according to claim 15, characterized in that from the fermentation broth, optionally after the addition of D-pantothenic acid and / or its salts and optionally after the addition of known organic or inorganic auxiliaries

a) drying and compacting, or

b) spray drying, or

c) spray drying and granulating, or

d) spray drying and build-up granulation,

an animal feed additive in the powder or granule form mentioned and the concentrations of the additive components mentioned wins.