DE10064146A1

DE10064146A1 - Biosensor and method for its production

Info

Publication number: DE10064146A1
Application number: DE2000164146
Authority: DE
Inventors: Andreas Hofmann
Original assignee: Individual
Current assignee: Jandratek 96346 Wallenfels De GmbH
Priority date: 2000-12-22
Filing date: 2000-12-22
Publication date: 2002-07-04
Also published as: WO2002052260A9; WO2002052260A2; AU2002237253A1; WO2002052260A3

Abstract

The invention relates to a biosensor comprising a support (1) (prism of glass), a plasmon-carrying layer (2) that consists of a metal layer with free electrons, especially gold or silver, or a semiconductor layer and a hydrogel layer (6) that consists of a polymer, especially a dextran to which receptors (7) can be bound. Said biosensor is further provided with a protective layer (4) that consists of a silicon oxide or a metal oxide, or a protective layer (9) that consists of a polymer and that is physisorbed to the plasmon-carrying layer (2). The hydrogel layer (6) can be bound via a linker (5, 10), for example in the case of a protective layer (4) from silicon oxide by for example silane as the linker (5). The protective layer (4) has a thickness of less than 10 nm, preferably less than 5 nm, and effectively protects the active plasmon-carrying layer (2) from any disturbing contaminations. The physical optical effect produced by the surface plasmon resonance does not take place outside the range that can be measured so that the suitability as a biosensor is not lost.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf einen Biosensor mit einem Trä ger, einer auf dem Träger angeordneten, plasmonentragenden Schicht aus einem Metall mit freien Elektronen bzw. einem Halb leiter, einer Zwischenschicht und einer außenliegenden Hydro gelschicht mit der Möglichkeit zum Anbinden von Rezeptoren für die Bindung von Analyten und der Eigenschaft, unspezifische Ad sorption zu vermeiden.The invention relates to a biosensor with a tra ger, one arranged on the carrier, plasmon-carrying Layer of a metal with free electrons or a half ladder, an intermediate layer and an external hydro gel layer with the possibility of binding receptors for the binding of analytes and the property, unspecific Ad to avoid sorption.

Ein derartiger Biosensor (Affinitätssensor) ist z. B. aus DE 198 17 180 C2 bekannt.Such a biosensor (affinity sensor) is e.g. B. from DE 198 17 180 C2 known.

Der Biosensor, dessen Hydrogelschicht aus einem Polymer, beispielsweise Dextran, Amylose oder Celulose besteht und des sen Rezeptoren beispielsweise von Proteinen (z. B. Antikörper, Antigenen, Membranproteinen), Glykoproteinen, Nykleotiden oder DNA gebildet sind, an die sich ein Analyt (Bindungspartner) an lagern kann, dient dem Nachweis bestimmter Moleküle (insbe sondere Biomoleküle) in einer zu untersuchenden Probe, wozu eine optische Plasmonenresonanzmessung vorgenommen wird. The biosensor, whose hydrogel layer is made of a polymer, for example dextran, amylose or celulose and receptors, for example of proteins (e.g. antibodies, Antigens, membrane proteins), glycoproteins, nykleotids or DNA are formed, to which an analyte (binding partner) attaches can be used for the detection of certain molecules (esp special biomolecules) in a sample to be examined, why an optical plasmon resonance measurement is carried out.

Bei den bekannten Biosensoren ist eine kovalentgebundene orga nische Verbindung, vorwiegend Schwefelverbindung, als Linker zwischen der plasmonentragenden Edelmetallschicht (insbesondere Goldschicht) und der Zwischenschicht aus einem Polymer vorgese hen, und ein weiterer Linker dient zum Anbinden des Hydrogels (Hauptpolymer). Dieser Aufbau erfordert nicht nur eine ver gleichsweise aufwändige Herstellung sondern hat auch den Nach teil, daß es zu einer störenden Verunreinigung der reaktiven Goldschicht durch Substanzen, z. B. von organischen Verbindungen aus der Luft, kommen kann, was wiederum eine aufwändige Reini gungsprozedur bedingt.In the known biosensors there is a covalently bound orga African compound, mainly sulfur compound, as a linker between the plasmon-bearing precious metal layer (in particular Gold layer) and the intermediate layer made of a polymer hen, and another linker is used to bind the hydrogel (Main polymer). This structure does not only require a ver equally complex production but also has the aftermath part that there is an annoying contamination of the reactive Gold layer through substances, e.g. B. of organic compounds can come from the air, which in turn is a complex process procedure.

