DE10155928A1

DE10155928A1 - recA-negativer und rhaB-negativer Mikroorganismus

Info

Publication number: DE10155928A1
Application number: DE10155928A
Authority: DE
Inventors: Oliver May; Klaus Liebeton; Juergen Eck
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2001-11-15
Filing date: 2001-11-15
Publication date: 2003-06-12
Also published as: ATE422558T1; EP1444367B1; WO2003042412A1; DE60231137D1; US20070128689A1; EP1444367A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung beschreibt neue Mikroorganismen speziell für den Einsatz als Expressionssysteme für rhamnoseinduzierbare Promotoren. DOLLAR A Durch die in diesen Organismen artifiziell geschaffene Kombination aus Rhamnose- und Rekombinationsdefizienz erhält man Expressionssysteme, welche zur Induktion weniger der teuren Rhamnose benötigen und damit kostengünstiger induzierbar sind sowie eine höhere genetische Stabilität aufweisen.

Description

Die vorliegende Erfindung ist auf einen Mikroorganismus gerichtet, der zur Expression von Genen codierend für rekombinant herzustellende Proteine dienen kann. Dieser Wirtsorganismus besitzt insbesondere eine Rekombinationsdefizient (recA-) gekoppelt mit der fehlende Fähigkeit, Rhamnose abzubauen (rhaB-). Weiterhin umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des Mikroorganismus sowie dessen bevorzugte Verwendungen.

Seit der Entwicklung der rekombinanten DNA Technologie ist es möglich, Proteine in rekombinanten Mikroorganismen kostengünstig herzustellen (Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. Cohen, S. N.; Chang, A. C.; Boyer, H. W.; Helling, R. B. (1973), Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 70, 3240-3244). Seit Anfang der 70er Jahre wurden daher aufgrund der zunehmenden industriellen Bedeutung von Proteinen Expressionssysteme basierend auf unterschiedlichen Promotoren und Wirtsorganismen entwickelt (Expression of heterologous gene products in yeast. Pichuantes, Sergio; Nguyen, Anton Tien; Franzusoff, Alex. Editor(s): Cleland, Jeffrey L.; Craik, Charles S. Protein Eng. (1996), 129-161. Inducible gene expression systems in Lactococcus lactis. Djordjevic G M; Klaenhammer T. R. MOLECULAR BIOTECHNOLOGY (1998 Apr), 9(2), 127-39. Expression systems for industrial Gram-positive bacteria with low guanine and cytosine content, de Vos W M; Kleerebezem M; Kuipers O P. CURRENT OPINION IN BIOTECHNOLOGY (1997 Oct), 8(5), 547-53. Alternative regulation principles for the production of recombinant proteins in Escherichia coli. Sawers G; Jarsch M. APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY (1996 Aug), 46(1), 1-9. Strategies for optimizing heterologous protein expression in Escherichia coli. Hannig, Gerhard; Makrides, Savvas C. Trends Biotechnol. (1998), 16(2), 54-60. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Makrides, Savvas C. Microbiol. Rev. (1996), 60(3), 512-538.). Unter einem Promotor versteht man landläufig ein DNA-Sequenzbereich, von dem aus die Transkription eines Gens oder Operons gesteuert wird. Man unterscheidet zwischen starken und schwachen Promotoren. Promotoren können durch Zugabe von bestimmten Substanzen zum Nährmedium des Mikroorganismus gesteuert werden (Gentechnologie für Einsteiger, T. A. Brown, Spektrum, 2. Auflage, S. 285). So ist z. B. auch L-Rhamnose eine Substanz, welche einen entsprechenden Promoter dahingehend beeinflussen kann, ein nachfolgendes Gen zu expremieren.

Um also die Expression eines durch L-Rhamnose induzierbaren Promoter-Gen-Konstruktes anzuschalten, muß dem Mikroorganismus L-Rhamnose zugeführt werden. Dies geschieht vorteilhafterweise durch Zugabe von L-Rhamnose zum Nährmedium, auf dem der Organismus wächst. L-Rhmanose bildet darüber hinaus aber auch eine für den Mikroorganismus zu verwendende Kohlenstoffquelle und wird durch den Mikroorganismus selbst verwertet und damit abgebaut.

