DE10132761B4

DE10132761B4 - Klimatisierbare Probenkammer und Verfahren zur Klimatisierung der Umgebung von Proben

Info

Publication number: DE10132761B4
Application number: DE2001132761
Authority: DE
Inventors: Maik Dipl.-Ing. Frede; Benno Dipl.-Phys. Radt; Gereon Dr. Hüttmann; Björn Dipl.-Phys. Lange
Original assignee: MED LASERZENTRUM LUEBECK GmbH; Medizinisches Laserzentrum Luebeck GmbH
Current assignee: MED LASERZENTRUM LUEBECK GmbH; Medizinisches Laserzentrum Luebeck GmbH
Priority date: 2001-07-10
Filing date: 2001-07-10
Publication date: 2006-02-09
Anticipated expiration: 2021-07-11
Also published as: DE10132761A1

Abstract

Klimatisierbare Probenkammer zur Durchführung chemischer, biochemischer, biologischer oder physikalischer Reaktionen an Proben im Piko- bis Nanoliterbereich, enthaltend
– einen in einer Probenkammer (6) angeordneten Probenträger (1), auf welchem in separaten Probenfeldern die Proben (2) angeordnet sind;
– ein Klimatisierungsmediumreservoir (5), mit welchem in der Probenkammer (6) ein Klimatisierungsmedium mit einem Feuchtegehalt von annähernd 100 % eingestellt ist; und wobei
– die Proben (2) auf dem Probenträger (1) separat heizbar sind.

Description

Die Erfindung betrifft eine klimatisierbare Probenkammer für Proben mit kleinen Volumina im Bereich von Piko- bis Nanolitern und ein Verfahren zur Klimatisierung der Umgebung solcher Proben.

Für den Bereich der biologischen, chemischen und medizinischen Forschung sind verschiedene Diagnose- und Untersuchungsgeräte mit rasterförmiger Anordnung der Trägerkompartimente bekannt, um eine Vielzahl von Proben parallel untersuchen und lagern zu können. Um auch kleine Probenvolumina während der Versuchsdurchführung erhalten und die klimatischen Bedingungen versuchsgerecht einstellen und einhalten zu können, werden die miniaturisierten Proben in Feuchtekammern inkubiert.

Eine solche Kammer bespielsweise ist aus Litborn E. et al, Chip-based nanovials for tryptic digest and capillary electrophoresis, Analytica Chimica Acta 401 (1999) 11-19) bekannt. Die Probenkammer besteht aus einem geschlossenen Plexiglaskasten und ist mit einem Thermostatwasserbad ausgestattet. Durch Öffnungen im Deckel wird das gewünschte Instrumentarium wie z.B. Mikropipetten eingeführt. Der Probenträger wird zur Temperatureinstellung teilweise in das Wasserbad eingetaucht und für die Zugabe weiterer Reagenzien über einen xyz-Translator bewegt, wobei die ablaufenden Reaktionen mit Hilfe eines oberhalb der Kammer angebrachten Mikroskops beobachtet werden können. Die Volumenregulation erfolgt durch die Zugabe von Wasser über eine Nanopipette in festen Zeitabständen. Der Nachteil dieser Probenkammer besteht darin, dass die unmittelbar über der Wasseroberfläche angeordnete Probe nach kurzer Zeit die Temperatur des Wasserbades annimmt. Das führt dazu, dass das Wasserbad nicht auf eine hohe Temperatur erhitzt werden kann, die für eine schnelle und ausreichend hohe Feuchtigkeitsabgabe erforderlich wäre, ohne auch in der Probe die für biochemische Reaktionen üblicherweise notwendigen physiologischen Versuchstemperaturen erheblich zu überschreiten.

Darüber hinaus ist die Inkubation von Proben in einer Feuchtekammer im Anschluß an die außerhalb der Kammer stattfindende Beschickung der Probengefäße bekannt (Oldenburg K. R. et al, Assay Miniaturization for Ultra-High Throughput Screening of Combinatorial and Discrete Compound Libraries: A 9600-Well (0,2 Microliter) Assay System, J. of Biomolecular Screening, Volume 3, Number 1, 1998). Die Auswertung der Reaktionen erfolgt ebenfalls außerhalb der Feuchtekammer, da die elektronischen Auswerteinstrumente der in der Feuchtekammer vorherrschenden 100%igen Luftfeuchtigkeit nicht standhalten Der Nachteil dieser Anordnung liegt in dem erheblichen Volumenverlust beim Transfer der Probe in die Feuchtekammer und ebenso beim Transport aus dieser heraus zur Auswertung außerhalb der Probenkammer.

Als Probenträger sind seit langem aus Kunststoff gefertigte, sogenannte Well-Platten (z. B. 96-, 384-, 864- Well-Platten) bekannt. Die Vertiefungen dieser Probenträger können gegebenenfalls mit Beschichtungen versehen sein, die die dann ablaufenden Reaktionen fördern bzw. ermöglichen. So sind die Vertiefungen für diagnostische Untersuchungen häufig mit organischen Carboxylgruppen enthaltenden Materialien beschichtet, so daß Biomoleküle (z.B. Proteine) kovalent an die Böden der Platten gekoppelt werden können. Ein Standardverfahren dieser Art ist der ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) Test.

