DE10155053B4 - Reversible binding of a fluorophore to a surface to detect ligate-ligand association events by fluorescence quenching - Google Patents
Reversible binding of a fluorophore to a surface to detect ligate-ligand association events by fluorescence quenching Download PDFInfo
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Abstract
Verfahren
zur Detektion von Ligat-Ligand-Assoziationsereignissen durch Fluoreszenz-Quenchen
umfassend die Schritte
a) Bereitstellen einer modifizierten
Oberfläche,
wobei die Modifikation in der Anbindung wenigstens einer Art von
modifizierten Ligaten (201) besteht und wobei die Ligaten (201)
durch Anbindung wenigstens einer Art von Fluorophor (102) modifiziert
sind, wobei der Fluorophor mit der modifizierten Oberfläche eine
reversible Bindung eingeht,
b) Bereitstellen einer Probe mit
Liganden,
c) Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten
Oberfläche,
d)
Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors (102),
e) Vergleich
der in Schritt d) detektierten Fluoreszenzintensität mit Referenzwerten.A method of detecting ligate-ligand association events by fluorescence quenching comprising the steps
a) providing a modified surface, wherein the modification consists in the attachment of at least one type of modified ligate (201) and wherein the ligates (201) are modified by attachment of at least one type of fluorophore (102), the fluorophore having the modified surface a reversible bond is received,
b) providing a sample with ligands,
c) contacting the sample with the modified surface,
d) detection of the fluorescence of the fluorophore (102),
e) Comparison of the fluorescence intensity detected in step d) with reference values.
Description
Technisches Gebiettechnical area
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von Ligat-Ligand-Assoziationsereignissen durch Fluoreszenz-Quenchen.The The present invention relates to a method for detecting ligate-ligand association events by fluorescence quenching.
In der Krankheitsdiagnose, bei toxikologischen Testverfahren, in der genetischen Forschung und Entwicklung, sowie auf dem Agrar- und pharmazeutischen Sektor werden Immunoassays und zunehmend auch die Sequenzanalyse von DNA und RNA eingesetzt. Neben den bekannten seriellen Verfahren mit autoradiographischer oder optischer Detektion finden zunehmend parallele Detektionsverfahren mittels Array-Technologie, sogenannten DNA- oder Protein-Chips, Verwendung. Auch bei diesen parallelen Verfahren beruht die Detektion auf optischen, radiographischen, massenspektrometrischen oder elektrochemischen Methoden.In the disease diagnosis, in toxicological tests, in the genetic research and development, as well as on the agricultural and In the pharmaceutical sector, immunoassays and increasingly also the Sequence analysis of DNA and RNA used. In addition to the well-known serial Find methods with autoradiographic or optical detection increasingly parallel detection methods using array technology, so-called DNA or protein chips, use. Even with these parallel Method, the detection is based on optical, radiographic, Mass spectrometric or electrochemical methods.
Zur Genanalyse auf einem Chip wird auf einer Oberfläche eine Bibliothek bekannter DNA-Sequenzen ("Sonden-Oligonukleotide") in einem geordneten Raster fixiert, so dass die Position jeder individuellen DNA-Sequenz bekannt ist. In der Untersuchungslösung anwesende Fragmente aktiver Gene ("Target-Oligonukleotide"), deren Sequenzen zu bestimmten Sonden-Oligonukleotiden auf dem Chip komplementär sind, können durch Nachweis der entsprechenden Hybridisierungsereignisse auf dem Chip identifiziert werden. Im Allgemeinen erfolgt die Analyse über optische (oder autoradiographische) Detektionsverfahren unter Verwendung von Target-Oligonukleotiden, die mit einem Radiolabel (z. B. 32P) oder einem Fluoreszenzfarbstoff (z. B. Fluorescein, Cy3 oder Cy5) markiert sind. Die Verwendung von Fluoreszenzlabel und entsprechenden Fluoreszenz-Scannern überwiegt dabei zunehmend die Anwendung von Radiolabel. Die zur Zeit auf dem Markt erhältlichen Fluoreszenz-Scanner ermöglichen den Nachweis von Fluorophoren im Subattomol-Bereich.For gene analysis on a chip, a library of known DNA sequences ("probe oligonucleotides") is fixed in an ordered grid on a surface so that the position of each individual DNA sequence is known. Fragments of active genes ("target oligonucleotides") present in the assay solution whose sequences are complementary to particular probe oligonucleotides on the chip can be identified by detection of the corresponding on-chip hybridization events. In general, analysis is by optical (or autoradiographic) detection methods using target oligonucleotides labeled with a radiolabel (e.g., 32 P) or a fluorescent dye (e.g., fluorescein, Cy3, or Cy5). The use of fluorescent labels and corresponding fluorescence scanners is increasingly outweighing the use of radiolabel. The fluorescence scanners currently available on the market enable the detection of fluorophores in the subattomol range.
Die Verwendung von markierten Targets zum Nachweis von Hybridisierungsereignissen beinhaltet jedoch einige Nachteile. Zum einen muss die Markierung vor der eigentlichen Messung erfolgen, was einen zusätzlichen Syntheseschritt und damit zusätzlichen Arbeitsaufwand bedeutet. Zudem ist es schwierig, eine homogene Markierung des Probenmaterials zu gewährleisten. Außerdem sind stringente Waschbedingungen notwendig, um im Anschluss an eine Hybridisierung nicht oder unspezifisch gebundenes Material zu entfernen.The Use of labeled targets to detect hybridization events but includes some disadvantages. For one, the mark must done before the actual measurement, giving an extra Synthesis step and thus additional Labor costs means. In addition, it is difficult to make a homogeneous mark to ensure the sample material. Furthermore stringent washing conditions are necessary to follow a Hybridization to remove or unspecifically bound material.
Sowohl für die Protein- als auch für die DNA-Analyse ist es daher wünschenswert und für den Anwender vorteilhaft, wenn die Targets (Antikörper bzw. Antigen oder DNA-Fragment) nicht mit einem Detektionslabel modifiziert werden müssen und nach der Hybridisierung keine komplizierten Waschschritte notwendig sind.Either for the Protein as well as for the DNA analysis is therefore desirable and for advantageous to the user when the targets (antibody or Antigen or DNA fragment) do not need to be modified with a detection label and after the hybridization no complicated washing steps necessary are.
Die Nachteile der Markierung des Probenmaterials mit radioaktiven Elementen oder Fluoreszenzfarbstoffen können umgangen werden, wenn an Stelle der Targets die Sondenmoleküle mit entsprechenden Fluoreszenzfarbstoffen markiert werden. Nach diesem Prinzip funktionieren die sogenannten molekularen Leuchten (molecular beacons). Diese einsträngigen Oligonukleotide weisen eine Haarnadelstruktur (hairpin, stem-and-loop) auf und tragen am einen Ende der Sequenz einen Fluorophor (z. B. Fluorescein, TexasRed®) und am anderen Ende der Sequenz einen geeigneten Fluoreszenzlöscher (z. B. DABCYL). Durch die spezielle geometrische Anordnung befinden sich die fluoreszierende Gruppe und die Einheit, die zur Löschung der Fluoreszenz führt, in räumlicher Nähe zueinander. Daher zeigen die Sonden nur eine äußerst geringe Fluoreszenz. In Gegenwart der entsprechenden zur Sequenz der Schlinge (loop) komplementären Sequenz (Target) erfolgt die Hybridisierung in diesem Bereich. Dies führt zu einer Änderung der Konformation und zur Trennung von Fluorophor und Quencher, was als starke Zunahme der Fluoreszenz beobachtet werden kann.The disadvantages of labeling the sample material with radioactive elements or fluorescent dyes can be circumvented if, instead of the targets, the probe molecules are labeled with appropriate fluorescent dyes. According to this principle, the so-called molecular beacons function. This single-stranded oligonucleotides have a hairpin structure (hairpin, stem-and-loop) and bear at one end of the sequence a fluorophore (eg., Fluorescein, Texas Red ®) and at the other end of the sequence for a suitable quencher (. B. DABCYL ). Due to the special geometric arrangement, the fluorescent group and the unit, which leads to the quenching of the fluorescence, are in spatial proximity to each other. Therefore, the probes show only a very low fluorescence. In the presence of the corresponding to the sequence of the loop (loop) complementary sequence (target), the hybridization takes place in this area. This leads to a change in conformation and separation of fluorophore and quencher, which can be observed as a large increase in fluorescence.
Neben organischen Molekülen (wie DABCYL) werden auch Gold-Nanopartikel als effiziente Quencher eingesetzt (vgl. Nature Biotech. Vol. 19, 2001, Seite 365). Das Quenchen der Fluoreszenz durch Metalle beruht primär auf einem strahlungslosen Energietransfer vom Farbstoffmolekül zum Metall. Durch die Verwendung von Gold-Nanopartikeln wird eine größere Sensitivität beobachtet als bei organischen Quenchern. Außerdem werden Farbstoffe bis in den nahen Infrarot-Bereich effizient gequencht. Ein Nachteil dieser Methode liegt allerdings darin, dass Gold-Nanopartikel bei Temperaturen über 50°C nicht mehr stabil sind. Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass diese Methode auf die Untersuchung von Lösungen beschränkt ist und daher nur wenige Sequenzen zur gleichen Zeit untersucht werden können, der Parallelisierungsgrad dieses Ansatzes also gering ist.Next organic molecules Like DABCYL, gold nanoparticles are also used as efficient quenchers (see Nature Biotech, Vol. 19, 2001, page 365). The quenching of Fluorescence through metals is primarily based on a nonradiative Energy transfer from the dye molecule to the metal. By the use of Gold nanoparticles a greater sensitivity is observed as with organic quenchers. In addition, dyes are up efficiently quenched in the near infrared range. A disadvantage However, this method lies in the fact that gold nanoparticles at Temperatures above 50 ° C not are more stable. Another disadvantage is that these Method is limited to the study of solutions and therefore only a few sequences are studied at the same time can, the degree of parallelization of this approach is therefore low.