Da L-Rhamnose ein verhältnismässig teurer Induktor ist, hat es nicht an Versuchen gefehlt, den Verbrauch von L-Rhamnose für solche Systeme zu minimieren. Kürzlich wurde ein L- Rhamnose-induzierbares Expressionssystem publiziert, welches im Vergleich zu anderen Systemen häufig bessere Ergebnisse erzielt (Ein neues, L-Rhamnose-induzierbares Expressionssystem für Escherichia coli. Stumpp, T.; Wilms, B.; Altenbuchner, Biospektrum (2000), 1, 33-36.). Es wurde ein Stamm erzeugt (E. coli BW3110) welcher durch Mutation im Rhamnulosekinasegen rhaB einen stark reduzierten Rhamnosestoffwechsel aufweist (Development of an Escherichia coli whole cell biocatalyst for the production of L-amino acids. Wilms, B.; Wiese, A.; Syldatk, C.; Mattes, R.; Altenbuchner, J. (2001), J. Biotechnol. 86, 19-30). Nachteile für die industrielle Anwendung dieses Expressionssystems (Kombination aus Rhamnosepromotor und E. coli BW3110) werden bereits bei Stumpp et al. aufgeführt:

- Die spezifische Aktivität des gebildeten Enzyms (Hydantoinase) im Rohextrakt blieb um 15-25% unter der eines isogenen E. coli-Stammes, der Rhamnose verbraucht.
- Da E. coli BW3110 ein Rekombinationssystem (recA) besitzt zeigte sich eine extreme Plasmidinstabilität: 70% der Zellen enthielten nach Fermentation ohne Selektionsdruck kein Plasmid mehr. Obwohl diese genetische Instabilität für Plasmide durch bekannte Stabilisierungssysteme verbessert werden kann, bleibt das Problem homologer Rekombinationen innerhalb des Bakterienchromosoms bestehen.

Aufgabe war es nun, einen Mikroorganismus zu kreieren, welcher zum einen weniger L-Rhamnose zur Induktion der Genexpression benötigt, bei dem andererseits jedoch die aus dem Stand der Technik bekannte genetische Instabilität zumindest vermindert ist. Insbesondere sollte der Mikroorganismus im technischen Maßstab zur Herstellung von rec-Proteinen in ökonomisch günstiger Weise verwendet werden können.

Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst. Anspruch 1 bis 4 beziehen sich auf den erfindungsgemäßen Mikroorganismus. Ansprüche 5 und 6 schützen ein besonderes Herstellverfahren für diesen, wohingegen Ansprüche 7 bis 9 auf dessen spezielle Verwendungen gerichtet sind. Anspruch 10 umfaßt einzelne Vektoren, die bei der Synthese des Mikroorgnismus heranzuziehen sind.

Dadurch, daß man einen Mikroorganismus bereitstellt, der eine Rekombinationsdefizienz (recA-) und eine durch eine Deletion des rhaB-Gens erfolgte Defizienz im Abbau von Rhamnose (rhaB-) aufweist, gelangt man zur Lösung der gestellten Aufgabe in vorteilhafter aber dafür nicht in ohne weiteres vorhersehbarer Art und Weise.

Der Mikroorganismus dient lediglich zur Vermehrung und Gewinnung einer ausreichenden Menge des rekombinanten Proteins. Die Verfahren zur Durchführung dieser Maßnahmen sind dem Fachmann wohlbekannt (Sambrook et al. 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Balbas P & Bolivar F. 1990, Design and construction of expression plasmid vectors in E. coli, Methods Enzymology 185, 14-37).

Der erfindungsgemäße Organismus kann in ausgezeichneter Weise zur Produktion von rekombinanten Proteinen herangezogen werden (Fig. 4), wobei die für die zur Induktion der Genexpression aufzuwendende Menge an L- Rhamnose deutlich reduziert werden kann, da der Mikroorganismus keine solche während des Wachstums verbraucht. Der Vergleich der Stämme bzgl. Rhamnoseabbau in Fig. 1 zeigt, dass sowohl E. coli BW3110 als auch der neu erzeugte Stamm E. coli DSM 14459 den Induktor L-Rhamnose kaum verstoffwechseln, wodurch eine, wie bereits für E. coli BW3110 gezeigt, 90%-ige Reduktion des Rhamnoseverbrauches möglich ist (Stumpp et al.).

