DE10036641A1 - New nucleic acid encoding mutant factor 7 activating protease, useful for diagnosis, treatment and prevention of coagulation disorders, also related protein and antibodies - Google Patents
New nucleic acid encoding mutant factor 7 activating protease, useful for diagnosis, treatment and prevention of coagulation disorders, also related protein and antibodiesInfo
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Abstract
Description
Gegenstand der Erfindung sind monoklonale Antikörper gegen die den Blutgerin nungsfaktor VII aktivierende Protease und ihre Verwendung als Immunabsorbens zur Reinigung, zum Nachweis und zur Bestimmung der Aktivität der genannten Protease (FSAP).The invention relates to monoclonal antibodies against blood clot Factor VII activating protease and its use as an immune absorbent for cleaning, detection and determination of the activity of the above Protease (FSAP).
Seit 1996 ist eine im Plasma vorkommende Protease bekannt, die aufgrund ihre Eigenschaft, an Hyaluronsäure zu binden, als Plasma Hyaluronean Binding Protein (= PHBP), bezeichnet wurde (Choi-Miura et al., J. Biochem. 1996; 119: 1157-65). Diese Protease wurde kurz danach auch in Prothrombin-Konzentraten nachgewie sen und daraus isoliert (Hunfeld et al., Ann. Hematol. 1998; 76: A101; Hunfeld et al., FEBS Letters, 1999; 456: 290-94). Eine mögliche biologische Funktion konnte bis dahin allerdings nicht beschrieben werden. Diese wurde erstmals 1999 mitge teilt (Römisch et al., Ann. Hematol. 1999; 78: A101; Römisch et al., Ann. Hematol. 1999; 78: A24; Römisch et al. Blood Coagul Fibrinol., 1999; 10: 471-79; Römisch et al.; Haemostasis 1999; 29: 292-99). In in vitro Untersuchungen wurde gezeigt, dass die Protease den Gerinnungsfaktor VII und die Einketten-Plasminogenaktivatoren aktivieren kann. Dagegen werden die Blutgerinnungsfaktoren V und VIII proteoly tisch degradiert (Deutsche Patentanmeldung 199 03 693.4). Entsprechend dem Erstbefund wurde die Protease Faktor Sieben Aktivierende Protease oder FSAP genannt. A protease occurring in plasma has been known since 1996 Property of binding to hyaluronic acid as a plasma hyaluronean binding protein (= PHBP), (Choi-Miura et al., J. Biochem. 1996; 119: 1157-65). Shortly afterwards, this protease was also detected in prothrombin concentrates sen and isolated therefrom (Hunfeld et al., Ann. Hematol. 1998; 76: A101; Hunfeld et al., FEBS Letters, 1999; 456: 290-94). A possible biological function could until then, however, not be described. This was first introduced in 1999 shares (Römisch et al., Ann. Hematol. 1999; 78: A101; Römisch et al., Ann. Hematol. 1999; 78: A24; Roman et al. Blood Coagul Fibrinol., 1999; 10: 471-79; Roman et al .; Haemostasis 1999; 29: 292-99). In vitro studies have shown that the protease has coagulation factor VII and the single chain plasminogen activators can activate. In contrast, the blood coagulation factors V and VIII become proteoly table degraded (German patent application 199 03 693.4). According to that The first finding was the protease factor seven activating protease or FSAP called.
Neuere Ergebnisse haben bestätigt, dass FSAP tatsächlich ein Plasmaprotein ist. Als potentiell in die Regulation der Hämostase, vor allem in Gerinnungs- und Fibri nolysereaktionen eingreifendes Enzym, ist nicht nur dessen Herstellung und Cha rakterisierung von Interesse, sondern auch die Quantifizierung von Blutplasma- Konzentrationen in gesunden Personen und Patienten. Außerdem könnten FSAP- Konzentrationen in anderen Körperflüssigkeiten oder Zellextrakten Informationen über potentielle Krankheitszustände geben. Entsprechende Testsysteme, die die Quantifizierung sowohl des FSAP-Antigengehaltes als auch die Bestimmung seiner Aktivität ermöglichen, wie Western Blots oder ein Enzym-Immunoassay (ELISA), wurden bereits beschrieben (Deutsche Patentanmeldungen 199 03 693.4 und 199 26 531.3).Recent results have confirmed that FSAP is indeed a plasma protein. As potentially in the regulation of hemostasis, especially in coagulation and fibri enzyme that interferes with nolysis reactions is not just its production and cha characterization of interest, but also the quantification of blood plasma Concentrations in healthy individuals and patients. FSAP- Concentrations in other body fluids or cell extracts information give about potential disease states. Appropriate test systems that the Quantification of both the FSAP antigen content and the determination of its Enable activity, such as Western blots or an enzyme immunoassay (ELISA), have already been described (German patent applications 199 03 693.4 and 199 26 531.3).
