DE10053047A1

DE10053047A1 - Verwendung von Caveolin-1 oder des Gens desselben zur Behandlung von nichtsteroidabhängigem Karzinom

Info

Publication number: DE10053047A1
Application number: DE10053047A
Authority: DE
Inventors: Florent Bender; Marc A Reymond; Claude Bron; Andrew F G Quest
Original assignee: Universite de Lausanne
Current assignee: Universite de Lausanne
Priority date: 2000-10-13
Filing date: 2000-10-13
Publication date: 2002-06-06
Also published as: WO2002030973A9; AU2524702A; US20020065224A1; WO2002030973A2; WO2002030973A8; WO2002030973A3; AU2002225247A1

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung einer pharmazeutisch wirksamen Menge Caveolin-1 oder des Caveolin-1-Gens zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von nichtsteroidabhängiem Karzinom, insbesondere zur Behandlung von Gastrointestinalkarzinom. Erfindungsgemäß ist Caveolin-1 oder dessen Gen besonders bevorzugt für die Behandlung von Dickdarmkarzinom.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung einer pharmazeutisch wirksamen Menge Caveolin-1 oder des Caveolin-1-Gens zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels zur prophylakti schen oder therapeutischen Behandlung von nichtsteroidab hängigem Karzinom, insbesondere zur Behandlung von Gastro intestinalkarzinom. Erfindungsgemäß ist Caveolin-1 oder dessen Gen besonders bevorzugt für die Behandlung von Dick darmkarzinom.

Caveolin-1 oder dessen Gen wird vorzugsweise auf einem Ab gabeträger bereitgestellt. Erfindungsgemäß können die Abga beträger Antikörper, die spezifisch an ein mit dem nicht steroidabhängigen Karzinom in Zusammenhang stehenden Anti gen binden, Liposomen, virale Vektoren oder Teilchen aus einer chemisch inerten Substanz wie beispielsweise Gold oder Diamant sein.

Seit 1992 ist Caveolin-1 als 21 kDa-Hüllprotein/Adaptorpro tein von Caveolen bekannt. Das menschliche Caveolin-1-Gen ist auch im Stand der Technik beschrieben (vergleiche zum Beispiel Engelmann et al., FEBS Letters 436 (1998), 403-410). Was die Funktion von Caveolin-1 bei Krebs am Menschen anbetrifft, so sind die Zitate des Standes der Technik wi dersprüchlich. In einigen Zitaten wird berichtet, daß Ca veolin-1 als Tumorsuppressorprotein bei der NIH-3T3 Maus- Fibroblasten-Zellinie, bei menschlichen Brustkrebs-Zelli nien und Lungenkarzinom-Zellinien fungiert [Koleske et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 1381-1385; Lee, S. W. et al., Oncogene 16 (1998), 1391-1397; Racine C. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 255 (1999), 580-586.]. WO 97/18454 und WO 99/22773 beschreiben, daß bestimmte meta statische Karzinome, darunter der metastatische Prostata krebs, mit Hilfe von Therapien behandelt werden können, die die Expression des Caveolin-Gens unterdrücken. Diese Pa tentschriften offenbaren biologische Techniken, die die Wirkung von Caveolin oder die Funktion der Caveolen bloc kieren sollen, darunter die Gabe von Vektoren mit Antisinn- Caveolin-Sequenzen oder die Verwendung von Anti-Caveolin- Antikörpern.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben festgestellt, daß Caveolin-1 bei nichtsteroidabhängigem Karzinom am Men schen, insbesondere bei Gastrointestinalkarzinom als Tumor suppressor fungiert. Des weiteren wurde gefunden, daß die erneute Expression von Caveolin-1 in den Zellen von mensch lichem nichtsteroidabhängigen Karzinom deren Fähigkeit zur Bildung von Tumoren verringert. Gemäß vorliegender Erfin dung wurden Beweise geliefert, daß die Bildung von nicht steroidabhängigem Karzinom wie Gastrointestinalkarzinom und insbesondere Dickdarmkarzinom sowohl bei Mäusen als auch am Menschen durch die Gegenwart von Caveolin-1 verhindert wird. Es wurde gefunden, daß 1) die Caveolin-1-Proteinge halte in Dickdarmtumoren aus menschlichen Patienten verrin gert waren; 2) die Dickdarmkarzinom-Zellen niedrige Gehalte an Caveolin-1-mRNA und Protein aufwiesen; 3) durch Expres sion von Caveolin-1 in der Dickdarmkarzinom-Linie HT-29 die Tumorbildung in Nacktmäusen blockiert oder verzögert wurde; 4) die Fähigkeit von HT29-cav-1 zur Bildung von Tumoren in Nacktmäusen trotz anfänglicher Gegenwart von Caveolin-1 mit einem Auswahlvorgang verknüpft war, der die Proliferation derjenigen Zellen mit verringertem Caveolin-1-Grundgehalt begünstigte.

Caveolin-1 ist ein wirksames Mittel zur prophylaktischen und therapeutischen Behandlung von nichtsteroidabhängigem Karzinom, vorzugsweise Gastrointestinalkarzinom wie bei spielsweise Magen- und Dickdarmkarzinom, besonders bevor zugt Kolorektalkarzinom. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung von Caveolin-1 oder eines pharma zeutisch annehmbaren Salzes desselben sowie die Verwendung des Caveolin-1-Gens zur prophylaktischen oder therapeuti schen Behandlung von nichtsteroidabhängigem Karzinom.

Gemäß vorliegender Erfindung kann Caveolin-1 oder ein phy siologisch annehmbares Salz in einer pharmazeutisch annehm baren Menge als pharmazeutische Formulierung, umfassend das Protein und pharmazeutisch annehmbare Hilfssubstanzen wie zum Beispiel Adjuvantien, Verdünnungsmittel, Stabilisie rungsmittel oder Träger, verabreicht werden. In der Fach welt ist bekannt, wie ein menschliches Protein zu formulie ren ist und wie derartige Formulierungen zu lagern sind, damit sie über lange Zeit stabil bleiben, zum Beispiel als Lyophilisate. Gemäß vorliegender Erfindung kann Caveolin-1 oder dessen Salz als Injektions- oder Infusionslösung ver abreicht werden. "Pharmazeutisch wirksame Menge" an Caveo lin-1 oder dessen Salz bezieht sich auf diejenige Menge, die bei verschiedenen Verabreichungsschemata prophylakti sche oder therapeutische Wirkung ergibt. Diese Mengen kön nen von Fachleuten ohne weiteres bestimmt werden. Die Menge Caveolin-1 richtet sich nach der Schwere des zu behandeln den Zustands, dem Verabreichungsweg etc.. Es können Formu lierungen davon hergestellt werden, die Caveolin-1-Mengen von wenigstens etwa 0,1 mg/ml, mehr als etwa 5 mg/ml, vor zugsweise von etwa 0,5 mg/ml bis etwa 2 mg/ml enthalten.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Er findung ist es auch möglich, Caveolin-1 zu verabreichen, das an einen Antikörper, vorzugsweise einen monoklonalen Antikörper gebunden ist, der spezifisch an ein Antigen bindet, das mit dem zu behandelnden nichtsteroidabhängigen Karzinom in Zusammenhang steht. Im Falle des Dickdarmkarzi noms können diese Antikörper, die das Protein Caveolin-1 zum Tumor transportieren, beispielsweise Antikörper gegen CEA sein.

Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann die Behandlung des nichtsteroidabhängigen Karzinoms durch Über tragen des Caveolin-1-Gens in die somatischen Zellen eines Patienten erfolgen, so daß die Tumorsuppressor-Wirkung aus der Expression des übertragenen Caveolin-1-Gens erhalten wird. Der somatische Gentransfer kann ex vivo durchgeführt werden, indem Karzinom-Zellen einem Patienten entnommen und isoliert werden, das Gen in die Zellen eingeführt wird, und diese Zellen zurück in den Körper verbracht werden.

Die andere Strategie für den somatischen Gentransfer ist der direkte Ansatz, wobei das Caveolin-1-Gen in vivo in den zu behandelnden Tumor eingeführt wird, ohne daß Zellen dem Patienten entnommen und kultiviert werden müssen. Gemäß vorliegender Erfindung ist der direkte Gentransfer aufgrund der anatomisch lokalisierten Pathologie der Malignitäten bevorzugt. Bei den Abgabeträgern für das Caveolin-1-Gen kann es sich um virale Expressionsvektoren handeln, die das Caveolin-1-Gen funktionstüchtig an einen Promotor geknüpft umfassen, vorzugsweise Adenovirus- oder Pockenvirus-Expres sionsvektoren.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfin dung kann das Caveolin-1-Gen auch über Liposom-Gen- oder Antikörper-Gen-Komplexe in die Karzinom-Zellen eingeführt werden, wobei die Antikörper spezifisch an ein Antigen bin den, das mit dem zu behandelnden nichtsteroidabhängigen Karzinom in Zusammenhang steht. Diese Techniken sind in der Fachwelt wohlbekannt, wobei insbesondere monoklonale Anti körper verwendet werden.

Gemäß vorliegender Erfindung kann die Übertragung des Ca veolin-1-Gens in die Karzinom-Zellen auch durch Teilchenbe schuß mit mikroskopischen Teilchen durchgeführt werden, die mit dem Caveolin-1-Gen beschichtet sind. Diese Teilchen be stehen aus einer chemisch inerten Substanz wie beispiels weise Gold oder Diamant (entweder synthetisch oder natür lich). Auch die Technik des Teilchenbeschusses ist in der Fachwelt bekannt. Die Teilchen werden durch eine Schock welle in einem gasförmigen Medium beschleunigt, so daß die Teilchen imstande sind, in die Karzinom-Zellen einzudringen und das Caveolin-1-Gen dorthin zu verbringen. Die Schock welle kann mit Hilfe einer Reihe von Hilfsmitteln erzeugt werden, darunter elektrische Hochspannungsentladung oder Helium-Druckentladung.

Die folgenden Experimente sollen die Ausführungsformen der Erfindung erläutern und nicht als Einschränkung des Umfangs der Erfindung angesehen werden.

Beispiele Beispiel 1 Materialien und Methoden Reagenzien und Antikörper

Nach Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), RPMI-1640, Trypsin/EDTA, Antibiotika (PSN: Penicillin, Streptomycin, Neomycin) wurden von Life Technologies (Paisley, Schottland) käuflich erworben. Das Kalbsfötenserum (FCS) stammte von Seromed-Biochrom KG (Ber lin), Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) von Eurogentec (Seraing, Belgien), Hygromycin B von Calbiochem (La Jolla, USA). Das BCA-Protein-Bestimmungskit stammte von Pierce (Rockford, USA), die vorgefärbten Molekulargewichtsprotein marker waren von New England Biolab Inc. (Beverly, USA), und das Kit mit verstärkter Chemilumineszenz (ECL) war von Amersham International (Bucks, UK). Der polyklonale Anti- Caveolin-1-Antikörper (C13630) wurde von Transduction Labo ratories (Lexington, USA) käuflich erworben, und der mono klonale Anti-Actin-Antikörper (010056) war von Bioscience (Seikagu Corporation, Tokio, Japan). Die an Meerrettichper oxidase (HRP) gebundenen Ziege-Antikaninchen- (1706515) und Ziege-Antimaus-Antikörper (A4416) stammten von Bio-Rad Lab oratories (Hercules, USA) bzw. von Sigma (St. Louis, USA).

Zellkultur

Die menschlichen Dickdarmkarzinom-Zellinien SW480, SW620, Co112, HT29 und die davon abgeleiteten diffe renzierten Klone HT29-5M12, HT29-5M21 (Lesuffleur, T., Bar bat, A., Dussaulx, E. und Zweibaum, A., Growth adaptation to methotrexate of HT-29 human colon carcinoma cells is associated with their ability to differentiate into colum nar absorptive and mucus-secreting cells, Cancer Res. 50, 6334-43, 1990), Lovo sowie die Lovo-Klone E2 und C5, ausge wählt für höheres metastatisches Potential (Glenney, J. R., Jr., The sequence of human caveolin reveals identity with VIP21, a component of transport vesicles, FEBS Lett. 314, 45-8, 1992), wurden von Dr. Bernard Sordat (Swiss Institute for Cancer Research (ISREC), Epalinges) zur Verfügung ge stellt, die Linie DLD1 von Dr. Emanuela Felley-Bosco (Inst. für Pharmakologie, Universität Lausanne) und die Linien Caco2 und MDCK Stamm II von Dr. Walter Hunziker (Inst. für Biochemie, Universität Lausanne). NIH-3T3-Fibroblasten und NIH-3T3 ExTu, eine Population von NIH-3T3-Zellen, die nach Tumorbildung auf Nacktmäusen isoliert wurden (Peli, J., Schroter, M., Rudaz, C., Hahne, M., Meyer, C., Reichmann, E. und Tschopp, J., Oncogenic Ras inhibits Fas ligand-me diated apoptosis by downregulating the expression of Fas, EMBO J. 18, 1824-31, 1999), wurden von Dr. Ernst Reichmann (ISREC, Epalinges) zur Verfügung gestellt. HT29, HT29-5M12, HT29-5M21, Co112, Caco2, MDCK, NIH-3T3 und NIH-ExTu wurden in mit 10% FCS und PSN ergänztem DMEM kultiviert. Lovo und die Lovo-Klone wurden im gleichen, 0,1% Na₂CO₃ enthaltenden Medium kultiviert. Die SW480-, SW620- und DLD1-Zellen wurden in RPMI-1640 mit 10% FCS und Antibiotika wie oben ge halten. Alle Zellen wurden bei 37°C unter 5% CO₂ kultiviert und jede Woche mit Trypsin/EDTA passagiert.