Im Prinzip kann jeder zur Herstellung von rec-Proteinen vorteilhaft zu benutzende Organismus erfindungsgemäß modifiziert werden. Organismen wie z. B. Prokaryonten oder Eukaryonten, wie Pseudomonas, Streptomyces, Arthrobacter, Bacillus, Staphylococcus, Escherichia, Candida, Hansenula, Pichia können für diesen Zweck herangezogen werden. Vorzugsweise ist ein E. coli zu benutzen. Ganz besonders bevorzugt sind: E. coli NM 522, BL21, XL1 Blue, JM101, JM109, JM105, RR1, DH5α, TOP 10- oder HB101. Äußerst bevorzugt sind davon diejenigen, die schon eine recA- Defizienz aufweisen.

Ganz besonders vorteilhaft ist der Mikroorganismus, welcher unter der Nummer DSM 14459 bei der DSMZ GmbH, Mascher oder Weg 1b, D-38124 Braunschweig am 24.08.01 nach dem Budapester Vertrag hinterlegt wurde. Äußerst bevorzugt ist darüberhinaus ein erfindungsgemäßer Mikroorganismus aufweisend die Vektoren pOM21 und pOM22 (PCT/US 00/08159).

Wie oben schon angedeutet eignet sich der erfindungsgemäße Mikroorganismus vorzugsweise zur Produktion von rec- Proteinen, wobei Genkonstrukte für die Expression herangezogen werden, die einen rhamnoseinduzierbaren Promotor besitzen. Ganz besonders bevorzugt ist deshalb ein erfindungsgemäßer Mikroorganismus aufweisend mindestens ein rhamnoseinduzierbares Expressionssystem. Unter dem Begriff Expressionssystem wird in diesem Fall ein Vektor verstanden, welcher in dem erfindungsgemäßen Mikroorganismus stabil replizierbar und mit einem rhasmnoseinduzierbaren Promotor ausgestattet ist. Derartige Vektoren können vorzugsweise von pUC, pBR, pSC101 und pACYC Derivaten abgeleitet und in entsprechend modifizierter Form beispielsweise Studier et al., Methods Enzymol. 1990, 185, 61-69 oder den Broschüren der Firmen Roche Biochemicals, Invitrogen, Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech oder Gibco BRL entnommen werden. Weiter bevorzugte Vektoren können gefunden werden in: DNA cloning: a practical approach. Volume I-III, edited by D. M. Glover, IRL Press Ltd., Oxford, Washington DC, 1985, 1987; Denhardt, D. T. and Colasanti, J.: A surey of vectors for regulating expression of cloned DNA in E. coli. In: Rodriguez, R. L. and Denhardt, D. T (eds), Vectors, Butterworth, Stoneham, MA, 1987, pp179-204; Gene expression technology. In: Goeddel, D. V. (eds), Methods in Enzymology, Volume 185, Academic Press, Inc., San Diego, 1990; Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.

Vektoren mit einem rhamnoseinduzierbaren Promotor, mit denen das die zu expremierende Nukleinsäure aufweisende Genkonstrukt in ganz bevorzugter Weise in den Wirtsorganismus kloniert werden kann, sind: pKK-177-3H (Roche Biochemicals), pBTac (Roche Biochemicals), pKK-233-3 (Amersham Pharmacia Biotech), pLex (Invitrogen) oder die Vektoren der pET-Serie (Novagen).

Ganz besonders bevorzugt sind z. B. die Vektoren pOM21 und pOM22 (PCT/US 00/08159).

Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Mikroorganismen, bei dem man das Mutagenesekonstrukt zur Inaktivierung des Rhamnulokinase-Gens konjugativ in den rekombinationsaktiven Mikroorganismus transferiert und nach erfolgreicher Integration die Rekombinationsaktivität gezielt ausschaltet.