Obwohl es also viele Detektionsmöglichkeiten für Ligat-Ligand-Assoziate gibt, ist der Bedarf an einfachen, kostengünstigen, problemlos durchzuführenden und verlässlichen Detektionsprinzipien vor allem im Bereich der weniger dichten Array-Technologien (DNA- und Protein-Chips mit wenigen einzelnen bzw. bis zu mehreren hunderttausend Test-sites pro cm2 z. B. für sogenannte POC (Point of Care)- Systeme bzw. für high throughput screening – HTS – Systeme) hoch.Thus, while there are many detection possibilities for ligate-ligand associates, the need for simple chen, inexpensive, easy to perform and reliable detection principles, especially in the field of less dense array technologies (DNA and protein chips with a few individual or up to several hundred thousand test sites per cm 2 z., For example, for so-called POC (Point of care) systems or for high throughput screening HTS systems).
Darstellung der Erfindungpresentation the invention
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, ein Verfahren zur Detektion von Ligat-Ligand-Assoziationsereignissen durch Fluoreszenz-Quenchen zu schaffen, welches die Nachteile des Standes der Technik nicht aufweist.task Therefore, the present invention is a method for detection ligate-ligand association events by fluorescence quenching which does not have the disadvantages of the prior art having.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das Verfahren gemäß unabhängigem Patentanspruch 1 und dem Kit gemäß unabhängigem Patentanspruch 26 gelöst.These Task is achieved by the method according to independent claim 1 and the kit according to independent claim 26 solved.
Weitere vorteilhafte Details, Aspekte und Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen, der Beschreibung, den Figuren und den Beispielen.Further advantageous details, aspects and embodiments of the present invention Invention will be apparent from the dependent claims, the Description, figures and examples.
Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Abkürzungen
und Begriffe benutzt: Genetik 
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von Ligat-Ligand-Assoziationsereignissen durch Fluoreszenz-Quenchen, das als ersten Schritt das Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche umfasst. Die Modifikation der Oberfläche besteht dabei in der Anbindung wenigstens einer Art von modifizierten Ligaten, wobei die Ligaten durch Anbindung wenigstens einer Art von Fluorophor modifiziert sind, wobei der Fluorophor mit der modifizierten Oberfläche eine reversible Bindung eingeht. Die weiteren Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Bereitstellen einer Probe mit Liganden, Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche, Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors und Vergleich der detektierten Fluoreszenzintensität mit Referenzwerten.The The present invention relates to a method for detecting ligate-ligand association events by fluorescence quenching, providing the first step a modified surface includes. The modification of the surface consists in the connection at least one type of modified ligate, wherein the ligates modified by attachment of at least one type of fluorophore wherein the fluorophore having the modified surface is a reversible binding. The further steps of the method according to the invention are providing a sample with ligands, contacting the Sample with the modified surface, detection of fluorescence of the fluorophore and comparison of the detected fluorescence intensity with reference values.
Daneben umfasst die vorliegende Erfindung auch einen Kit zur Durchführung eines Verfahrens zur Detektion von Ligat-Ligand-Assoziationsereignissen durch Fluoreszenz-Quenchen. Der Kit umfasst eine modifizierte Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung wenigstens einer Art von modifizierten Ligaten besteht, wobei die Ligaten durch Anbindung wenigstens einer Art von Fluorophor modifiziert sind und wobei der Fluorophor durch Anbindung wenigstens einer chemischen Gruppe modifiziert ist, die mit der modifizierten Oberfläche eine reversible Bindung eingeht.Besides The present invention also includes a kit for carrying out a Method for detecting ligate-ligand association events by fluorescence quenching. The kit includes a modified surface, the modification in the attachment of at least one type of modified ligate exists, wherein the ligates by binding at least one kind are modified by fluorophore and wherein the fluorophore by binding at least one chemical group is modified with the modified surface a reversible bond is received.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren ist ein Vergleich der detektierten Fluoreszenzintensität mit Referenzwerten erforderlich. Diese Referenzwerte können aus vorangegangenen Messungen bereits vorliegen und brauchen daher im allgemeinsten Fall nicht im Laufe des erfindungsgemäßen Verfahrens detektiert werden. Da die Referenzwerte aber im Idealfall unter exakt den gleichen äußeren Bedingungen bestimmt werden sollen wie die eigentlichen Messwerte der Fluoreszenzintensitäten, wird gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung vor dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche eine erste Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors durchgeführt. Die so erhaltenen Werte werden dann als Referenzwerte verwendet.In the method according to the invention is a comparison of the detected fluorescence intensity with reference values required. These reference values can be obtained from previous measurements already exist and therefore do not need in the most general case in the course of the process according to the invention be detected. As the reference values are ideally under exactly the same external conditions be determined as the actual measurements of the fluorescence intensities, is according to a preferred embodiment of the present invention prior to contacting the sample with the modified surface one first detection of the fluorescence of the fluorophore performed. The values thus obtained are then used as reference values.
Alternativ können die Referenzwerte auch gleichzeitig mit den Messwerten der Fluoreszenzintensität bestimmt werden, also nach dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche. Dies kann auf zwei verschiedene Arten erfolgen. Entweder ist ein Bereich der modifizierten Oberfläche bekannt, der im wesentlichen keine Liganden trägt, oder es ist ein Bereich der modifizierten Oberfläche bekannt, der im wesentlichen ausschließlich Ligand/Ligat-Assoziate trägt. Es muss also im ersten Fall sichergestellt sein, dass in der Probe keinerlei Liganden anwesend sind, die mit den in dem besagten Bereich der modifizierten Oberfläche anwesenden Ligaten Ligat/Ligand-Assoziate ausbilden können. Im zweiten Fall muss umgekehrt sichergestellt sein, dass in der Probe eine ausreichende Menge an Liganden vorhanden sind, die mit im wesentlichen der ganzen Menge an in dem definierten Bereich anwesenden Ligaten Ligand/Ligat-Assoziate ausbilden. Die auf diese beiden Arten bestimmten Referenzwerte spiegeln die Fluoreszenzintensität bei 0% Assoziatbildung bzw. bei 100% Assoziatbildung wieder und können zur quantitativen Bestimmung der Assoziatbildung in den anderen Bereichen der modifizierten Oberfläche dienen.alternative can the reference values are also determined simultaneously with the measured values of the fluorescence intensity So after contacting the sample with the modified Surface. This can be done in two different ways. Either one is Area of modified surface known, which carries substantially no ligands, or it is an area the modified surface known, consisting essentially exclusively ligand / ligate associates wearing. It must therefore be ensured in the first case that in the sample no ligands are present with those in the said region the modified surface present Ligate ligate / ligand associates can form. In the second case must on the contrary, ensure that there is sufficient Amount of ligands that are present with substantially the whole Amount of ligate ligand / ligate associates present in the defined region form. Reflect the reference values determined in these two ways the fluorescence intensity at 0% associate formation or at 100% associative education again and can for the quantitative determination of associate formation in the others Serve areas of the modified surface.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die beiden beschriebenen Referenzmessungen durchgeführt. Es wird also nach dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche sowohl die Fluoreszenzintensität in einem Bereich der modifizierten Oberfläche bestimmt, der im wesentlichen keine Liganden trägt, als auch in einem Bereich der modifizierten Oberfläche, der im wesentlichen ausschließlich Ligand/Ligat-Assoziate trägt. Durch die Bestimmung der beiden Extremwerte ist eine quantitative Detektion mit höherer Genauigkeit erforderlich. Es versteht sich, dass in diesem Fall sich die Ligaten des ersten Bereiches von den Ligaten des zweiten Bereiches unterscheiden müssen.According to one particularly preferred embodiment The present invention describes the two described reference measurements carried out. So it is after contacting the sample with the modified surface both the fluorescence intensity determined in a region of the modified surface, which is substantially does not carry any ligands, as well as in a modified surface area, in the essentially exclusively Ligand / ligate associates. By determining the two extreme values is a quantitative Detection with higher Accuracy required. It is understood that in this case The ligates of the first area of the ligates of the second Range must differ.
Sind an dem Fluorophor in seiner unmodifizierten Form keine Gruppen vorhanden, die mit der modifizierten Oberfläche eine ausreichende Bindungsfähigkeit aufweisen, so können auch modifizierte Fluorophore in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden also Fluorophore verwendet, die durch Anbindung wenigstens einer chemischen Gruppe modifiziert sind, wobei die chemische Gruppe mit der modifizierten Oberfläche eine reversible Bindung eingeht.are there are no groups on the fluorophore in its unmodified form, those with the modified surface a sufficient binding ability have, so can also modified fluorophores in the process according to the invention be used. According to one preferred embodiment Thus, fluorophores are used, which by binding at least a chemical group are modified, the chemical group with the modified surface a reversible bond is received.