Isolierung menschlicher Dickdarm-Krypten und Reinigung der Epithelzellen

Menschliche Dickdarm-Krypten und danach Dickdarm-Epithelzellen oder Stroma wurden nach Einholen der Einwilligung der informierten Patienten isoliert wie be reits früher beschrieben (Reymond, M. A., Sanchez, J. C., Schneider, C., Rohwer, P., Tortola, S., Hohemberger, W., Kirchner, T., Hochstrasser, D. F. und Kockerling, F., Specific sample preparation in colorectal cancer, Electro phoresis 18, 622-4, 1997; Reymond, M. A., Sanchez, J. C., Hughes, G. J., Gunter, K., Riese, J., Tortola, S., Peinado, M. A., Kirchner, T., Hohenberger, W., Hochstrasser, D. F. und Kockerling, F., Standardized characterization of gene expression in human colorectal epithelium by two-dimension al electrophoresis, Electrophoresis 18, 2842-8, 1997). Die Arbeiten wurden am Universitätsklinikum Genf (Schweiz) und am Carl-Thiem-Klinikum Cottbus durchgeführt. Eine Genehmi gung wurde vom Ethik-Ausschuß erteilt. Die mittels Trypan blau-Anfärbung bestimmte Lebensfähigkeit der Epithelzellen nach der Reinigung belief sich auf über 90%. Nach Kreuzan färbung mit einem Pan-Anti-Cytokeratin-Antikörper (CAM 5,12, Perkin Elmer, Norwalls, USA) wurde mittels FACS-Ana lyse gezeigt, daß die Epithelzellen-Präparate eine Reinheit von mehr als 95% aufwiesen.

Plasmide

Das Plasmid placIOP-cav-1, das die IPTG-induzier bare Expression von Caveolin-1 in transfizierten Zellen er möglicht, wurde wie folgt aufgebaut. Die für Hunde-Caveo lin-1 codierende cDNA in ihrer vollen Länge wurde mittels RT-PCR amplifiziert, wobei Caveolin-1-spezifische Primer, flankiert von NotI-Restriktionsstellen, sowie aus MDCK-Zel len isolierte RNA als Matrize verwendet wurden. Die resul tierende cDNA wurde gereinigt und dann in die NotI-Stelle von placIOP kloniert, das aus den Vektoren p3'SS und pOPRSVI CAT von Invitrogen (Carlsbad, USA) besteht, die wie beschrieben verschmolzen wurden (Peli, J., Schroter, M., Rudaz, C., Hahne, M., Meyer, C., Reichmann, E., and Tschopp, J. Oncogenic Ras inhibits Fas ligand-mediated apoptosis by downregulating the expression of Fas, EMBO J. 18: 1824-31, 1999). Die Sequenz des 5'-Sinnprimers, die au ßerdem ein Kozak-Motiv (unterstrichen) stromaufwärts vom ATG-Startcodon enthielt, war

und die des Antisinn primers war

Die NotI-Restriktionsstellen sind fettgedruckt. Das Kon strukt pGEM-cav-1 wurde verwendet, um Caveolin-1-spezifi sche Sonden für die Northern-Analyse zu produzieren, und erhalten durch Amplifizieren einer zwischen Hund und Mensch konservierten cDNA-Sequenz (Nucleotide 63-433 der codieren den cDNA Sequenz) mittels RT-PCR, wobei aus MDCK-Zellen isolierte RNA als Matrize und geeignete Primer verwendet wurden, um das nachfolgende Klonieren des amplifizierten Produkts in die XbaI/EcoRI-Stellen von pGEM2 (Promega, Ma dison, USA) zu ermöglichen. Der Sinnprimer enthielt eine XbaI-stelle (fett):

Der Antisinnprimer enthielt eine EcoRI-Stelle (fett):

Das zur Standardisierung der Northern-Blots verwendete pSP65m-β-Actin-Plasmid (Plae tinck, G., Combe, M. C., Corthesy, P., Sperisen, P., Kana mori, H., Honjo, T. und Nabholz, M., Control of IL-2 re ceptor-alpha expression by IL-1, tumor necrosis factor, and IL-2. Complex regulation via elements in the 5' flanking region, J. Immunol. 145, 3340-7, 1990. 29) wurde freundli cherweise von Markus Nabholz (ISREC, Epalinges) zur Verfü gung gestellt.

Stabile Transfektion von HT29- und DLD1-Zellen mit einem Plasmid, das die induzierbare Expression von Caveolin-1 er möglicht

HT29- und DLD1-Zellen wurden mit placIOP (mock) oder placIOP-cav-1 mittels Calciumphosphat-Fällung wie be schrieben stabil transfiziert (Hunziker, W. und Mellman, I., Expression of macrophage-lymphocyte Fc receptors in Ma din-Darby canine kidney cells: polarity and transcytosis differ for isoforms with or without coated pit localization domains, J. Cell Biol. 109, 3291-302, 1989). Einzelne, ge gen 500 µg/ml Hygromycin B resistente Klone wurden mittels Western-Blot-Analyse auf IPTG-induzierte Expression von re kombinantem Caveolin-1 überprüft. Die Induktion von Caveo lin-1 war 24 h nach Stimulierung mit 1 mM IPTG maximal.