Dementsprechend liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, einen Biosensor zu schaffen, der sich vergleichsweise einfach her stellen läßt und der unanfällig gegen störende Verunreinigung der plasmonentragenden Schicht ist.Accordingly, the invention is based on the object To create a biosensor that is comparatively simple can be put and the insensitive to disturbing pollution the plasmon-bearing layer.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die Zwi schenschicht eine die plasmonentragende Schicht abdeckende Schutzschicht enthält, die auf die plasmonentragende Schicht physisorbiert ist und mit der die Hydrogelschicht verbunden ist.This object is achieved in that the Zwi layer covering the plasmon-bearing layer Contains protective layer on the plasmon-bearing layer is physisorbed and with which the hydrogel layer is connected is.

Die erfindungsgemäß vorgesehene Physisorption, also eine Bin dung über elektrostatische Kräfte, macht ein chemisches An binden nach Art eines Linkers an die plasmonentragende Schicht überflüssig. Die physisorbierte Schutzschicht, beispielsweise eine sehr dünne Siliziumoxidschicht, schützt die plasmonentra gende Schicht in hervorragender Weise vor Verunreinigungen, insbesondere verhindert sie in Kombination mit der Hydrogel schicht die sogenannte unspezifische Adsorption. Dieses Er gebnis wird bereits mit einer die plasmonentragende Schicht versiegelnden dünnen Schutzschicht von weniger als 10 nm, ins besonder weniger als 5 nm, erreicht, ohne daß durch diese Schutzschicht der für die Messungen relevante physikalische Ef fekt verloren geht. The physisorption provided according to the invention, that is to say a bin application via electrostatic forces, makes a chemical application bind to the plasmon-bearing layer in the manner of a linker superfluous. The physisorbed protective layer, for example a very thin silicon oxide layer protects the plasmonentra layer in an excellent way against impurities, in particular it prevents in combination with the hydrogel layer the so-called unspecific adsorption. This he The plasmon-bearing layer is already obtained sealing thin protective layer of less than 10 nm, ins particularly less than 5 nm, achieved without this Protective layer of the physical Ef relevant for the measurements is lost.

Weitere Vorteile des erfindungsgemäßen Biosensors bestehen darin, daß sich die Hydrogelschicht einfacher an die physisor bierte Schutzschicht anbinden läßt und sich bekannte und be währte Beschichtungsmethoden aus anderen Bereichen übernehmen lassen. Weiter läßt sich beim Aufbringen der plasmonentragenden Edelmetallschicht durch Aufdampfen oder Sputtern auf den Träger in arbeitssparender Weise in einem Schritt auch die Schutz schicht aufbringen.There are further advantages of the biosensor according to the invention in that the hydrogel layer attaches itself more easily to the physisor can be tied protective layer and known and be adopt proven coating methods from other areas to let. Furthermore, when applying the plasmon-carrying Precious metal layer by vapor deposition or sputtering on the carrier protection in one step in a labor-saving manner apply layer.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Herstellen des erfindungsgemäßen Biosensors, bei dem auf einen Träger eine plasmonentragende Schicht aufgebracht wird, die dann unter Zwi schenfügung einer Zwischenschicht mit einer Hydrogelschicht überdeckt wird.The invention also relates to a method for producing the Biosensor according to the invention, in which a plasmon-bearing layer is applied, which then under interim Add an intermediate layer with a hydrogel layer is covered.

Dieses Verfahren ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, daß nach dem Aufbringen der plasmonentragenden Schicht auf diese als Zwischenschicht eine Schutzschicht physisorbiert wird, worauf an die Zwischenschicht die Hydrogelschicht angela gert wird.According to the invention, this method is characterized in that that after applying the plasmon-bearing layer This physisorbs a protective layer as an intermediate layer becomes, whereupon the hydrogel layer angela on the intermediate layer is gert.

Zweckmäßige Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.Appropriate refinements and developments of the invention result from the subclaims.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von zwei Beispielen und den zugehörigen schematischen Fig. 1 und 2 der beiden bei spielhaften Biosensoren näher erläutert, wobei die Fig. 3 und 4 das Ergebnis optischer Plasmonenresonanzmessungen (Detektorantwortskurven) mit einem Biosensor gemäß Fig. 1 mit physisorbierter Schutzschicht (Fig. 4) und ohne eine solche Schutzschicht (Fig. 3) zeigen.The invention is explained in more detail below with the aid of two examples and the associated schematic FIGS. 1 and 2 of the two exemplary biosensors, FIGS . 3 and 4 the result of optical plasmon resonance measurements (detector response curves) with a biosensor according to FIG. 1 with a physisorbed protective layer ( Fig. 4) and without such a protective layer ( Fig. 3) show.