Eine chemische Gruppe, die mit der modifizierten Oberfläche eine reversible Bindung eingeht, kann nicht nur direkt an den Fluorophor angebunden werden, sondern auch an den Ligaten. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Ligaten verwendet, die zusätzlich durch Anbindung wenigstens einer chemischen Gruppe modifiziert sind, wobei die chemische Gruppe mit der modifizierten Oberfläche eine reversible Bindung eingeht. Besonders günstige Bedingungen zur Detektion der Differenz der Fluoreszenzintensität von Ligand/Ligat-Assoziaten und Ligaten bestehen dann, wenn der Fluorophor sich möglichst nahe an der modifizierten Oberfläche befindet. Diese Bedingung ist insbesondere dann erfüllt, wenn Ligaten verwendet werden, die zusätzlich durch Anbindung wenigstens einer chemische Gruppe modifiziert sind, wobei die chemische Gruppe mit der modifizierten Oberfläche eine reversible Bindung eingeht und die chemische Gruppe maximal durch 10 chemische Bindungen von dem Fluorophor getrennt ist. In diesem Fall befindet sich die chemische Gruppe also in räumlicher Nähe zu dem Fluorophor, womit sich wiederum nach Ausbildung der reversiblen Bindung zwischen chemischer Gruppe und modifizierter Oberfläche der Fluorophor in räumlicher Nähe zu der modifizierten Oberfläche befindet.A chemical group that reversibly binds to the modified surface can not only be attached directly to the fluorophore, but also to the ligates. According to a preferred embodiment of the present invention, ligates are used which are additionally modified by attachment of at least one chemical group, the chemical group reversibly binding with the modified surface. Particularly favorable conditions for detecting the difference in the fluorescence intensity of ligand / ligate associates and ligates exist when the fluorophore is as close as possible to the modified surface. This condition is fulfilled in particular when ligates are used which are additionally modified by attachment of at least one chemical group, wherein the chemical group reversibly binds to the modified surface and the chemical group is separated by a maximum of 10 chemical bonds from the fluorophore. In this case, the chemical group is thus in close proximity to the fluorophore, which in turn, after formation of the reversible bond between chemical group and modified surface of the fluorophore is in spatial proximity to the modified surface.
Besonders günstige Bedingungen sind dann zu erwarten, wenn die modifizierte Oberfläche zusätzlich durch Anbindung von chemischen Gruppen modifiziert ist und zugleich die Ligaten mit chemischen Gruppen modifiziert sind, weil dann die an die Oberfläche gebundenen chemischen Gruppen mit den an den Ligaten angebundenen chemischen Gruppen eine reversible Bindung eingehen können.Especially favorable Conditions are to be expected if the modified surface is additionally replaced by Connection of chemical groups is modified and at the same time the Ligates are modified with chemical groups, because then the at the surface bound chemical groups with those attached to the ligates chemical groups can undergo a reversible bond.
Die Quench-OberflächeThe quench surface
Mit dem Begriff "Oberfläche" wird jedes Trägermaterial bezeichnet, das geeignet ist, direkt oder nach entsprechender chemischer Modifizierung Fluorophor-derivatisierte Ligaten zu tragen, die kovalent an der Oberfläche immobilisiert sind und deren Fluoreszenz nahe an der Oberfläche (in ca. 1 bis 50 Angstrom Abstand zur Oberfläche) durch Fluoreszenzlöschung (strahlungsloser Energietransfer zwischen dem Fluorophor als Emitter und der Oberfläche als Absorber) signifikant ( > 10% der erwarteten Fluoreszenzintensität des Fluorophors in Abwesenheit der Oberfläche bei ansonsten gleichen Bedingungen) reduziert wird. Insbesondere sind Gold und Silber als Quench-Oberflächenmaterial geeignet. Die Bezeichnung Oberfläche ist unabhängig von den räumlichen Dimensionen der Oberfläche und beinhaltet auch Nanopartikel (Partikel oder Cluster aus wenigen einzelnen bis mehreren hunderttausend Oberflächen-Atomen oder -Molekülen). Die Oberfläche kann zusätzlich an einen festen Träger wie z. B. Glas, Metall oder Plastik gebunden vorliegen.With The term "surface" is any carrier material which is suitable, directly or after appropriate chemical Modification To carry fluorophore-derivatized ligates that are covalent on the surface are immobilized and their fluorescence is close to the surface (in about 1 to 50 Angstrom distance to the surface) by fluorescence quenching (radiationless Energy transfer between the fluorophore as emitter and the surface as Absorber) significantly (> 10% the expected fluorescence intensity of the fluorophore in the absence the surface under otherwise identical conditions) is reduced. In particular are Gold and silver as quench surface material suitable. The term surface is independent of the spatial Dimensions of the surface and also includes nanoparticles (particles or clusters of a few single to several hundred thousand surface atoms or molecules). The surface can additionally to a solid support such as As glass, metal or plastic bound.
Bindung des Ligaten an die OberflächeBinding of the Ligates to the surface
Verfahren zur Immobilisierung von Ligat-Molekülen, insbesondere Biopolymeren wie Nukleinsäure-Oligomeren oder Antigenen bzw. Antikörpern an einer Oberfläche sind dem Fachmann bekannt. Die Immobilisierung kann z. B. kovalent über Hydroxyl-, Epoxid-, Amino-, oder Carboxygruppen des Trägermaterials mit natürlicherweise am Ligat vorhandenen oder durch Derivatisierung am Ligat angebrachten Thiol-, Hydroxy-, Amino- oder Carboxylgruppen erfolgen. Der Ligat kann direkt oder über einen Linker/Spacer mit den Oberflächenatomen oder -molekülen einer Oberfläche verbunden werden. Daneben kann der Ligat durch die bei Immunoassays üblichen Methoden verankert werden wie z. B. durch Verwendung von biotinylierten Ligaten zur nichtkovalenten Immobilisierung an Avidin oder Streptavidin-modifizierten Oberflächen. Bei Verwendung von Nukleinsäure-Oligomeren als Ligaten kann die chemische Modifikation der Sonden-Nukleinsäure-Oligomere mit einer Oberflächen-Ankergruppe bereits im Verlauf der automatisierten Festphasensynthese oder aber in gesonderten Reaktionsschritten eingeführt werden. Dabei wird auch das Nukleinsäure-Oligomer direkt oder über einen Linker/Spacer mit den Oberflächenatomen oder -molekülen einer Oberfläche der oben beschriebenen Art verknüpft. Diese Bindung kann auf verschiedene, aus dem Stand der Technik bekannten Arten durchgeführt werden (vgl. z. B. Hartwich, G.: ELEKTROCHEMISCHE DETEKTION VON SEQUENZSPEZIFISCHEN NUKLEINSÄUREOLIGOMERHYBRIDISIERUNGSEREIGNISSEN (1999), WO 00/42217).method for the immobilization of ligate molecules, in particular biopolymers such as nucleic acid oligomers or antigens or antibodies on a surface are known in the art. The immobilization may, for. Covalently via hydroxyl, Epoxide, amino, or carboxy groups of the support material with naturally present on the ligate or attached by derivatization on the ligate Thiol, hydroxy, amino or carboxyl groups take place. The ligate can be direct or via a linker / spacer with the surface atoms or molecules of a surface get connected. In addition, the ligate can by the usual in immunoassays Methods are anchored such. B. by using biotinylated Ligates for noncovalent immobilization on avidin or streptavidin-modified Surfaces. When using nucleic acid oligomers as ligates, the chemical modification of the probe nucleic acid oligomers with a surface anchor group already in the course of automated solid-phase synthesis or else be introduced in separate reaction steps. It will also the nucleic acid oligomer directly or via a linker / spacer with the surface atoms or molecules of a surface linked to the type described above. This bond can be based on various known from the prior art Species performed (see, for example, Hartwich, G .: ELECTROCHEMICAL DETECTION OF SEQUENCE-SPECIFIC NUCLEIC ACID OLIGOMER HYBRIDIZATION EVENTS (1999), WO 00/42217).
Liganden (Targets)Ligands (targets)
Als Liganden werden Moleküle bezeichnet, die spezifisch mit dem an einer Oberfläche immobilisierten Ligaten (Sonde) unter Ausbildung eines Komplexes wechselwirken. Beispiele von Liganden im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Substrate, Cofaktoren oder Coenzyme als Komplexbindungspartner eines Proteins (Enzyms), Antikörper (als Komplexbindungspartner eines Antigens), Antigene (als Komplexbindungspartner eines Antikörpers), Rezeptoren (als Komplexbindungspartner eines Hormons), Hormone (als Komplexbindungspartner eines Rezeptors) oder Nukleinsäure-Oligomere (als Komplexbindungspartner des komplementären Nukleinsäure-Oligomers).When Ligands become molecules designated specifically with the ligate immobilized on a surface (Probe) interact to form a complex. Examples of ligands in the sense of the present invention are substrates, Cofactors or coenzymes as complex binding partner of a protein (enzyme), antibody (as a complex binding partner of an antigen), antigens (as a complex binding partner of a Antibody) Receptors (as a complex binding partner of a hormone), hormones (as Complex binding partner of a receptor) or nucleic acid oligomers (as a complex binding partner of the complementary nucleic acid oligomer).