In den letzten Jahren ist in der High Throughput Technologie die Miniaturisierung von Probenträgern und Auslesegeräten weiter vorangeschritten, wobei die Zahl der Probenaufnahmegefäße auf einer Plattform auf 1536 Wells und auch darüber gestiegen ist. Die Probenvolumina wurden auf 10 μl und weniger ver kleinert. Probenträger in der Biochip-Technologie arbeiten inzwischen mit Probenvolumina bis in den Pikoliterbereich.

Die Volumenverkleinerung der Proben auf Kleinstvolumina verursacht Probleme, die sich nicht auf die linear mit dem Probenvolumen sinkende Menge an Reaktionsprodukten beschränken. Eine besondere Problematik ergibt sich aus der unzureichenden Dispensiergenauigkeit herkömmlicher Dispensiergeräte, die nach dem Verdrängerprinzip arbeiten. Für diesen Volumenbereich stehen jedoch bereits Entwicklungen zur Verfügung, die Einzug in die Praxis des Kleinvolumenbereichs gehalten haben. So sind z.B. Piezodispensierköpfe bekannt, die – mit einer Technologie analog zur Ink-Jet Technologie in der Drucktechnik – ein Dispensieren von Pikoliterproben erlauben. Diese Köpfe, die Volumina von 30 – 100 pl pipettieren können, ermöglichen es, auch Substanzen bis in Volumenbereiche von Nanolitern zu mischen und so komplexe Reaktionen in kleinsten Volumina ablaufen zu lassen. Insbesondere für Untersuchungen im Rahmen des High Throughput Screenings (HTS) finden solche Dispensiertechniken Anwendung (Technologieanalyse Lasergestützte Verfahren für das Hochdurchsatz-Screening; Zukünftige Technologien Nr. 33; Düsseldorf 05.2000; ISSN 1436-5928).

Ein besonderes Problem bei der Miniaturisierung der Probenvolumina stellt die schnelle Verdunstung dar. Dies ist insbesondere nachteilig, wenn die gewünschten Reaktionen über einen Zeitraum von mehreren Minuten bis Stunden ablaufen sollen. Proben von ca. 150 pl verdampfen z. B. unter Laborbedingungen innerhalb weniger Sekunden. Eine Analyse der Reaktionsprodukte ist demnach nur möglich, wenn die Reaktionen in dem Probenvolumen sehr schnell ablaufen und die Reaktionsprodukte auch im eingetrockneten Zustand oder nach einmaligem Eintrocknen noch auswertbar sind. Dies ist bei empfindlichen biochemischen Reaktionen oft nicht gegeben. Zudem werden häufig Reaktionszeiten von mehreren Stunden benötigt. Plattformen, in denen Submikro litervolumina genutzt werden, sind daher i.d.R. nur für wenige Reaktionen geeignet, von denen bekannt ist, daß sie innerhalb der durch Verdunstung vorgegebenen Zeiten ablaufen und sich auswerten lassen. Wobei auch dann das Problem nicht konstanter Versuchsbedingungen aufgrund der Konzentrationsänderung entsteht. Ein Beispiel hierfür ist die Hybridisierung von fluoreszenzmarkierten Stoffen mit DNA auf Biochips.

Andere Systeme zur Untersuchung kleinster Volumina arbeiten im Durchflußverfahren, wobei eine Probe über ein Kapillarsystem verschiedene fertig präparierte Analyseorte erreicht (Technologieanalyse Lasergestützte Verfahren für das Hochdurchsatz-Screening; Zukünftige Technologien Nr. 33; Düsseldorf 05.2000; ISSN 1436-5928). Derartige Systeme werden von der amerikanischen Firma Agilent angeboten.

Zur Reduzierung der ungewünschten Verdunstung ist es bekannt, Proben in kleine, luftdicht verschlossene Kompartimente zu bringen, wie es zum Beispiel bei Multi-Well-Platten geschieht. Für eine hohe Anzahl sehr kleiner Volumina werden dazu aufwendig strukturierte Probenträger benötigt. Ein späteres Zufügen von Substanzen zu den Proben ist bei dieser Vorgehensweise sehr schwierig.

So bietet die amerikanische Firma Corning Inc. unter der Marke CMT-GAPS eine Hybridisierungskammer an, die durch eine mit zwei Klammern fixierte Abdeckung Feuchtigkeit im Reaktionssaum hält. Bei dieser Kammer handelt es sich jedoch um eine kleine, in der Größe eines typischen Objektträgers gestaltete Probenkammer, die keine Steuerung der Feuchtigkeit erlaubt und nicht für weitere Manipulationen an der Probe geeignet ist.