Diese Testsysteme basieren darauf, dass FSAP durch spezifische monoklonale Antikörper gebunden und/oder detektiert wird. Obwohl bei der Immunisierung bspw. von Mäusen häufig viele positive Klone bezüglich der Expression eines spe zifischen monoklonalen Antikörpers identifiziert werden, sind doch nicht selten nur wenige davon für die vorstehend genannten Fragestellungen geeignet. Es stellte sich deshalb die Aufgabe, spezifische monoklonale Antikörper gegen die den Blut gerinnungsfaktor VII aktivierende Protease aufzufinden, die sowohl für ihre Rein darstellung, als auch für ihren qualitativen und quantitativen Nachweis als auch für ihre Aktivitätsbestimmung effektiv einsetzbar sind.These test systems are based on the fact that FSAP is characterized by specific monoclonal Antibody is bound and / or detected. Although in immunization For example, mice often have many positive clones regarding the expression of a spe specific monoclonal antibodies are not only rare few of them are suitable for the questions mentioned above. It posed therefore the task of specific monoclonal antibodies against the blood Find clotting factor VII activating protease, both for their Rein representation, as well as for their qualitative and quantitative detection as well as for their activity determination can be used effectively.
Es wurde nun gefunden, dass diesen Anforderungen in hohem Maße monoklonale Antikörper gegen die den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierende Protease gerecht werden, die von der Hybridomazelllinie DSM ACC2453 und der Hybridomazelllinie DSM ACC2454 gebildet werden.It has now been found that these requirements are highly monoclonal Antibodies against the protease activating blood coagulation factor VII by the hybridoma cell line DSM ACC2453 and the hybridoma cell line DSM ACC2454 can be formed.
Bis vor kurzem wurde FSAP überwiegend in ihrer aktivierten Form gereinigt. Kon ventionelle Präparationsmethoden, wie säulenchromatografische Techniken, be günstigten die rasche Aktivierung und anschließende Inaktivierung der Protease. Until recently, FSAP was mostly cleaned in its activated form. Kon conventional preparation methods, such as column chromatography techniques, be favored the rapid activation and subsequent inactivation of the protease.
Erfindungsgemäß ist nun die Reindarstellung der den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierenden Protease und vor allem ihres Proenzyms mit hoher Ausbeute da durch möglich, dass man einen der vorstehend genannten Antikörper an einen Träger koppelt, diesen mit einer die Protease oder ihre Proenzym enthaltenden Flüssigkeit equilibriert, anschließend auswäscht und dann die Protease oder ihr Proenzym durch Elution gewinnt.According to the invention, the pure representation of the blood coagulation factor VII activating protease and especially their proenzyme there with high yield by possible that one of the above-mentioned antibodies to a Carrier couples this with one containing the protease or its proenzyme Liquid equilibrated, then washed out and then the protease or her Proenzyme wins by elution.