Fluorophorefluorophores
Als Fluorophore werden kommerziell erhältliche Fluoreszenzfarbstoffe wie z. B. Texas Red®, Rhodamin-Farbstoffe, Cyaninfarbstoffe wie z. B. Cy3TM, Cy5TM, Fluorescein etc (vgl. Fluka, Amersham und Molecular Probes Katalog) verwendet.As fluorophores are commercially available fluorescent dyes such. As Texas Red ® , rhodamine dyes, cyanine dyes such. Cy3 ™ , Cy5 ™ , fluorescein etc (see Fluka, Amersham and Molecular Probes catalog).
Fluoreszenzlöschungfluorescence quenching
Mit Fluoreszenzlöschung wird die Deaktivierung einer elektronisch angeregten Spezies über einen strahlungslosen Prozess bezeichnet. Die Deaktivierung kann durch Stöße oder auch durch strahlungslose Energieübertragung auf Metalle erfolgen. Die freiwerdende Energie wird als thermische Energie dissipiert. Gold ist ein Beispiel für ein Metall, das die Fähigkeit zur Fluoreszenzlöschung besitzt. Die Löschung weist eine starke Abhängigkeit vom Abstand des Fluorophors von der als Fluoreszenzlöscher fungierenden Oberfläche auf (umgekehrt proportional zur sechsten Potenz des Abstands). Der Effekt der Fluoreszenzlöschung ist daher nur bei Abständen kleiner 100 bis 200 Å messbar. Im Bereich größer als ca. 200 Å führen weitere Abstandsänderungen nicht mehr zu einer messbaren Erhöhung der Fluoreszenzintensität.With fluorescence quenching The deactivation of an electronically excited species is via a radiationless Process called. The deactivation can be caused by impacts or also by non-radiative energy transfer to metals. The released energy is dissipated as thermal energy. Gold is an example of a metal that has the ability for fluorescence quenching has. The deletion has a strong dependence from the distance of the fluorophore from that acting as a fluorescence quencher surface on (inversely proportional to the sixth power of the distance). Of the Effect of fluorescence quenching is therefore only at intervals less than 100 to 200 Å measurable. In the area larger than about 200 Å lead more changes in distance no longer a measurable increase in fluorescence intensity.
Kurze Beschreibung der ZeichnungenShort description the drawings
Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen im Zusammenhang mit den Zeichnungen näher erläutert werden. Es zeigenThe Invention is intended below with reference to embodiments in connection closer with the drawings explained become. Show it
- 101101
- Sonde in Form einer Haarnadel ("hairpin")probe in the form of a hairpin
- 102102
- Fluorophorfluorophore
- 103103
- Fluoreszenz-LöscherFluorescence quenchers
- 104104
- Targettarget
- 105105
- Fluoreszenzlöschungfluorescence quenching
- 106106
- Fluoreszenzfluorescence
- 201201
- einsträngige Oligomer-Sondesingle-stranded oligomer probe
- 202202
- Sonde hybridisiert mit Targetprobe hybridizes with target
- 203203
- Oberfläche (z. B. Gold)Surface (z. Gold)
- 204204
- Abstand des Fluorophor zur Goldoberfläche vor der Hybridisierungdistance of the fluorophore to the gold surface before hybridization
- 205205
- Abstand des Fluorophor zur Goldoberfläche nach der Hybridisierungdistance of the fluorophore to the gold surface after hybridization
- 206206
- Molekülgruppe am Fluorophor, die spezifische Wechselwirkungen mit entsprechenden Gruppen an der Oberfläche eingehtmolecular group at the fluorophore, the specific interactions with corresponding Groups on the surface received
- 207207
- Molekülgruppe an der Oberfläche, die spezifische Wechselwirkungen mit entsprechenden Gruppen am Fluorophor eingehtmolecular group on the surface, the specific interactions with corresponding groups on the fluorophore received
Die
Die
Wege zur Ausführung der ErfindungWays to execute the invention
Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Detektion von Ligat/Ligand Assoziaten am Beispiel der Nukleinsäure-Hybridisierung (Ligat: Sonden-Oligonukleotid, Ligand: zum Sonden-Oligonukleotid komplementäres DNA-Teilstück) erläutert. Das geschilderte Verfahren ist für den Fachmann ohne weiteres auf die Detektion anderer Ligat/Ligand-Assoziate, wie sie im Abschnitt "Liganden/Signal-Liganden" erwähnt wurden, zu übertragen.in the The following is the process of the invention for the detection of ligate / ligand associates using the example of nucleic acid hybridization (Ligate: probe oligonucleotide, ligand: DNA fragment complementary to the probe oligonucleotide). The described method is for the person skilled in the art readily to the detection of other ligate / ligand associates, as mentioned in the section "Ligands / Signal ligands", transferred to.
Um die Vorteile der DNA-Chip-Technologie auf die Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybriden durch Modulation des Fluoreszenzquenchens anzuwenden, werden verschiedene modifizierte Nukleinsäure-Oligomer-Sonden unterschiedlicher Sequenz mit den oben beschriebenen Immobilisierungstechniken an einen Träger gebunden. Mit der Anordnung der Nukleinsäure-Oligomer-Sonden bekannter Sequenz an jeder Position der Oberfläche, einem DNA-Array, soll das Hybridisierungsereignis eines beliebigen Target-Nukleinsäure-Oligomers oder einer (fragmentierten) Target-DNA detektiert werden, um z. B. Mutationen im Target aufzuspüren und sequenzspezifisch nachzuweisen. Dazu werden auf einer Oberfläche die Oberflächenatome oder -moleküle eines definierten Bereichs (einer Test-Site) mit DNA-/RNA-/PNA-Nukleinsäure-Oligomeren bekannter, aber beliebiger Sequenz, wie oben beschrieben, verknüpft. In einer allgemeinsten Ausführungsform kann der DNA-Chip auch mit einem einzigen Sonden-Oligonukleotid derivatisiert werden. Als Sonden-Nukleinsäure-Oligomere werden Nukleinsäure-Oligomere (z. B. DNA-, RNA- oder PNA-Fragmente) der Basenlänge 3 bis 50, bevorzugt der Länge 5 bis 40, besonders bevorzugt der Länge 12 bis 30 verwendet.Around the advantages of DNA-chip technology on the detection of nucleic acid-oligomer hybrids Applying modulation of fluorescence quenching will be various modified nucleic acid oligomer probes different sequence with the immobilization techniques described above to a carrier bound. With the arrangement of nucleic acid oligomer probes known Sequence at every position of the surface, a DNA array the hybridization event of any target nucleic acid oligomer or a (fragmented) target DNA can be detected to z. B. track down mutations in the target and sequence specific evidence. These are on a surface the Surface atoms or molecules a defined area (a test site) with DNA / RNA / PNA nucleic acid oligomers known, but any sequence, as described above, linked. In a most general embodiment the DNA chip is also derivatized with a single probe oligonucleotide become. As probe nucleic acid oligomers are Nucleic acid oligomers (For example, DNA, RNA or PNA fragments) of the base length 3 to 50, preferably the Length 5 used to 40, more preferably the length 12 to 30.
An den so bereitgestellten Oberflächen mit immobilisierten und Fluorophor-markierten Sonden-Oligonukleotiden wird in einer Referenzmessung, z. B. mit einem Fluoreszenz-Scanner, die Fluoreszenzintensität der Fluorophor-markierten Sonden-Oligonukleotide im einsträngigen Zustand bestimmt.At the surfaces thus provided with immobilized and fluorophore-labeled probe oligonucleotides is in a reference measurement, z. B. with a fluorescence scanner, the fluorescence intensity of the fluorophore-labeled Probe oligonucleotides in single-stranded Condition determined.
Im nächsten Schritt wird die (möglichst konzentrierte) Untersuchungslösung mit Target-Oligonukleotid(en) zur Oberfläche mit immobilisierten Sonden-Oligonukleotiden gegeben. Dabei kommt es nur in dem Fall zur Hybridisierung, in dem die Lösung Target-Nukleinsäure-Oligomer-Stränge enthält, die zu den an die Oberfläche gebundenen Sonden-Nukleinsäure-Oligomeren komplementär oder zumindest in weiten Bereichen komplementär sind.in the next Step will be the (possible concentrated) investigation solution with target oligonucleotide (s) to the surface given with immobilized probe oligonucleotides. It comes it only in the case of hybridization in which the solution contains target nucleic acid oligomer strands, the to the surface bound probe nucleic acid oligomers complementary or at least in a wide range are complementary.
Nach der Hybridisierung zwischen Sonde und Target wird in einer zweiten Fluoreszenzmessung die Fluoreszenzintensität im hybridisierten, doppelsträngigen Zustand bestimmt.To the hybridization between probe and target is in a second Fluorescence measurement fluorescence intensity in the hybridized, double-stranded state certainly.