Zur Erzeugung des gewünschten Phänotyps könnte der Fachmann u. a. das rhaB-Gen analog der Herstellung des Stammes E. coli BW3110 (Development of an Escherichia coli whole cell biocatalyst for the production of L-amino acids. Wilms, B.; Wiese, A.; Syldatk, C.; Mattes, R.; Altenbuchner, J. (2001), J. Biotechnol. 86, 19-30.) gezielt deletieren, wobei im Gegensatz zur Erzeugung von E. coli BW3110 auf einen Stamm mit recA-negativen Phänotyp zurückgegriffen wird. Aus dem recA-negativen Phänotyp ergaben sich jedoch bei der Erzeugung des gewünschten Stammes mehrere für den Fachmann unerwartete Probleme:
Voraussetzung für die Mutagenese über homologe Rekombination ist die Wiederherstellung des recA-positiven Phänotyps in E. coli JM109. Dazu kann das recA-Gen aus dem Stamm E, coli BL21 mittels PCR amplifiziert und beispielsweise mit dem Vektor pBR322 bzw. pUniBlunt/V5-His- TOPO (Fig. 2) ligiert werden. Diese Konstrukte vermitteln dem Stamm E. coli JM109 einen recA-positiven Phänotyp, wie die Induktion der SOS-Antwort nach UV-Bestrahlung belegt (siehe Beispiel 1).

Ein Mutagensekonstrukt (z. B. pMut1, siehe Beispiel 1, Fig. 3) zur Inaktivierung des Rhamnulokinase-Gens (rhaB) kann beispielsweise durch Ligation einer Teilsequenz des rhaB- Gens, in die eine Leserasterverschiebung eingeführt wird, in einen in E. coli JM109 nicht replizierbaren Vektor (Suizidvektor) erstellt werden. Eine rhaB-negative Mutante des Stamms E. coli JM109 + pBrecA+, welche durch das Plasmid pBrecA+ einen recA-positiven Phänotyp besitzt, konnte nach dieser Vorgehensweise durch Transformation des Mutagenesekonstrukts jedoch nicht dargestellt werden. Die Konstruktion einer rhaB-negativen Mutante von E. coli JM109 durch ein Rekombinase-System (ein von recA unabhäniges System; analog One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Datsenko, Kirill A.; Wanner, Barry L. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2000), 97(12), 6640-6645.) führte ebenfalls nicht zum Ziel.

Zum Ziel gelangt man jedoch, wenn man nach Insertion des RP4-"origins of replication" (Conditionally replicative and conjugative plasmids carrying lacZα for cloning, mutagenesis, and allele replacement in bacteria. Metcalf, William W.; Jiang, Weihong; Daniels, Larry L.; Kim, Soo-Ki; Haldimann, Andreas; Wanner, Barry L. Plasmid (1996), 35(1), 1-13.) in den Vektor pMut1 das resultierende Mutagensekonstrukt pMut2 (Fig. 3) konjugativ (Sambrook et a1. 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Balbas P & Bolivar F. 1990) nach E. coli JM109 + pBrecA+ transferiert und in das Chromosom integriert. Mit pMut2 lässt sich wie erwartet sowohl rhaB-negative als auch rhaB-positive Transkonjuganten identifizieren, was sich am weißen bzw. roten Phänotyp auf dem Indikatormedium (siehe Beispiel 1) zeigt.

Ausgehend von einem rhaB-negativem Transkonjugant (bzw. rhaB-positiven Transkonjuganten und anschließender Excission des integrierten Vektors), lassen sich solche Klone anreichern, die nach mehrfacher Inkubation ohne Selektionsdruck für die durch den Vektor pBrecA+ vermittelte Antibiotikumsresistenz (Tetrazyklin) Tetrazyklin-sensibel sind. Durch Induktion der SOS-Antwort mittels UV-Bestrahlung kann deren recA-Phänotyp überprüft und als recA-negativ bestätigt werden. So lassen sich Klone identifizieren, deren Phänotyp als rhaβ-negativ und recA- negativ zusammengefasst werden kann.

In einer nächsten Ausgestaltung beschäftigt sich die Erfindung mit der Verwendung des erfindungsgemäßen Mikroorganismus in einem Verfahren zur Herstellung von rec- Proteinen. Prinzipiell ist der Fachmann frei in der Wahl der herzustellenden rec-Proteine. Die Verfahren sind der allgemeinen Fachliteratur zu entnehmen (s.: Sambrook et al. 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Balbas P & Bolivar F. 1990; Design and construction of expression plasind vectors in E. coli, Methods Enzymology 185, 14-37; Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses. R. L. Rodriguez & D. T. Denhardt, Eds: 205-225). Bezüglich der allgemeinen Vorgehensweise (PCR, Klonierung, Expression etc.) sei auch auf obengenannte Literatur und das dort Zitierte verwiesen.

