DE10118554A1 - New system of two or more different enzymes, useful e.g. for degradation of alkylpolyglycoside detergents, and as biosensors, bioreactors and chromatography materials - Google Patents
New system of two or more different enzymes, useful e.g. for degradation of alkylpolyglycoside detergents, and as biosensors, bioreactors and chromatography materialsInfo
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft enzymatische Systeme mit Enzymabbau ketten aus Enzymen verschiedenen Typs, vorzugsweise im immobilisierten Zustand, und ihre Verwendung, insbesondere für die Anwendung in Biore aktoren, Biosensoren und chromatographischen Systemen.The present invention relates to enzymatic systems with enzyme degradation chains of different types of enzymes, preferably immobilized Condition, and their use, especially for use in biore actuators, biosensors and chromatographic systems.
In der angewandten Mikrobiologie, insbesondere in der Biotechnologie, ist es bekannt, Enzyme, enzymproduzierende Mikroorganismen oder Zellen auf bestimmten Trägern zu fixieren, beispielsweise wenn sie als Biokatalysatoren verwendet werden. Dieser Vorgang wird im allgemeinen als Immobilisierung bezeichnet.It is in applied microbiology, especially in biotechnology known, enzymes, enzyme-producing microorganisms or cells to fix certain carriers, for example if they are used as biocatalysts be used. This process is commonly called immobilization designated.
Da native Enzyme bei der Lagerung oder beim einmaligen Batch-Ansatz durch biologische, chemische oder physikalische Einwirkungen in ihrer Akti vität reduziert werden, besteht wegen der hohen Herstellungskosten von Enzymen ein Bedarf, diese Enzyme zu stabilisieren. Durch die Immobilisie rung werden sie wiederverwendbar. Nach der Verwendung können die En zyme leicht wieder abgetrennt werden. Auf diese Weise lassen sie sich in ho her lokaler Konzentration und in kontinuierlichem Durchfluß einsetzen. Die Substrat-Spezifität und die Spezifität der Reaktion sowie die Reaktivität des Enzyms dürfen durch die Immobilisierung nicht verloren gehen.As native enzymes during storage or with a one-time batch approach through biological, chemical or physical effects in their actions due to the high manufacturing costs of Enzymes have a need to stabilize these enzymes. Through immobilization They are reusable. After use, the En zyme can be easily separated. This way they can be ho local concentration and in continuous flow. The Substrate specificity and the specificity of the reaction as well as the reactivity of the Enzyme must not be lost through immobilization.
Bei der Immobilisierung von Enzymen werden im allgemeinen drei grund sätzliche Methoden unterschieden, nämlich erstens die Immobilisierung durch Quervernetzung, zweitens die Immobilisierung durch Bindung an einen Trä ger und drittens die Immobilisierung durch Einschluß.There are generally three reasons for the immobilization of enzymes different methods, namely firstly by immobilization Cross-linking, secondly the immobilization by binding to a carrier thirdly, immobilization by inclusion.
Bei der Immobilisierung durch Quervernetzung erhält man quervernetzte En zyme, die miteinander fixiert sind, ohne daß ihre Aktivität beeinflußt wird. Die Enzyme sind jedoch nicht mehr löslich. Die Quervernetzung erfolgt bei spielsweise mit Glutardialdehyd.When immobilized by cross-linking, cross-linked enes are obtained enzymes that are fixed to one another without affecting their activity. The However, enzymes are no longer soluble. The cross-linking takes place at for example with glutardialdehyde.
Wenn die Immobilisierung durch Anbindung an einen Träger erfolgt, kann die Bindung durch Adsorption, Ionenbindung oder kovalente Bindung erfolgen. If the immobilization is carried out by connection to a carrier, the Binding takes place by adsorption, ion binding or covalent binding.
Die Bindung an den Träger kann auch innerhalb der ursprünglichen mikro biellen Zelle stattfinden. Das Enzym wird durch die Fixierung nicht in seiner Aktivität beeinflußt, es kann trägergebunden mehrfach oder kontinuierlich eingesetzt werden.The bond to the carrier can also be within the original micro biological cell take place. The enzyme is not in its fixation Activity affects, it can be carrier-bound multiple or continuous be used.
Bei der Immobilisierung durch Einschluß wird das Enzym meist zwischen se mipermeablen Membranen und/oder Gelen, Mikrokapseln oder Fasern einge schlossen. Die gekapselten Enzyme sind z. B. durch eine semipermeable Membran von der umgebenden Substrat- und Produkt-Lösung getrennt. Es können auch Zellen gekapselt werden. Das Enzym ist durch die Fixierung im Raum nicht in seiner Aktivität beeinflußt.When immobilized by inclusion, the enzyme is usually between se mipermeable membranes and / or gels, microcapsules or fibers closed. The encapsulated enzymes are e.g. B. by a semipermeable Separated membrane from the surrounding substrate and product solution. It cells can also be encapsulated. The enzyme is due to the fixation in the Space is not affected in its activity.
Immobilisierte Enzyme, enzymproduzierende Mikroorganismen oder Zellen werden insbesondere in biotechnologischen Verfahren eingesetzt. Die ersten technischen Verfahren mit immobilisierten Zellen wurden empirisch optimiert und werden noch heute eingesetzt, so z. B. die Abwasserreinigung im Tropf körper. Ein ebenfalls älteres Verfahren ist die Essigproduktion mit dem Gene ratorverfahren. Im Nahrungsmittelbereich ist der Einsatz von Zellen mit Glu cose-Isomerase zur Produktion von fructosehaltigem Sirup das wichtigste Verfahren. Glucose-Amylase zur Glucose-Herstellung im Stärkeprozeß wird ebenfalls immobilisiert eingesetzt. Die Spaltung von Lactose mit Hilfe der im mobilisierten β-Galaktosidase aus Hefen zu Glucose und Galactose ist eben falls ein gängiges Verfahren. Weitere technische Verfahren mit immobilisierten Systemen gibt es bei der Aminosäureherstellung, bei der Spaltung von Peni cillin G zu 6-Aminopenicillinsäure und bei der Herstellung von Ethanol mit wachsenden, immobilisierten Zellen von Saccharomyces sp.Immobilized enzymes, enzyme-producing microorganisms or cells are used in particular in biotechnological processes. The first Technical processes with immobilized cells have been empirically optimized and are still used today. B. the wastewater treatment in the drip body. Another older method is the vinegar production with the gene ratorverfahren. In the food sector, the use of cells with glu cose isomerase for the production of fructose syrup the most important Method. Glucose amylase for glucose production in the starch process is also used immobilized. The splitting of lactose with the help of mobilized β-galactosidase from yeast to glucose and galactose is flat if a common practice. Further technical processes with immobilized Systems exist in the production of amino acids, in the cleavage of penis cillin G to 6-aminopenicillinic acid and in the production of ethanol with growing immobilized cells from Saccharomyces sp.
Immobilisierte Enzym- und Zellsysteme werden nicht nur in biotechnologisch ablaufenden Produktionsverfahren, sondern auch in der Analytik eingesetzt, so z. B. in sogenannten Biosensoren. Das Prinzip der Analytik mit Hilfe von immobilisierten Systemen beruht darauf, daß ein zu bestimmendes Substrat durch ein immobilisiertes System umgesetzt wird, wobei die Veränderung der Produkt-, Substrat- oder Cosubstrat-Konzentration verfolgt werden kann, beispielsweise mit mehreren gekoppelten Methoden (z. B. Enzym-Elektro den). Immobilized enzyme and cell systems are not only used in biotechnology ongoing production processes, but also used in analytics, so z. B. in so-called biosensors. The principle of analytics with the help of immobilized systems is based on the fact that a substrate to be determined is implemented by an immobilized system, changing the Product, substrate or cosubstrate concentration can be tracked, for example with several coupled methods (e.g. enzyme electro the).
Oftmals erfolgt der Abbau oder die Umsetzung von Molekülen aber nicht durch ein einziges Enzym, sondern entlang einer sogenannten Enzymabbau kette aus mehreren Enzymen, d. h. die Reaktion wird mehrstufig enzymkata lysiert mit unterschiedlichen Enzymen. Bisweilen ist auch die parallele Be stimmung mehrerer Stoffe durch mehrere unterschiedliche Enzyme oder durch Enzym(abbau-)ketten erforderlich. In herkömmlichen Biosensoren und Bioreaktoren des Standes der Technik kann eine solche mehrfach enzyma tisch katalysierte Reaktionsfolge aber oftmals nur selten durchgeführt wer den, weil die aus dem Stand der Technik bekannten Bioreaktoren und Bio sensoren vorzugsweise einen Typ von Enzym umfassen.Often, however, molecules are not broken down or converted through a single enzyme but along a so-called enzyme breakdown chain of several enzymes, d. H. the reaction is enzymkata in several stages lyses with different enzymes. Sometimes the parallel Be mood of several substances by several different enzymes or due to enzyme (degradation) chains required. In conventional biosensors and Prior art bioreactors can use such a multiple enzyme table-catalyzed reaction sequence but often only rarely carried out who that because the bioreactors and bio sensors preferably comprise a type of enzyme.
Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Problem besteht darin, ein System bereitzustellen, mit dem sich auch solche Prozesse enzymatisch kata lysieren lassen, die mehrstufig enzymatisch ablaufen, d. h. bei denen die Mo leküle, insbesondere Biomoleküle oder technische Moleküle, in mehreren Stu fen enzymatisch katalysiert abgebaut oder zu Endprodukten umgesetzt wer den, wobei die Umsetzung innerhalb nur eines einzigen enzymatischen Sy stems, aber mit verschiedenen Enzymen erfolgen soll.The problem underlying the present invention is a To provide a system with which such processes can also be enzymatically catalyzed Allow lysing that takes place in a multi-stage enzymatic manner, d. H. where the Mon leküle, in particular biomolecules or technical molecules, in several hours enzymatically catalyzed or converted into end products the, the implementation within only a single enzymatic Sy stems, but with different enzymes.
Des weiteren liegt der vorliegenden Erfindung das Problem zugrunde, ein System bereitzustellen, mit dem auch die parallele Umsetzung mehrerer Stoffe durch mehrere unterschiedliche Enzyme oder durch Enzym(abbau-)ketten möglich ist.Furthermore, the present invention addresses the problem of a Provide system with which the parallel implementation of several substances by several different enzymes or by enzyme (degradation) chains is possible.
Insbesondere soll ein solches System zur Anwendung in Bioreaktoren, Bio sensoren und chromatographischen Systemen geeignet sein.In particular, such a system for use in bioreactors, bio sensors and chromatographic systems.
Es wurde nun hier überraschenderweise herausgefunden, daß das zuvor ge nannte Problem gelöst werden kann durch Kombination von mindestens zwei verschiedenen Enzymen, d. h. mindestens zwei verschiedenen Typen von Enzymen, die vorzugsweise jeweils in immobilisierter Form vorliegen können.It has now surprisingly been found here that the previously ge mentioned problem can be solved by combining at least two different enzymes, i. H. at least two different types of enzymes, which are preferably each in immobilized form can.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein enzymatisches System, welches eine Enzymabbaukette umfaßt, die ihrerseits mindestens zwei verschiedene bzw. unterschiedliche Enzyme, d. h. Enzyme unterschiedlichen Typs, umfaßt.The present invention thus relates to an enzymatic system which comprises an enzyme degradation chain, which in turn has at least two different ones or different enzymes, d. H. Enzymes different Type.