Aufgrund der Hybridisierung von Sonden-Nukleinsäure-Oligomer und dem dazu komplementären Nukleinsäure-Oligomer-Strang (Target) verändert sich der Abstand zwischen dem fluoreszierenden Farbstoffmolekül und der als Quencher fungierenden Metalloberfläche. Aufgrund des veränderten Abstandes erfährt auch das Ausmaß des Quench-Vorgangs und damit die Intensität der Fluoreszenz eine starke Änderung. Somit kann ein sequenzspezifisches Hybridisierungsereignis durch fluoreszenzbasierte Verfahren wie z. B. Fluoreszenzmikroskopie oder Messungen mit Fluoreszenz-Scanner detektiert werden.by virtue of the hybridization of probe nucleic acid oligomer and the complementary nucleic acid oligomer strand (Target) changed the distance between the fluorescent dye molecule and the as a quencher functioning metal surface. Due to the changed Distance experiences also the extent of Quenching process and thus the intensity of fluorescence a strong change. Thus, a sequence-specific hybridization event may occur fluorescence-based methods such. B. fluorescence microscopy or Measurements can be detected with fluorescence scanner.
Die Differenz aus Referenzmessung und zweiter Messung je Test-Site ist proportional zur Anzahl der ursprünglich in der Untersuchungslösung für das jeweilige Test-Site vorhandenen komplementären (bzw. in weiten Bereichen komplementären) Target-Oligonukleotide.The Difference between reference measurement and second measurement per test site proportional to the number of originally in the study solution for each Test site existing complementary (or in a wide range complementary) target oligonucleotides.
Gemäß einem alternativen Verfahren kann die Referenzmessung weggelassen werden, wenn die Größe des Referenzsignals vorher (z. B. durch vorausgegangene Messungen etc.) hinlänglich genau bekannt ist.According to one alternative methods, the reference measurement can be omitted if the size of the reference signal previously (eg by previous measurements, etc.) with sufficient accuracy is known.
Durch
spezifische Wechselwirkungen zwischen Gruppen am Farbstoff, die
natürlicherweise
bereits am Farbstoff vorhanden sind oder die durch eine chemische
Modifikation eingeführt
werden, und der (gegebenenfalls modifizierten) Oberfläche kann
eine bestimmte geometrische Anordnung des Sonden-Nukleinsäure-Oligomers
relativ zur modifizierten Oberfläche
erreicht werden. Durch das Anbringen von geeigneten Molekülgruppen
am Farbstoff (z. B. komplexierende Gruppen wie Bipyridyl-Gruppen
oder Diamino-Gruppen), die eine unter geeigneten Bedingung stabile
spezifische Wechselwirkung (z. B. Komplexbildung) mit entsprechenden
Gruppen an der Oberfläche
eingehen können,
lässt sich
eine geometrische Anordnung realisieren, bei der der Fluorophor
im nichthybridisierten Zustand nahe an der Oberfläche vorliegt.
Vor der Hybridisierung liegt das einsträngige Sonden-Nukleinsäure-Oligomer
also in einer Form vor, die durch einen geringen Abstand von Fluorophor
und quenchender Metalloberfläche
charakterisiert ist (geringe Fluoreszenzintensität). Durch die Hybridisierung
mit dem dazu komplementären
Nukleinsäure-Oligomer-Strang
(Target) verändert
sich der Abstand zwischen dem fluoreszierenden Farbstoffmolekül und der
als Quencher fungierenden Metalloberfläche dahingehend, dass es durch
die Vergrößerung des
Abstands zu einer Verringerung des Quenchens kommt und eine höhere Intensität der Fluoreszenz
nach der Hybridisierung beobachtet werden kann (siehe
Ausführungsformenembodiments
Die n Nukleotide (nt) lange Nukleinsäure-Sonde (DNA, RNA oder PNA, z. B. ein 20 Nukleotide langes Oligo) ist in der Nähe eines ihrer Enden (3'- oder 5'-Ende) direkt oder über einen (beliebigen) Spacer mit einer reaktiven Gruppe zur kovalenten Verankerung an der Oberfläche versehen, z. B. als 3'-Thiol-modifiziertes Sonden-Oligonukleotid, bei dem die endständige Thiolmodifikation als reaktive Gruppe zur Anbindung an Gold dient. Weitere kovalente Verankerungsmöglichkeiten ergeben sich z. B. aus aminmodifiziertem Ligat-Oligonukleotid, das zur Verankerung an oberflächlich gebundene Carbonsäurefunktionen (z. B. über säurefunktionalisierte Thiole wie Mercaptopropionsäure und eine Aktivierung z. B. als Aktivester) verwendet wird. In der Nähe des anderen Terminus des Sondenoligonukleotids ist ein Fluorophor kovalent angebunden (vgl. Beispiel 1), der mit einer funktionellen Gruppe (z. B. einer Fettsäure, einer Bipyridyl-Gruppe oder einer Diamino-Gruppe) modifiziert ist. Die so modifizierte Nukleinsäure-Sonde wird
- (i) in Puffer (z. B. 10 – 500 mM Phosphat-Puffer, pH = 7,1 mM EDTA) gelöst mit der Oberfläche in Kontakt gebracht und dort über die reaktive Gruppe des Sonden-Nukleinsäureoligomers an die – gegebenenfalls entsprechend derivatisierte – Oberfläche angebunden oder
- (ii) in Gegenwart eines bifunktionalen Linkers (z. B. einer geeigneten Diaminothiolverbindung oder einer als Aktivester aktivierten Mercaptopropionsäure und anschließender Reaktion mit einer entsprechenden Triaminoverbindung) in Puffer (z. B. 100 mM Phosphat-Puffer, pH = 7,1mM EDTA, 0,1 – 1M NaCl) gelöst mit der Oberfläche in Kontakt gebracht und dort über die reaktive Gruppe des Sonden-Nukleinsäureoligomers gemeinsam mit dem bifunktionalen Linker an die – gegebenenfalls entsprechend derivatisierte – Oberfläche angebunden, wobei darauf geachtet wird, dass genügend bifunktionaler Linker geeigneter Kettenlänge zugesetzt wird (etwa 0.1 bis 10 facher Überschuss), um zwischen den einzelnen Sonden-Oligonukleotiden genügend Freiraum für eine Hybridisierung mit den Signal-Liganden bzw. dem Target-Oligonukleotid zur Verfügung zu stellen oder
- (iii) in Puffer (z. B. 10 – 350 mM Phosphat-Puffer, pH = 7,1 mM EDTA) gelöst mit der Oberfläche in Kontakt gebracht und dort über die reaktive Gruppe des Sonden-Nukleinsäureoligomers an die – gegebenenfalls entsprechend derivatisierte – Oberfläche angebunden. Anschließend wird die so modifizierte Oberfläche mit dem entsprechenden bifunktionalen Linker in Lösung (z. B. einer geeigneten Diaminothiolverbindung oder einer als Aktivester aktivierten Mercaptopropionsäure und anschließender Reaktion mit einer entsprechenden Triaminoverbindung in Phosphat-Puffer/EtOH-Mischungen bei Thiol-modifizierten Sondenoligonukleotiden) in Kontakt gebracht, wobei der bifunktionale Linker über seine reaktive Gruppe an die – gegebenenfalls entsprechend derivatisierte – Oberfläche anbindet (vgl. Abschnitt "Bindung des Ligaten an die Oberfläche").
- (i) brought into contact with the surface in buffer (for example 10 to 500 mM phosphate buffer, pH = 7.1 mM EDTA) and, via the reactive group of the probe nucleic acid oligomer, to the - optionally correspondingly derivatized - Surface tethered or
- (ii) in the presence of a bifunctional linker (eg a suitable diaminothiol compound or a mercapto propionic acid activated as an active ester and subsequent reaction with a corresponding triamino compound) in buffer (eg 100 mM phosphate buffer, pH = 7.1 mM EDTA, 0.1 - 1M NaCl) brought into contact with the surface and there via the reactive group of the probe nucleic acid oligomer together with the bifunctional linker to the - possibly correspondingly derivatized - surface, taking care that sufficient bifunctional linker suitable chain length is added (about 0.1 to 10-fold excess) in order to provide sufficient space between the individual probe oligonucleotides for hybridization with the signal ligands or the target oligonucleotide or
- (iii) dissolved in buffer (eg 10 - 350 mM phosphate buffer, pH = 7.1 mM EDTA) brought into contact with the surface and there via the reactive group of the probe nucleic acid oligomer to the - possibly correspondingly derivatized - Surface tethered. Subsequently, the thus-modified surface is contacted with the appropriate bifunctional linker in solution (eg, a suitable diaminothiol compound or mercaptopropionic acid activated as an active ester, followed by reaction with a corresponding triamino compound in phosphate buffer / EtOH mixtures with thiol-modified probe oligonucleotides) brought about, the bifunctional linker via its reactive group to the - possibly correspondingly derivatized - surface binds (see section "Binding of the ligate to the surface").