Eine weitere bekannte Methode ist das Überschichten der Proben mit einer leichtflüchtigen Flüssigkeit, wie z. B. Oktan, die sich nicht mit den Proben mischt. Dieses Verfahren ist aber technisch aufwendig und mit einem hohen Kontaminationsrisiko behaftet. Durch Kondensationseffekte besteht zudem die Gefahr des Überlaufens der Probengefäße und damit der Vermischung der unterschiedlichen Proben (Litborn E. et al, Liquid lid for chemical reactions in chipbased nanovials, J. of Chromatography B, 137-147 (2000)).

Aus DE 37 12 531 C1 ist es bekannt, biologische Proben zu deren Kryosubstitution im Innenraum einer Probenkammer in einem Metallkörper anzuordnen und den Metallkörper mittels eines Kühlmittels auf einer gewünschten Temperatur von -80°C zu halten. Dabei werden alle im Metallkörper vorgesehenen Proben auf dieser Temperatur gehalten.

Aus DE 41 15 586 A1 ist es zur Klimatisierung eines Prüfraumes in einem Klimaschrank bekannt, die Luft durch Einstellen deren Temperatur oder Luftfeuchtigkeit zu konditionieren. Dies erfolgt durch Einbau einer Luftbefeuchtigungseinrichtung oder durch geeignete Heiz- und/oder Kühleinrichtungen.

Aus WO 98/09437 A1 ist es bekannt, mehrere Proben auf einem Probenträger anzuordnen und die Reaktionstemperatur am Probenträger durch eine Belüftungseinrichtung und durch eine Quarz-Halogenlampe zu steuern.

Bei den bekannten Vorrichtungen und Verfahren ist es schwierig, eine stark miniaturisierte Probe ohne Volumenverlust auf die erforderlichen Versuchsbedingungen einzustellen und diese entweder während der Versuchsdauer konstant zu behalten oder gezielt zu verändern. Ebenso ist es schwierig, unterschiedliche Dispensoren, Wasch- oder Mess- bzw. Auswertevorrichtungen einzusetzen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung und ein Verfahren der eingangsgenannten Art bereitzustellen, bei denen für die Proben jeweils gewünschte Klimatisierungsbedingungen geschaffen werden.

Die Aufgabe wird bei einer klimatisierbaren Probenkammer gemäß Anspruch 1 und beim Verfahren gemäß Anspruch 17 gelöst.

Dabei können physikalische Parameter der Probe so beeinflusst werden, dass sich optimale Reaktionsbedingungen auch bei kleinen Probenvolumina erreichen und konstant halten lassen.

Um die klimatischen Parameter besonders effektiv zu kontrollieren, kann die Probenkammer einen geschlossenen Probenraum aufweisen. Die Luftfeuchtigkeit und die Temperatur über der Probe können mit Hilfe von Feuchtigkeitsdetektoren und Temperatursensoren, die in der direkten Probenumgebung angebracht sein können, ermittelbar und regulierbar sein.

Durch Verwendung von Heiz- und Kühlvorrichtungen zur Temperatureinstellung des Klimatisierungsmediums im Reservoir und den Einsatz eines Umluftsystems zur Regulierung der Luftfeuchtigkeitsverteilung innerhalb der Kammer kann ein geeigneter Luftstrom erzeugt werden, der Feuchtigkeit aus dem Reservoir aufnimmt und diese zur Herstellung einer definierten Luftfeuchtigkeit in den Raum über den Proben transportiert. Die der Erzeugung eines definierten Klimas in der Probenumgebung dienenden Vorrichtungen können über eine computergestützte Steuereinheit gekoppelt sein, die die Kondensations- und/oder Verdunstungsraten und Temperaturen steuert. Die Steuerung der Kondensations- und/oder Verdunstungsraten erfolgt vorzugsweise über das Umluftsystem. Ein definiertes Anfeuchten des Luftstromes kann auch über ein außerhalb der Probenkammer angeordnetes regelbares Lüftungssystem erfolgen. Des weiteren kann die Probenkammer mit einem außerhalb der Kammer angeordneten Reservoir zur Anfeuchtung der Luft verbunden sein, so daß eine externe Feuchtigkeitsanreicherung erfolgen kann. Darüber hinaus kann die erfindungsgemäße Probenkammer mit einem Überwachungssystem ausgestattet sein, das eventuell im Laufe einer Versuchsdurchführung auftretende Undichtigkeiten der Probenkammer automatisch durch Änderung der Klimaparameter ausgleicht.

Bei der erfindungsgemäßen Probenkammer kann die Feuchtigkeitsaufnahme des Luftstroms durch eine vergrößerte Oberfläche des Klimatisierungsmediumreservoirs bzw. des Klimatisierungsmediums beschleunigt werden. Vorzugsweise erfolgt dies durch durch die Verwendung eines schwammartigen Körpers oder durch den Einsatz eines Verneblers. Die Oberflächenvergrößerung hat den Vorteil, daß sich die gewünschten Klimabedingungen in besonders kurzer Zeit einstellen lassen.

