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Die
Erfindung betrifft ein Scanmikroskop und ein Modul für ein Scanmikroskop.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Scanmikroskop zur stimulierten Emission
und ein Modul zum Erzeugen stimulierter Emission für ein Scanmikroskop.
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In
der Scanmikroskopie wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet,
um das von der Probe emittierte Reflexions- oder Fluoreszenzlicht
zu beobachten. Der Fokus des Beleuchtungslichtstrahles wird mit
Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen
durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Objektebene bewegt, wobei
die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so daß ein Spiegel
in x- und der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel
wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt.
Die Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes wird in Abhängigkeit
von der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente
mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet. Neben
diesen sogenannten strahlscannenden Methoden sind auch Scanmikroskope
mit räumlich
feststehendem Beleuchtungslichtstrahl bekannt, bei denen die Probe zur
Abtastung mit Hilfe eines Feinpositioniertisches verfahren wird.
Diese Scanmikroskope werden objektscannend genannt.
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Speziell
in der konfokalen Scanmikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus
eines Lichtstrahles in drei Dimensionen abgetastet.
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Ein
konfokales Rastermikroskop umfasst im allgemeinen eine Lichtquelle,
eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende – die sog.
Anregungsblende – fokussiert
wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung,
eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum
Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen
Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz-
oder Reflexionslicht gelangt über
die Strahlablenkeinrichtung zurück
zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende
fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Detektionslicht,
das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen
Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so daß man eine
Punktinformation erhält,
die durch sequentielles Abtasten des Objekts zu einem dreidimensionalen
Bild führt.
Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme
erzielt.
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Die
Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes wird in festen Zeitabständen während des Abtastvorganges
gemessen und so Rasterpunkt für Rasterpunkt
abgetastet. Der Messwert muss eindeutig der dazugehörigen Scanposition
zugeordnet sein, um aus den Messdaten ein Bild erzeugen zu können. Zweckmäßiger Weise
werden hierfür
die Zustandsdaten der Verstellelemente der Strahlablenkeinrichtung
laufend mitgemessen oder, was allerdings weniger genau ist, direkt
die Steuersolldaten der Strahlablenkeinrichtung verwendet.
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Es
ist auch möglich
in einer Durchlichtanordnung beispielsweise das Fluoreszenzlicht
oder die Transmission des Anregungslichtes kondensorseitig zu detektieren.
Der Detektionslichtstrahl gelangt dann nicht über die Scanspiegel zum Detektor
(Non descan Anordnung). Für
die Detektion des Fluoreszenzlichtes wäre in der Durchlichtanordnung
eine kondensorseitige Detektionsblende nötig, um, wie in der beschriebenen
Descan-Anordnung, eine dreidimensionale Auflösung zu erzielen. Im Falle
der Zweiphotonenanregung kann jedoch auf eine kondensorseitige Detektionsblende
verzichtet werden, da die Anregungswahrscheinlichkeit vom Quadrat
der Photonendichte abhängt
(proportional der Intensität2), die naturgemäß im Fokus viel höher ist
als in den Nachbarregionen. Das zu detektierende Fluoreszenzlicht stammt
daher mit großer
Wahrscheinlichkeit zum aller größten Teil
aus der Fokusregion, was eine weitere Differenzierung von Fluoreszenzphotonen
aus dem Fokusbereich von Fluoreszenzphotonen aus den Nachbarbereichen
mit einer Blendenanordnung überflüssig macht.
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Das
Auflösungsvermögen eines
konfokalen Rastermikroskops ist unter anderem durch die Intensitätsverteilung
und die räumliche
Ausdehnung des Fokus des Anregungslichtstrahls gegeben. Eine Anordnung
zur Steigerung des Auflösungsvermögens für Fluoreszenzanwendungen
ist aus der WO 95/21393 A1 bekannt. Hierbei werden die lateralen Randbereiche
des Fokusvolumens des Anregungslichtstrahls mit einem Lichtstrahl
einer anderen Wellenlänge,
dem sog. Stimulationslichtstrahl, der von einem zweiten Laser emittiert
wird, beleuchtet, um dort die vom Licht des ersten Lasers angeregten
Probenbereiche stimuliert in den Grundzustand zurück zu bringen.