Die mindestens zwei Enzyme der Enzym(abbau-)kette sind dabei derart auf einander abgestimmt, daß sie, insbesondere selektiv oder im wesentlichen se lektiv, mindestens ein bestimmtes Molekül - auch als "Target-Molekül" be zeichnet - abbauen.The at least two enzymes of the enzyme (degradation) chain are based on this coordinated with one another so that they, in particular, selectively or essentially lective, at least one specific molecule - also as a "target molecule" draws - dismantle.
Gemäß einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Enzyme der Enzym(abbau-)kette derart aufeinander abgestimmt sein, daß sie, insbesondere selektiv oder im wesentlichen selektiv, mindestens ein nicht na türlich vorkommendes Molekül, insbesondere ein technisches Molekül, ab bauen. Dabei können die Enzyme der Enzym(abbau-)kette beispielsweise derart aufeinander abgestimmt sein, daß sie das nicht natürlich vorkommende Molekül, insbesondere technische Molekül, gemäß einem nicht natürlich vor kommenden Metabolismus abbauen, d. h. eine nicht natürlich vorkommende Metabolismuskette bilden. Alternativ können aber die Enzyme der En zym(abbau-)kette auch derart aufeinander abgestimmt sein, daß sie das nicht natürlich vorkommende Molekül, insbesondere technische Molekül, gemäß einem natürlich vorkommenden Metabolismus abbauen, d. h. eine natürlich vorkommende Metabolismuskette bilden, welche aber natürlich vorkommend den Abbau anderer, nämlich natürlich vorkommender Moleküle reguliert.According to a first embodiment of the present invention, the Enzymes in the enzyme (degradation) chain must be coordinated with one another in such a way that in particular selective or essentially selective, at least one not na naturally occurring molecule, in particular a technical molecule to build. The enzymes of the enzyme (degradation) chain can, for example be coordinated so that they do not occur naturally Molecule, especially technical molecule, according to a not natural reduce upcoming metabolism, d. H. a non-natural one Form metabolism chain. Alternatively, the enzymes of En zym (degradation) chain can also be coordinated so that they do not naturally occurring molecule, especially technical molecule, according to break down a naturally occurring metabolism, d. H. one of course Form occurring metabolism chain, which occurs naturally regulates the breakdown of other, namely naturally occurring, molecules.
Gemäß einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Enzyme der Enzym(abbau-)kette derart aufeinander abgestimmt sein, daß sie, insbesondere selektiv oder im wesentlichen selektiv, mindestens ein na türlich vorkommendes Molekül gemäß einem nicht natürlich vorkommenden Metabolismus abbauen. Das natürlich vorkommende Molekül kann bei spielsweise ein Naturstoff sein.According to a second embodiment of the present invention the enzymes of the enzyme (degradation) chain must be coordinated with one another in such a way that they, in particular selectively or essentially selectively, at least one na naturally occurring molecule according to a non-naturally occurring one Reduce metabolism. The naturally occurring molecule can for example, be a natural product.
Das erfindungsgemäße enzymatische System eignet sich insbesondere zum konsekutiven und/oder mehrstufigen Abbau von Molekülen. Dabei verläuft der Abbau vorzugsweise selektiv oder im wesentlichen selektiv in bezug auf das oder die abzubauenden Moleküle. The enzymatic system according to the invention is particularly suitable for consecutive and / or multi-stage degradation of molecules. It runs the degradation is preferably selective or substantially selective with respect to the molecule or molecules to be broken down.
Des weiteren kann das erfindungsgemäße enzymatische System insbesondere zur Katalyse mehrstufig enzymatisch katalysierter Reaktionen eingesetzt werden.Furthermore, the enzymatic system according to the invention can in particular used for catalysis of multi-stage enzymatically catalyzed reactions become.
Gleichermaßen eignet sich das erfindungsgemäße enzymatische System zur parallelen Umsetzung von verschiedenen Molekülen mit jeweils unterschied lichen Enzymen.The enzymatic system according to the invention is equally suitable for parallel implementation of different molecules, each with a difference enzymes.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt in dem erfindungsgemäßen enzymatischen System mindestens eines der En zyme der Enzym(abbau-)kette in immobilisierter Form vor. Vorzugsweise können bei dieser Ausführungsform alle Enzyme der Enzym(abbau-)kette in immobilisierter Form vorliegen.According to a particular embodiment of the present invention in the enzymatic system according to the invention at least one of the enes zyme the enzyme (degradation) chain in immobilized form. Preferably can in this embodiment, all enzymes of the enzyme (degradation) chain in immobilized form.
Die Immobilisierung der Enzyme kann erfindungsgemäß nach den üblichen, zuvor beschriebenen Verfahren des Standes der Technik erfolgen, wobei die Reaktivität der auf diese Weise immobilisierten Enzyme zumindest im we sentlichen erhalten bleiben soll.According to the invention, the immobilization of the enzymes can be carried out according to the usual The previously described methods of the prior art take place, the Reactivity of the enzymes immobilized in this way at least in the week substantial should be preserved.
So kann die Immobilisierung mindestens eines der Enzyme des erfindungs gemäßen enzymatischen Systems beispielsweise durch Quervernetzung er folgen.Thus, the immobilization of at least one of the enzymes of the invention according to the enzymatic system, for example by cross-linking it consequences.
Des weiteren besteht die Möglichkeit, mindestens eines der Enzyme des erfin dungsgemäßen enzymatischen Systems durch Einschluß oder Verkapselung zu immobilisieren, insbesondere durch Einschluß oder Verkapselung in eine semipermeable Membran oder zwischen mehrere semipermeable Membranen, aber auch zwischen eine und/oder mehrere semipermeable Membranen und abschließend eine ionendurchlässige, aber gaspermeable Membran, z. B. aus PTFE oder Silikonkautschuk.There is also the possibility of at least one of the enzymes of the inventin Enzymatic system according to the invention by inclusion or encapsulation to immobilize, in particular by inclusion or encapsulation in a semipermeable membrane or between several semipermeable membranes, but also between one and / or more semipermeable membranes and finally an ion permeable but gas permeable membrane, e.g. B. from PTFE or silicone rubber.
Die Immobilisierung mindestens eines der Enzyme des erfindungsgemäßen enzymatischen Systems kann auch durch Bindung an einen geeigneten Trä ger erfolgen. Hierbei kann die Bindung aufgrund von Adsorption, Ionenbin dung oder/und kovalenter Bindung zustandekommen. Beispielsweise kann die Immobilisierung durch Anbindung an einen geeigneten, vorzugsweise chemisch inerten Träger erfolgt sein, wobei der Träger zuvor durch plasma chemische Oberflächenmodifizierung aktiviert worden sein kann.The immobilization of at least one of the enzymes of the invention enzymatic system can also by binding to a suitable Trä ger done. Here, the binding due to adsorption, ion bin tion and / or covalent bond. For example immobilization by connection to a suitable, preferably chemically inert carrier must have been carried out, the carrier previously by plasma chemical surface modification may have been activated.
Schließlich besteht auch die Möglichkeit, das oder die Enzyme des erfin dungsgemäßen enzymatischen Systems durch ein Verfahren zu immobilisieren ist wie es beschrieben ist in der ebenfalls auf die Henkel KGaA zurück gehende deutsche Patentanmeldung mit dem Amtsaktenzeichen DE 101. . . (kanzlei-internes Aktenzeichen: 00.495.6.do) vom selben Anmeldetag wie die vorliegende Anmeldung, wobei deren gesamter Inhalt hiermit ausdrück lich durch Bezugnahme eingeschlossen ist.Finally, there is also the possibility of inventing the enzyme or enzymes to immobilize the inventive enzymatic system by a method is as described in the Henkel KGaA outgoing German patent application with the official file number DE 101.. , (internal file number: 00.495.6.do) from the same filing date as the present application, the entire contents of which hereby express Lich is included by reference.
Dieses Verfahren umfaßt die folgenden Verfahrensschritte:
This process comprises the following process steps:
- a) Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche durch Modifizierung der Trägeroberfläche mit plasmachemischen Methoden, insbesondere wobei die Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche eine Funktionalisierung der Trägeroberfläche umfaßt und vorzugsweise da durch erfolgt, daß unter plasmachemischen Bedingungen mindestens eine geeignete, gegenüber dem oder den anzubindenden Enzymen re aktive funktionelle Gruppe direkt an der chemisch inerten Trägerober fläche angebracht wird, insbesondere wobei die funktionelle Gruppe vorzugsweise eine Carboxyl-, Amino-, Hydroxy- und/oder Thiogruppe, gegebenenfalls in aktivierter, insbesondere protonierter oder deproto nierter Form, umfaßt; anschließenda) Activation of the chemically inert carrier surface by modification the carrier surface using plasma chemical methods, in particular wherein the activation of the chemically inert carrier surface Functionalization of the carrier surface includes and preferably there by that at least under plasma chemical conditions a suitable one, towards the enzyme or enzymes to be bound active functional group directly on the chemically inert support surface surface is attached, in particular being the functional group preferably a carboxyl, amino, hydroxy and / or thio group, optionally in activated, especially protonated or deproto form, includes; subsequently
- b) Anbindung des oder der zu immobilisierenden Enzyms, gegebenenfalls nach ihrer Überführung in einen aktivierten, anbindungsfähigen Zu stand, an die auf in Schritt (a) aktivierte Trägeroberfläche; und schließ lichb) binding of the enzyme or enzymes to be immobilized, if appropriate after transfer to an activated, connectable Zu stood on the carrier surface activated in step (a); and close Lich
- c) gegebenenfalls Quervernetzung des in Verfahrensschritt (b) ange bundenen Enzyms,c) optionally crosslinking the in process step (b) bound enzyme,
insbesondere wobei die Verfahrensschritte (b) und (c) gegebenenfalls zu sammengefaßt, insbesondere gleichzeitig durchgeführt werden können und/oder die Immobilisierung gegebenenfalls schichtweise, insbesondere mit Glutardialdehyd, durchgeführt werden kann. in particular with the process steps (b) and (c) possibly increasing summarized, in particular can be carried out simultaneously and / or the immobilization, if necessary in layers, in particular with Glutardialdehyde, can be carried out.
Die vorliegende Erfindung betrifft also gemäß einer besonderen Ausfüh rungsform ein enzymatisches System, bei dem mindestens eines der Enzyme, vorzugsweise sämtliche Enzyme der Enzym(abbau-)kette durch Fixierung und/oder Bindung an eine chemisch inerte, plasmachemisch aktivierte und/oder funktionalisierte Trägeroberfläche nach dem zuvor beschriebenen Verfahren immobilisiert sind.The present invention therefore relates to a special embodiment form of an enzymatic system in which at least one of the enzymes, preferably all enzymes in the enzyme (degradation) chain by fixation and / or binding to a chemically inert, plasma-chemically activated and / or functionalized carrier surface according to that previously described Procedures are immobilized.