Über eine Bestrahlung, z. B. durch eine Lichtquelle, kann die Temperatur an bestimmten Probenorten gezielt verändert werden, um so die Kondensation bzw. das Verdunsten an diesem Ort zu beeinflussen. Zum anderen kann die Strahlenquelle dazu dienen, die Temperatur in der Probe so einzustellen, daß bestimmte chemische Reaktionen, die ein definiertes Temperaturoptimum erfordern, bevorzugt oder benachteiligt ablaufen. Daraus ergibt sich der weitere Vorteil, daß unterschiedliche Versuchsparameter parallel geprüft werden können, was wiederum bei aufwendigen Versuchsanordnungen eine Zeitersparnis bedeuten kann. Darüber hinaus kann die Bestrahlung auch zur Anregung von photochemischen Reaktionen in der Probe bzw. an dem Probeort genutzt werden. Die Bestrahlung des Probenträgers kann mit Hilfe einer Maske, die auf dem Probenträger abgebildet wird oder durch Abrastern des Probenträgers mit einem Lichtstrahl erfolgen. Die Steuerung des Aufbaus kann unter Zuhilfenahme einer zentralen rechnerbasierten Steuereinheit optimiert werden.

Bei der erfindungsgemäßen Probekammer werden die eigentliche Kammer, das Klimatisierungsmediumreservoir und der Probenträger vorzugsweise unabhängig voneinander temperiert. Der Vorteil einer solchen Konstruktion liegt in der großen Flexibilität, die es der durchführenden Person erlaubt, besonders für komplizierte, mehrstufige und/oder zeitlich aufwendige Reaktionsabläufe die jeweils optimalen Bedingungen einzustellen, zu erhalten oder zu verändern. Damit besteht die Möglichkeit, ein Probenfeld bezüglich der Probenorte und der Probenzusammensetzung nach den jeweiligen Versuchserfordernissen optimal einzustellen.

Mit der erfindungsgemäßen Probenkammer kommen vorzugsweise stahlungsdurchlässige, insbesondere transparente Probenträger, wie Objekträger aus Glas oder Polycarbonat, zum Einsatz. Die Transparenz der Probenträger bietet den Vorteil, optische Auswertungen und Manipulationen ohne ein Öffnen der Kammer durchführen zu können. Insbesondere erlaubt die stahlungsdurchlässige Ausgestaltung die Beobachtung der Probe während des Reaktionsablaufes mit Hilfe eines Mikroskops.

In einer bevorzugten Probenkammer ist erfindungsgemäß eine vollständige Trennung des eigentlichen Probenraumes zu den der Probenherstellung und -auswertung dienenden Gerätschaften möglich. Die Abdeckung der Proben kammer kann zu diesem Zweck als Lochplatte ausgestaltet sein. Durch diese Lochplatte können die Dispensoren und Wascheinrichtungen zur Herstellung und Bearbeitung der Proben eingeführt werden. Die externe Anordnung dieser Geräte bietet den Vorteil, daß die Dispensier- und auch die der Auswertung dienenden Messgeräte nicht wassertest gearbeitet sein müssen. Dadurch ist eine deutlich kostengünstigere Konstruktion möglich.

Für die Behandlung und Auswertung der Proben können in der erfindungsgemäßen Probenkammer Mittel unterschiedlicher Art insbesondere optische Mittel aber auch z. B. Mikrowellen oder mechanische Mittel zum Einsatz kommen. Als Detektoren zur Messung von beispielsweise Fluoreszenzen oder Lumineszenzen aus den Proben können je nach benötigter Empfindlichkeit Photomultiplier, Avalachedioden oder Kamerasysteme in Frage kommen. Um nur in einzelnen räumlichen Bereichen der Proben Messungen durchzuführen, kann ein konfokaler optischer Aufbau benutzt werden. Ein solcher Aufbau bietet den Vorteil, daß der Einfluß von störenden Randeffekten wie einsetzende Trocknung oder Vermischung der Probe mit winzigen Kondensationströpfchen in der direkten Nachbarschaft der Probe unterdrückt werden kann. Für bestimmte Messungen kann die Probenkammer lichtdicht verschlossen werden, so daß beispielsweise kein Umgebungslicht die Messung stören kann. Die jeweilige optische Meßvorrichtung kann sich unterhalb des strahlungsdurchlässig gestalteten Probenträgers befinden. Gleichzeitig können auch Lichtstrahlen in die Probenkammer eingekoppelt werden, so daß einzelne Areale des Probenträgers gezielt bestrahlt werden können. Die jeweiligen optischen Wege können sich lichtdicht kapseln lassen. Mit Hilfe von geeigneten elektronischen Verschlüssen kann das Eindringen von Störlicht verhindert und die Beleuchtung bzw. Bestrahlung der Proben gezielt gesteuert werden. Die Auswertung kann je nach Versuchsanordnung beispielsweise über radioaktive Stoffe, über Oberflächenplasmonen-Anregung oder Kontaktverfahren wie der Rasterkraftmikroskopie erfolgen.