example 1

Auf einem Träger 1, beispielsweise ein Glasprisma, ist eine plasmonentragende Schicht 2 angeordnet, bei der es sich um eine Edelmetallschicht, insbesondere eine Goldschicht, eine Silber schicht oder eine Halbleiterschicht handeln kann. Zwischen dem Träger 1 und der Schicht 2 kann ein Haftvermittler (nicht dar gestellt) vorgesehen sein. Wie in Fig. 1 dargestellt, befindet sich auf der Schicht 2 eine Zwischenschicht 3. Auf die Schicht 2 wurde über einen Haftvermittler, z. B. Nickel/Chrom, Titan, Chrom, mittels thermischen Aufdampfens, Sputterns, Elektronen strahlverdampfens, Solgeltechnik oder Plasmapolymerisation eine ultradünne Siliziummonoxid-Schicht (SiO-Schicht) von weniger als 5 nm Dicke aufgebracht. Das SiO ist an der Luft zu SiO₂ oxidiert und bildet eine Schutzschicht 4 auf der plasmonentra genden Schicht 2.On a carrier 1 , for example a glass prism, a plasmon-bearing layer 2 is arranged, which can be a noble metal layer, in particular a gold layer, a silver layer or a semiconductor layer. An adhesion promoter (not shown) can be provided between the carrier 1 and the layer 2 . As shown in FIG. 1, there is an intermediate layer 3 on layer 2 . Layer 2 was applied via an adhesion promoter, e.g. B. nickel / chromium, titanium, chromium, by means of thermal vapor deposition, sputtering, electron beam evaporation, solgel technology or plasma polymerization, an ultra-thin silicon monoxide layer (SiO layer) of less than 5 nm thickness is applied. The SiO is oxidized to SiO _{2 in} air and forms a protective layer 4 on the plasmonentra layer 2 .

Anschließend wurde die Oberfläche der Schutzschicht 4 silani siert, wie es dem Fachmann bekannt und u. a. von Elam, Nygren und Stenberg im Artikel "Covalent coupling of polysaccharides to silicon and silicon rubber surfaces" in Journal of Biomedi cal Materials Research, Vol. 18, 953 bis 959 (1984) beschrieben ist. Über die so gebildete Silanschicht 5 ist eine Hydrogel schicht 6, z. B. Dextran, Amylose oder Cellulose, angeschlossen. Diese Hydrogelschicht 6 kann in bekannter Weise mit Rezeptoren 7 versehen werden, z. B. Proteinen (z. B. Antikörpern, Antigenen, Membranproteinen), Glykoproteinen, Nukleotiden, DNA, an die sich nur die nachzuweisenden Analyte, vorwiegend Biomoleküle, anlagern, soweit sich diese in einer auf die Hydrogelschicht 6 aufzubringenden Probe befinden.The surface of the protective layer 4 was then silanized, as is known to the person skilled in the art and, inter alia, by Elam, Nygren and Stenberg in the article "Covalent coupling of polysaccharides to silicon and silicon rubber surfaces" in the Journal of Biomedical Materials Research, Vol. 18, 953 to 959 ( 1984 ). About the silane layer 5 thus formed is a hydrogel layer 6 , z. B. dextran, amylose or cellulose, connected. This hydrogel layer 6 can be provided in a known manner with receptors 7 , for. B. proteins (z. B. antibodies, antigens, membrane proteins), glycoproteins, nucleotides, DNA, to which only the analytes to be detected, predominantly biomolecules, attach, insofar as they are in a sample to be applied to the hydrogel layer 6 .

Zum Nachweis dafür, daß die erfindungsgemäß vorgesehene phy sisorbierte Schutzschicht 4 die Plasmonenresonanzmessung nicht stört, wurden Vergleichsversuche für einen Biosensor ohne die Schutzschicht 4 (Fig. 3) und für den Biosensor mit der Schutz schicht 4 (Fig. 4) gemacht. Dabei sind die reflektierten Lichtintensitäten über den durchgestimmten Einfallswinkeln des auf die Unterseite des Trägers 1 gelenkten monochromatischen Lichts dargestellt. Für beide Fälle ist das resonanzbedingte Intensitätsminimum, das einen Hinweis auf die an den Rezeptoren 7 angelagerten Biomoleküle gibt, annähernd gleich deutlich zu erkennen. Dabei entspricht die im Vergleich zu Fig. 3 in Fig. 4 vorhandene Verschiebung und Verbreiterung der Kurven den theoretischen Annahmen. Exakte Meßergebnisse sind also trotz der vorhandenen Schutzschicht 4 gewährleistet. To demonstrate that the phy sorbed protective layer 4 provided according to the invention does not interfere with the plasmon resonance measurement, comparative tests were carried out for a biosensor without the protective layer 4 ( FIG. 3) and for the biosensor with the protective layer 4 ( FIG. 4). The reflected light intensities are shown over the tuned angles of incidence of the monochromatic light directed onto the underside of the carrier 1 . For both cases, the resonance-related intensity minimum, which gives an indication of the biomolecules attached to the receptors 7 , can be recognized approximately equally clearly. The shifting and widening of the curves in comparison to FIG. 3 in FIG. 4 corresponds to the theoretical assumptions. Exact measurement results are thus guaranteed despite the protective layer 4 present.