Die (Rest-) Fluoreszenz des Fluorophors am Sonden-Oligonukleotid wird durch ein geeignetes Verfahren detektiert, z. B. durch Fluoreszenzmessung mit einem Fluoreszenz-Scanner unter Nutzung spezifischer Wechselwirkungen zwischen funktionellen Gruppen am Farbstoff und gegebenenfalls entsprechend funktionalisierten Gruppen an der Goldoberfläche. Eine Ausführungsform sind z. B. am Farbstoffmolekül oder in dessen Nähe angebrachte Bipyridyl-Gruppen, die mit der Goldoberfläche unter geeigneten Bedingungen relativ stabile Wechselwirkungen eingehen. Eine weitere Ausführungsform sind am Farbstoffmolekül oder in dessen Nähe angebrachte Diaminogruppen, die über eine durch Kupfer(II) oder Nickel(II) erzeugte Komplexbindung an entsprechende an der Goldoberfläche angebrachte Diaminogruppen eine relativ stabile Wechselwirkung eingehen.The (Residual) fluorescence of the fluorophore at the probe oligonucleotide becomes detected by a suitable method, e.g. B. by fluorescence measurement with a fluorescence scanner using specific interactions between functional groups on the dye and, if appropriate, accordingly functionalized groups on the gold surface. An embodiment are z. B. on the dye molecule or near it attached bipyridyl groups with the gold surface below appropriate conditions relatively stable interactions. Another embodiment are on the dye molecule or attached in the vicinity Diamino groups over a complex bond formed by copper (II) or nickel (II) corresponding to the gold surface attached diamino groups undergo a relatively stable interaction.
Eine weitere Ausführungsform sind am Farbstoffmolekül angebrachte hydrophobe Alkylketten (z. B. über Anbindung einer Fettsäure), die über hydrophobe Wechselwirkungen mit der ebenfalls hydrophoben Goldoberfläche relativ stabile Wechselwirkungen eingehen.A another embodiment are on the dye molecule attached hydrophobic alkyl chains (eg via attachment of a fatty acid), which via hydrophobic Interactions with the likewise hydrophobic gold surface relative to undergo stable interactions.
Anschließend wird das gelöste Target zugegeben, potentielle Hybridisierungsereignisse werden unter geeigneten, dem Fachmann bekannten Bedingungen ermöglicht (beliebige, frei wählbare Stringenzbedingungen der Parameter Potential/Temperatur/Salz/chaotrope Salze etc. für die Hybridisierung) und die Messung zur Detektion des Fluorophors wiederholt.Subsequently, will the solved one Target added, potential hybridization events are considered to be appropriate, conditions known to those skilled in the art (arbitrary, freely selectable stringency conditions the parameter potential / temperature / salt / chaotropic salts etc. for the hybridization) and the measurement is repeated to detect the fluorophore.
Der
Unterschied im Messsignal (Zunahme der Fluoreszenzintensität nach der
Hybridisierung, vgl.
Das beschriebene Verfahren kann für eine Targetart (z. B. eine bestimmte Targetoligonukleotid-Art mit bekannter Sequenz) an einer Oberfläche oder – bei Verwendung verschiedener Sonden-Arten je Test-Site – für mehrere Target-Arten (gleiche Ligandengruppen wie z. B. mehrere verschiedene Target-Oligonukleotid-Arten oder verschiedene Antikörper-Arten, Antigen-Arten etc., aber auch Mischungen davon) angewendet werden.The described method can for a type of target (e.g., a particular type of target oligonucleotide known in the art) Sequence) on a surface or at Use of different types of probes per test site - for several Target species (same ligand groups such as several different Target oligonucleotide species or various types of antibodies, Antigen types, etc., but also mixtures thereof) are applied.
Beispiel 1example 1
Darstellung der aminomodifizierten Oligonukleotide zur Verankerung auf modifizierten Goldoberflächen als Ligat- bzw. SondenoligonukleotideRepresentation of the amino-modified Oligonucleotides for anchoring on modified gold surfaces as Ligate or probe oligonucleotides
Die Synthese der Oligonukleotide erfolgt in einem automatischen Oligonukleotid-Synthesizer (Expedite 8909; ABI 384 DNA/RNA-Synthesizer) gemäß der vom Hersteller empfohlenen Syntheseprotokolle für eine 1.0 μmol Synthese. Bei den Synthesen mit dem 1-O-Dimethoxytrityl-propyl-disulfid-CPG-Träger (Glen Research 20-2933) werden die Oxidationsschritte mit einer 0.02 M Iodlösung durchgeführt, um eine oxidative Spaltung der Disulfidbrücke zu vermeiden. Modifikationen an der 5'-Position der Oligonukleotide erfolgen mit einem auf 5 min verlängerten Kopplungsschritt. Der Amino-Modifier C2 dT (Glen Research 10-1037) wird in die Sequenzen mit den jeweiligen Standardprotokoll eingebaut. Die Kopplungseffizienzen werden während der Synthese online über die DMT-Kationen-Konzentration photometrisch bzw. konduktometrisch bestimmt.The Synthesis of the oligonucleotides takes place in an automatic oligonucleotide synthesizer (Expedite 8909; ABI 384 DNA / RNA Synthesizer) according to the manufacturer's recommendation Synthesis protocols for a 1.0 μmol Synthesis. Syntheses with the 1-O-dimethoxytrityl-propyl-disulfide-CPG support (Glen Research 20-2933), the oxidation steps with a 0.02 M iodine solution carried out, to avoid oxidative cleavage of the disulfide bridge. modifications at the 5'-position the oligonucleotides are made with a prolonged to 5 min Coupling step. The amino modifier C2 dT (Glen Research 10-1037) is inserted into the sequences with the respective ones Standard protocol installed. The coupling efficiencies are during the synthesis online over the DMT cation concentration photometrically or conductometrically certainly.
Die Oligonukleotide werden mit konzentriertem Ammoniak (30%) bei 37 °C 16 h entschützt. Die Reinigung der Oligonukleotide erfolgt mittels RP-HPL Chromatographie nach Standardprotokollen (Laufmittel: 0,1 M Triethylammoniumacetat-Puffer, Acetonitril), die Charakterisierung mittels MALDI-TOF MS. Die aminmodifizierten Oligonukleotide werden mit an die entsprechenden aktivierten Fluorophore (z. B. Fluoresceinisothiocyanat) gemäß dem Fachmann bekannten Bedingungen gekoppelt. Die Kopplung kann sowohl vor als auch nach der Anbindung der Oligonukleotide an die Oberfläche erfolgen.The Oligonucleotides are deprotected with concentrated ammonia (30%) at 37 ° C for 16 h. The Purification of the oligonucleotides is carried out by means of RP-HPL chromatography according to standard protocols (eluent: 0.1 M triethylammonium acetate buffer, Acetonitrile), characterization by MALDI-TOF MS. The amine-modified Oligonucleotides are added to the corresponding activated fluorophores (eg, fluorescein isothiocyanate) according to conditions known to those skilled in the art coupled. The coupling can be done both before and after the connection the oligonucleotides are made to the surface.
Beispiel 2Example 2
Darstellung der fluorophormodifizierten Oligonukleotide zur Verankerung auf modifizierten Goldoberflächen als Ligat- bzw. SondenoligonukleotidePreparation of fluorophore-modified Oligonucleotides for anchoring on modified gold surfaces as ligate or probe oligonucleotides
Die Synthese der Oligonukleotide erfolgt in einem automatischen Oligonukleotid-Synthesizer (Expedite 8909; ABI 384 DNA/RNA-Synthesizer) gemäß der vom Hersteller empfohlenen Syntheseprotokolle für eine 1.0 μmol Synthese. Bei den Synthesen mit dem 1-O-Dimethoxytrityl-propyl-disulfid-CPG-Träger (Glen Research 20-2933) werden die Oxidationsschritte mit einer 0.02 M Iodlösung durchgeführt, um eine oxidative Spaltung der Disulfidbrücke zu vermeiden. Modifikationen an der 5'-Position der Oligonukleotide erfolgen mit einem auf 5 min verlängerten Kopplungsschritt. Die Fluorophore werden am Synthesizer beim vorletzten Kopplungsschritt als Phosphoramidite (Fluorescein-Phosphoramidite Glen Research 10-1963) in die Sequenzen mit dem jeweiligen Standardprotokoll eingebaut. Der Amino-Modifier C2 dT (Glen Research 10-1037) wird beim letzten Kopplungsschritt in die Sequenzen mit den jeweiligen Standardprotokoll eingebaut. Die Kopplungseffizienzen werden während der Synthese online über die DMT-Kationen-Konzentration photometrisch bzw. konduktometrisch bestimmt.The Synthesis of the oligonucleotides takes place in an automatic oligonucleotide synthesizer (Expedite 8909; ABI 384 DNA / RNA Synthesizer) according to the manufacturer's recommendation Synthesis protocols for a 1.0 μmol Synthesis. Syntheses with the 1-O-dimethoxytrityl-propyl-disulfide-CPG support (Glen Research 20-2933), the oxidation steps with a 0.02 M iodine solution carried out, to avoid oxidative cleavage of the disulfide bridge. modifications at the 5'-position the oligonucleotides are made with a prolonged to 5 min Coupling step. The fluorophores are on the synthesizer at the penultimate Coupling step as phosphoramidites (fluorescein phosphoramidites Glen Research 10-1963) into the sequences with the respective standard protocol built-in. The amino modifier C2 dT (Glen Research 10-1037) becomes in the last coupling step in the sequences with the respective Standard protocol installed. The coupling efficiencies are during the Synthesis online over the DMT cation concentration photometrically or conductometrically certainly.