Für Untersuchungen im Rahmen des High Throughput Screenings kann die erfindungsgemäße Probenkammer mit Nanoliter-Probenfelder beispielsweise zur Analyse von DNA/RNA-Molekülen, Proteinen, Peptiden und/oder Polysacchariden ausgestattet werden. Durch den Vorteil der getrennten Klimatisierung der einzelnen Kompartimente der Probenkammer können gerade für empfindliche – überwiegend unter physiologischen Bedingungen ablaufende – Reaktionen optimaler Versuchsbedingungen geschaffen werden.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das die Proben mit den erforderlichen Klimawerten versorgende gasförmige Medium beispielsweise durch die in den Ausführungsbeispielen genannten Vorrichtungen auf bestimme Klimaparameter eingestellt werden. Im Anschluß daran kann in der geschlossenen Kammer die Temperierung des Probenträgers erfolgen. Durch den unmittelbaren Transport des bereits eingestellten gasförmigen Mediums und eine entsprechende Temperierung des Probenträgers können die Proben ohne Verdunstungsgefahr den für den Versuchsablauf optimalen Bedingungen ausgesetzt werden. Eine zusätzliche Einflußnahme auf die Einstellung der Klimaparameter besteht durch die Bestrahlung der Probenträgerorte.

Nach einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Analyse von Reaktionen in Nano- und Pikoliterproben kann mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung nach dem Aufbringen einer Pikoliter-Substanzmatrix aus einer ersten Substanz auf den Probenträger nachfolgende Substanzen hinzugefügt werden und dabei die Konzentration der ersten Substanz variiert werden, indem ein bis mehrere Pikolitertropfen der nachfolgenden Substanz an einen Probenort abgegeben werden. Des weiteren besteht durch das Hinzufügen von Substanzen, die einen gewünschten Reaktionspartner am Probenort immobilisieren, die Möglichkeit, mehrere Reaktions- und Waschvorgänge in einem Probenvolumen durchzuführen. In einer bevorzugten Ausführungform werden magnetische Partikel verwendet, die mit Hilfe eines Elektromagneten am Probenort gehalten werden. Auf diese Weise kann ein Reaktionspartner an magnetische Partikel immobilisiert und diese im ersten Reaktionsschritt dispensiert werden. Bei Waschschritten können diese Partikel durch einen Elektromagneten, der unter dem Waschort befestigt ist, auf dem Probenträger fixiert werden. Diese Vorgehensweise ermöglicht ein besonders kostengünstiges Screening mit unterschiedlichen Reaktionen, da die Probenträger nicht für jede Reaktion spezifisch präpariert werden müssen.

Ein einfaches Anwendungsbeispiel für die erfindungsgemäße Probenkammer ist ein miniaturisierter ELISA (enzyme linked immunosorbent assay). Es können aber auch komplexe biochemische Synthesen und Reaktionsketten durchgeführt werden, bei denen ein Reaktionspartner an einem Reaktionsort auf dem dafür präparierten Probenträger immobilisiert wird. Ein weiteres Beispiel ist eine EDC Kopplung von Proteinen an einen mit Gold bedampften, beschichteten Glasobjektträger, der für eine Auswertung von SPR (surface plasmon resonance)-Signalen geeignet ist. Die erfindungsgemäße Probenkammer eignet sich darüber hinaus für Reaktionen, denen eine Kopplung von Antikörpern an eine Trägeroberfläche vorangeht und zu denen Untersuchungsmaterial hinzugegeben wird, das beispielsweise ein entsprechendes Antigen enthält.

Darüber hinaus kann die erfindungsgemäße Probenkammer der Durchführung von Zellassays mit vereinzelten pro- bzw. eukaryontischen Zellen dienen, da jeder Probenort auch ein Behältnis für eine einzelne oder wenige Zellen darstellen kann, die in darauf folgenden Schritten z.B. auf die Wirkung von toxischen oder pharmazeutisch wirksamen Stoffen untersucht werden kann.

Die erfindungsgemäße Probenkammer bietet den großen Vorteil unterschiedlicher Auswertemöglichkeiten und damit die Flexibilität, eine Vielzahl von Versuchsanordnungen durchführen zu können.

In der Zeichnung ist ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Probenkammer dargestellt. Es zeigen:
1: eine schematische Schnittansicht der klimatisierbaren Probenkammer;
2: Schnittansicht eines erfindungsgemäßen Probenträgers mit lokaler Beeinflussung der Temperatur des Probenträgers

a) durch eine Heiz- oder Kühlvorrichtung
b) durch einen temperierten Luftstrom;
c) durch temperierbare Stempel;
d) durch Strahlung;

3: Darstellung der Positionierung:

a) des erfindungsgemäßen Probenträgers,
b) des Dispensors,
c) von Teilen der erfindungsgemäßen Kammer, die jeweils mit Probenträger und Dispensor fest verbunden sind,

4: Schnittansichten verschiedener Ausführungsformen von Probenträgern:

a) planer Probenträger,
b) beschichteter Probenträger,
c) strukturierte Probenträger;