Die Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche mittels plasmachemi scher Methoden in Schritt (a) des zuvor beschriebenen Verfahrens ist vor zugsweise selektiv nur an der Oberfläche erfolgt, so daß die Bulk-Eigen schaften der chemisch inerten Trägeroberfläche im übrigen erhalten bleiben, wobei die Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche in Schritt (a) des zuvor beschriebenen Verfahrens im reaktiven Plasma, insbesondere Hoch frequenzplasma, erfolgt ist. Die chemisch inerte Trägeroberfläche kann insbe sondere Edelmetalle wie insbesondere Platin sowie deren Legierungen, Edel stahl oder polyhalogenierte Polymere, insbesondere polyhalogenierte poly mere Kohlenwasserstoffe wie insbesondere Polytetrafluorethylen oder Po lyvinylchlorid, oder aber Celluloseacetat oder Kombinationen dieser Ma terialien umfassen. Besonders geeignet sind beispielsweise PTFE-(Teflon®) und Celluloseacetatmembranen.Activation of the chemically inert carrier surface using plasmachemi Scher methods in step (a) of the method described above is before preferably done selectively only on the surface, so that the bulk property properties of the chemically inert carrier surface are otherwise retained, wherein the activation of the chemically inert carrier surface in step (a) of the previously described method in reactive plasma, in particular high frequency plasma, has occurred. The chemically inert carrier surface can in particular special precious metals such as platinum and their alloys, precious steel or polyhalogenated polymers, especially polyhalogenated poly mere hydrocarbons such as in particular polytetrafluoroethylene or Po lyvinyl chloride, or cellulose acetate or combinations of these Ma include materials. For example, PTFE (Teflon®) are particularly suitable and cellulose acetate membranes.
Die Anbindung oder Ankopplung des oder der zu immobilisierenden Enzyme an die plasmachemisch modifizierte Trägeroberfläche gemäß Schritt (b) des zuvor beschriebenen Verfahrens kann insbesondere durch Anbindung oder Ankopplung des oder der Enzyme über die in Schritt (a) angebrachten, reak tiven funktionellen Gruppen erfolgt sein, wobei das oder die Enzyme un mittelbar an die auf die Trägeroberfläche aufgebrachten, reaktiven funktio nellen Gruppen angebunden sein können oder aber mittelbar über einen ge eigneten Linker.The connection or coupling of the enzyme or enzymes to be immobilized to the plasma-chemically modified carrier surface according to step (b) of the The method described above can in particular by connection or Coupling of the enzyme or enzymes via the reak attached in step (a) tive functional groups have taken place, the enzyme or enzymes un indirectly to the reactive function applied to the carrier surface nelle groups can be connected or indirectly via a ge suitable linker.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein enzymatisches System bei dem mindestens eines der Enzyme, vorzugs weise sämtliche Enzyme der Enzym(abbau-)kette durch Fixierung und/oder Bindung an eine chemisch inerte, plasmachemisch aktivierte und/oder funk tionalisierte Trägeroberfläche immobilisiert sind. Dabei können das oder die Enzyme unmittelbar oder mittelbar an eine chemisch inerte Trägeroberfläche fixiert, insbesondere angebunden oder angekoppelt sein. Insbesondere kann die Anbindung oder Ankopplung des oder der Enzyme über an die chemisch inerte Trägeroberfläche angebrachte, geeignete, reaktive funktionelle Grup pen erfolgt sein.According to a particular embodiment, the present invention relates an enzymatic system in which at least one of the enzymes is preferred all enzymes in the enzyme (degradation) chain by fixation and / or Binding to a chemically inert, plasma-chemically activated and / or radio tionalized carrier surface are immobilized. You can do this Enzymes directly or indirectly on a chemically inert carrier surface fixed, in particular tied or coupled. In particular, can the attachment or coupling of the enzyme or enzymes to the chemically Suitable, reactive functional group attached to inert support surface pen.
Die Enzyme des erfindungsgemäßen enzymatischen Systems können insbe sondere ausgewählt sein aus der Gruppe von Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen (z. B. Esterasen wie Lipasen), Lyasen, Isomerasen und Ligasen (Synthetasen) sowie deren Mischungen oder Kombinationen untereinander.The enzymes of the enzymatic system according to the invention can in particular especially selected from the group of oxidoreductases, transferases, Hydrolases (e.g. esterases such as lipases), lyases, isomerases and ligases (Synthetases) and their mixtures or combinations with one another.
Bei dem erfindungsgemäßen enzymatischen System befinden sich die minde stens zwei Enzyme entweder innerhalb einer einzigen Reaktionszone oder aber in getrennten, hintereinander folgenden, sequentiell geschalteten Reak tionszonen, die dann gemeinsam das enzymatische System bilden. Mit an deren Worten können in dem erfindungsgemäßen enzymatischen System die Enzyme der Enzym(abbau-)kette innerhalb einer Einheit, vorzugsweise in nerhalb einer Reaktionszone, eines Kompartimentes oder einer Zelle, insbe sondere Meßzelle, angeordnet sein oder aber auch in getrennten, insbeson dere hintereinanderfolgenden Einheiten, vorzugsweise in getrennten, hinter einanderfolgenden Reaktionszonen, Kompartimenten oder Zellen, insbeson dere Meßzellen, die zusammen das enzymatische System bilden, angeordnet sein. Zwecks Differenzmessung kann jedoch auch eine Parallelschaltung von Meßzellen erfolgen.In the enzymatic system according to the invention there are the mind at least two enzymes either within a single reaction zone or but in separate, consecutive, sequentially switched react tion zones, which then together form the enzymatic system. With at whose words can in the enzymatic system according to the invention Enzymes of the enzyme (degradation) chain within a unit, preferably in within a reaction zone, a compartment or a cell, in particular special measuring cell, be arranged or in separate, in particular their successive units, preferably in separate, behind successive reaction zones, compartments or cells, in particular whose measuring cells, which together form the enzymatic system, are arranged his. However, a parallel connection of Measuring cells take place.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ent hält das erfindungsgemäße enzymatische System Amyloglucosidase und Glu coseoxidase, gegebenenfalls in Kombination mit Mutarotase und/oder α-Glu cosidase (Maltase). Ein solches System ist insbesondere zum Abbau von nichtionischen Tensiden, insbesondere von Alkylpolyglucosiden, geeignet.According to a particular embodiment of the present invention ent holds the inventive enzymatic system amyloglucosidase and Glu coseoxidase, optionally in combination with mutarotase and / or α-Glu cosidase (maltase). Such a system is particularly useful for breaking down nonionic surfactants, especially of alkyl polyglucosides.
Das erfindungsgemäße enzymatische System ist vielseitig verwendbar, insbe sondere in Biosensoren, Bioreaktoren oder chromatographischen Systemen (z. B. chromatographischen Säulen). Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit auch Biosensoren, Bioreaktoren und chromatographische Systeme, welche das erfindungsgemäße enzymatische System umfassen. The enzymatic system according to the invention can be used in many ways, in particular especially in biosensors, bioreactors or chromatographic systems (e.g. chromatographic columns). Subject of the present invention are therefore also biosensors, bioreactors and chromatographic systems, which comprise the enzymatic system according to the invention.
Wie zuvor beschrieben, können die erfindungsgemäßen enzymatischen Sy steme in Biosensoren Verwendung finden. Es werden mindestens zwei ver schiedene Arten von immobilisierten Enzymen miteinander kombiniert, die in einer Enzymkette oder Enzymabbaukette eingesetzt werden. Dabei können die verschiedenen Enzyme entweder in einem einzigen Reaktionssystem (z. B. in einer Meßzelle) vorliegen oder aber sequentiell hintereinander ge schaltet sein (z. B. in aufeinanderfolgenden Meßzellen), die dann zusammen das erfindungsgemäße enzymatische System bilden. Auf diese Weise gelingt beispielsweise die parallele Bestimmung mehrerer Stoffe durch mehrere En zyme (oder Enzymketten) in einer Meßzelle oder der sequentielle Abbau ei nes Ausgangsstoffes (Analyt) in mehreren hintereinander geschalteten Meß zellen bei gleichzeitiger Elektroanalyse in einer und/oder mehreren Meßzel len.As described above, the enzymatic Sy systems in biosensors. There are at least two ver different types of immobilized enzymes combined in one another an enzyme chain or enzyme degradation chain can be used. You can the different enzymes either in a single reaction system (e.g. in a measuring cell) or sequentially one after the other be switched (e.g. in successive measuring cells), which then together form the enzymatic system according to the invention. This is how it works for example the parallel determination of several substances by several En zyme (or enzyme chains) in a measuring cell or the sequential degradation nes starting material (analyte) in several series-connected measurements cells with simultaneous electrical analysis in one and / or several measuring cells len.
Unter "Biosensoren" versteht man erfindungsgemäß Meßfühler mit einer bio aktiven Komponente, basierend auf der Kopplung von Biomolekülen, die als Rezeptoren im weitesten Sinne spezifisch Analyte erkennen, mit physiko chemischen Transduktoren, die ein biologisch erzeugtes Signal (z. B. Sauer stoffkonzentration, pH-Wert, Farbstoff etc.) in elektrische Meßsignale umfor men.According to the invention, “biosensors” are understood to mean sensors with a bio active component, based on the coupling of biomolecules as Recognize receptors in the broadest sense specifically analytes, with physiko chemical transducers that produce a biologically generated signal (e.g. Sauer substance concentration, pH value, dye etc.) into electrical measurement signals men.
Fig. 1 zeigt schematisch den typischen Aufbau eines Biosensors zur spezifi schen Erkennung eines Analyten 1, wobei der Biosensor einen Rezeptor 2 und einen Transduktor 3 umfaßt, der das vom Rezeptor 2 erzeugte biologi sche Signal in ein elektronisches Signal 4 umwandelt, welches an eine Elek tronik 5 weitergeleitet wird. Fig. 1 shows schematically the typical structure of a biosensor for specific detection of an analyte 1 , the biosensor comprising a receptor 2 and a transducer 3 which converts the biological signal generated by the receptor 2 into an electronic signal 4 which is sent to an elec tronik 5 is forwarded.
Zur spezifischen Erkennung können verschiedene Biomoleküle verwendet werden, insbesondere Enzyme. Als Transduktoren können eingesetzt werden potentiometrische Sensoren, amperometrische Elektroden, piezoelektrische Sensoren, Thermistoren oder optoelektronische Sensoren. Aufgrund der Re aktion oder Wechselwirkung des Analyten mit dem Rezeptor unterscheidet man insbesondere zwei Grundtypen von Biosensoren, nämlich einerseits Bio affinitätssensoren, die bei der Komplex-Bildung eintretende Veränderung der Elektronendichte ausnutzen, und andererseits Metabolismussensoren, die auf der spezifischen Erkennung und Umsetzung von Substraten beruhen. Different biomolecules can be used for specific recognition especially enzymes. Can be used as transducers potentiometric sensors, amperometric electrodes, piezoelectric Sensors, thermistors or optoelectronic sensors. Due to the Re action or interaction of the analyte with the receptor there are two basic types of biosensors, namely bio affinity sensors, the change in complex formation occurring Exploit electron density, and on the other hand, metabolism sensors based on the specific detection and implementation of substrates.
Biosensoren finden - insbesondere in Form von Enzym-Elektroden - im Ge sundheitswesen, zur Kontrolle biotechnologischer Prozesse, in der Lebens mittelindustrie oder im Umweltschutz Verwendung. Mit Biosensoren können unterschiedlichste Systeme analysiert werden z. B. Glucose, Galactose, Lac tose, Ethanol, Milchsäure oder Harnsäure.Biosensors are found in the ge - especially in the form of enzyme electrodes healthcare, to control biotechnological processes in life medium industry or environmental protection use. With biosensors different systems are analyzed z. B. glucose, galactose, lac tose, ethanol, lactic acid or uric acid.