Darüber hinaus eignen sich die genannten Antikörper auch zum Nachweis der den
Blutgerinnungsfaktor VII aktivierenden Protease oder ihres Proenzyms mit einem
Immunoassay, bei dem man
In addition, the antibodies mentioned are also suitable for the detection of the protease activating blood coagulation factor VII or its proenzyme with an immunoassay in which
- a) eine Probe, die die Protease oder ihr Proenzym enthalten soll, mit ei nem auf einem festen Träger fixierten ersten erfindungsgemäßen An tikörper inkubiert und auswäscht, dann einen zweiten markierten er findungsgemäßen Antikörper zugibt und abermals auswäscht und das vom zweiten Antikörper oder anderen monklonalen oder polyklonalen Antikörpern hervorgerufene Signal misst; odera) a sample, which is to contain the protease or its proenzyme, with egg nem fixed to a solid support first to the invention incubated and washed out, then labeled a second Antibodies according to the invention are added and washed out again and the from the second antibody or other monclonal or polyclonal Antibody-induced signal measures; or
- b) auf einem Träger die in der zu untersuchenden Probe enthaltene Protease oder ihr Proenzym fixiert, beispielsweise durch polyklonale Antikörper gegen die Protease oder ihr Proenzym, und sie mit einem markierten erfindungsgemäßen Antikörper allein oder in Mischung oder mit einem unmarkierten der erfindungsgemäßen Antikörper und anschließendem Nachweis des monoklonalen Antikörpers detektiert oderb) the support contained in the sample to be examined Protease or its proenzyme fixed, for example by polyclonal Antibodies to the protease or its proenzyme, and it with a labeled antibodies according to the invention alone or in a mixture or with an unlabelled antibody of the invention and subsequent detection of the monoclonal antibody was detected or
- c) einen auf einem Träger fixierten erfindungsgemäßen Antikörper mit einer auf die Protease oder ihr Proenzym zu untersuchenden Probe in Gegenwart einer markierten Protease oder ihres Proenzyms ver setzt und das durch die Markierung hervorgerufene Signal misst.c) an antibody according to the invention fixed on a support a sample to be examined for the protease or its proenzyme in the presence of a labeled protease or its proenzyme sets and measures the signal caused by the marking.
Eine andere Möglichkeit zum Nachweis der den Blutgerinnungsfaktor VII aktivie renden Protease oder ihres Proenzyms besteht darin, dass man den Nachweis mit der Western Blot-Methodik durch eine immunologische Reaktion mit einem mar kierten erfindungsgemäßen Antikörper allein oder in Mischung oder mit einem un markierten der erfindungsgemäßen Antikörper und anschließendem Nachweis des monoklonalen Antikörpers, z. B. durch markiertes Protein A oder G oder einen mar kierten, gegen den monoklonalen Antikörper gerichteten monoklonalen oder po lyklonalen Antikörper durchführt.Another possibility for the detection of the blood coagulation factor VII protease or its proenzyme is that the detection with the Western blot methodology by an immunological reaction with a mar Kiert antibodies of the invention alone or in a mixture or with an un labeled the antibody of the invention and subsequent detection of the monoclonal antibody, e.g. B. by labeled protein A or G or a mar kiert, against the monoclonal antibody directed monoclonal or po carries out lyonal antibody.
Schließlich ist es auch möglich, die Aktivität der den Blutgerinnungsfaktor VII akti vierenden Protease oder ihres Proenzyms in Proteinlösungen dadurch zu bestim men, dadurch dass man die die Protease und/oder ihr Proenzym enthaltende Pro teinlösung an einem festen Träger inkubiert, an die zuvor ein gegen die Protease gerichteter monoklonaler erfindungsgemäßer Antikörper gekoppelt wurde und nach Auswaschen des festen Trägers die daran fixierte Protease und ihr Proenzym mit Reagentien inkubiert, die deren Aktivitätsbestimmung erlauben. Die Aktivität der Protease oder ihres Proenzyms kann dann durch eine photometrische Bestimmung der bei der Einwirkung auf chromogene Substrate auftretenden Extinktion gemes sen werden.Finally, it is also possible to activate the activity of the blood coagulation factor VII thereby determining protease or its proenzyme in protein solutions by making the pro that contains the protease and / or its proenzyme Ink solution incubated on a solid support, to which previously an against the protease Directed monoclonal antibody according to the invention was coupled and after Wash out the solid support, the protease attached to it and its proenzyme Incubated reagents that allow their activity determination. The activity of the Protease or its proenzyme can then be determined by a photometric determination the extinction occurring when exposed to chromogenic substrates will be.
Andere Möglichkeiten zur Bestimmung der Aktivität der Protease oder ihres Prote
ins bestehen darin, dass man
Other ways of determining the activity of the protease or its protein are that one
- - ihre die Blutgerinnungsfaktoren VIII/VIIIa oder V/Va aktivierende Wir kung oder- Her activating the blood coagulation factors VIII / VIIIa or V / Va kung or
- - ihre die Blutgerinnungszeiten verkürzende Wirkung in globalen Ge rinnungstests oder- their effect in global ge that reduces blood clotting times coagulation tests or
- - ihre Plasminogenaktivatoren aktivierende Wirkung oder - their plasminogen activators activating effect or
- - ihre den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierende Wirkung misst.- measures their activating effect on blood coagulation factor VII.