5: Darstellung der optischen Wege beim Auslesen von Signalen und zum Heizen von Probenträgerbereichen;
6: Darstellung der optischen Wege zum Nachweis von Massenanlagerungen mit Hilfe der Oberflächenplasmonen-Resonanz und der Ellipsometrie;
7: Probenkammer mit den Zugängen für Dispensier-, Heiz-, Kühl-, Bestrahlungs-, Magnet- und Auslesevorrichtungen etc.;
8: Probenkammer mit Probenträgerwechselvorrichtung.
In einer Probenkammer 6 befindet sich ein Probenträger 1 mit Proben 2, ein temperierbares Wasserreservoir als Klimatisierungsmediumreservoir 5 für die Regulation des Kammerklimas, Sensoren 4 zu dessen Überwachung und wenigstens ein Dispensor 7 in einem Gehäuse mit einer Abdeckung 9. Außerhalb des Gehäuses sind Auswertegeräte 8 angeordnet.
Zur Herstellung, Behandlung und Auswertung von Proben mit Volumina bis hin- unter in den Pikoliterbereich wird der Probenträger 1 zunächst in die Probenkammer 6 eingesetzt und die Proben 2 dann durch einen in einer Lochplatte in der Abdeckung 9 der Probenkammer angeordneten Dispensor 7 auf den Probenträger 1 aufgebracht. Das Volumen der Probe 2 wird nach dem Aufbringen durch eine gezielte Beeinflussung der Verdunstung über eine Zeit von bis zu mehreren Stunden computergestützt reguliert. Dazu werden in der Probenkammer 6 die Luftfeuchtigkeit über der Probe 2, die Lufttemperatur und die Temperatur des Probenträgers 1 so geregelt, daß sich eine gewünschte Verdunstungs- oder Kondensationsrate auf dem Probenträger 1 kurzfristig einstellt.
Das Klimatisierungsmediumreservoir 5 der Probenkammer 6 besitzt zu diesem Zweck Heiz- bzw. Kühlvorrichtungen zur Erzeugung einer bestimmten Temperatur und Luftfeuchtigkeit in dem Luftraum über der Probe 2.
Über einen an der Stirnseite der Probenkammer 6 befindlichen Auslaß 101, Schläuche 104, eine variierbare Pumpe 102 und einen Einlass 106 wird die Luft umgewälzt, um einen homogenen Luftstrom über der Probe 2 zu erzeugen. Ein Luftstrom 3 über den Proben 2 und über dem Klimatisierungsmediumreservoir 5 ist durch Pfeile gekennzeichnet.
Zur Vergrößerung des Probenvolumens wird die Luftfeuchtigkeit im Luftstrom 3 soweit erhöht, dass das Wasser der Klimatisierungsmediumreservoirs 5 an den Proben 2 kondensiert. Für eine Aufkonzentrierung der Proben 2 wird hingegen die Luftfeuchtigkeit im Luftstrom 3 so weit gesenkt, dass Probenflüssigkeit verdunstet.
Eine Steigerung der Feuchtigkeitsaufnahme wird bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel durch die Vergrößerung der Oberfläche des Klimatisierungsmediumreservoirs 5 durch ein schwammartiges Gewebe oder durch den Einsatz eines Verneblers erreicht. Eine weiter Alternative ergibt sich aus der Möglichkeit, den Luftstrom 3 außerhalb der Probenkammer (6) mit einer bestimmten Feuchtigkeit anzureichern.
Indem die Probenkammer 6, das Klimatisierungsmediumreservoir 5 und der Probenträger 1 getrennt heizbar ausgebildet sind, können Temperaturunterschiede zwischen der zu 100% gesättigten Luft und Punkten auf dem Probenträger 1 für eine gezielte Verdampfung oder Kondensation des Klimatisierungsmediums optimal genutzt werden. Das Verdunsten kleiner Probenvolumina wird in der geschlossenen Probenkammer durch eine Luftfeuchtigkeit von annähernd 100% auf ein Minimum reduziert, während die durch eine Übersättigung der Luft mit Wasser oder einem anderen Klimatisierungsmedium eintretende Kondensation zur gezielten Volumenvergrößerung eingesetzt werden kann.
Wie in 2 dargestellt, erfolgt die Temperierung des Probenträgers 1 durch einen Heizwiderstand oder ein Peltierelement 15, das sich im direkten Kontakt mit dem Probenträger 1 befindet, durch einen von unten an den Probenträger herangeführten Luftstrom, durch temperierbare Stempel 17 oder durch Strahlen einer geeigneten Wellenlänge, die beispielsweise durch einen Laser 20 erzeugt und über eine Focussier- oder Ablenkeinrichtung 19 auf den Probenträger 1 gelenkt werden. Der Strahlengang wird durch eine Maske mit entsprechender Abbildungsoptik oder durch einen optischen Scanner 18 an die vorgesehen Orte geleitet. So kann mit Hilfe des Bestrahlungsmusters und durch die Wahl einer geeigneten Leistung, die Kondensations- bzw. Verdunstungsrate des Klimatisierungsmediums an verschiedenen Reaktionsorten unterschiedlich eingestellt werden.