Bei der Verwendung des erfindungsgemäßen enzymatischen Systems in Bio sensoren können beispielsweise die verschiedenen Enzymmoleküle zur Im mobilisierung entweder in polymere Matrizes (wie z. B. PVC, Gele, Graphite oder Zeolithe) oder zwischen Folien (z. B. Celluloseacetat) eingebracht wer den. Des weiteren kann bei Sensoren, die beispielsweise auf der enzyma tischen Erzeugung oder dem Verbrauch von Sauerstoff basieren und eine chemisch inerte Membran (z. B. eine Teflon®-Membran) besitzen, diese ge nutzt werden, um die verschiedenen Enzyme anzubinden. Die Herstellung der erfindungsgemäßen Biosensoren kann beispielsweise erfolgen, wie es beschrieben ist in der bereits zitierten, ebenfalls auf die Henkel KGaA zu rückgehenden deutschen Patentanmeldung mit gleichem Anmeldetag und dem Amtsaktenzeichen DE 101. . . (kanzlei-internes Aktenzeichen: 00.495.6.do), deren gesamter Inhalt durch Bezugnahme eingeschlossen ist.When using the enzymatic system according to the invention in bio sensors can, for example, the various enzyme molecules for Im mobilization either in polymer matrices (such as PVC, gels, graphite or zeolites) or between foils (e.g. cellulose acetate) the. Furthermore, sensors, for example on the enzyma based generation or consumption of oxygen and a have chemically inert membrane (e.g. a Teflon® membrane), this ge can be used to bind the various enzymes. The production the biosensors according to the invention can be carried out, for example, as is the case is described in the already cited, also for Henkel KGaA declining German patent application with the same filing date and the official file number DE 101.. , (Internal file number: 00.495.6.do), the entire content of which is included by reference.
Die erfindungsgemäßen Biosensoren ermöglichen beispielsweise die Herstel lung von Mikroelektroden(arrays) für kleine Volumina und hohen Proben durchsatz (z. B. für die kombinatorische Anwendung).The biosensors according to the invention enable the manufacturers, for example Microelectrodes (arrays) for small volumes and high samples throughput (e.g. for combinatorial application).
Anwendungsbeispiele für die erfindungsgemäßen Biosensoren sind die ana lytische Bestimmung von Tensiden, insbesondere ionischen Tensiden wie nichtionischen Tensiden (z. B. Alkylpolyglucosiden), von Polyasparaginsäure und von Fettalkoholderivaten.Application examples for the biosensors according to the invention are ana lytic determination of surfactants, especially ionic surfactants such as nonionic surfactants (e.g. alkyl polyglucosides), of polyaspartic acid and fatty alcohol derivatives.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen Biosensor, insbesondere zur qualitativen und/oder quantitativen Be stimmung nichtionischer Tenside, vorzugsweise von Alkylpolyglucosiden, wobei der Biosensor als Enzym(abbau-)kette ein enzymatisches System um faßt, welches als Enzyme Amyloglucosidase und Glucoseoxidase, gegebe nenfalls in Kombination mit Mutarotase und/oder α-Glucosidase (Maltase), enthält. Dabei liegen die zuvor genannten Enzyme insbesondere in immobi lisierter Form vor, vorzugsweise durch Bindung an eine chemisch inerte Ober fläche und/oder Membran, bevorzugt an eine Polytetrafluorethylen- oder Celluloseacetatmembran.According to a particular embodiment, the present invention relates a biosensor, in particular for qualitative and / or quantitative loading mood of nonionic surfactants, preferably of alkyl polyglucosides, the biosensor as an enzyme (degradation) chain around an enzymatic system summarizes which are given as enzymes amyloglucosidase and glucose oxidase if necessary in combination with mutarotase and / or α-glucosidase (maltase), contains. The above-mentioned enzymes are in particular immobi form, preferably by binding to a chemically inert surface surface and / or membrane, preferably to a polytetrafluoroethylene or Cellulose acetate.
Wie zuvor beschrieben kann das erfindungsgemäße enzymatische System auch in Bioreaktoren Verwendung finden.As described above, the enzymatic system according to the invention can can also be used in bioreactors.
Unter "Bioreaktoren" versteht man erfindungsgemäß das physikalische Be hältnis, in dem biologische Stoffumwandlungen insbesondere mit Enzymen durchgeführt werden.According to the invention, “bioreactors” are understood to mean the physical loading ratio, in which biological material conversions, especially with enzymes be performed.
Dabei können die immobilisierten Enzyme des erfindungsgemäßen enzymati schen Systems beispielsweise an die Wandungsoberflächen des Bioreaktors angebracht sein oder aber - insbesondere im Fall von Festbettreaktoren - an das stationäre Trägermaterial oder Schüttgut angebunden sein. Zu Einzelhei ten kann verwiesen werden auf die bereits zitierte, ebenfalls auf die Henkel KGaA zurückgehende deutsche Patentanmeldung vom selben Anmeldetag mit dem Amtsaktenzeichen DE 101. . . (kanzlei-internes Aktenzeichen: 00.495.6.do), deren gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme eingeschlos sen ist. Auf diese Weise kann eine effizientere Generation von Reaktoren verwirklicht werden, bei denen keine Abtrennung der Enzyme von der Re aktionslösung erforderlich ist. Erfindungsgemäß geeignete Reaktoroberflä chen können aus Metall (z. B. Edelmetall wie Platin) bestehen oder mit allen gängigen Polymeren, die für die Reaktorherstellung eingesetzt werden, be schichtet sein (z. B. Teflon®).The immobilized enzymes of the enzymati according to the invention systems, for example on the wall surfaces of the bioreactor be attached or - especially in the case of fixed bed reactors the stationary carrier material or bulk material must be attached. To single ten can be referred to the one already cited, also to the handles KGaA declining German patent application from the same filing date with the official file number DE 101.. , (Internal file number: 00.495.6.do), the entire contents of which are hereby included by reference is. This way, a more efficient generation of reactors be realized in which no separation of the enzymes from the Re action solution is required. Reactor surface suitable according to the invention Chen can be made of metal (e.g. precious metal such as platinum) or with all of them common polymers that are used for reactor manufacture, be be layered (e.g. Teflon®).
Fig. 2 zeigt beispielhaft und schematisch verschiedene Arten von Bioreakto ren des Standes der Technik: Fig. 2 shows by way of example and schematically different types of Bioreakto ren of the prior art:
Fig. 2A zeigt einen Rührkessel-Reaktor, bei dem der Energieeintrag durch mechanisch bewegte Einheiten erfolgt. Hierbei bezeichnet G den Gasstrom und M die mechanische Antriebsvorrichtung (z. B. Motor). Wegen ihrer Viel seitigkeit werden Rührkessel-Reaktoren am häufigsten eingesetzt. Fig. 2A shows a stirred tank reactor in which the energy input is accomplished by mechanically moving units. Here G denotes the gas flow and M the mechanical drive device (e.g. motor). Because of their versatility, stirred tank reactors are used most frequently.
Fig. 2B zeigt einen Blasensäulen-Reaktor, bei dem die Durchmischung durch Zufuhr von Luft oder eines anderen Gases erfolgt. Hierbei bezeichnet G den Gasstrom. Fig. 2B shows a bubble column reactor, wherein the mixing is carried out by supplying air or other gas. Here G denotes the gas flow.
Fig. 2C zeigt einen sogenannten Airlift-Fermenter mit innerem Durchlauf, wobei im allgemeinen durch Eintrag von Luft oder einem anderen Gas ein Flüssigkeitsumlauf und eine Durchmischung erzeugt wird. Hierbei bezeichnet G den Gasstrom. Fig. 2C shows a so-called airlift fermenter with inner passage, generally by the introduction of air or another gas, a liquid circulation and thorough mixing is generated. Here G denotes the gas flow.
Fig. 2D zeigt einen sogenannten Airlift-Fermenter mit äußerem Durchlauf, wobei im allgemeinen durch Eintrag von Luft oder einem anderen Gas ein Flüssigkeitsumlauf und eine Durchmischung erzeugt wird. Hierbei bezeichnet G den Gasstrom. Fig. 2D shows a so-called airlift fermenter with outer flow, generally by the introduction of air or another gas, a liquid circulation and thorough mixing is generated. Here G denotes the gas flow.
In den zuvor beschriebenen Bioreaktor-Typen des Standes der Technik kann das erfindungsgemäße enzymatische System zum Einsatz kommen, beispiels weise durch Modifizierung der Wandungsoberfläche (z. B. durch Ankopp lung der Enzyme an die chemisch inerte Reaktorwandungen) oder im Fall von Festbett-Bioreaktoren durch Anbindung der Enzyme an das stationäre Trägermaterial bzw. Schüttgut.In the prior art bioreactor types described above the enzymatic system according to the invention are used, for example wise by modifying the wall surface (e.g. by coupling the enzymes on the chemically inert reactor walls) or in the case of fixed bed bioreactors by linking the enzymes to the stationary one Carrier material or bulk material.
Bei der Verwendung der erfindungsgemäßen enzymatischen Systems in Bio reaktoren, insbesondere zur Modifizierung der Wandungsoberfläche oder bei der Bindung der Enzyme an das stationäre Trägermaterial bzw. Schüttgut, besteht die Möglichkeit, die mindestens zwei verschiedenen Arten von En zymen derart miteinander zu kombinieren, d. h. die Enzymketten oder En zymabbauketten derart einzusetzen, daß entweder die verschiedenen En zyme in einer einzigen Reaktionszone vorliegen oder aber sequentiell hin tereinander geschaltet sind (z. B. in aufeinanderfolgenden Reaktionszonen). Auf diese Weise werden insbesondere mehrstufige, enzymatisch katalysierte Synthesen und Prozesse ermöglicht oder auch die zeitgleiche, parallele Um setzung verschiedener Ausgangsstoffe durch verschiedene Enzyme.When using the enzymatic system according to the invention in bio reactors, in particular to modify the wall surface or at the binding of the enzymes to the stationary carrier material or bulk material, there is a possibility of using at least two different types of en to combine zymen in such a way, d. H. the enzyme chains or En use zymab chain in such a way that either the different En zymes are present in a single reaction zone or sequentially are connected in series (e.g. in successive reaction zones). In this way, multi-stage, enzymatically catalyzed Syntheses and processes enable or also the simultaneous, parallel Um different enzymes.
Die Fig. 3 zeigt exemplarisch und schematisch einige Ausführungsformen von Bioreaktoren nach der vorliegenden Erfindung: Figs. 3 shows by way of example and schematically some embodiments of bioreactors according to the present invention:
Fig. 3A zeigt einen Bioreaktor, dessen chemisch inerte Wandungen durch Ankopplung eines immobilisierten Enzyms vom Typ A und eines immobilisier ten Enzyms vom Typ B modifiziert sind, welche in unterschiedlichen, aufein anderfolgenden Reaktionszonen angeordnet sind. Hierbei bezeichnet G den Gasstrom. Fig. 3A shows a bioreactor, the chemically inert walls are modified by coupling an immobilized type A enzyme and an immobilized type B enzyme, which are arranged in different, successive reaction zones. Here G denotes the gas flow.