Besonders bevorzugt ist die Verwendung des Mikroorganismus zur Herstellung von enantiomerenangereicherten Aminosäuren analog einem Ganzzellkatalysator wie in PCT/EP 00/08473 und PCT/US 00/08159 offenbart. Äußerst bevorzugt ist daher die Ausführungsform, in der der erfindungsgemäße Mikroorganismus ein rec-Protein mit der Eigenschaft einer Hydantoinase, einer Carbamoylase und/oder einer Hydantoin- oder Carbamoylracemase aufweist. Damit ist es möglich aus leicht zu synthetisierenden Hydantoinen enantiomerenangereicherte Aminosäuren zu generieren. Vorteilhafterweise kann der so verwendete Mikroorganismus die Vektoren pOM21 und pOM22, wie in E. coli DSM 14459 (pOM21/pOM22) verwirklicht, aufweisen (PCT/US 00/08159). E.coli DSM 14459, E.coli JM109 und E.coli BW3110 wurden jeweils mit pOM21 und pOM22 transformiert und bezüglich Rhamnoseverbrauch und Aktivität verglichen (Fig. 1/4). Fig. 4 zeigt, dass der rekombinante Stamm DSM 14459 nicht nur gegenüber dem rekombinanten Ausgangstamm E. coli JM109 (pOM21, pOM22) sondern überraschenderweise auch gegenüber E. coli BW3110 (pOM21, pOM22) eine deutlich höhere Aktivität besitzt. Interessant in diesem Zusammenhang ist, dass für E. coli BW3110 berichtet wurde, dass die spezifische Aktivität eines gebildeten Enzyms im Rohextrakt um 15-25% unter der eines isogenen Stammes, der Rhamnose verbraucht, bleibt (Ein neues, L-Rhamnose-induzierbares Expressionssystem für Escherichia coli. Stumpp, T.; Wilms, B.; Altenbuchner, Biospektrum (2000), 1, 33-36.).

Einen weiteren Aspekt der Erfindung bildet die Tatsache, daß weitere Mutationen im Genom des erfindungsgemäßen Mikroorganismus zu Mutanten oder Varianten führen können, die weiter verbesserte Eigenschaften besitzen. Daher beinhaltet die vorliegende Erfindung ebenfalls die Verwendung des erfindungsgemäßen Mikroorganismus zur Herstellung von Mutanten oder Varianten des Mikroorganismus. Die Verfahren zur Einführung sind dem Fachmann hinlänglich bekannt (s. in dieser Schrift zitierte Lit.).

Der erfindungsgemäße Organismus kann mit allen dem Fachmann für diesen Zweck in Frage kommenden Vektoren transformiert werden. Die Konstruktion geeigneter Vektoren kann dem allgemeinen Fachwissen entnommen werden. Spezielle Strategien sind z. B in: One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Datsenko, Kirill A.; Wanner, Barry L. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2000), 97(12), 6640-6645; A genomebased approach for the identification of essential bacterial genes. Arigoni, Fabrizio; Talabot, Francois; Peitsch, Manuel; Edgerton, Michael D.; Meldrum, Eric; Allet, Elisabeth; Fish, Richard; Jamotte, Therese; Curchod, Marie-Laure; Loferer, Hannes. Nat. Biotechnol. (1998), 16(9), 851-856, beschrieben. Vorzugsweise werden die folgenden Vektoren zur erfindungsgemäßen Modifizierung der Mikroorganismen verwendet: pBrecA+, pMut1, pMut2. Ebenso umfasst von der Erfindung ist die Erzeugung einer Kombination eines recA-negativen und rhaB-negativen Phänotyps durch gezieltes Knockout von rhaB mit dem Fachmann bekannten Methoden unter Verwendung recA-positiver Stämme und anschließender Inaktivierung von recA.