Der Probenträger 1 und der wenigstens eine Dispensor 7 sind relativ zueinander bewegbar (3), um die Proben an den vorgesehenen Positionen des Probenträgers 1 aufzubringen. Diese Relativbewegung erfolgt durch die Bewegung des Probenträgers 1, des Dispensors 7 oder beider. Als Dichtung 21 für die beweglichen Bauteile werden z. B. Balgendichtungen oder Flüssigkeitsfilme eingesetzt.
In dem in 4 dargestellten Ausführungsbeispiel a) ist der Probenträger in Form einer planaren Glasplatte 11 vorgesehen, während in dem Ausführungsbeispiel b) die Oberfläche 12 des Probenträgers durch eine Beschichtung 23 hydrophob und durch eine Beschichtung 24 hydrophil strukturiert ist, so daß die Proben an bestimmten Orten auf dem Probenträger stabil vorliegen. In dem in 3 dargestellten Ausführungsbeispiel c) sind Vertiefungen 13, 14 für die Aufnahme der Proben vorgesehen.
Die 5 und 6 zeigen vorteilhafte Auswertevorrichtungen für die Messungen der unterschiedlichen, in den Proben ablaufenden Vorgänge. Diese sind unterhalb der Probenkammer 6 angebracht und können für optische Meßverfahren wie Chemolumineszenz, Fluoreszenz (z. B. mit einer Xenonlampe 27), und Oberflächenplasmonen-Anregung, vorgesehen sein. Das Auslesen von Fluoreszenz und Chemolumineszenz erfolgt in 5 mit einem Detektor 28, während ein Laserstrahl eines Lasers 29 über einen Scanner 30 auf den Probenträger 1 gelenkt wird. Die Proben werden von einem Aufbau analog zu einem Fluoreszenzmikroskop auf dem Detektor 28 abgebildet. Im Fall der Oberflächenplasmonenresonanz-Auswertung oder der Ellipsometrie, wie in 6 dargestellt, wird der Probenträger mit einer geeigneten Beschichtung wie z.B. einer Goldbedampfung versehen, die entsprechende Resonanzen aufweist. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, radioaktiv markierte Proben mit einem in einer unter dem Probenträger 1 vorgesehenen Filmhalterung angeordneten Film zu untersuchen.
Die in 7 gezeigte Vorrichtung besteht im wesentlichen aus drei Räumen: der Probenkammer 6, in der der Probenträger 1 fixiert wird, einem Raum, der die Probenkammer 6 umschließt und einem Raum unterhalb der Probenkammer 6, in denen sich Auswertegeräte 8 für optische Messungen befinden. Der Probenträger 1 wird über eine xy-Positioniereinheit 25 relativ zu den Dispensoren 7 positioniert, ohne daß dabei die Probenkammer 6 geöffnet werden muß. Durch die als Lochmaske ausgestaltete Abdeckung 9 der Probenkammer 6 ragen die beweglich kanstruierten Dispensoren und Waschvorrichtungen. Die Abdeckung 9 verschließt die Probenkammer 6 luftdicht und ist strahlungsdurchlässig ausgebildet, um einen optischer Zugang zu den Proben 2 zu ermöglichen. Die Abdeckung 9 besteht aus Glas, Quarz oder Plexiglas. Der Probenträger 1 ist in einer Aussparung in der unteren Wandung 26 der Probenkammer 6 so gelagert, dass durch reines Aufliegen oder durch die zusätzliche Dichtung 21 die Probenkammer 6 luftdicht verschlossen ist. Auf diese Weise bil det der Probenträger 1 einen Teil der Wandung der Probenkammer 6 und ermöglicht, die Proben 2 direkt durch den Probenträger 1 zu analysieren. Die untere Wandung 26 der Probenkammer 6 wird mit Hilfe eines xy-Positioniersystems 25 relativ zu den verschiedenen Dispensoren 7 angeordnet.
8 zeigt eine detaillierte Zeichnung der Probenträgerwechselvorrichtung und die Lagerung des Probenträger 1 in einem ihn umgebenden Klimatisierungsmediumreservoir 22. Die Probenkammer 6 verfügt über die untere Wandung 26, in die der Probenträger 1 eingesetzt wird und damit zu einem Teil der Wandung der Probenkammer 6 wird. Von besonderer Bedeutung ist die gas- und flüssigkeitsdichte Dichtung 21 zwischen Probenkammer 6 und Probenträger 1. Die untere Wandung 26 der Probenkammer 6 ist entweder fest mit dieser verbunden oder in Form einer Schublade ausgebildet, die mehrere Aufnahmen für Probenträger 1 enthält, so dass durch Verschieben der Probenkammer 6 gegenüber der unteren Wandung 26 der Probenträger 1 frei wird und damit gewechselt werden kann, ohne daß die Probenkammer 6 vollständig geöffnet werden muß. Die Probenkammer 6 selber ist derart ausgebildet, daß sie dicht mit der unteren Wandung 26 und der oberen Wandung abschließt. Die Flächen zwischen den einzelnen Komponenten – untere Wandung, obere Wandung und Probenträger – werden unter anderem durch einen Flüssigkeitsfilm abgedichtet, der die Kapillarwirkung von Spalten nutzt.