Fig. 3B zeigt einen Bioreaktor, dessen chemisch inerte Wandungen durch Ankopplung eines immobilisierten Enzyms vom Typ A und eines immobilisier ten Enzyms vom Typ B modifiziert sind, welche innerhalb einer einzigen Re aktionszone angeordnet sind. Fig. 3B shows a bioreactor, the chemically inert walls are modified by coupling an immobilized enzyme of type A and a type B enzyme immobilisier th, which are arranged within a single re action zone.
Fig. 3C zeigt einen Bioreaktor in Form eines Festbettreaktors, an dessen Trä germaterial oder Schüttgut immobilisierte Enzyme vom Typ A und vom Typ B angekoppelt sind, welche innerhalb einer Reaktionszone angeordnet sind. Fig. 3C shows a bioreactor in the form of a fixed bed reactor, at whose Trä germaterial or bulk are coupled immobilized enzymes of the type A and type B, which are arranged within a reaction zone.
Es sind noch zahlreiche andere Varianten möglich, die der Fachmann beim Lesen der vorliegenden Beschreibung ohne weiteres in Betracht ziehen wird, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.Numerous other variants are possible, which the person skilled in the art Reading the present description will readily consider without departing from the scope of the present invention.
Des weiteren besteht die Möglichkeit, das erfindungsgemäße enzymatische System in chromatographischen Systemen, insbesondere in chromatographi schen Säulen, einzusetzen. Dies kann zu synthetischen Zwecken geschehen (z. B. Durchführung enzymatisch katalysierter Reaktionen auf einer chroma tographischen Säule) oder aber auch zu analytischen Zwecken (z. B. bei der analytischen Säulenchromatographie). Hierbei können die immobilisierten Enzyme des enzymatischen Systems beispielsweise an das stationäre Träger material oder Schüttgut, insbesondere das stationäre Säulenmaterial, des chromatographischen Systems gebunden sind. Für weitere Einzelheiten kann verwiesen werden auf die bereits zitierte, auf die Anmelderin der vorliegen den Patentanmeldung zurückgehende deutsche Patentanmeldung vom glei chen Anmeldetag mit dem Amtsaktenzeichen DE 101. . . (kanzlei-internes Aktenzeichen 00.495.6.do), deren gesamter Inhalt hiermit durch Bezug nahme eingeschlossen ist.There is also the possibility of the enzymatic according to the invention System in chromatographic systems, especially in chromatographi columns. This can be done for synthetic purposes (e.g. carrying out enzymatically catalyzed reactions on a chroma graphical column) or for analytical purposes (e.g. for the analytical column chromatography). The immobilized Enzymes of the enzymatic system, for example on the stationary carrier material or bulk material, especially the stationary column material, the chromatographic system are bound. For more details, can Reference is made to the one already cited, to the applicant of the present German patent application from the same declining patent application Chen filing date with the official file number DE 101.. , (Firm-internal File number 00.495.6.do), the entire contents of which are hereby incorporated by reference name is included.
Der Einsatz des erfindungsgemäßen enzymatischen Systems hat den Vorteil, daß sich mit dem erfindungsgemäßen System auch solche Prozesse enzymatisch katalysieren lassen, die mehrstufig enzymatisch ablaufen, d. h. bei denen die Moleküle, insbesondere Biomoleküle oder technische Moleküle, in meh reren Stufen und mit verschiedenen Enzymen enzymatisch katalysiert abge baut oder zu Endprodukten umgesetzt werden.The use of the enzymatic system according to the invention has the advantage that with the system according to the invention such processes are also enzymatic catalyze the multi-stage enzymatic process, d. H. at them the molecules, in particular biomolecules or technical molecules, in meh rere stages and enzymatically catalyzed with various enzymes builds or be converted into end products.
Des weiteren ermöglicht der Einsatz des erfindungsgemäßen enzymatischen Systems auch die parallele Umsetzung mehrerer Stoffe durch unterschiedliche Enzyme oder durch Enzym(abbau-)ketten und hierdurch beispielsweise die parallele analytische Bestimmung mehrerer Stoffe nebeneinander mit einer einzigen Meßzelle, welche eine Enzymabbaukette aus verschiedenen Enzy men enthält oder der sequentielle Abbau eines Ausgangsstoffes (Analyt) in mehreren hintereinander geschalteten Meßzellen bei gleichzeitiger Elektro analyse in einer und/oder mehreren Meßzellen.Furthermore, the use of the enzymatic according to the invention enables Systems also the parallel implementation of several substances by different Enzymes or by enzyme (degradation) chains and thereby, for example, the parallel analytical determination of several substances side by side with one single measuring cell, which an enzyme degradation chain from different Enzy contains or the sequential degradation of a starting material (analyte) in several measuring cells connected in series with simultaneous electrical analysis in one and / or several measuring cells.
Schließlich hat der Einsatz des erfindungsgemäßen enzymatischen Systems auch den Vorteil, daß einerseits die Enzyme aufgrund der Immobilisierung wiederverwendet werden können und andererseits nach ihrer Verwendung eine leichte Abtrennung möglich ist (z. B. nach erfolgter Synthese im Bio reaktor, beispielsweise durch Ablassen der Reaktionsmischung). Auf diese Weise lassen sich die Enzyme effizient und kostengünstig in hoher lokaler Konzentration und in kontinuierlichem Durchfluß einsetzen. Die Substrat- Spezifität und die Spezifität der Reaktion sowie die Reaktivität der Enzyme gehen dabei jedoch nicht verloren.Finally, the use of the enzymatic system according to the invention also the advantage that on the one hand the enzymes due to the immobilization can be reused and on the other hand after their use easy separation is possible (e.g. after synthesis in the bio reactor, for example by draining the reaction mixture). To this In this way, the enzymes can be efficiently and inexpensively used in high local areas Use concentration and in continuous flow. The substrate Specificity and the specificity of the reaction as well as the reactivity of the enzymes however, they are not lost.
Das Konzept der vorliegenden Erfindung besteht also darin, verschiedene Enzyme so miteinander zu kombinieren, daß auf diese Weise Moleküle (z. B. technische Moleküle oder Biomoleküle) abgebaut werden können. Dies kann beispielsweise zu analytischen Zwecken dazu genutzt werden, um die abgebauten Moleküle über bestimmte, wie zuvor beschriebene Parameter (z. B. pH-Wertveränderung, Sauerstoffzehrung/-erzeugung etc.) nachzuwei sen. In bezug auf Bioreaktoren bedeutet dies, daß auch die Möglichkeit der gleichzeitigen oder sequentiellen Umsetzung eines oder mehrerer Stoffe be steht.The concept of the present invention is therefore different Combine enzymes in such a way that molecules (e.g. technical molecules or biomolecules) can be broken down. This can be used, for example, for analytical purposes to degraded molecules via certain parameters as previously described (e.g. change in pH value, oxygen consumption / generation etc.) sen. With regard to bioreactors, this means that the possibility of simultaneous or sequential implementation of one or more substances stands.
Nach dem erfindungsgemäßen Konzept sind die Herstellung eines Stoffes und die Reaktionsverfolgung mit Sensoren, die beispielsweise Sauerstoff oder H2O2 messen, identisch und ermöglichen somit auch eine effiziente Reaktions kontrolle.According to the concept of the invention, the production of a substance and the reaction tracking with sensors that measure oxygen or H 2 O 2 , for example, are identical and thus also enable efficient reaction control.
Weitere Ausgestaltungen und Variationen der vorliegenden Erfindung sind für den Fachmann beim Lesen der Patentschrift ohne weiteres erkennbar und realisierbar, ohne daß er dabei den Rahmen der vorliegenden Erfindung ver läßt.Further configurations and variations of the present invention are readily recognizable to the person skilled in the art when reading the patent specification and realizable without ver ver the scope of the present invention leaves.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Ausführungsbeispiele veranschaulicht, welche die vorliegende Erfindung jedoch keinesfalls be schränken sollen. The present invention is based on the following exemplary embodiments illustrates which, however, in no way be the present invention should restrict.
Für APG® (Alkylpolyglucoside, eine Gruppe von nichtionischen Tensiden, vertrieben von der Firma Henkel) wurde eine enzymatische Abbaukette ent wickelt, bestehend aus Amyloglucosidase und Glucoseoxidase sowie gege benenfalls auch Mutarotase und/oder α-Glucosidase (Maltase).For APG® (alkyl polyglucoside, a group of non-ionic surfactants, distributed by the company Henkel) an enzymatic degradation chain was ent wraps, consisting of amyloglucosidase and glucose oxidase as well as gege also mutarotase and / or α-glucosidase (maltase).
Zur Herstellung des erfindungsgemäßen Biosensors wurden die zuvor ge nannten Enzyme zunächst immobilisiert.To produce the biosensor according to the invention, the previously ge called immobilized initially.
Die Immobilisierung erfolgte, indem die zuvor genannten Enzyme auf eine Celluloseacetat-Membran oder auf eine Teflon®-Membran aufgebracht wur den, wie dies beschrieben ist in der ebenfalls auf die Henkel KGaA zurück gehende deutsche Patentanmeldung mit dem Amtsaktenzeichen DE 101. . . (kanzlei-internes Aktenzeichen: 00.495.6.do) vom selben Anmeldetag wie die vorliegende Patentanmeldung. Hierzu wurde die Mem bran nach an sich bekannten plasmachemischen Methoden modifiziert bzw. aktiviert, d. h. im reaktiven Hochfrequenzplasma unter an sich bekannten Bedingungen funktionalisiert, wobei hierdurch geeignete, enzymreaktive funktionelle Gruppen an die chemisch inerte Membranoberfläche gebunden werden, insbesondere Amino- und/oder Carboxylgruppen. Hieran wurden dann die Enzyme mit an sich bekannten Methoden gebunden.The immobilization was carried out by the aforementioned enzymes on a Cellulose acetate membrane or was applied to a Teflon® membrane as described in the Henkel KGaA outgoing German patent application with the official file number DE 101.. , (internal file number: 00.495.6.do) from the same Filing date as the present patent application. The mem bran modified or known according to known plasma chemical methods activated, d. H. in reactive high-frequency plasma among those known per se Functionalized conditions, thereby suitable, enzyme-reactive functional groups bound to the chemically inert membrane surface are, in particular amino and / or carboxyl groups. Here were then the enzymes are bound using methods known per se.
Alternativ kann die Immobilisierung auch mit an sich aus dem Stand der Technik bekannten Methoden durchgeführt werden, z B. durch Einbringen zwischen Folien (z. B. aus Celluloseacetat) oder in polymere Matrizes (z. B. PVC, Gele, Graphite, Zeolithe etc.).Alternatively, the immobilization can also be carried out from the state of the art Techniques known in the art can be carried out, for example by introduction between foils (e.g. from cellulose acetate) or in polymeric matrices (e.g. PVC, gels, graphites, zeolites etc.).
Mit dieser enzymatischen Abbaukette konnten dann APG® nachgewiesen oder elektroanalytisch bestimmt werden.APG® could then be detected using this enzymatic degradation chain or can be determined electroanalytically.
Seit circa 10 Jahren konnte ein erheblicher Anstieg in der Produktion von Alkylpolyglycosiden beobachtet werden. Phosphatfrei werden sie als oberflächenaktive Neutraltenside Kosmetikpräparaten oder Waschmitteln zugesetzt. Ein bis sieben Glucoseeinheiten, in der Häufigkeit von Mono- zu Heptaglycosiden drastisch abnehmend, sind glycosidisch mit einem meist langkettigen Alkohol wie Dodecanol oder Tetradecanol verknüpft.For about 10 years, there has been a significant increase in the production of Alkyl polyglycosides can be observed. They are called phosphate-free Neutraltenside surface-active cosmetic preparations or detergents added. One to seven glucose units, in the frequency of mono- drastically decreasing to heptaglycosides are glycosidic with one mostly linked long-chain alcohol such as dodecanol or tetradecanol.