Für die erfindungsgemäßen Anwendungen, z. B. zur Herstellung von Aminosäuren, können die betrachteten und erfindungsgemäß hergestellten rec-Enzyme in freier Form als homogen aufgereinigte Verbindungen verwendet werden. Weiterhin kann das rec-Enzym auch als Bestandteil des intakten Gastorganismus eingesetzt werden oder in Verbindung mit der aufgeschlossenen und beliebig hoch aufgereinigten Zellmasse des Wirtsorganismus. Möglich ist ebenfalls die Verwendung der Enzyme in immobilisierter Form (Bhavender P. Sharma, Lorraine F. Bailey and Ralph A. Messing, "Immobilisierte Biomaterialien - Techniken und Anwendungen", Angew. Chem. 1982, 94, 836-852). Vorteilhafterweise erfolgt die Immobilisierung durch Lyophilisation (Dordick et al., J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 5009-5010; Okahata et al., Tetrahedron Lett. 1997, 38, 1971-1974; Adlercreutz et al., Biocatalysis 1992, 6, 291-305). Ganz besonders bevorzugt ist die Lyophilisation in Gegenwart von oberflächenaktiven Substanzen, wie Aerosol OT oder Polyvinylpyrrolidon oder Polyethylenglycol (PEG) oder Brij 52 (Diethylenglycol-mono-cetylether) (Goto et al., Biotechnol. Techniques 1997, 11, 375-378). Die Verwendung als CLECs ist ebenfalls denkbar (St Clair et al., Angew Chem Int Ed Engl 2000 Jan, 39(2), 380-383).

Unter optisch angereicherten (enantiomerenangereicherten, enantiomer angereicherten) Verbindungen wird im Rahmen der Erfindung das Vorliegen einer optischen Antipode im Gemisch mit der anderen in > 50 mol-% verstanden.

Eine natürliche Aminosäure ist eine solche, wie in Beyer- Walter, Lehrbuch der organischen Chemie, S. Hirzel Verlag Stuttgart, 22. Auflage, 1991, S. 822f. dargestellt. Darüberhinaus sind jedoch auch entsprechende unnatürliche α-Aminosäuren angesprochen, wie z. B. in DE 199 03 268.8 aufgeführt.

Die in dieser Schrift genannten Literaturstellen gelten als von der Offenbarung mitumfaßt. SEQUENZPROTOKOLL

Beispiele 1. Verfahren zur Herstellung eines recA- und rhaB- E. colis 1.1 Präparation genomischer DNA aus E. coli JM109 und E. coli BL21 (DE3)

5 ml LB-Flüssigmedium wurden mit einer Kolonie beimpft und bei 37°C, 180 rpm, 16 Stunden inkubiert. Die Präparation genomischer DNA erfolgte mittels eines Kits (Cat# 6560-200) von Bio 101 (Vista, USA) gemäß des darin enthaltenen Protokols.

1.2 Amplifikation von recA aus genomischer DNA von E. coli BL21 (DE3) und rhaB aus genomischer DNA von E. coli JM109 mittels PCR PCR-Ansatz

Ca. 100 ng genomische DNA aus 1.1; jeweils 20 pmol primer recA+_01f (Seq ID 1) und primer recA+_01r (Seq. ID 2) für Amplifikation des recA Gens bzw. 20 µmol primer rhab_01f (Seq ID 3) und primer rhab_01r (Seq. ID 4) für Amplifikation des rhaB Gens; 2,5 U Hot Star Taq Polymerase (Qiagen, Germany); sonstige Bedingungen gem. Anleitung des Hot Star Taq Polymerase Kits von Qiagen (Germany). PCR-Zyklen 1 × (15 min 95°C)
30 × (30 s 95°C, 30 s 48°C, 60 s 72°C)
1 × (7 min 72°C)

Die Aufreinigung der PCR-Fragmente erfolgte mittels Min Elute PCR Purification Kit (Qiagen, Germany) gem. Anleitung.

1.3 Klonierung der rhaB und recA Fragmente in pUniBlunt/V5- His-TOPO (Konstruktion von pUnirecA+ und pRhaB)

Die Klonierung der aus 1.2 resultierenden PCR-Fragmente und Transformation der Ligationsprodukte in E. coli PIR1 erfolgte mittels des pUni/V5-His-TOPO Klonierungskits (Cat.#: ET004-xx) von Invitrogen (Carlsbad, USA) gemäß enthaltener Anleitung. Das aus rhaB und pUnißlunt/V5-His- TOPO resultierende Plasmid wird als pRhaB bezeichnet (Fig. 5) Das aus recA und pUniBlunt/V5-His-TOPO resultierende Plasmid wird als pUnirecA+ bezeichnet.