Detektiert wird dann nur das spontan emittierte Licht aus den nicht
vom zweiten Laser beleuchteten Bereichen, so daß insgesamt eine Auflösungsverbesserung
erreicht wird. Für
dieses Verfahren hat sich die Bezeichnung STED (Stimulated Emission
Depletion) eingebürgert.
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Eine
neue Entwicklung hat gezeigt, daß man gleichzeitig sowohl lateral,
als auch axial eine Auflösungsverbesserung
erzielen kann, wenn es gelingt, den Fokus des Stimulationslichtstrahles
innen hohl zu machen. Hierzu wird in den Strahlengang des Stimulationslichtstrahles
eine runde λ/2-Platte,
die in ihrem Durchmesser kleiner als der Strahldurchmesser ist und
folglich überleuchtet
wird, eingebracht.
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Mikroskope
zur STED-Mikroskopie sind sehr aufwendig und schwer justierbar,
da der Fokus des Anregungslichtstrahls stets mit dem Fokus eines
Stimulationslichtstrahles in fester räumlicher Beziehung stehen muß. Ganz
besonders schwierig gestaltet sich dieses Problem bei strahlscannenden
Systemen, da bei diesen Systemen die Fokusse des Anregungslichtstrahls
und des Detektionslichtstrahles simultan und zueinander ortsfest über bzw.
durch die Probe geführt
werden müssen.
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Scanmikroskope
zur STED-Mikroskopie auf einer optischen Bank realisiert sind sehr
platzraubend und aufgrund ihrer Größe sehr schwierig gegen äußere Einflüsse, wie
mechanische Vibrationen oder Temperaturschwankungen der Umgebung
schützbar. Aus
diesem Grund wurden bislang auch nur objektscannende Systeme realisiert.
Aufgrund der Komplexität
sind Scanmikroskope zur STED-Mikroskopie durch Nachrüsten herkömmlicher
Scanmikroskope nicht umsetzbar.
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Der
Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Scanmikroskop zum
optischen Messen eines Probenpunktes einer Probe mit hoher Ortsauflösung anzugeben,
das einfach, insbesondere auch durch Nachrüsten oder Umrüsten eines
herkömmlichen
Scanmikroskops, realisierbar ist.
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Die
Aufgabe wird durch ein Scanmikroskop gelöst, das die Merkmale des Anspruchs
1 aufweist.
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Ferner
ist es Aufgabe der Erfindung ein Modul zur Formung eines Stimulationslichtstrahles
anzugeben, das einfach die beschriebenen Probleme bei der Realisierung
eines Scanmikroskops zum optischen Messen eines Probenpunktes einer
Probe mit hoher Ortsauflösung
löst.
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Die
Aufgabe wird durch ein Modul gelöst,
das die Merkmale des Anspruchs 11 aufweist.
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Die
Erfindung hat den Vorteil, daß der
Aufwand zur Realisierung eines höchstauflösenden Scanmikroskops
durch Zusammenfassung wesentlicher den Stimulationslichtstrahl formender
optischer Elemente zu einem Modul erheblich reduziert wird.
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Das
Modul kann neben den optischen Elementen zur Formung des Stimulationslichtstrahles auch
Elemente zur Strahlführung,
Strahlaufweitung oder Fokussierung beinhalten. Alle optischen Elemente
innerhalb des Moduls sind zueinander justiert und das gesamte Modul
weist eine Justiervorrichtung auf, die eine einfache Positionierung
innerhalb des Strahlenganges eines Scanmikroskops ermöglicht. Hierdurch
wird der Gesamtjustieraufwand erheblich reduziert.