Da auf der Basis von Enzymen die gesamte biochemische Information zur Erkennung des Analyten in ein Membransystem inkorporiert werden kann, bieten sich bioelektrochemische Membranelektroden als ein beson ders attraktives Meßprinzip für die Alkylpolyglycoside an.Because all of the biochemical information on the basis of enzymes Detection of the analyte can be incorporated into a membrane system bioelectrochemical membrane electrodes are particularly suitable ders attractive measuring principle for the alkyl polyglycosides.
Von den bisher konzipierten verschiedenen molekularselektiven APG®- Membranen mit immobilisierten Enzymen wird hier anhand von elf Mem bransystemen über die erfindungsgemäßen Prinzipien berichtet.Of the various molecular selective APG® Membranes with immobilized enzymes are here eleven Mem Bransystemen reported the principles of the invention.
Zur Analytik stand das wasserlösliche Alkylpolyglycosid APG® 220 der Firma Henkel KGaA in Düsseldorf zur Verfügung. Alle Meßlösungen wur den phophatgepuffert auf einen pH-Wert von 5,0.The water-soluble alkyl polyglycoside APG® 220 was used for analysis Henkel KGaA in Düsseldorf is available. All measurement solutions were the phosphate buffered to a pH of 5.0.
Die erfindungsgemäßen Sensoren sind in ein Durchflußmeßsystem inte griert, wobei die Enzymmembranen für den APG®-Substratumsatz das Dach einer wannenförmig abgeflachten Durchflußkammer bilden, die über radiale Zu- und Abflußkanäle verfügt. Die tangentiale Anströmung der Enzymmembran erfolgt durch Ansaugung der APG®-haltigen Lösungen mit einer der Meßzelle nachgeordneten Rollenpumpe, wobei Meß- und Kalibrierlösungen luftblasengetrennt eingespeist werden.The sensors of the invention are inte in a flow measuring system griert, whereby the enzyme membranes for the APG® substrate conversion Form the roof of a trough-shaped, flattened flow chamber radial inflow and outflow channels. The tangential flow of the Enzyme membrane is made by sucking in the APG®-containing solutions with a roller pump downstream of the measuring cell, measuring and Calibration solutions can be fed in separately from air bubbles.
Es handelt sich um amperometrische APG®-Biosensoren mit H2O2-Detek toren in Disk-Elektrodenbauweise ohne Innenelektrolyt aus Pt-Meßanode und Ag-Referenzkathode mit jeweils 2 mm Durchmesser in zwei getrenn ten, seriell angeordneten und über einen Schlauch verbundenen Durch flußkammern. Meßanode und Referenzkathode sind in "zündkerzenförmi ger" Bauweise ausgeführt und werden dichtend gegen die Berandung der Durchflußkammern geschraubt. Nur die Stirnflächen der Edelmetall-Elek troden liegen in frei zugänglicher Form vor und sind elektroanalytisch ak tiv. Die Membransysteme mit einem Durchmesser von 5 mm stehen jeweils kavitätengeschützt in direktem Kontakt zur Pt-Meßanode.These are amperometric APG® biosensors with H 2 O 2 detectors in disk-electrode design without internal electrolyte made of Pt measuring anode and Ag reference cathode, each with a diameter of 2 mm, in two separate, serially arranged and connected through flow chambers , Measuring anode and reference cathode are made in "spark plug-shaped" design and are screwed sealingly against the edges of the flow chambers. Only the end faces of the precious metal electrodes are freely accessible and are electro-analytically active. The membrane systems with a diameter of 5 mm are protected against cavities and are in direct contact with the Pt measuring anode.
Besondere Ausgestaltungsformen der Enzym-Membranen sehen zwecks Oberflächenvergrößerung die zylindrische Auskleidung der Kavität gege benenfalls mit Überzug der Pt-Oberfläche vor (SBC-1412-APG®). Kon vexe Elektrodenoberflächengestaltung in Verbindung mit dünnen En zymmembranen fördert die Schnelligkeit des Einstellverhaltens.Special designs of the enzyme membranes see the purpose Surface enlargement against the cylindrical lining of the cavity if necessary with a coating of the Pt surface (SBC-1412-APG®). Kon vex electrode surface design in connection with thin enes zymmembranen promotes the speed of adjustment.
Für eine spezielle Applikationsform erfolgte der Einbau der hier beschrie benen Meßanoden und Referenzkathoden in den Deckel und Boden von Kunststoffgefäßen (SBC-1420-APG®) zur stationären Messung z. B. für einen Meßkoffer des Kundendienstes. In einer anderen Ausführungsform wurden diese Meßsystembauteile in die Seitenwände eines Acrylglasroh res integriert, das am oberen und unteren Ende mit Zu- und Abflußhähnen versehen war.The installation described here was installed for a special form of application benen measuring anodes and reference cathodes in the lid and bottom of Plastic vessels (SBC-1420-APG®) for stationary measurement e.g. B. for a customer service measurement kit. In another embodiment these measuring system components were made into the side walls of an acrylic glass tube res integrated, the top and bottom end with inlet and outlet taps was provided.
Die Pt-Meßanode mit ebenfalls kavitätengeschützter Enzymmembran von 5 mm verfügt durch ein anodisches Fenster über einen direkten Zugang zur Meßlösung, während sich die stabförmige Ag-Referenzkathode (Durchmesser 1 mm) in einem Seitenraum der Meßzelle befindet und über einen Innenelektrolyten mit der Pt-Meßanode in Verbindung steht.The Pt measuring anode with cavity-protected enzyme membrane from 5 mm has direct access through an anodic window to the measuring solution, while the rod-shaped Ag reference cathode (Diameter 1 mm) is located in a side space of the measuring cell and above an internal electrolyte is connected to the Pt measuring anode.
Diese APG®-Sensoren bestehen aus einer Pt-Kathode mit einem Mem bransystem (vgl. 2.1.2.1. und 2.1.2.2.) auf der Basis von PTFE und immo bilisierten Enzymen. Die Ag/AgCl-Referenzanode befindet sich wiederum analog zu 2.1.1.2. in einem Seitenraum der Meßzelle und steht über einen gepufferten Innenelektrolyten mit der Pt-Meßelektrode im kathodischen Fenster in Verbindung, das durch die PTFE-Membran ionenundurchlässig, aber gaspermeabel verschlossen ist, so daß O2 als Transducer zwischen den immobilisierten Enzymen und der Pt-Kathode fungieren kann. These APG® sensors consist of a Pt cathode with a membrane system (see 2.1.2.1. And 2.1.2.2.) Based on PTFE and immobilized enzymes. The Ag / AgCl reference anode is in turn analogous to 2.1.1.2. in a side area of the measuring cell and is connected via a buffered internal electrolyte to the Pt measuring electrode in the cathodic window, which is sealed by the PTFE membrane, but is gas-permeable, so that O 2 acts as a transducer between the immobilized enzymes and the Pt cathode can act.
Elektrodenseitig verfügt das Membransystem über eine chemisch nicht modifizierte PTFE-Membran, der meßlösungswärts zwei Dialysemembra nen aus Celluloseacetat aufliegen, zwischen denen - vor bakteriellem Ab bau geschützt - die Enzyme an einem Streifen aus Cellulosefasern durch Adsorption und/oder ionischer Bindung immobilisiert und/oder kovalent vernetzt liegen.The membrane system does not have a chemical one on the electrode side modified PTFE membrane, two dialysis membranes towards the measuring solution of cellulose acetate, between which - before bacterial Ab protected by construction - the enzymes on a strip of cellulose fibers Adsorption and / or ionic binding immobilized and / or covalent networked.
An die im Hochfrequenzplasma aminisierten PTFE-Membranen koppelt kovalent das bifunktionelle Reagenz Glutardialdehyd unter gleichzeitiger Quervernetzung APG® umsetzende Enzyme.Coupled to the PTFE membranes aminated in high-frequency plasma covalently the bifunctional reagent glutardialdehyde with simultaneous Cross-linking enzymes that convert APG®.
Der enzymatische Angriff auf die α-1,6-glucosidischen Bindungen von
APG® 220 durch die Amyloglucosidase liefert Glucose,
The enzymatic attack on the α-1,6-glucosidic bonds of APG® 220 by the amyloglucosidase provides glucose,
deren β-Form durch Glucoseoxidase (GOD) weiter umgesetzt wird:
whose β-form is further converted by glucose oxidase (GOD):
Reaktionsbedingt kann die amperometrische Messung am Ende der En zymabbaukette über den Verbrauch von O2 durch Sauerstoff-Elektroden oder die Bildung von H2O2 mit Wasserperoxid-Detektoren erfolgen.Due to the reaction, the amperometric measurement at the end of the enzyme degradation chain can take place via the consumption of O 2 by oxygen electrodes or the formation of H 2 O 2 with water peroxide detectors.
Abb. 1 zeigt ein U/I-Diagramm für Bienzym-Membranen für Alkylpolygly cosid-Biosensoren mit Wasserstoffperoxid-Detektoren (t = 20,0°C). Fig. 1 shows a U / I diagram for bienzyme membranes for alkyl polyglycoside biosensors with hydrogen peroxide detectors (t = 20.0 ° C).
Für die APG®-Sensoren mit Wasserstoffperoxid-Detektoren des Typs 2.1.1.1. mit den Membranen SBC-1408, SBC-1417 und SBC-1419 gibt Abb. 1 graphisch den Zusammenhang zwischen der Enzymkonzentra tiongesamt in U/Membran, der bei 7500 ppm APG® 220 (Markierungspunkte) gemessenen Stromstärke und der Einstellzeit wieder.For the APG® sensors with type 2.1.1.1 hydrogen peroxide detectors. with the membranes SBC-1408, SBC-1417 and SBC-1419, Fig. 1 graphically shows the relationship between the total enzyme concentration in U / membrane, the current measured at 7500 ppm APG® 220 (marking points) and the response time.
Die Bienzym-Membranen enthalten die beiden Enzyme Amyloglucosidase und Glucoseoxidase in gleicher Konzentration bezogen auf Units, deren Gesamtkonzentration in der graphischen Darstellung in Abb. 1 angegeben ist. Die Enzyme liegen in den Membransystemen durch Glutardialdehyd in vernetzter Form vor.The bienzyme membranes contain the two enzymes amyloglucosidase and glucose oxidase in the same concentration based on units, the total concentration of which is shown in the graph in Fig. 1. The enzymes are present in the membrane systems in cross-linked form due to glutardialdehyde.
SBC-1419-APG® verfügt unter den drei in Abb. 1 aufgeführten Meßsyste men mit Bienzym-Membranen über das höchste analytische Auflösungsver mögen.SBC-1419-APG® has the highest analytical resolution capacity among the three measuring systems with bienzyme membranes shown in Fig. 1.