Anschließend wird an die Aminogruppe eine Fettsäure oder eine Ethylendiamin-Funktion (z. B. als Ethylendiamin-N,N'-diessigsäure) oder die Bipyridyl-Gruppe (z. B. als 2,2' Bipyridin-4,4'dicarbonsäure) über entsprechende Aktivester-Verfahren angebunden.Subsequently, will to the amino group, a fatty acid or an ethylenediamine function (eg as ethylenediamine-N, N'-diacetic acid) or the bipyridyl group (e.g., as 2,2'-bipyridine-4,4'-dicarboxylic acid) via appropriate active ester methods tethered.
Beispiel 3Example 3
Herstellung der Oligonukleotid-Elektrode Au-S(CH2)2-ss-oligo-FPPreparation of the oligonucleotide electrode Au-S (CH 2 ) 2 -ss-oligo-FP
Die Quench-Oberfläche (hier: Gold-Plättchen) wird mit doppelt modifiziertem 20 bp Einzelstrang-Oligonukleotid der Sequenz 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' (Modifikation 1: die Phosphatgruppe des 3' Endes ist mit (HO-(CH2)2-S)2 zum P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH verestert; Modifikation 2: an das 5' Ende ist ein Fluorophor und eine Ethylendiamin-Gruppe (vgl. Bsp. 2) nach dem jeweiligen Standardprotokoll eingebaut) in 5×10–5 molarer Pufferlösung (Phosphatpuffer, 0,5 molar in Wasser, pH 7) mit Zusatz von ca. 10–5 bis 10–1 molarer Diaminothiol-Verbindung (oder anderen geeigneten Thiolen oder Disulfiden geeigneter Kettenlänge wie z. B. als Aktivester aktivierte Mercaptopropionsäure, an die anschließend eine Triamino-Gruppe angekoppelt wird) 2 – 24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au- Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer 1:1 Koadsorption des ss-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxy-mercaptoethanols kommt. Das in der Inkubationslösung gleichzeitig anwesende, freie bifunktionelle Thiol wird ebenfalls durch Ausbildung einer Au-S Bindung koadsorbiert (Inkubationsschritt). Statt des Einzelstrang-Oligonukleotids kann dieser Einzelstrang auch mit seinem Komplementärstrang hybridisiert sein.The quench surface (here: gold platelets) is treated with double-modified 20 bp single-stranded oligonucleotide sequence 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3 '(modification 1: the phosphate group of the 3' end is with (HO) (CH 2 ) 2 -S) 2 esterified to the PO- (CH 2 ) 2 -SS- (CH 2 ) 2 -OH; Modification 2: to the 5 'end is a fluorophore and an ethylenediamine group (see Ex. 2) according to the respective standard protocol) in 5 × 10 -5 molar buffer solution (phosphate buffer, 0.5 molar in water, pH 7) with the addition of about 10 -5 to 10 -1 molar diaminothiol compound (or other suitable thiols or disulfides of suitable chain length, such as activated mercaptopropionic acid, to which a triamino group is subsequently coupled), are incubated for 2 to 24 hours. During this reaction time, the disulphide spacer PO- (CH 2 ) 2 -SS- (CH 2 ) 2 -OH of the oligonucleotide is homolytically cleaved. The spacer with Au atoms of the surface forms a covalent Au-S bond resulting in a 1: 1 coadsorption of the ss oligonucleotide and the split-off 2-hydroxy-mercaptoethanol. The simultaneously present in the incubation solution, free bifunctional thiol is also koadsorbiert by formation of an Au-S bond (incubation step). Instead of the single-stranded oligonucleotide, this single strand can also be hybridized with its complementary strand.
Anschließend wird durch Zugabe von löslichen Nickel-Salzen (z. B. Ni (II) Chlorid) oder anderen geeigneten Metall-Ionen (wie z. B. Kupfer) über die Bildung eines Komplexes unter Nutzung der Komplexbildungseigenschaften der Diaminogruppe am Fluorophor und der Diaminogruppe an der Oberfläche ein Zustand erreicht, bei dem der Fluorophor in einer geometrischen Anordnung nahe an der Oberfläche vorliegt.Subsequently, will by adding soluble Nickel salts (eg, Ni (II) chloride) or other suitable metal ions (such as copper) over the formation of a complex using the complexation properties of the diamino group on the fluorophore and the diamino group on the surface State reached in which the fluorophore in a geometric Arrangement near the surface is present.
Beispiel 4Example 4
Alternative Herstellung der Oligonukleotid-Elektrode Au-S(CH2)2-ss-oligo-FPAlternative preparation of the oligonucleotide electrode Au-S (CH 2 ) 2 -ss-oligo-FP
Die alternative Herstellung von Au-S(CH2)2-ss-oligo-FP gliedert sich in 2 Teilabschnitte, nämlich der Derivatisierung der Gold-Oberfläche mit dem Sonden-Oligonukleotid (Inkubationsschritt) und der Nachbelegung der so modifizierten Elektrode mit einem geeigneten bifunktionalen Linker (Nachbelegungsschritt).The alternative preparation of Au-S (CH 2 ) 2 -ss-oligo-FP is divided into 2 subsections, namely the derivatization of the gold surface with the probe oligonucleotide (incubation step) and the subsequent deposition of the thus modified electrode with a suitable bifunctional Left (reload step).
Die Quench-Oberfläche (hier: Gold-Plättchen) wird mit doppelt modifiziertem 20 bp Einzelstrang-Oligonukleotid der Sequenz 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' (Modifikation 1: die Phosphatgruppe des 3' Endes ist mit (HO-(CH2)2-S)2 zum P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH verestert; Modifikation 2: an das 5' Ende ist ein modifizierter Fluorophor und eine Ethylendiamin-Gruppe (vgl. Beispiel 2) nach dem jeweiligen Standardprotokoll eingebaut) in 5×10–5 molarer Pufferlösung (Phosphatpuffer, 0,5 molar in Wasser, pH 7) 2 – 24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer 1:1 Koadsorption des ss-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxy- mercaptoethanols kommt. Statt des Einzelstrang-Oligonukleotids kann dieser Einzelstrang auch mit seinem Komplementärstrang hybridisiert sein.The quench surface (here: gold platelets) is treated with double-modified 20 bp single-stranded oligonucleotide sequence 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3 '(modification 1: the phosphate group of the 3' end is with (HO) (CH 2 ) 2 -S) 2 esterified to the PO- (CH 2 ) 2 -SS- (CH 2 ) 2 -OH; Modification 2: to the 5 'end is a modified fluorophore and an ethylenediamine group (see Example 2) according to the respective standard protocol) in 5 × 10 -5 molar buffer solution (phosphate buffer, 0.5 molar in water, pH 7) for 2 - 24 h incubated. During this reaction time, the disulphide spacer PO- (CH 2 ) 2 -SS- (CH 2 ) 2 -OH of the oligonucleotide is homolytically cleaved. The spacer with Au atoms of the surface forms a covalent Au-S bond, resulting in a 1: 1 coadsorption of the ss-oligonucleotide and the split-off 2-hydroxy-mercaptoethanol. Instead of the single-stranded oligonucleotide, this single strand can also be hybridized with its complementary strand.
Anschließend wird die so modifizierte Gold-Oberfläche mit einer ca. 10–5 bis 10–1 molaren Diaminothiol-Verbindung (oder anderen geeigneten Thiolen oder Disulfiden geeigneter Kettenlänge wie z. B. als Aktivester aktivierte Mercaptopropionsäure, an die anschließend eine Triamino-Gruppe angekoppelt wird) 2 – 24 h komplett benetzt und 2 – 24 h inkubiert. Die freie Thiolverbindung belegt die nach dem Inkubationsschritt verbleibende freie Gold-Oberfläche durch Ausbildung einer Au-S Bindung.Subsequently, the thus modified gold surface is coupled with a ca. 10 -5 to 10 -1 molar diaminothiol compound (or other suitable thiols or disulfides of suitable chain length, such as activated mercapto-propionic acid, to which a triamino group is subsequently coupled is) completely wetted for 2 - 24 h and incubated for 2 - 24 h. The free thiol compound occupies the free gold surface remaining after the incubation step by forming an Au-S bond.
Anschließend wird durch Zugabe von löslichen Nickel-Salzen (z. B. Ni (II) Chlorid) oder anderen geeigneten Metall-Ionen (wie z. B. Kupfer) ein Zustand erreicht, bei dem der Fluorophor in einer geometrischen Anordnung nahe an der Oberfläche vorliegt (vgl. Beispiel 4).Subsequently, will by adding soluble Nickel salts (eg, Ni (II) chloride) or other suitable metal ions (such as copper) reaches a state where the fluorophore is present in a geometric arrangement close to the surface (see Example 4).