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Ein
optisches Element zur Formung des Stimulationslichtstrahles kann
eine Verzögerungsplatte, vorzugsweise
eine λ/2-Platte
sein, die von einem Teil des Stimulationslichtstrahles durchstrahlt
wird. Auch andere Elemente, wie beispielsweise LCD-Elemente sind
zur Formung des Fokus des Stimulationslichtstrahles in der Probe
einsetzbar. LCD-Elemente haben den Vorteil, daß die LCD-Rasterelemente elektronisch
einzeln ansprechbar sind und die Form des Fokus des Stimulationslichtstrahles
den aktuellen Abtastbedingungen angepaßt werden kann. Es ist insbesondere
möglich,
die Form des Fokus während des
Abtastvorganges bzw. während
des Scannens zu verändern.
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In
ganz besonders vorteilhafter Weise werden die formenden Elemente
derart angeordnet bzw. angesteuert, daß der Fokus des Stimulationslichtstrahles
in der Probe innen hohl ist, da so eine Auflösungssteigerung in allen Raumrichtungen
möglich ist.
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Besonders
stabil ist es, das Modul mit einer Grundplatte auszurüsten, auf
der die optischen Elemente montiert werden. Die Grundplatte weist
vorzugsweise einen kleinen thermischen Ausdehnungskoeffizient auf.
Es ist auch möglich
die Grundplatte oder das gesamte Modul aktiv zu temperieren. Hierzu kann
ein elektrischer Regelkreis mit einem Peltierelement vorgesehen
sein.
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Ganz
besonders günstig
ist es, das Scanmikroskop mit Anschlagflächen zu versehen, die eine
genaue Arbeitsposition des Moduls definieren, in der das Modul sicher
fixiert ist. Im Idealfall ist dann keine weitere Justierung des
Moduls nötig.
In besonders vorteilhafter Weise sind Bajonettanschlüsse zur
Positionierung und Fixierung des Moduls vorgesehen.
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Zum
Schutz vor einer äußeren Einwirkung weist
das Modul ein Gehäuse
auf. Das Gehäuse kann
staubdicht ausgeführt
sein.
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In
ganz besonders Vorteilhafter Weise ist das Modul an ein herkömmliches
Scanmikroskop adaptierbar, so daß ein Zugang zur höchstauflösenden Scanmikroskopie
durch einfaches Nachrüsten
ermöglicht
ist. Auch die Verwendung des Scanmikroskops in herkömmlicher
Weise bleibt unbenommen, da das Modul ohne großen Aufwand entfernbar ist.
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Das
Modul beinhaltet in einer besonderen Ausgestaltung die Lichtquelle,
insbesondere den Teil der Lichtquelle, die den Stimulationslichtstrahl
erzeugt. Als Lichtquelle werden hauptsächlich Laser, insbesondere
Pulslaser verwendet. Hier sind insbesondere Diodenlaser, Festkörperlaser, Farbstofflaser und
Gaslaser einsetzbar. Auch die Verwendung einer Lichtquelle, die
Photonic-Band-Gap-Material beinhaltet, ist möglich. Diese kann beispielsweise
aus einem Pulslaser bestehen, dem ein Lichtleitelement oder eine
Lichtleitfaser aus Photonic-Band-Gap-Material nachgeordnet ist.
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Das
Stimulationslicht kann auch mit einer Lichtleitfaser von einer externen
Lichtquelle zum Modul transportiert werden. Zur Auskopplung des
Lichtes aus der Lichtleitfaser weist das Modul eine Koppeloptik
auf. Ganz besonders vorteilhaft ist es in diesem Zusammenhang, das
Modul mit genormten Lichtleitfasersteckern bzw. Muffen zu versehen.
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Das
Scanmikroskop kann insbesondere auch als konfokales Scanmikroskop
ausgestaltet sein.
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In
der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt
und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben. Dabei zeigen:
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1 eine erfindungsgemäßes Scanmikroskop,
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2 ein weiteres erfindungsgemäßes Scanmikroskop,
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3 ein erfindungsgemäßes nachgerüstetes Scanmikroskop
und
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4 eine schematische Darstellung
der Ausbildung einer bestimmten Fokusform.