Eine Erhöhung der Enzymkonzentration (SBC-1408-APG®) verlängert die intramembranösen Diffusionswege. Durch die Membranverdickung kommt es zu einem Anstieg in der Einstellzeit. Parallel geht damit zugleich ein Ab sinken des Auflösungsvermögens einher. Es erscheint diskussionswürdig, daß hierfür ursächlich u. a. ein größerer Zerfall an H2O2 auf dem längeren Diffusionsweg zur Pt-Meßanode mit zusätzlichem Verlust durch Abdiffusion über die Membranoberfläche verantwortlich sein könnte.Increasing the enzyme concentration (SBC-1408-APG®) extends the intramembranous diffusion pathways. The membrane thickening increases the response time. At the same time this is accompanied by a decrease in the resolving power. It seems worthy of discussion that this could be caused, among other things, by a larger decay of H 2 O 2 on the longer diffusion path to the Pt measuring anode, with additional loss due to diffusion across the membrane surface.
Als Ausdruck niedrigerer Enzymkonzentration (SBC-1417-APG®) sinkt der Substratumsatz und entsprechend der Meßstrom. Die schnelleren Einstellzeiten sind eine Folge der kürzeren intramembranösen Diffusi onswege (Membranverdünnung).As an expression of lower enzyme concentration (SBC-1417-APG®) decreases the substrate turnover and accordingly the measuring current. The faster ones Response times are a consequence of the shorter intramembranous diffusi onswege (membrane thinning).
Die Bienzym-Membran SBC-1419-APG® ist prinzipiell auch für einen Ein satz am H2O2-sensitiv-enzymatischen Meßsystem mit anodischem Fenster (2.1.1.2.) geeignet ebenso wie die im nachfolgenden beschriebene Trien zym-Membran. In principle, the bienzyme membrane SBC-1419-APG® is also suitable for use on the H 2 O 2 sensitive enzymatic measuring system with an anodic window (2.1.1.2.), As is the trienzyme membrane described below.
Um die Empfindlichkeit des APG®-Sensors nochmals zu steigern, wurde durch zusätzliche kovalente Bindung beziehungsweise Quervernetzung von Mutarotase mit Glutaraldehyd die Trienzym-Membran SBC-1425- APG® konzipiert (Tab. 1).To further increase the sensitivity of the APG® sensor, through additional covalent bonding or cross-linking of mutarotase with glutaraldehyde the trienzyme membrane SBC-1425- APG® designed (Tab. 1).
Bekanntlich reagiert GOD hochselektiv mit β-D-Glucose, während die α-Form durch dieses Enzym nicht umgesetzt wird.As is known, GOD reacts very selectively with β-D-glucose, while the α-form is not implemented by this enzyme.
Von Rybinski, W. und Hill, K. beschreiben aber in ihrer Arbeit über "Al
kylpolyglycoside - Eigenschaften und Anwendungen einer neuen Ten
sidklasse" in Angew. Chem. 110 (1998), Seiten 1395 bis 1412, daß im
technischen Prozeß die α-Anomere und β-Anomere in einem Verhältnis
von ungefähr 2 : 1 stehen. Da aber nahezu umgekehrt nach Einstellung
des Mutarotationsgleichgewichtes α-D-Glucose mit 36% und β-D-Glu
cose mit 64% nach ca. 2 Stunden aus frisch angesetzter α-D-Glucose
vorliegen, wurde erwartet, daß mit Hilfe der zusätzlich inkorporierten Mu
tarotase
Von Rybinski, W. and Hill, K. describe in their work on "Alkyl polyglycosides - properties and applications of a new surfactant class" in Angew. Chem. 110 (1998), pages 1395 to 1412 that in the industrial process the α-anomers and β-anomers are in a ratio of approximately 2: 1. However, since, almost inversely after adjustment of the mutarotation equilibrium, α-D-glucose with 36% and β-D-glucose with 64% are present after approximately 2 hours from freshly prepared α-D-glucose, it was expected that with the help of the additionally incorporated Mu tarotase
in beschleunigter Reaktionsweise ein höheres intramembranöses Sub stratangebot für die Glucoseoxidase erzwungen werden kann, wenn man davon ausgeht, daß im Produkt APG® 220 ein ähnliches Verhältnis der α- und β-Anomere wie im technischen Prozeß gegeben ist.a faster intramembrane sub in accelerated reaction strate supply for glucose oxidase can be enforced if one assumes that in the product APG® 220 a similar ratio of α- and β-anomers as given in the technical process.
Es konnte an modular aufgebauten Meßsystemen (vgl. 2.1.1.1.) mit H2O2- Detektoren der Nachweis erbracht werden, daß sich gegenüber der Bien zymmembran SBC-1419-APG® durch die zusätzliche Anwesenheit der Mutarotase in der Trienzym-Membran SBC-1425-APG® die Sensorem pfindlichkeit um ca. 30% steigern ließ, obwohl die beiden anderen En zyme sogar in geringfügig niedrigeren enzymatischen Konzentrationen im Trienzym-Membransystem vorlagen (vgl. Tab. 1).It was possible to prove on modular measuring systems (cf. 2.1.1.1.) With H 2 O 2 detectors that the bee enzyme membrane SBC-1419-APG® can be distinguished by the additional presence of the mutarotase in the trienzyme membrane SBC -1425-APG® had the sensor sensitivity increased by approx. 30%, although the two other enzymes were present in the trienzyme membrane system even in slightly lower enzymatic concentrations (see Table 1).
Die ersten molekularselektiven Membranelektroden zur Bestimmung von APG® wurden auf der Basis von vier Enzymen realisiert und enthielten neben Amyloglucosidase, Glucoseoxidase, Mutarotase zusätzlich α-Glu cosidase, letztere unter der Vorstellung, möglicherweise den Fettalkohol aus seiner glycosidischen Bindung freizusetzen (Tab. 2).The first molecular selective membrane electrodes for the determination of APG® were realized on the basis of four enzymes and contained in addition to amyloglucosidase, glucose oxidase, mutarotase additionally α-Glu cosidase, the latter imagining possibly the fatty alcohol to be released from its glycosidic bond (Tab. 2).
Ein Umsatz von α-1,6-glucosidischen Bindungen durch das auch als Mal tase bekannte Enzym erfolgt leider nur langsam. Kein Angriff findet auf β- glucosidische Bindungen statt. Hingegen sind α-1,4-glucosidische Bin dungen der bevorzugte Angriffsort.A turnover of α-1,6-glucosidic bonds through that as well as times Unfortunately, this enzyme is slow. No attack takes place on β- glucosidic bonds instead. In contrast, α-1,4-glucosidic bin the preferred target.
Die Immobilisierung der vier Enzyme erfolgte durch Adsorption und/oder ionischer Bindung an einem Streifen aus Cellulosefasern zwischen zwei Dialysemembranen aus Celluloseacetat. Die Enzymmembran wurde mit ei ner chemisch nicht modifizierten PTFE-Membran abgedeckt und auf einem Acrylglasring mittels eines O-Ringes gespannt und schließlich unter Ver mittlung eines Innenelektrolytfilmes vor der Pt-Kathode des O2-Sensors positioniert, die durch eine Ag/AgCl Referenzkathode mit dem gemeinsa men Innenelektrolyten zur Meßzelle komplettiert wurde: O2 sensitive APG®-Multienzym-Membranelektroden. The four enzymes were immobilized by adsorption and / or ionic binding on a strip of cellulose fibers between two dialysis membranes made of cellulose acetate. The enzyme membrane was covered with a chemically unmodified PTFE membrane and stretched on an acrylic glass ring by means of an O-ring and finally positioned with the help of an inner electrolyte film in front of the Pt cathode of the O 2 sensor, which was covered by an Ag / AgCl reference cathode The common internal electrolyte for the measuring cell was completed: O 2 sensitive APG® multi-enzyme membrane electrodes.
An chemisch modifizierte PTFE-Membranen in aminisierter Form (2.1.2.2.) für Sauerstoff-Elektroden (2.1.2.) wurden durch das bifunktionelle Rea genz Glutardialdehyd Amyloglucosidase und Glucoseoxidase kovalent gebunden. In weiteren Schichten wurden diese Enzyme quervernetzt und an die vorherige Schicht angekoppelt. Unter den in Tab. 3 aufgeführten Enzymmembranen zeichnet den APG®-Sensor mit 10.) SBC-1322-APG®- HDKS5-Nr. 1 neben einer hohen Meßwertstabilität Einstellzeiten von nur 3 bis 6 Minuten aus. Dies ist Folge einer besonders strömungsgünstigen Geometrie bei tangentialer Anströmung des gesamten Membransystems und dem Fehlen von Enzyme kapselnden Dialysemembranen.On chemically modified PTFE membranes in aminized form (2.1.2.2.) for oxygen electrodes (2.1.2.) were determined by the bifunctional Rea genz glutardialdehyde amyloglucosidase and glucose oxidase covalently bound. In further layers, these enzymes were cross-linked and coupled to the previous layer. Among those listed in Tab. 3 Enzyme membranes draw the APG® sensor with 10.) SBC-1322-APG®- HDKS5 no. 1 in addition to high measurement stability, response times of only 3 to 6 minutes. This is the result of a particularly aerodynamic Geometry with tangential flow of the entire membrane system and the lack of enzyme-encapsulating dialysis membranes.
Neben der Wechselzahl der einzelnen Enzyme und strömungsgünstigen Positionierung der Membransysteme üben die Konzentrationen immobili sierter Enzyme über die damit in Zusammenhang stehende Länge der Dif fusionswege Einfluß auf die Einstellzeit der APG®-Sensor-Membranen aus. Das Verhältnis von Masse (mg) zum Substratumsatz (Unit) der in den APG®-Sensor-Membranen immobilisierten Enzyme läßt nach Abb. 2 er warten, daß der geschwindigkeitsbestimmende Schritt im intramembranö sen Diffusionsgeschehen von der Amyloglucosidase ausgeht. Ein Ver gleich von Abb. 3 mit Abb. 4 bestätigt diesen Zusammenhang (vgl. hierzu auch Abb. 1). Daraus erklärt sich aber auch das schleichende Einstellver halten von SBC-1402. Im Gegensatz hierzu zeigen andere APG®-selektive Membranelektroden mit O2-Detektoren und immobilisierten Enzymen an aminisierten PTFE-Membranen bei ebenfalls tangentialer Anströmung unter Verzicht auf Dialysemembranen kurze Einstellzeiten von wenigen Minuten: vgl. hierzu 10.) SBC-1322-APG®-HDKSS-Nr. 1 unter 3.4 und Tab. 3, während APG®-Sensoren mit Wasserstoffperoxid-Detektoren mit einer überlegenem Empfindlichkeit bzw. größerem Auflösungsvermögen aufwarten (vgl. hierzu Abb. 1).In addition to the changing number of individual enzymes and the streamlined positioning of the membrane systems, the concentrations of immobilized enzymes influence the response time of the APG® sensor membranes via the related length of the diffusion paths. The ratio of mass (mg) to substrate turnover (unit) of the enzymes immobilized in the APG® sensor membranes leads to the fact that the rate-determining step in the intramembrane diffusion process starts from the amyloglucosidase in Fig. 2. A comparison of Fig. 3 with Fig. 4 confirms this relationship (see also Fig. 1). This explains the creeping setting behavior of SBC-1402. In contrast to this, other APG®-selective membrane electrodes with O 2 detectors and immobilized enzymes on aminated PTFE membranes also show short response times of a few minutes with a tangential flow and without dialysis membranes: cf. 10.) SBC-1322-APG®-HDKSS-No. 1 under 3.4 and Tab. 3, while APG® sensors with hydrogen peroxide detectors offer superior sensitivity or greater resolution (see Fig. 1).