Northern-Analyse

Die zelluläre Gesamt-RNA wurde mit einem Reinigungskit in Gegenwart von Guanidiniumthiocyanat (Qia gen, Hilden) nach den Anweisungen des Herstellers extra hiert. 15 µg zytoplasmatische RNA enthaltende Proben wurden auf 1% Agarose-Gelen, hergestellt in 10 mM Natriumphosphat- Puffer pH 7, fraktioniert, auf eine Nylon-Membran überführt und mittels UV-Bestrahlung wie beschrieben an die Membran vernetzt (Sambrook, J. F., Fritsch, E. F. und Maniatis, T., Molecular cloning: a laboratory manual. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Melton, D. A., Krieg, P. A., Rebagliati, M. R., Maniatis, T., Zinn, K. und Green, M. R., Efficient in vitro synthesis of biologically active RNA and RNA hybridization probes from plasmids containing a bacteriophage SP6 promoter, Nucleic Acids Res. 12, 7035-56, 1984.). Alternativ wurden mehrere Gewebe- oder Zellinien- Northern-Blots von Clontech Laboratories käuflich erworben (Palo Alto, USA). Nach Vorinkubieren über Nacht bei 55°C in Hybridisierungspuffer (50% Formamid, 5 × SSC, 1 mM EDTA, 0,2% SDS, 2 × Denhardt, 0,5 mg/ml Hefe-tRNA, 0,25 mg/ml Lachsspermien-DNA in 50 mM Natriumphosphat-Puffer pH 6,5) wurden die Blots mit 10⁶ min^-1 /ml [³²P]-markierten RNA- Sonden auf Caveolin-1 weitere 24 h in Hybridisierungspuffer inkubiert. Die Sonden wurden wie beschrieben (Sambrook, J. F., Fritsch, E. F. und Maniatis, T., Molecular cloning: a laboratory manual. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Melton, D. A., Krieg, P. A., Rebagliati, M. R., Maniatis, T., Zinn, K. und Green, M. R., Efficient in vitro synthesis of biologically active RNA and RNA hybri dization probes from plasmids containing a bacteriophage SP6 promoter, Nucleic Acids Res. 12, 7035-56, 1984) aus XbaI-linearisiertem pGEM-cav-1 synthetisiert. Die Blots wurden viermal 15 min lang bei 65°C in 0,1 × SSC, 0,1% SDS- Lösung gewaschen und zur Filmbelichtung aufgelegt (BioMax MR-1, Kodak, New York, USA). Nach dem Caveolin-1-Nachweis wurden die Blots abgezogen (nach einer Vorschrift von Clon tech Laboratories, Palo Alto, USA) und mit einer Ribo- Sonde, hergestellt aus MaeI-linearisiertem pSP65m-β-Actin, gegen β-Actin standardisiert.

SDS-PAGE und Western-Blotting

Die Expression von Caveo lin-1 in Karzinom-Zellinien, transfizierten HT29- oder DLD1-Zellen, menschlichem Dickdarmgewebe oder NIH-3T3-Zel len wurde mittels Western-Blot-Analyse untersucht. Die Zel len wurden vermehrt, bis sie zu 80% konfluent waren. Das Kulturmedium wurde dann entfernt, die Zellen wurden zweimal mit kaltem PBS gewaschen und in einem 4% SDS, 125 mM Tris- HCl, pH 6,8, und Proteaseinhibitoren (10 µg/ml Benzamidin, 2 µg/ml Antipain, 1 µg/ml Leupeptin) enthaltenden Puffer lysiert. Die Zell-Lysate wurden beschallt und die Protein- Konzentration mittels BCA-Assay bestimmt. Die menschlichen Dickdarmgewebe wurden in ähnlicher Weise lysiert, doch wur den die Homogenate mehrmals durch eine 25-G-Nadel gedrückt, beschallt und durch 5minütiges Zentrifugieren bei 10 000 × g in einer Eppendorf-Zentrifuge geklärt. Die Pro tein-Konzentration der Überstände wurde mittels BCA-Assay bestimmt. Alle Proben wurden auf die Laemmli-Pufferzu sammensetzung eingestellt (Laemmli, U. K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 227, 680-5, 1970) (2% SDS, 10% Glycerin, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 100 mM DTT und 0,1% Bromphenolblau), durch 5minütiges Erhitzen auf 95°C denatu riert und anschließend auf 10% Gele aufgetragen. Nach der Trennung wurden die Proteine auf Nitrocellulose überführt. Zur Bestätigung gleicher Probenbeladung wurden die Membra nen mit Ponceau Red S (Sigma, St. Louis, USA) angefärbt und über Nacht in PBS/3% Milch/2 mM NaN₃ blockiert. Dann wurden die Membranen 1 h bei RT entweder mit in Blockierlösung verdünnten Anti-Caveolin-1-Antikörpern (1 : 10 000) oder Anti-Actin-Antikörpern (1 : 1000) inkubiert. Die Membranen wurden dann 5mal in PBS/0,1% Tween-20 gewaschen, 1 h lang mit dem in Blockierlösung (ohne Azid) verdünnten Antikörper (1 : 2500) inkubiert und wie oben gewaschen. Die membran gebundenen zweiten Antikörper wurden mittels ECL gemäß den Anweisungen des Herstellers nachgewiesen.

Tumorigenizitätsprüfungen.

10⁶ Zellen wurden in 50 µl DMEM suspendiert und subkutan in 6-8 Wochen alte Nacktmäuse in jiziert. Bei jeder Maus wurden links Kontrollzellen (paren tale HT29- oder DLD1-Zellen oder mock-transfizierte Zellen) und rechts mit Caveolin-1 transfizierte HT29- oder DLD1- Zellen (Klone C13, C14, C16 bzw. C2, C4) injiziert. Große (D) und kleine (d) Durchmesser der wachsenden Tumoren wur den zweimal pro Woche gemessen, und die entsprechenden Vo lumina (V) wurden mit der Gleichung V = d2.D.π/6 berechnet. Zur erneuten Isolierung der Tumorzellen für die weitere Kultivierung wurde das Tumorgewebe exzidiert, unter steri len Bedingungen mit Skalpellmessern in kleine Stücke ge schnitten und mit Trypsin/EDTA 15 min lang bei 37°C verdaut. Die Tumorzellen wurden in 10 cm-Petri-Schalen kultiviert, trypsiniert, in frischem Medium auf 1 : 10 verdünnt und er neut verimpft. Nach einer zweiten Passage, als Gewebestücke und verunreinigende Zellen beseitigt worden waren, wurden die Ex-Tumorzellen auf 80% Konfluenz lysiert und wie be schrieben für den Caveolin-1-Nachweis aufgearbeitet.

Beispiel 2 Caveolin-1-Expression in normalem menschlichem Dickdarm-Gewebe und in Dickdarm-Karzinomen

Wir analysierten die Caveolin-1-mRNA- und Proteingehalte in einer Reihe von menschlichen Dickdarmkarzinom-Zellinien so wie in menschlichen Geweben normalen oder tumoralen Ur sprungs. In anfänglichen Experimenten wurden die Caveo lin-1-mRNA-Gehalte in menschlichen Geweben (Epithel von Dünndarm' und Dickdarm) und in der SW480-Karzinom-Zellinie (Fig. 1, obere Reihe) mittels Northern-Blot-Analyse vergli chen. Die spezifische 3 kb-mRNA von Caveolin-1 (Glenney, J. R., Jr., The sequence of human caveolin reveals identity with VIP21, a component of transport vesicles, FEBS Lett. 314, 45-8, 1992) war im Herzen überaus reichlich vorhanden, jedoch in den peripheren Blutleukozyten (PBL), die bei die sen Experimenten als positive bzw. negative Kontrolle dien ten, nicht nachweisbar (Glenney, J. R., Jr., The sequence of human caveolin reveals identity with VIP21, a component of transport vesicles, FEBS Lett. 314, 45-8, 1992; Fra, A. M., Williamson, E., Simons, K. und Parton, R. G., Deter gent-insoluble glycolipid microdomains in lymphocytes in the absence of caveolae, J. Biol. Chem. 269, 30745-8, 1994). Interessanterweise waren die Caveolin-1-mRNA-Gehalte in Dünndarm oder Dickdarm um das 10-20fache höher als die in der Dickdarmkarzinom-Zellinie SW480 festgestellten Gehalte.