1.4 Kontruktion von pMut1 ausgehend von pRhaB

pRhaB wurde mit dem Restriktionsenzym ClaI von Roche (Deutschland) gem. beigefügter Anleitung geschnitten. Die überstehenden Enden des resultierende Vektorfragment wurden mit T4 DNA Polymerase von New England Biolabs (Frankfurt, Germany) gem. beigefügter Anleitung aufgefüllt.

1.5 Konstruktion von pMut2 ausgehend von pMut1

pMut1 wurde mit KpnI und BglII verdaut und mit Hilfe der T4 DNA Polymerase die überhängenden Enden aufgefüllt. Das ca. 2,6 kb große Fragment wurde mittels eines Qiagen Gel Extraction Kit aufgereinigt und mit einem RP4-Ori und R6K- ori tragenden DNA Fragments (Seq. ID 5) mit einer T4 DNA Ligase gem. Anleitung (s. o.) ligiert.

1.6 Herstellung eines recA-positiven E. coli JM109

E. coli 314109 wurde mit dem Plasmid pBrecA+ gem. eines Standardprotokolls transformiert (z. B. beschrieben in: Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.). Transformanten wurden auf einer LB-Agarplatte durch UV- Bestrahlung (254 nm, 40 cm Entfernung, 5-20 Sekunden) auf RecA-Aktivität getestet. Positive (recA-aktive) Klone zeigten bei ansteigender Bestrahlungsdauer im Gegensatz zu E. coli JM109 Wildtyp noch deutliches Wachstum. recA- positive Klone werden als E. coli JM109 + pBrecA+ bezeichnet.

1.7 Konjugativer Transfer des Mutagenesekonstruktes pMut2 und Screening nach rhaB-negativem Phänotyp

2 ml stationärer Kulturen von E. coli S17-1 (λpir), welche mit pMut2 gem. Standardprotokoll (s. o.) transformiert wurden, und E. coli JM109 + pBrecA+ wurden durch Zentrifugation geerntet und 3× mit LB-Medium gewaschen. Nach Resuspendierung der jeweiligen Zellen wurden diese gemischt und für 16 h auf LB-Platten bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen von der Platte abgeschwemmt und auf LB-Kan, Tet-Platten ausplattiert. Nach 16-24 Stunden waren Transkonjuganten sichtbar, bei welchen das Mutagenesekonstrukt ins Chromosom integriert worden ist. Ca. 25% der Transkonjuganten waren bei Plattierung auf MacConkey-Rhamnose-Agar-Platten (Zusammensetzung in g/Liter: Pepton 20.0; NaCl 5.0; Gallensalz 1.5; Rhamnose 10.0; Crystall Violet 0.001; Neutral Rot 0.03; Agar-Agar 15.0) weiß und zeigten damit einen rhaB-negativen Phänotyp.

1.8 Anreicherung eines Tetrazyklin-sensiblen, recA- negativen Phänotyps

Die in 1.7 erzeugten rhaB-negativen Klone haben durch das Plasmid pBrecA+ einen recA-positiven Phänotyp. Um nun recA- negative Zellen zu erhalten wurden die in 1.7 erhaltene rhaB-negative Klone ohne Selektionsdruck für die durch das Plasmid pBrecA-vermittelte Tetrazyklinresistenz über mehrere Generationen unter Zusatz von Tetrazyklin (12,5 µg/ml) und Ampicillin (100 µg/ml) kultiviert. (Anmerkung: Durch diese negative Selektion können nur Zellen überleben, welche das Plasmid pBrecA+ verloren haben.) Nach Ernte der Zellen und dreimaligem Waschen mit LB-Medium wurden die Zellen auf LB-Agar aufgebracht und 16 Stunden bei 37°C bebrütet. Der Verlust von pBrecA+ der gewachsenen Klone konnte anschließend durch Tetrazyklin-Sensibilität und UV- Bestrahlung zum Nachweis des recA-negativen Phänotyps analog zum Vorgehen in 1.6 bestätigt werden. Somit konnten E. coli Klone mit recA-negativen und rhaB-negativen Phänotyp, wie beispielsweise E. coli DSM 14459, erzeugt werden.