Example 2

Fig. 2 zeigt einen gegenüber Fig. 1 abgewandelten Biosensor, der jedoch in gleicher Weise einen Träger 1, eine plasmonentra gende Schicht 2 und eine Hydrogelschicht 6 mit Rezeptoren 7 aufweist. Abweichend weist die Zwischenschicht 8 eine Schutz schicht 9 auf, zu deren Ausbildung auf die Oberfläche der Schicht 2 mittels Plasmapolymerisation ein Polymer, beispiels weise Polyacrylsäure, aufgebracht wurde. An diese als Schutz schicht dienende Polymerschicht 9 ist die Hydrogelschicht 6 mittels eines Linkers 10 angelagert. FIG. 2 shows a biosensor modified compared to FIG. 1, but which in the same way has a carrier 1 , a plasmonentra layer 2 and a hydrogel layer 6 with receptors 7 . Deviating from this, the intermediate layer 8 has a protective layer 9 , for the formation of which a polymer, for example polyacrylic acid, was applied to the surface of the layer 2 by means of plasma polymerization. The hydrogel layer 6 is attached to this polymer layer 9 serving as a protective layer by means of a linker 10 .

Claims

1. Biosensor with a carrier ( 1 ), one on the carrier ( 1 ) on ordered, plasmon-carrying layer ( 2 ) made of a metal with free electrons or a semiconductor, an intermediate layer ( 3 , 8 ) and an external hydrogel layer ( 6 ) with the possibility of binding receptors ( 7 ) for the binding of analytes and the property of avoiding unspecific adsorption, characterized in that the intermediate layer ( 3 , 8 ) has a protective layer ( 4 , covering the plasmon-carrying layer ( 2 )), 9 ), which is physisorbed onto the plasmon-carrying layer ( 2 ) and to which the hydrogel layer ( 6 ) is connected.

2. Biosensor according to claim 1, characterized in that the protective layer ( 4 , 9 ) is less than 10 nm thick.

3. Biosensor according to claim 1, characterized in that the protective layer ( 4 , 9 ) is less than 5 nm thick.

4. Biosensor according to one of claims 1 to 3, characterized in that the protective layer ( 4 ) has a silicon oxide.

5. Biosensor according to one of claims 1 to 3, characterized in that the protective layer ( 4 ) has a metal oxide.

6. Biosensor according to one of claims 1 to 3, characterized in that the protective layer ( 9 ) comprises a polymer.

7. Biosensor according to one of claims 1 to 3, characterized in that the protective layer ( 9 ) comprises polyacrylic acid or polystyrene.

8. Biosensor according to one of claims 1 to 7, characterized in that the hydrogel layer ( 6 ) via a linker ( 5 , 10 ) with the protective layer ( 4 , 9 ) is connected.

9. Biosensor according to one of claims 1 to 7, in particular according to claim 4, characterized in that the hydrogel layer ( 6 ) via a silane layer ( 5 ) as a linker layer with the protective layer ( 4 ) is connected.

10. A method for producing a biosensor according to claims 1 to 9, in which a plasmon-bearing layer ( 2 ) is applied to a carrier ( 1 ), which is then interposed with an intermediate layer ( 3 , 8 ) with a hydro gel layer ( 6 ) is covered, characterized in that after the application of the plasmon-carrying layer ( 2 ) on this as an intermediate layer ( 3 , 8 ) a protective layer ( 4 , 9 ) is physisorbed, whereupon the hydrogel layer ( 6 ) is deposited on the intermediate layer.

11. The method according to claim 10, characterized in that the Protective layer is applied by thermal vapor deposition.

12. The method according to claim 10, characterized in that the Protective layer is applied by sputtering.

13. The method according to claim 10, characterized in that the Protective layer applied by electron beam evaporation becomes.

14. The method according to claim 10, characterized in that the Protective layer is applied by Solgeltechnik.

15. The method according to claim 10, characterized in that the Protective layer is applied by plasma polymerization.

16. The method according to any one of claims 10 to 15, characterized in that said hydrogel layer (6) by means of a linker (5, 10) is attached to the protective layer (4, 9).