Um zu prüfen, ob es sich hierbei um ein allgemeines Charak teristikum von Dickdarmkarzinomlinien handelt, wurden die Gehalte von Caveolin-1-Protein und -mRNA mittels Western- Blot-Analyse verglichen (Fig. 2). Im Vergleich zu MDCK wa ren die Caveolin-1-Proteingehalte (Fig. 2A) in allen analy sierten Linien äußerst niedrig und überstiegen niemals die bei SW480 beobachteten Gehalte. Die Expression war beson ders gering bei HT29, Co112 und Caco2. Selbst bei SW480, SW620 und DLD1, wo Caveolin-1 vorhanden war, waren die Gehalte um das 50-100fache niedriger als in den MDCK-Zel len. Zudem wiesen alle Dickdarmkarzinom-Zellinien niedrige Gehalte an Caveolin-1-mRNA auf (Fig. 2B), die den bei SW480 beobachteten vergleichbar oder niedriger waren (Fig. 1).

Um die Bedeutung der obigen Befunde bei Dickdarmkarzinom- Zellinien zu unterstreichen, wurden sowohl normale als auch Tumorgewebeproben von Patienten mit Dickdarmkarzinomen un tersucht. Die Ergebnisse aus vier Patienten (Code G009, G010, G011 und G017) sind dargestellt (Fig. 3), wobei Dick darmschleimhaut (Epithel) und -stroma von normalem oder tu moralem Gewebe verglichen wurden. Die Caveolin-1-Gehalte in der Tumorschleimhaut nahmen ab, was darauf hindeutet, daß die in Dickdarmkarzinomlinien festgestellte geringe Caveo lin-1-Expression eine inhärente Eigenschaft der unsterblich gewordenen Zellen widerspiegelt, die sich vom Dickdarmtu mor-Epithel ableiten. Zudem waren die Caveolin-1-Gehalte im Tumorstroma in ähnlicher Weise abgesenkt.

Einige weitere Patienten (insgesamt n = 15) wurden in ähn licher Weise mittels Western-Blot-Analyse charakterisiert. Um den Vergleich zu vereinfachen, wurden die erhaltenen Ca veolin-1-Signale mittels Abtastdensitometrie quantifiziert. Die für Schleimhaut und Stroma gezeigten Zahlen (Tabelle 1) entsprechen dem Verhältnis der Abtastdensitometrie-Werte, die für normales gegen Tumorgewebe erhalten wurden. Bei etwa 70% (10/15) der analysierten Proben waren die Caveo lin-1-Gehalte in der Schleimhaut bis zu 7fach verringert (im Durchschnitt 3,9fach). Bei Stroma standen weniger Pro ben zur Verfügung, doch wurde im Durchschnitt eine ähnliche Abnahme des vorhandenen Caveolin-1 beobachtet. Bei etwa 30% (5/15) der Fälle war keine signifikante Abnahme der Caveo lin-1-Expression in Tumorgewebe zu beobachten bzw. war der Trend in einem Fall sogar gegenläufig.

Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse darauf hin, daß sich das Ausmaß der Caveolin-1-Expression in menschlichen Dickdarmtumorproben sowie in Dickdarmkarzinom-Zellinien verringert, und daß die Abnahme des vorhandenen Caveolin-1- Proteins verringerten mRNA-Gehalten zugeschrieben werden kann.

Beispiel 3 Bei der Tumorbildung kommt es zu einer Rückre gulierung von Caveolin-1

Zu diesem Zeitpunkt war nicht klar, ob die Tumorbildung selbst ausreichend ist, um die Caveolin-1-Expression zu verringern. Die niedrigen Gehalte in den Dickdarmkarzinom linien machten ein anderes Modellsystem erforderlich. Ideal in dieser Hinsicht sind NIH-3T3-Fibroblastzellen, da sie Caveolin-1 exprimieren und in der Lage sind, Tumorbildung bei Nacktmäusen nach längeren Zeiträumen in der Größenord nung von 50-60 Tagen herbeizuführen (Peli, J., Schroter, M., Rudaz, C., Hahne, M., Meyer, C., Reichmann, E. und Tschopp, J., Oncogenic Ras inhibits Fas ligand-mediated apoptosis by downregulating the expression of Fas, EMBO J. 18, 1824-31, 1999). Mittels Western- und Northern-Blotting angestellte Vergleiche von parentalen NIH-3T3-Zellen mit Zellen, die nach der Tumorbildung in Nacktmäusen isoliert worden waren, zeigten, daß letztere niedrigere Gehalte an Caveolin-1-Protein (Fig. 4A) und - mRNA (Fig. 4B) exprimier ten. Somit korrelierte die Tumorbildung in Mäusen entweder mit einer Verringerung der Caveolin-1-Expression in NIH- 3T3-Zellen oder einer Eliminierung von Zellen, die Caveo lin-1 exprimieren.

Beispiel 4 Caveolin-1 kann in den Dickdarmkarzinom-Zelli nien HT29 und DLD1 erneut exprimiert werden

Zur Bewertung, ob die Gegenwart von Caveolin-1 in Dickdarm karzinom-Zellen einen geschwindigkeitsbegrenzenden Faktor bei der Tumorentwicklung dieser Zellen darstellt, wurden HT29- oder DLD1-Zellen unter der Kontrolle eines IPTG-indu zierbaren Promotors (placIOP-cav-1) mit einem Plasmid transfiziert, das eine für Hunde-Caveolin-1 codierende cDNA in ihren vollen Länge beherbergt. Es wurden mehrere Klone isoliert und mittels Western-Blotting auf Caveolin-1-Ex pression geprüft (Fig. 5). Die Klone C13, C14 und C16 ex primierten höhere Caveolin-1-Mengen als parentale HT29- oder mock-transfizierte Zellen, selbst dann, wenn sie in Abwesenheit von IPTG vermehrt wurden (Fig. 5A, - IPTG). Zu gabe von IPTG (Fig. 5A, +IPTG) erhöhte das Grundniveau der Caveolin-1-Expression bei allen Klonen drastisch, hatte aber sowohl auf die parentalen als auch auf die mock transfizierten HT29-Zellen keine Wirkung. Die Caveolin-1- Grundexpressionsniveaus und die Niveaus nach IPTG-Induktion waren bei diesen Klonen nicht identisch, wobei Klon C14 die höchsten und C16 die geringsten Mengen exprimierte. Auch die Klone C2 und C4 exprimierten höhere Caveolin-1-Mengen als parentale DLD1- und mock-transfizierte Zellen, doch wurden die Caveolin-1-Expressionsniveaus durch Zugabe von IPTG nicht erhöht (Fig. 5B).