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1 zeigt ein erfindungsgemäßes Scanmikroskop,
das als konfokales Scanmikroskop ausgeführt ist.
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Das
Scanmikroskop beinhaltet eine Lichtquelle 1, die aus einem
ersten Laser 3 zur Erzeugung eines Anregungslichtstrahles 5 und
aus einem zweiten Laser 7 zur Erzeugung eines Stimulationslichtstrahles 9 besteht.
Der erste Laser 3 ist als modenverkoppelter Ti:Saphir-Laser
ausgeführt,
der Pulse mit einer Repetitionsrate von ca. 80 MHz emittiert. Der
zweite Laser 7 ist ein optisch parametrischen Oszillator,
der von einem anderen gepulst arbeitenden Ti:Saphir-Laser gepumpt
wird, der in der Pulsfolge auf den ersten Laser synchronisiert ist.
Der Anregungslichtstrahl 5 wird auf ein Beleuchtungspinhole 11 fokussiert
und wird anschließend
von einem ersten Strahlteiler 13, der als 50:50-Neutralteiler
ausgeführt
ist, zum Scanmodul 15 reflektiert, das einen kardanisch
aufgehängten
Scanspiegel 17 beinhaltet, der den Anregungslichtstrahl 5 über die
Scanoptik 19, die Optik 21 und durch die Mikroskopoptik 23 hindurch über bzw.
durch die Probe 25 führt.
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Der
von dem zweiten Laser 7 ausgehende Stimulationslichtstrahl 9 passiert
das Modul 27 und wird mit Hilfe des zweiten Strahlteilers 28,
der als dichromatischer Strahlteiler ausgeführt ist, mit dem Anregungslichtstrahl 5 vereinigt.
Das Modul 27 beinhaltet eine erste Optik 29 zur
Aufweitung des Stimulationslichtstrahles 9, eine Verzögerungsplatte 31,
die als λ/2-Platte
ausgeführt
ist und die so angeordnet ist, daß sie vom mittleren Anteil
des Stimulationslichtstrahles 9 durchstrahlt wird, während die äußeren Anteile
vorbei gehen, und eine zweite Optik 33 zur Fokussierung.
Die Verzögerungsplatte 31 befindet sich
in einer zur Fokusebene in der Probe 25 konjugierten Fourierebene.
Sie erzeugt einen innen hohlen Fokus (siehe 4). Sie fungiert in dieser Ausführungsvariante
als Mittel zur Beeinflussung der Form des Fokus 46. Das
Modul 27 weist ein thermisch isolierendes, staubschützendes
Gehäuse 34 auf
und ist mit Hilfe der Justiervorrichtungen 35, 36 justierbar.
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Das
von der Probe 25 ausgehende Detektionslicht 37 gelangt
durch die Mikroskopoptik 23 hindurch und über die
Scanoptik 19, die Optik 21 und über das
Scanmodul 15 zum ersten Strahlteiler 13, passiert
diesen und das folgende Detektionspinhole 39 und gelangt
schließlich
zum Detektor 41, der als Photomultiplier ausgeführt ist.
Im Detektor 39 werden elektrische, zur Leistung des vom
Objekt ausgehenden Detektionslichtes 37 proportionale Detektionssignale
erzeugt.
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Die
Probe wird schichtweise abgetastet, um aus den Detektionssignalen
ein dreidimensionales Bild der Probe zu erzeugen.
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Die
Anregung der Probe erfolgt in diesem Ausführungsbeispiel durch Zweiphotonenanregung. Der
zeitliche Abstand der Pulse des Anregungslichtstrahles und des Stimulationslichtstrahles
ist kürzer gewählt, als
die mittlere Lebensdauer des angeregten Zustandes der Probe.
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2 zeigt schematisch ein
Scanmikroskop mit einem Modul 43, das zum Schutz vor Staub
und Verschmutzung ein Gehäuse 45 aufweist.
Das Modul beinhaltet einen zweiten Laser 7, der den Stimulationslichtstrahl 9 erzeugt.