Abb. 2 zeigt die Beziehung von Masse (mg) zum Substratumsatz (U) der in den APG®-Sensor-Membranen eingesetzten Enzyme (1 Unit = 1 µmol Substratumsatz/min) Fig. 2 shows the relationship of mass (mg) to substrate turnover (U) of the enzymes used in the APG® sensor membranes (1 unit = 1 µmol substrate turnover / min)
Abb. 3 zeigt die Enzymkonzentrationen in U/APG®-selektiver Biosensor- Membran. Fig. 3 shows the enzyme concentrations in the U / APG® selective biosensor membrane.
In den Abb. 3 und 4 sind die Säulen für Mutarotase und Maltase (α-Glucosidase) der mit "Bi." (Abkürzung für Bienzymmembran) gekenn zeichneten Membranen auf Null gesetzt, für SBC-1425-Tri. (Tri. = Trien zymmembran) betrifft dies entsprechend nur die α-Glucosidase (Maltase).In the Fig. 3 and 4, the columns for mutarotase and maltase (α-glucosidase) with the "Bi". (Abbreviation for bienzyme membrane) marked membranes set to zero for SBC-1425-Tri. (Tri. = Trien zymmembran) this only affects the α-glucosidase (maltase).
Abb. 4 zeigt die Enzymkonzentrationen in mg/APG®-selektiver Biosen sor-Membran Fig. 4 shows the enzyme concentrations in mg / APG®-selective biosensor membrane
Durch Anhebung der Temperatur des Meßmediums darf eine Verkürzung der Einstellzeiten von APG®-Sensoren erwartet werden. Um eine ther misch bedingte Denaturierung der Enzyme sicher auszuschließen, wurde ein Temperaturanstieg über 40°C vermieden. Für die Trienzym-Membran SBC-1425-APG® wurde an H2O2-Detektoren des nach 2.1.1.1. aufgebau ten modularen Durchflußmeßsystems bei einer Temperaturerhöhung um 10°C der Faktor 1,3 bestimmt, der ebenfalls darauf hinweist, daß der phy sikalische Vorgang der Diffusion als geschwindigkeitsbestimmender Schritt für die Einstellzeiten dieses APG®-Sensors maßgeblich ist; denn bekanntlich steigt nach der RGT-Regel die Geschwindigkeit einer chemi schen Reaktion um das Zwei- bis Vierfache an, wenn sich die Temperatur um 10°C erhöht. Offensichtlich wird also dieser chemische Vorgang durch die intramembranösen Diffusionsvorgänge überlagert, wobei dann ein Fak tor von nur etwa 1, 2 zu erwarten ist. By increasing the temperature of the measuring medium, a shortening of the response times of APG® sensors can be expected. In order to reliably rule out thermal denaturation of the enzymes, a temperature rise above 40 ° C was avoided. For the trienzyme membrane SBC-1425-APG®, the H 2 O 2 detector according to 2.1.1.1. built-up modular flow measuring system determines the factor 1.3 when the temperature rises by 10 ° C, which also indicates that the physical process of diffusion as a rate-determining step is decisive for the response times of this APG® sensor; because, as is well known, according to the RGT rule, the speed of a chemical reaction increases two to four times when the temperature increases by 10 ° C. Obviously, this chemical process is superimposed by the intramembrane diffusion processes, in which case a factor of only about 1.2 can be expected.
Da der bisherige Schwerpunkt in der Erarbeitung membranchemischer Prinzipien lag, wurden die kontinuierlichen Dauerperfusionen der APG®- Sensoren mit Phosphatpuffer des pH-Wertes 5,0 bei zwischenzeitlichen Messungen in APG®-haltigen Lösungen nach einigen Wochen abgebro chen.Since the previous focus in the development of membrane chemical Principles, the continuous long-term perfusions of the APG® Sensors with a phosphate buffer with a pH value of 5.0 and intermediate Measurements in APG®-containing solutions stopped after a few weeks chen.
Neben der Substratselektivität der Enzyme sind prinzipiell detektorbezo gene Querempfindlichkeiten bei APG®-Sensoren zu berücksichtigen. Die se verursachen bei O2-Detektoren grenzflächenaktive oder gasförmige, die PTFE-Membran permeierende und kathodisch umsetzbare Substanzen wie beispielsweise die Halogenkohlenwasserstoffe Chloroform (Trichlor methan) oder das Inhalationsnarkotikum Halothan (1,1,1-Trifluor-2-brom-2- chlorethan).In addition to the substrate selectivity of the enzymes, detector-related cross-sensitivities have to be taken into account with APG® sensors. With O 2 detectors, these cause surface-active or gaseous substances that permeate the PTFE membrane and can be converted cathodically, such as the halogenated hydrocarbons chloroform (trichloromethane) or the inhalation anesthetic halothane (1,1,1-trifluoro-2-bromo-2-chloroethane) ).
Wasserstoffperoxid-Detektoren setzen in ihrer Eigenschaft als Meßanoden auch andere anodisch oxidierbare Substanzen um. Der bei einer Polarisati onsspannung von +950 mV Meß- gegen Referenzelektrode an frisch po lierten Platin-Anoden zu beobachtende Glucose-Interferenzstrom in 5,55 mmol/l glucosehaltigen Phosphatpufferlösungen mit einem pH-Wert von 7,04 zeigte innerhalb von zwei Wochen einen e-funktionellen drasti schen Abfall, der nach diesem Zeitraum nahezu vernachlässigbar klein wurde.Hydrogen peroxide detectors act as measuring anodes also other anodically oxidizable substances. The one with a Polarisati on voltage of +950 mV measuring against reference electrode on freshly po gelled platinum anodes observed glucose interference current in 5.55 mmol / l phosphate buffer solutions containing glucose with a pH value of 7.04 showed an e-functional drasti within two weeks waste that after this period is almost negligible has been.
Bei einer Konzentration von 7500 mg/l APG® 220 in auf einen pH-Wert von 5,0 phophatgepufferten Lösungen lieferten nicht frisch polierte Pt- Meßanoden in einem modular aufgebauten Meßsystem nach 2.1.1.1. ledig lich 1,33% des Meßstromes gegenüber einer mit der Bienzym-Membran SBC-1419 beschichteten. Diese geringfügige durch die APG®-Moleküle konzentrationsabhängig direkt am Detektor auslösbare zusätzliche Strom stärke kann nicht als Interferenzsignal gewertet werden, da sie synergi stisch zu dem durch die Enzym-Membran ausgelösten Meßstrom wirkt und einkalibrierbar ist. At a concentration of 7500 mg / l APG® 220 in to a pH value of 5.0 phosphate buffered solutions did not provide freshly polished Pt Measuring anodes in a modular measuring system according to 2.1.1.1. unmarried Lich 1.33% of the measuring current compared to one with the bienzyme membrane SBC-1419 coated. This minor due to the APG® molecules Additional current that can be triggered directly at the detector depending on the concentration Strength cannot be considered an interference signal because it is synergi acts on the measuring current triggered by the enzyme membrane and can be calibrated.
Der Nanoamperemeßwandler liefert dem amperometrischen Sensor pla teauanpaßt eine Polarisationsspannung und verfügt über eine Wandler konstante von 1 mV/nA. Die Polarisationsspannung beträgt für O2-sensitiv enzymatische Meßsysteme -750 mV Meß- gegen Referenzelektrode und fur H2O2 sensitiv-enzymatische Meßsysteme mit anodischer Oxidation +950 mV Meß- gegen Referenzelektrode.The nanoamperemeter transducer supplies the amperometric sensor with a polarization voltage that is adapted to the plateau and has a transducer constant of 1 mV / nA. The polarization voltage for O 2 sensitive enzymatic measuring systems is -750 mV measuring against reference electrode and for H 2 O 2 sensitive enzymatic measuring systems with anodic oxidation +950 mV measuring against reference electrode.
Der 21-Bit-AD-Wandler setzt die von dem Nanoamperemeßwandler nach Stromstärke/Spannungswandlung gelieferten elektrischen Gleichspan nungen in entsprechende digitale Signale uml die über eine serielle Schnittstelle (RS 232) an einen IBM-kompatiblen Rechner übermittelt werden, um rechnergestützt aus den gemessenen Stromstärken eine Meß datenauswertung vorzunehmen. Der Meßkurvenverlauf mit einem Meß wert innerhalb von ca. 2 Sekunden läßt sich dadurch am Bildschirm in fortlaufender Darstellung verfolgen.The 21-bit AD converter replaces that of the nano-amperemeter Current / voltage conversion supplied electrical DC to corresponding digital signals via a serial Interface (RS 232) transmitted to an IBM compatible computer be a computer-based measurement of the measured currents perform data analysis. The curve shape with a measurement value within about 2 seconds Track continuous display.
Weitere Anwendungsmöglichkeiten im Bereich der Biosensoren sind neben Alkylpolyglucosiden und anderen Tensiden beispielsweise auch die Bestim mung von Polyasparaginsäure und Fettalkoholderivaten.Other applications in the field of biosensors are besides Alkyl polyglucosides and other surfactants, for example, also the determinations tion of polyaspartic acid and fatty alcohol derivatives.
Stoffe im Bereich der Reaktoren können z. B. Stoffe sein, die vor Ort beim Kunden gebraucht werden, so z. B. Peroxide oder Tenside, Schmiermittel oder hochwertige Spezialchemikalien.Substances in the area of the reactors can e.g. B. substances that are on site at Customers are needed, e.g. B. peroxides or surfactants, lubricants or high-quality specialty chemicals.
Claims (42)
- a) Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche durch Modifi zierung der Trägeroberfläche mit plasmachemischen Methoden, insbesondere wobei die Aktivierung der chemisch inerten Trä geroberfläche eine Funktionalisierung der Trägeroberfläche umfaßt und vorzugsweise dadurch erfolgt, daß unter plasmachemischen Bedingungen mindestens eine geeignete, gegenüber dem oder den anzubindenden Enzymen reaktive funktionelle Gruppe direkt an der chemisch inerten Trägeroberfläche angebracht wird, insbeson dere wobei die funktionelle Gruppe vorzugsweise eine Carboxyl-, Amino-, Hydroxy- und/oder Thiogruppe, gegebenenfalls in akti vierter, insbesondere protonierter oder deprotonierter Foim, um faßt; anschließend
- b) Anbindung des oder der zu immobilisierenden Enzyms, gegebe nenfalls nach ihrer Überführung in einen aktivierten, anbindungs fähigen Zustand, an die auf in Schritt (a) aktivierte Trägeroberflä che; und schließlich
- c) gegebenenfalls Quervernetzung des in Verfahrensschritt (b) an gebundenen Enzyms,
- a) Activation of the chemically inert carrier surface by modifying the carrier surface using plasma chemical methods, in particular wherein the activation of the chemically inert carrier surface comprises functionalizing the carrier surface and preferably taking place in that at least one suitable, reactive towards the enzyme or enzymes to be bound under plasma chemical conditions functional group is attached directly to the chemically inert support surface, in particular the functional group preferably comprising a carboxyl, amino, hydroxyl and / or thio group, optionally in activated, in particular protonated or deprotonated, foam; subsequently
- b) binding of the enzyme or enzymes to be immobilized, if appropriate after their conversion into an activated, bindable state, to the surface of the carrier activated in step (a); and finally
- c) if appropriate crosslinking of the enzyme bound to process step (b),
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