2. Bestimmung der Enzymaktivität von Ganzzellbiokatalysatoren (siehe Fig. 4)

Zusammensetzung von Wachstumsmedium:
10 g/l Trypton
5 g/l Hefeextrakt
10 g/l NaCl
100 mg/l Ampicillin
50 mg/l Chloramphenicol
2 g/l Rhamnose
1 mM CoCl2
Zusammensetzung von Reaktionslösung:
100 mM DL-Methylthioethylhydantoin (MTEH)
0.1 mM CoCl2
pH 7.8

Übernachtkulturen von E. coli DSM 14459 (pOM21, pOM22), E. coli JM109 (pOM21, pOM22) und E. coli BW3110 (pOM21, pOM22) wurden 1 : 100 in 20 ml Wachstumsmedium verdünnt und bei 30°C mit 250 rpm inkubiert. Das Wachstum wurde über 24 h verfolgt. Nach ca. 24 h wurde eine optische Dichte gemessen bei 600 nm (OD600) von 4 erreicht und die Zellen mittels Zentrifugation (5 min, 15.000 g) pelletiert. Die jeweiligen Zellpellets wurden anschliessend in der Reaktionslösung so suspendiert, dass sich eine OD600 von 10 ergab und sofort bei 37°C, 1000 rpm, für 10 Minuten inkubiert. Im Anschluss daran wurde die Reaktion durch Zugabe von HPLC-Laufmittel (s. u.) gestoppt und die Zellen mittels Zentrifugation (5 min, 15.000 g) vom Reaktionsüberstand abgetrennt. Im Reaktionsüberstand wurde mittels HPLC (s. u.) die gebildete Konzentration an Methionin bestimmt und der prozentuale Umsatz (mol/mol) berechnet.
HPLC-Methode:
Säule: RP-18 (Waters)
HPLC-Laufmittel: 985 ml H2O, 15 ml Acetonitril, 1 ml Trifluoressigsäure
Fluss: 1 ml/min
Detektion: 220 nm

3. Bestimmung des Rhamnoseverbrauchs (siehe Fig. 1)

Übernachtkulturen von E. coli DSM 14459 (pOM21, pOM22), E. coli JM109 (pOM21, pOM22) und E. coli BW3110 (pOM21, pOM22) wurden 1 : 100 in 20 ml Wachstumsmedium verdünnt und bei 30°C mit 250 rpm inkubiert. Das Wachstum wurde über 24 h verfolgt. Nach ca. 24 h wurde eine optische Dichte gemessen bei 600 nm (OD600) von 4 erreicht und die Zellen mittels Zentrifugation (5 min, 15.000 g) pelletiert. Der Überstand wurde mittels HPLC auf Rhamnosegehalt analysiert.
HPLC-Methode:
Säule: Aminex HPX-87 H (BioRad)
HPLC-Laufmittel: 5 mM H2SO4
Fluss: 0.6 ml/min
Detektion: Brechungsindex (RI-Detektor)

Claims

1. Mikroorganismus aufweisend eine Rekombinationsdefizienz (recA-) und eine durch eine Deletion des rhaB-Gens erfolgte Defizienz im Abbau von Rhamnose (rhaB-).

2. Mikroorganismus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um E. coli handelt.

3. Mikroorganismus nach Anspruch 1 und 2 hinterlegt unter der Nummer DSM 14459

4. Mikroorganismus gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3 aufweisend mindestens ein rhamnoseinduzierbares Expressionssystem.

5. Verfahren zur Herstellung von Mikroorganismen nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Mutagenesekonstrukt zur Inaktivierung des Rhamnulokinase-Gens konjugativ in den rekombinationsaktiven Mikroorgansimus transferiert und nach erfolgreicher Integration die Rekombinationsaktivität gezielt ausschaltet.

6. Verfahren nach Anspruch 5 dadurch gekennzeichnet, daß man die Konjugationszeit auf ≤ 30 min einstellt.

7. Verwendung des Mikroorganismus nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4 in einem Verfahren zur Herstellung von rec-Proteinen.

8. Verwendung nach Anspruch 7 dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus ein rec-Protein mit der Eigenschaft einer Hydantoinase, einer Carbamoylase und/oder einer Hydantoin- oder Carbamoylracemase aufweist.

9. Verwendung des Mikroorganismus nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung von Mutanten oder Varianten des Mikroorganismus.

10. Plasmid pBrecA+, pMut1, pMut2.