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In
dieser erfindungsgemäßen Ausgestaltung wird
ein LCD-Element 47 zur Formung des Fokus des Stimulationslichtstrahl
verwendet. Das von zweiten Laser 7 emittierte Licht gelangt über einen Strahlteilerwürfel 49 zu
einer Aufweitungsoptik 51, um anschließend auf das LCD-Element 47 zu
treffen. Das LCD-Element 47 fungiert in dieser Ausführungsvariante
als Mittel zur Beeinflussung der Form des Fokus 46. Dort
können
pixelweise die Phase einzelner Anteile des auftreffenden Anregungslichtstrahls um λ/4 verzögert werden.
Der durchgetretene Stimulationslichtstrahl 9 wird von einem
Spiegel 53 reflektiert und die bereits beim ersten Durchlaufen
verzögerten
Anteile erfahren eine weitere Phasenverzögerung beim rückwärtigen Durchlaufen
des LCD-Elements 47. Anschließend passiert der Stimulationslichtstrahl 9 den
Strahlteilerwürfel 49 und
wird am zweiten Strahlteiler 28 mit dem Anregungslichtstrahl vereinigt.
Da jedes einzelne Pixel direkt angesteuert werden kann ist diese
Anordnung sehr flexibel und gestattet auch Veränderungen während des Betriebs, insbesondere
während
des Abtastvorganges.
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Das
Scanmikroskop weist zwei Anschlagelemente 55, 57 auf,
die eine Arbeitsposition des Moduls definieren. Das Modul ist einfach
in dieser Arbeitsposition positionierbar und wird von nicht gezeigten
Andruckelementen, die als Blattfedern ausgeführt sind, gegen die Anschlagelemente
gedrückt
und in der Arbeitsposition gehalten.
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3 zeigt ein konfokales Scanmikroskop 59 mit
einem Stativgehäuse 61,
bei dem durch Nachrüsten
mit dem Modul 63 ein Zugang zur höchstauflösenden Scanmikroskopie geschaffen
ist. Das Modul 63 weist ein staubdichtes Gehäuse 65 mit
einem Bajonettanschluß 67 auf.
Das Modul 63 beinhaltet, wie das bereits in 1 beschriebene Modul 27,
eine erste Optik 29 zur Aufweitung des Stimulationslichtstrahles 9,
eine Verzögerungsplatte 31,
die als λ/2-Platte
ausgeführt
ist und die so angeordnet ist, daß sie vom mittleren Anteil
des Stimulationslichtstrahles 9 durchstrahlt wird, während die äußeren Anteile
vorbei gehen, und eine zweite Optik 33 zur Fokussierung.
Die λ/2-Platte 31 befindet
sich in einer zur Fokusebene in der Probe 25 konjugierten
Fourierebene. Sie erzeugt einen innen hohlen Fokus. Das Modul 63 beherbergt
ferner einen Laser 7, der den Stimulationslichtstrahl 9 erzeugt
und als Diodenlaser ausgeführt
ist. Alle Elemente innerhalb des Moduls 63 sind derart
justiert, daß nach
dem Anflanschen an das Stativgehäuse 61 keine
weitere Justierung erforderlich ist.
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Innerhalb
des konfokalen Scanmikroskops 59 verlaufen die Strahlengänge analog
zu den in 1 beschriebenen
Strahlengängen.
Der Stimulationslichtstrahl 9 wird am zweiten Strahlteiler 28 mit dem
Anregungslichtstrahl 5 vereinigt, der von dem Laser 3 erzeugt
wurde. Der Anregungslichtstrahl 5 erreicht zusammen mit
dem Stimulationslichtstrahl 9 den ersten Strahlteiler 13,
der die Lichtstrahlen zum kardanisch aufgehängten Scanspiegel 17 reflektiert. Von
dort aus gelangen der Stimulationslichtstrahl und der Anregungslichtstrahl über die
Scanoptik 19, die Optik 21 und durch die Mikroskopoptik 23 hindurch zur
Probe 25, die auf einem Mikroskoptisch 69 angeordnet
ist.