Beispiel 5 Erneute Expression von Caveolin-1 in HT29- und DLD1-Zellen verringert die Tumorbildung bei Nacktmäusen

Die mit NIH-3T3-Zellen bei Nacktmäusen erhaltenen Ergeb nisse zeigten, daß bei Tumorbildung eine Caveolin-1-Rückre gulierung erfolgt, und legten nahe, daß die erneute Einfüh rung von Caveolin-1 in Dickdarmkarzinomlinien wie HT29 oder DLD1 die Fähigkeit dieser Zellen zur Tumorbildung blockie ren könnte. Zur Überprüfung dieser Hypothese wurden Nackt mäusen jeweils Kontrollzellen (parentale oder mock-transfi zierte Zellen) auf der linken und Caveolin-1 exprimierende HT29-Zellen (Klone C13, C14, C16) oder DLD1-Zellen (Klone C2, C4) auf der rechten Seite injiziert (Gesamtzahl der Mäuse n = 13 bzw. n = 7) (Fig. 6 und 7). Alle HT29-Zellen führten einen Monat nach der Injektion zu erkennbarer Tu morbildung, doch waren in 75% (n = 10) der untersuchten Fälle bei den Caveolin-1 exprimierenden HT29 Klonen die Tu moren entweder signifikant kleiner (Fig. 6A, B; n = 7) oder nahezu nicht nachweisbar (Fig. 6C; n = 3). Hatten sich Tu moren entwickelt, so war die Kinetik der Tumorbildung eine andere, wobei eine Verzögerungszeit von zwei bis drei Wo chen vor der Tumorbildung erkennbar war (Fig. 6A, B). Bei 25% (n = 3) der getesteten Mäuse war jedoch weder ein Un terschied in der Größe der Tumoren noch in der Kinetik der Tumorentwicklung feststellbar (Fig. 6D).

In ähnlicher Weise war bei 70% (n = 5) der untersuchten Fälle die Tumorbildung bei den Caveolin-1 exprimierenden DLD1-Klonen verringert (Fig. 7A, B, C). Bei den HT29-cav-1- Klonen war Tumorbildung im allgemeinen nach einer anfängli chen Verzögerungszeit von 2-3 Wochen zu beobachten (Fig. 7B, C). Bei 30% der getesteten Mäuse war jedoch kein Unter schied in der Größe der Tumoren feststellbar (Fig. 7D).

Beispiel 6 Die Caveolin-1-Expressionsniveaus in HT29-cav- 1- und DLD1-cav-1-Zellen verringerten sich bei Tumorbildung in Nacktmäusen

Die Experimente mit NIH-3T3-Fibroblasten (Fig. 4) zeigten, daß die Tumorbildung zu Zellpopulationen mit verringerten Caveolin-1-Gehalten führt. Mögliche Erklärungen, warum Tu morbildung bei transfizierten HT29- und DLD1-Zellen in ei nigen Fällen auftrat, wären somit, daß dieser Vorgang - ob schon unter der Kontrolle eines exogenen Promotors - entwe der zur Ausschaltung der Caveolin-1-Expression oder zur Se lektion von Zellen mit niedrigeren Caveolin-1-Grundexpres sionsniveaus geführt haben könnte. Zur Untersuchung dieser Möglichkeiten wurden Zellen aus exzidierten Tumoren iso liert, in Kultur zurückverbracht und anschließend, nachdem reine Zellpopulationen zur Verfügung standen, auf Caveo lin-1-Proteinexpression untersucht (Fig. 8, ExTumor). Di rekt nach Aufgabe auf die Platte waren die von Tumoren ab geleiteten Zellen eine Mischung aus Wirtszellen (hauptsäch lich Fibroblasten) und Tumorzellen, doch nur die Tumorzel len vermehrten sich schnell. Die Wirtszellen dagegen neig ten zu Ablösung und schnellem Absterben (Daten nicht ge zeigt). Sobald die Kulturplatten nach zwei Passagen konflu ent waren, wurden homogene Tumorzellpopulationen erhalten, die mit den parentalen HT29- bzw. DLD1-Zellen morphologisch identisch waren, jedoch die zusätzliche Fähigkeit aufwie sen, sich in Gegenwart von Hygromycin B zu vermehren (Daten nicht gezeigt). Bei diesen Zellen waren die Caveolin-1- Grundexpressionsniveaus im Vergleich zu den bei HT29-cav-1- Zellen vor der Injektion in Mäuse beobachteten verringert (Fig. 8, ExTumor bzw. BI). Trotzdem ließ sich die Caveo lin-1-Expression durch Zugabe von IPTG immer noch herbei führen (Daten nicht gezeigt). Somit trat eine Selektion nach HT29-Zellen, die niedrigere Caveolin-1-Gehalte expri mieren, nach Tumorbildung bei Nacktmäusen auf. Ähnliche Er gebnisse wurden mit DLD1 Zellen-erhalten (Daten nicht ge zeigt).

Beispiel 7 Selektion nach Methotrexat-Resistenz und meta statischem Potential verstärkte die Caveolin-1- Expression in Dickdarmkarzinom-Zellen