1: Probenträger
2: Proben
3: Luftstrom
4: Sensoren
5: Klimatisierungsmedium-Reservoir
6: Probenkammer
7: Dispensors
8: Auswertegeräte
9: Abdeckung
11: Glasplatte
12: Oberfläche des Probenträgers
13, 14: Vertiefungen
17: temperierbare Stempel
18: Scanner
19: Fokussier- und Ablenkeinrichtung
20: Laser
21: Dichtung
22: Klimatisierungsmedium-Reservoir
23: hydrophobe Beschichtung
24: hydrophile Beschichtung
25: xy-Positioniereinheit
26: untere Wandung der Probenkammer
27: Xenonlampe
28: Detektor
29: Laser
30: Scanner
101: Auslass
102: Pumpe
104: Schläuche
106: Einlass

Claims

Klimatisierbare Probenkammer zur Durchführung chemischer, biochemischer, biologischer oder physikalischer Reaktionen an Proben im Piko- bis Nanoliterbereich, enthaltend – einen in einer Probenkammer (6) angeordneten Probenträger (1), auf welchem in separaten Probenfeldern die Proben (2) angeordnet sind; – ein Klimatisierungsmediumreservoir (5), mit welchem in der Probenkammer (6) ein Klimatisierungsmedium mit einem Feuchtegehalt von annähernd 100 % eingestellt ist; und wobei – die Proben (2) auf dem Probenträger (1) separat heizbar sind.
Probenkammer nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch ein temperierbares Klimatisierungsmediumreservoir (5).
Probenkammer nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch einen geschlossenen Probenraum in der Probenkammer (6).
Probenkammer nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch ein Umluftsystem (101 – 106) zur Regelung der Luftfeuchtigkeitsverteilung innerhalb der Probenkammer (6).
Probenkammer nach einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch eine vergrößerte Oberfläche des Klimatisierungsmediumreservoirs (5).
Probenkammer nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche des Klimatisierungsmediumreservoirs (5) durch einen schwammartigen Körper vergrößert ist.
Probenkammer nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche des Klimatisierungsmediumsreservoirs (5) durch einen Vernebler vergrößert ist.
Probenkammer nach einem der Ansprüche 1 bis 7, gekennzeichnet durch eine Strahlenquelle (20; 29) zur separaten Bestrahlung der Proben (2) auf dem Probenträger (1 ).
Probenkammer nach Anspruch 8, gekennzeichnet durch eine auf dem Probenträger (1) abbildbare Maske.
Probenkammer nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlenquelle (20; 29) ein Laser ist.
Probenkammer nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenkammer (6), des Klimatisierungsmediumreservoirs (5; 22) und der Probenträger (1) unabhängig voneinander temperierbar sind.
Probenkammer nach einem der Ansprüche 1 bis 11, gekennzeichnet durch eine xy-Positioniereinrichtung (25), mit welcher der Probenträger (1) gegenüber Dispensoren (7) und Waschvorrichtungen sowie Auswertegeräten (8) positionierbar ist.
Probenkammer nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Probenträger strahlungsdurchlässig ist und die Strahlenquelle (20; 29) außerhalb der Probenkammer (16) und unterhalb des Probenträgers (1) angeordnet ist.
Probenkammer nach einem der Ansprüche 1 bis 13, gekennzeichnet durch eine als abdichtbare Lochplatte ausgebildete Abdeckung (9) der Probenkammer (6).
Probenkammer nach Anspruch 14, gekennzeichnet durch in der Abdeckung (9) angeordnete Dispensoren (7) und Wascheinrichtungen.
Probenkammer nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass Dichtungen (21) der Probenkammer (6) als Flüssigkeitsfilme ausgebildet sind.
Verfahren zur Klimatisierung der Umgebung von Proben im Piko- bis Nanoliterbereich, welche in bestimmten Probenfeldern angeordnet sind, bei dem – in der Probenumgebung das Klimatisierungsmedium auf einen Feuchtegehalt von annähernd 100% eingestellt wird und – die jeweiligen Probenfelder selektiv temperiert werden, wobei – die Kondensations- oder Verdunstungsrate des Klimatisierungsmediums an den Probenfeldern eingestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass eine Pikoliter-Substanzmatrix aus einer ersten Substanz auf den Probenträger aufgebracht wird, die Konzentration der ersten Substanz durch Hinzufügen von nachfolgenden Substanzen oder von Klimatisierungsmedium variiert wird, wobei eine unterschiedliche Menge der nachfolgenden Substanzen oder von Klimatisierungsmedium an die jeweiligen Probenorte abgegeben wird und Substanzen, die einen gewünschten Reaktionspartner am Probenort immobilisieren, hinzugefügt werden.
Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass magnetische Partikel mit Hilfe eines Magneten am Probenort gehalten werden.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Klimatisierung der Probenumgebung in Zellassays mit einzelnen oder wenigen prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen verwendet wird.