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Das
gezeigte konfokale Scanmikroskop 59 weist einen Descan-Detektor 71 und
einen Non-Descan-Detektor 73 auf. Insbesondere bei der
Anregung der Probe 25 über
einen Mehrphotonenprozeß ist
die Verwendung des Non-Descan-Detektor 73 von
besonderem Interesse. In der Descan-Arbeitsweise gelangt das Detektionslicht 37 durch
die Mikroskopoptik 23 hindurch und über die Optik 21,
die Scanoptik 19 und über
das den Scanspiegel 17 zum ersten Strahlteiler 13,
passiert diesen und das folgende Detektionspinhole 39 und
gelangt schließlich
zum Descan-Detektor 71, der als Photomultiplier ausgeführt ist.
In der Non-Descan-Arbeitsweise wird das Detektionslicht 37 von
einem Kondensor 75 gebündelt
und gelangt über
den Spiegel 77 zum Non-Descan-Detektor 73. Auf
ein Detektionspinhole kann in der Non-Descan-Arbeitsweise verzichtet werden.
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4 zeigt eine schematische
Darstellung der Ausbildung einer bestimmten Fokusform des Stimulationslichtstrahles 9 und
verdeutlicht die räumliche
Lage des Anregungslichtstrahles 5 und des Stimulationslichtstrahles 9 innerhalb oder
an der Oberfläche
der zu untersuchenden Probe 25. Der Stimulationslichtstrahl 9 besitzt
einen größeren Strahldurchmesser
als der Anregungslichtstrahl 5, so dass der Anregungslichtstrahl 5 von
dem Stimulationslichtstrahl 9 im Fokusbereich vollständig umschlossen
ist. Der Stimulationslichtstrahl 9 weist einen innen hohlen
Fokus auf. Durch die Überlappung
des Anregungslichtstrahles 5 und des Stimulationslichtstrahles 9 wird
im Fokusbereich ein 3-dimensionaler Überlappungsbereich 79 definiert,
der in 4 als schraffierte
Fläche
dargestellt ist. Der Bereich der im Fokusbereich des Anregungslichtstrahles 5 und
innerhalb des hohlen Anteils des Stimulationslichtstrahles 9 liegt,
definiert das Emissionsvolumen 81.
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Die
Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es
ist jedoch selbstverständlich,
dass Änderungen
und Abwandlungen durchgeführt
werden können,
ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.
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- 1
- Lichtquelle
- 3
- erster
Laser
- 5
- Anregungslichtstrahl
- 7
- zweiter
Laser
- 9
- Stimulationslichtstrahl
- 11
- Beleuchtungspinhole
- 13
- erster
Strahlteiler
- 15
- Scanmodul
- 17
- Scanspiegel
- 19
- Scanoptik
- 21
- Optik
- 23
- Mikroskopoptik
- 25
- Probe
- 27
- Modul
- 28
- zweiter
Strahlteiler
- 29
- erste
Optik
- 31
- Verzögerungsplatte
- 33
- zweite
Optik
- 34
- Gehäuse
- 35
- Justiervorrichtung
- 36
- Justiervorrichtung
- 37
- Detektionslicht
- 39
- Detektionspinhole
- 41
- Detektor
- 43
- Modul
- 45
- Gehäuse
- 46
- Mittel
zur Beeinflussung der Form des Fokus
- 47
- LCD-Element
- 49
- Strahlteilerwürfel
- 51
- Aufweitungsoptik
- 53
- Spiegel
- 55
- Anschlagelement
- 57
- Anschlagelement
- 59
- Scanmikroskop
- 61
- Stativgehäuse
- 63
- Modul
- 65
- Gehäuse
- 67
- Bajonettanschluß
- 69
- Mikroskoptisch
- 71
- Descan-Detektor
- 73
- Non-Descan-Detektor
- 75
- Kondensor
- 77
- Spiegel
- 79
- Überlappungsbereich
- 81
- Emissionsvolumen