Die obigen Experimente bestärkten die Vorstellung, daß die Tumorbildung beim Menschen und bei Nacktmäusen mit verrin gerten Caveolin-1-Expressionsniveaus korreliert. Alternativ dazu war es nun interessant, zu untersuchen, ob es sich bei den niedrigen Caveolin-1-Expressionsniveaus um einen irre versiblen Zustand der Dickdarmkarzinom-Zellen handelt. Geht man davon aus, daß stärker differenzierte Zellen zur Ex pression höherer Caveolin-1-Mengen neigen (Kandror, K. V., Stephens, J. M. und Pilch, P. F., Expression and compartmentalization of caveolin in adipose cells: coordinate re gulation with and structural segregation from GLUT4, J. Cell Biol. 129, 999-1006, 1995), so ist zu erwarten, daß Kulturbedingungen, die die Zelldifferenzierung fördern, die Caveolin-1-Expression in Dickdarmkarzinom-Zellen verstär ken. Tatsächlich exprimierten die Methotrexat-resistenten, stärker differenzierten HT29-Klone 5M12 und 5M21 (Lesuf fleur, T., Barbat, A., Dussaulx, E. und Zweibaum, A., Growth adaptation to methotrexate of HT-29 human colon carcinoma cells is associated with their ability to dif ferentiate into columnar absorptive and mucus-secreting cells, Cancer Res. 50, 6334-43, 1990) signifikant höhere Caveolin-1-Mengen als parentale HT29-Zellen, wobei der Un terschied beim enterozytischen Klon 5M12 am größten und bei den schleimsezernierenden 5M21-Zellen weniger augenfällig ist (Fig. 9A). Dagegen war Caveolin-1 weder in Caco2-Zel len, die mit häufigem Passagieren normal kultiviert worden waren (proliferative, undifferenzierte Zellen; siehe Fig. 2), noch in Zellen, die 5 Wochen lang ohne Passagieren be lassen worden waren (differenzierte Zellen; Daten nicht ge zeigt), nachweisbar (Rousset, M., The human colon carcinoma cell lines HT-29 and Caco-2: two in vitro models for the study of intestinal differentiation, Biochimie 68, 1035-40, 1986).

Zusammengenommen weisen diese Experimente darauf hin, daß Veränderungen der Kulturbedingungen, die die Differenzie rung begünstigen, wenig Auswirkung auf die Caveolin-1-Ex pression in Dickdarmkarzinom-Zellen haben, daß aber phäno typische Veränderungen mit erhöhter Caveolin-1-Expression korrelierten, wenn sie in Verbindung mit Arzneimittelresi stenz beobachtet wurden.

Zur Überprüfung der Möglichkeit, daß sich die Caveolin-1- Expression mit dem metastatischen Potential ändern könnte, wie Experimente mit menschlichen Prostatakrebszellen nahelegen (Glenney, J. R., Jr., The sequence of human caveolin reveals identity with VIP21, a component of transport vesi cles, FEBS Lett. 314, 45-8, 1992), wurden zwei aus der Dickdarmkarzinom-Zellinie Lovo (E2 und C5) isolierte Klone charakterisiert, die ein höheres metastatisches Potential als die parentalen Lovo-Zellen aufweisen (Remy, L., Lissitzky, J. C., Daemi, N., Jacquier, M. F., Bailly, M., Martin, P. M., Bignon, C. und Dore, J. F., Laminin expres sion by two clones isolated from the colon carcinoma cell line Lovo that differ in metastatic potential and basement membrane organization, Int. J. Cancer. 51, 204-12, 1992). Tatsächlich waren die Caveolin-1-Expressionsniveaus bei Lovo E2 und C5 signifikant höher als bei der parentalen Lovo-Linie (Fig. 9B), was darauf hindeutet, daß es bei der Metastasierung zu einer Höherregulierung von Caveolin-1 kommen könnte.

Tabelle 1

Caveolin-1-Expressionsniveaus in menschlichem Dickdarmge webe. Analyse von Proben aus Patienten mit Dickdarmkrebs

^a) Aus Dickdarmkrebs-Patienten chirurgisch exzidierte Proben wurden mittels Western-Blotting wie in Fig. 3 analysiert, und die relativen Caveolin-1-Expressionsniveaus wurden mit Hilfe der Abtastdensitometrie be stimmt. Die Ergebnisse für die jeweiligen Patienten sind angegeben als Verhältnis der in normalen Dickdarmgeweben (Schleimhaut oder Stroma) gemessenen Caveolin-1-Gehalte dividiert durch diejenigen in ihren Tumor-Gegenstücken festgestellten.
^b) Die Patient-Daten waren anonymisiert.
^c) Die Tumoren wurden mittels Klassifikationskriterien charakterisiert (TNM-System), die die lokale Ausdehnung des Primärtumors (T), Metastasen der regionären Lymphknoten (N) und Fernmetastasen (M) beschreiben [Hermanek, P., Hutter, R. V. P., Sobin, L. H., Wagner, G. und Wittekind, C., TNM-Atlas, Springer-Verlag, Heidelberg, New York, 1998].
^d) n. v.: Proben nicht verfügbar.

Fig. 1 Northern-Blot-Analyse von normalen menschlichen Ge webeproben und Vergleich mit der Dickdarmkarzinom- Zellinie SW480. Mehrere Gewebe- oder Zell-Northern- Blots (Clontech), enthaltend gleiche Mengen Po ly(A)-⁺RNA pro Bahn, wurden entweder mit [³²P]-mar kierten Sonden auf Caveolin-1 (oberes Bild) oder β-Actin (unteres Bild) als Kontrolle hybridisiert. Herz und periphere Blutleukozyten (PBL) stellen die positive bzw. negative Kontrolle für die Caveo lin-1-Expression dar. Die Wanderung der RNA-Marker (kb) ist links am Bild angegeben.

Fig. 2 Analyse der Caveolin-1-Expression in mehreren menschlichen Dickdarmkarzinom-Zellinien. A: Es wur den Lysate aus den angegebenen Zellinien wie be schrieben hergestellt und mittels Western-Blotting analysiert. Die Proteine aus den Karzinomzellen (50 µg) oder MDCK-Zellen (5 µg) wurden mittels SDS- PAGE aufgetrennt, auf Nitrocellulose überführt, und anschließend wurde Caveolin-1 (oberes Bild) oder Actin (unteres Bild) mit spezifischen Antikörpern nachgewiesen. Die Positionen der Wanderung der Mar ker-Proteine sind links angegeben (kDa). B: North ern-Blot-Analyse der Caveolin-1-mRNA-Expression. Zytoplasmatische RNA aus Karzinomzellen (20 µg) oder MDCK-Zellen (2 µg) enthaltende Proben wurden auf einem 1% Agarose-gel aufgetrennt, auf eine Ny lon-Membran überführt und wie beschrieben auf Ca veolin-1 geprüft. Die Zellen, aus denen die RNA hergestellt wurde, sind oben angegeben. Links ist die Position der 28S- und der 18S-ribosomalen RNA angegeben.

Fig. 3 Caveolin-1-Proteinexpression in Dickdarmgeweben aus vier Patienten (G009, G010, G011 und G017) mit Dickdarmkrebs. Die Gewebe wurden aus normalen und Tumorstellen chirurgisch exzidiert, und die Dick darmschleimhaut wurde wie beschrieben durch Affini tätsreinigung vom Rest des Stroma abgetrennt. Die Proteine aus den Lysaten der angegebenen Gewebe (10 µg) oder aus MDCK-Zellen (5 µg) wurden wie in Fig. 2 behandelt. Das Aufbringen auf die einzelnen Bahnen wurde mittels Ponceau Red S-Anfärbung nach Übertragung auf Nitrocellulose kontrolliert (nicht gezeigt). Die verwendeten Abkürzungen sind: NM = normale Schleimhaut; TM = Tumorschleimhaut; NS = normales Stroma; TS = Tumorstroma; M = MDCK Zellen.