Beispiel 5Example 5
Alternative Herstellung der Oligonukleotid-Elektrode Au-S(CH2)2-ss-oligo-FPAlternative preparation of the oligonucleotide electrode Au-S (CH 2 ) 2 -ss-oligo-FP
Eine alternative Herstellung von Au-S(CH2)2-ss-oligo-FP besteht in der Derivatisierung der Gold-Oberfläche mit dem Sonden-Oligonukleotid (Inkubationsschritt) ohne Nachbelegung.An alternative preparation of Au-S (CH 2 ) 2 -ss-oligo-FP consists in the derivatization of the gold surface with the probe oligonucleotide (incubation step) without subsequent application.
Die Quench-Oberfläche (hier: Gold-Plättchen) wird mit doppelt modifiziertem 20 bp Einzelstrang-Oligonukleotid der Sequenz 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' (Modifikation 1: die Phosphatgruppe des 3' Endes ist mit (HO-(CH2)2-S)2 zum P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH verestert; Modifikation 2: an das 5' Ende ist ein modifizierter Fluorophor und eine Bipyridyl-Gruppe (vgl. Beispiel 2) nach dem jeweiligen Standardprotokoll eingebaut) in 5×10–5 molarer Pufferlösung (Phosphatpuffer, 0,5 molar in Wasser, pH 7) 2 – 24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer 1:1 Koadsorption des ss-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxy- mercaptoethanols kommt. Statt des Einzelstrang-Oligonukleotids kann dieser Einzelstrang auch mit seinem Komplementärstrang hybridisiert sein.The quench surface (here: gold platelets) is treated with double-modified 20 bp single-stranded oli gonucleotide of the sequence 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3 '(modification 1: the phosphate group of the 3' end is with (HO- (CH 2 ) 2 -S) 2 to the PO- (CH 2 ) 2 -SS - (CH 2 ) 2 -OH esterified, modification 2: at the 5 'end a modified fluorophore and a bipyridyl group (see Example 2) according to the respective standard protocol incorporated) in 5 × 10 -5 molar buffer solution (phosphate buffer, 0.5 molar in water, pH 7) for 2 - 24 h incubated. During this reaction time, the disulphide spacer PO- (CH 2 ) 2 -SS- (CH 2 ) 2 -OH of the oligonucleotide is homolytically cleaved. The spacer with Au atoms of the surface forms a covalent Au-S bond, resulting in a 1: 1 coadsorption of the ss-oligonucleotide and the split-off 2-hydroxy-mercaptoethanol. Instead of the single-stranded oligonucleotide, this single strand can also be hybridized with its complementary strand.
Die am Fluorophor oder in dessen Nähe angebrachte Bipyridyl-Gruppe geht mit der unmodifizierten Goldoberfläche eine Wechselwirkung ein, wodurch eine geometrische Anordnung erreicht wird, bei der der Fluorophor nahe an der Oberfläche vorliegt.The at the fluorophore or in its vicinity attached bipyridyl group merges with the unmodified gold surface Interaction, whereby a geometric arrangement achieved where the fluorophore is close to the surface.
Beispiel 6Example 6
Alternative Herstellung der Oligonukleotid-Elektrode Au-S(CH2)2-ss-oligo-FPAlternative preparation of the oligonucleotide electrode Au-S (CH 2 ) 2 -ss-oligo-FP
Eine weitere alternative Herstellung von Au-S(CH2)2-ss-oligo-FP besteht in der Derivatisierung der Gold-Oberfläche mit dem Sonden-Oligonukleotid (Inkubationsschritt) ohne Nachbelegung.Another alternative preparation of Au-S (CH 2 ) 2 -ss-oligo-FP consists of derivatization of the gold surface with the probe oligonucleotide (incubation step) without subsequent application.
Die Quench-Oberfläche (hier: Gold-Plättchen) wird mit doppelt modifiziertem 20 bp Einzelstrang-Oligonukleotid der Sequenz 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' (Modifikation 1: die Phosphatgruppe des 3' Endes ist mit (HO-(CH2)2-S)2 zum P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH verestert; Modifikation 2: an das 5' Ende ist ein modifizierter Fluorophor und eine Alkylkette (z. B. als Fettsäureeinheit, vgl. Beispiel 2) nach dem jeweiligen Standardprotokoll eingebaut) in 5×10–5 molarer Pufferlösung (Phosphatpuffer, 0,5 molar in Wasser, pH 7) 2 – 24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer 1:1 Koadsorption des ss-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxy-mercaptoethanols kommt. Statt des Einzelstrang-Oligonukleotids kann dieser Einzelstrang auch mit seinem Komplementärstrang hybridisiert sein.The quench surface (here: gold platelets) is treated with double-modified 20 bp single-stranded oligonucleotide sequence 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3 '(modification 1: the phosphate group of the 3' end is with (HO) (CH 2 ) 2 -S) 2 esterified to the PO- (CH 2 ) 2 -SS- (CH 2 ) 2 -OH; Modification 2: to the 5 'end is a modified fluorophore and an alkyl chain (e.g. Fatty acid unit, see Example 2) according to the respective standard protocol incorporated) in 5 × 10 -5 molar buffer solution (phosphate buffer, 0.5 molar in water, pH 7) for 2 - 24 h incubated. During this reaction time, the disulphide spacer PO- (CH 2 ) 2 -SS- (CH 2 ) 2 -OH of the oligonucleotide is homolytically cleaved. The spacer with Au atoms of the surface forms a covalent Au-S bond, resulting in a 1: 1 coadsorption of the ss-oligonucleotide and the split-off 2-hydroxy-mercaptoethanols. Instead of the single-stranded oligonucleotide, this single strand can also be hybridized with its complementary strand.
Alternativ dazu kann die Goldoberfläche auch durch Koadsorption (vgl. Beispiel 3) oder Nachbelegung (vgl. Beispiel 4) mit hydrophoben Alkylthiolen (z. B. Propanthiol oder anderen Thiolen oder Disulfiden geeigneter Kettenlänge) entsprechend hydrophob modifiziert werden.alternative this can be the gold surface also by co-adsorption (see Example 3) or post-use (cf. Example 4) with hydrophobic alkyl thiols (for example, propanethiol or other thiols or disulfides of suitable chain length) be modified hydrophobic.
Die am Fluorophor oder in dessen Nähe angebrachte Fettsäureeinheit geht mit der hydrophoben Goldoberfläche Wechselwirkungen ein, wodurch eine geometrische Anordnung erreicht wird, bei der der Fluorophor nahe an der Oberfläche vorliegt.The at the fluorophore or in its vicinity attached fatty acid unit interacts with the hydrophobic gold surface, resulting in a geometric arrangement is achieved in which the fluorophore close to the surface is present.
Beispiel 7Example 7
Fluoreszenz-Intensitätsmessungen am System Au-ss-oligo-Fluorescein bzw. am System Au-ds-oligo-Fluorescein in Gegenwart von flüssigen MedienFluorescence intensity measurements on the system Au-ss-oligo-fluorescein or on the system Au-ds-oligo-fluorescein in the presence of liquid media
Die Sonden-Oberfläche wird analog zu den Beispielen 3 – 6 hergestellt. Dazu wird ein modifiziertes Oligonukleotid der Sequenz 5'-Fluorescein-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' [C3-S-S-C3-OH] auf Gold immobilisiert (50 μmol Oligonukleotid in Phosphat-Puffer (K2HPO4/KH2PO4 500 mM, pH 7) und in der Form Au-S(CH2)2-ss-oligo-Fluorescein die Fluoreszenzintensität der Oberfläche mit einem Fluoreszenz-Scanner der Firma Lavision Biotech bestimmt. Zur Messung der Fluoreszenz in Gegenwart von flüssigen Medien werden 150 μl des Mediums auf die Goldoberfläche gegeben und anschließend mit einem Deckglas abgedeckt. Alternativ können auch Hybriwells oder Imaging Chambers verwendet werden.The probe surface is prepared analogously to Examples 3-6. For this purpose, a modified oligonucleotide of the sequence 5'-fluorescein-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3 '[C 3 -SSC 3 -OH] is immobilized on gold (50 .mu.mol oligonucleotide in phosphate buffer (K 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 500 mM, pH 7) and, in the form of Au-S (CH 2 ) 2 -ss-oligo-fluorescein, the fluorescence intensity of the surface is determined using a fluorescence scanner from Lavision Biotech, to measure the fluorescence in the presence of liquid media 150 μl of the medium are placed on the gold surface and then covered with a coverslip, alternatively Hybriwells or Imaging Chambers can be used.
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999047702A2 (en) * | 1998-03-18 | 1999-09-23 | november Aktiengesellschaft Gesellschaft für Molekulare Medizin | Method and device for identifying a tag |
| WO2001001138A1 (en) * | 1999-06-25 | 2001-01-04 | Ingeneus Corp. | Fluorescent intensity method for assaying binding between proteins or peptides |
| WO2001011381A1 (en) | 1999-08-09 | 2001-02-15 | Motorola Inc. | Adaptive delay lock loop tracking |
| WO2001046474A1 (en) * | 1999-12-21 | 2001-06-28 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | Detection of nucleic acids |
| WO2001053526A2 (en) * | 2000-01-24 | 2001-07-26 | Ingeneus Corporation | Homogenous assay of duplex or triplex hybridization by means of multiple measurements under varied conditions |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102016000865A1 (en) * | 2016-01-28 | 2017-08-03 | Friz Biochem Gesellschaft Für Bioanalytik Mbh | Functionalized metallic nanoparticles |
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