Fig. 4 Caveolin-1-Expression in NIH-3T3-Zellen nach Tumor bildung in Nacktmäusen. A: Die Lysate aus den MDCK- Zellen, parentalen NIH-3T3-Zellen oder NIH-3T3- Zellen, erhalten nach Tumorbildung in Nacktmäusen (ExTumor), wurden wie beschrieben hergestellt. Die Proteine aus den NIH-3T3-Zellen (50 µg) oder MDCK- Zellen (5 µg) wurden wie in Fig. 2A behandelt. B: Proben, die zytoplasmatische RNA (15 µg) aus MDCK- Zellen, parentalen NIH-3T3-Zellen oder NIH-3T3- ExTumor enthielten, wurden mittels Northern-Blot- Analyse wie in Fig. 2B beschrieben analysiert.

Fig. 5 IPTG-induzierbare Expression von rekombinantem Ca veolin-1 in den menschlichen Dickdarmkarzinom-Zel linien HT29 und DLD1. HT29-Zellen (A) oder DLD1- Zellen (B) wurden wie beschrieben unter der Kon trolle eines IPTG-induzierbaren Promotors stabil mit Caveolin-1 transfiziert. Nach 24 h Wachstum in Abwesenheit (-) oder Gegenwart (+) von 1 mM IPTG wurden Zell-Lysate aus transfizierten (mock, C13, C14, C16) und parentalen HT29-Zellen (A) oder aus transfizierten (mock, C2, C4) und parentalen DLD1- Zellen hergestellt. Die Proteine (20 µg) wurden mittels Western-Blotting wie in Fig. 2 analysiert.

Als positive Kontrolle für den Caveolin-1-Nachweis wurden Extrakte von MDCK-Zellen (5 µg Gesamtpro tein) mit eingeschlossen.

Fig. 6 Tumorentwicklung von Caveolin-1-transfizierten HT29-Zellen in Mäusen. 1.10⁶ Zellen wurden subkutan in 6-8 Wochen alte Nacktmäuse injiziert. Insgesamt wurden n = 13 Mäuse in dieser Weise analysiert. Bei jeder Maus wurden links Kontrollzellen (parentale HT29-Zellen oder mock-transfizierte Zellen) und rechts mit Caveolin-1 transfizierte HT29-Zellen (Klone C13, C14, C16) injiziert. Große (D) und kleine (d) Durchmesser der wachsenden Tumoren wur den zweimal pro Woche gemessen, und die entspre chenden Volumina (V) wurden mit der Gleichung V = d2.D.π/6 berechnet. Dargestellt sind die Ergebnisse aus einer repräsentativen Reihe von Experimenten mit 4 Mäusen.

Fig. 7 Tumorentwicklung von Caveolin-1-transfizierten DLD1-Zellen in Mäusen. 1.10⁶ Zellen wurden subkutan in 6-8 Wochen alte Nacktmäuse injiziert. Insgesamt wurden n = 7 Mäuse in der gleichen Weise wie in Fig. 6 beschrieben analysiert. Dargestellt sind die Ergebnisse aus einer repräsentativen Reihe von Ex perimenten mit 4 Mäusen.

Fig. 8 Immunoblot-Analyse der Caveolin-1-Expression in transfizierten HT29-Zellen nach Tumorbildung in Nacktmäusen. Tumoren, die sich nach Injektion pa rentaler, mock- oder Caveolin-1-transfizierter HT29-Zellen entwickelten, wurden exzidiert wie be schrieben und kultiviert (ExTumor). Sobald homogene Zellpopulationen erhalten worden waren, wurden die Zellen lysiert, und die Proteine (50 µg) wurden wie in Fig. 2 mittels Western-Blot analysiert. Die Caveolin-1-Expression in Abwesenheit oder Gegenwart von IPTG wurde in Proben aus Zellen vor (BI) und nach (ExTumor) der Injektion in Mäuse verglichen. Dargestellt sind jeweils die Ergebnisse für Zellpo pulationen, die aus zwei getrennten Tumoren (T1 und T2) erhalten wurden.

Fig. 9. Caveolin-1-Expression in Dickdarmkarzinom-Zellen, die gegen hohe Methotrexat-Dosen resistent sind oder hohes metastatisches Potential aufweisen. A: Die Expression von Caveolin-1 in stabil differen zierten HT-29-Populationen des enterozytischen (5M12) oder schleimsezernierenden (5M21) Phänotyps, erhalten durch Einwirkung hoher Methotrexat-Konzen trationen auf HT-29-Zellen, wurde mittels Western- Blot-Analyse analysiert. Die Proteine aus Karzinom zellen (50 µg) oder MDCK-Zellen (5 µg) wurden wie in Fig. 2A beschrieben analysiert. B: Die Expres sion von Caveolin-1-Protein in der Dickdarmkarzi nom-Linie Lovo und in zwei abgeleiteten Klonen, ausgewählt nach hohem metastatischen Potential (E2 und C5), wurden wie in A mittels Western-Blot-Ana lyse analysiert.

Claims

1. Verwendung von Caveolin-1 oder eines pharmazeutisch an nehmbaren Salzes desselben zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von nichtsteroidabhängigem Karzinom.

2. Verwendung des Caveolin-1-Gens zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von nichtsteroidabhän gigem Karzinom.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 zur Behandlung von Gastrointestinalkarzinom, vorzugsweise von Dickdarmkar zinom.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Caveolin-1 oder das Caveolin-1-Gen auf einem Abgabeträger bereitgestellt wird.

5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Abgabeträger ein Antikörper ist, der spezifisch an ein Antigen bindet, das mit dem zu behandelnden nicht steroidabhängigen Karzinom in Zusammenhang steht.

6. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß Liposomen als Abgabeträger verwendet werden.

7. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß Virusgen-Expressionsvektoren als Abgabeträger für das Caveolin-1-Gen verwendet werden.

8. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß Teilchen aus chemisch inerten Substanzen als Abgabeträ ger für das Caveolin-1-Gen verwendet werden.

9. Verfahren zur Behandlung eines Patienten mit nichtste roidabhängigem Karzinom, umfassend die Gabe einer the rapeutisch wirksamen Menge des Caveolin-1-Proteins oder eines Salzes desselben an den Patienten.

10. Verfahren zur Behandlung eines Patienten mit nichtste roidabhängigem Karzinom, umfassend die Gabe des Cave olin-1-Gens an den Patienten.