Für die Anwendung in den vorstehend genannten Verfahren eignen sich sowohl die vollständigen monoklonalen Antikörper als auch deren Fragmente wie F(ab)2 oder F(ab). Die Antikörper oder ihre Fragmente werden nach Markierung mit einer ra dioaktiven oder fluoreszierenden oder enzymatisch aktiven Substanz als detektie rende Hilfsmittel in einem Immunoassay oder in einem Western Blot-Nachweis verfahren eingesetzt. Die unmarkierten monoklonalen Antikörper oder Fragmente können ebenfalls eingesetzt werden, jedoch wird dann die Detektion oder Immobi lisierung z. B. durch einen gegen den Maus-Antikörper gerichteten markierten Anti körper oder sein markiertes Fragment durchgeführt (Sandwich-Verfahren). Die er findungsgemäßen monoklonalen Antikörper oder ihre Fragmente können allein oder als Mischung eingesetzt werden. Dies ist besonders empfehlenswert bei Western Blots, da SDS-Gelelektrophoresen häufig unter reduzierenden Bedingun gen der Proben durchgeführt werden. Da die beiden Polypeptidketten der FSAP lediglich über eine Disulfidbrücke miteinander verbunden sind, zerfällt das Molekül bei der Reduktion in zwei Ketten, nämlich in die schwere und die leichte Kette, wo bei die erstere vom monoklonalen Antikörper der DSM ACC2454 und die letztere vom monoklonalen Antikörper der DSM ACC2453 erkannt wird. Zur Detektion bei der Ketten sind also die beiden erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper oder ihre Fragmente erforderlich.Both the complete monoclonal antibodies and their fragments such as F (ab) 2 or F (ab) are suitable for use in the abovementioned methods. After labeling with a radioactive or fluorescent or enzymatically active substance, the antibodies or their fragments are used as detection aids in an immunoassay or in a Western blot detection method. The unlabelled monoclonal antibodies or fragments can also be used, but then the detection or immobilization z. B. performed by a directed against the mouse antibody labeled antibody or its labeled fragment (sandwich method). The monoclonal antibodies according to the invention or their fragments can be used alone or as a mixture. This is particularly recommended for Western blots, since SDS gel electrophoresis is often carried out under reducing conditions on the samples. Since the two polypeptide chains of the FSAP are only connected to one another via a disulfide bridge, the molecule breaks down into two chains during the reduction, namely into the heavy and the light chain, where the former is derived from the monoclonal antibody DSM ACC2454 and the latter from the monoclonal antibody DSM ACC2453 is recognized. The two monoclonal antibodies according to the invention or their fragments are therefore required for detection in chains.
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper wurden wie folgt hergestellt und charakterisiert:The monoclonal antibodies according to the invention were produced as follows and characterized:
Drei weibliche Balb/c-Mäuse (ca. 6 Wochen alt) wurden mit FVIII-aktivator immuni siert. Die erste Injektion bestand aus 0,2 ml des Antigens (10 µg) gemischt mit 0,2 ml kompl. Freunds Adjuvans. In den drei folgenden Boost-Injektionen (Abstand jeweils 2 Wochen) wurde das Antigen (20 µg in 0,2 ml) ohne Adjuvans verabreicht (alle Injektionen i. p.). Die Verdünnung des Immunogens erfolgte in PBS. Nach der letzten Injektion wurden die Serum-Titer mittels indirektem ELISA bestimmt, indem eine Mikrotiterplatte mit FVII-Aktivator beschichtet wurde. Für die Fusion wurde die Maus mit dem höchsten Serum-Titer ausgewählt.Three female Balb / c mice (approx. 6 weeks old) were immunized with FVIII activator Siert. The first injection consisted of 0.2 ml of the antigen (10 µg) mixed with 0.2 ml compl. Freund's adjuvant. In the following three boost injections (distance 2 weeks each), the antigen (20 µg in 0.2 ml) was administered without adjuvant (all injections i.p.). The immunogen was diluted in PBS. After In the last injection, the serum titers were determined by means of indirect ELISA, by a microtiter plate was coated with FVII activator. For the merger, the Mouse with the highest serum titer selected.
Etwa drei Wochen nach der letzten Applikation wurde das Antigen an drei aufein anderfolgenden Tagen verabreicht (10 µg in 0,1 ml i. v.). Am nächsten Tag (Tag 4) wurde die Maus nach einer Blutentnahme getötet, die Milz entnommen und die Milzzellen isoliert. Die Milzzellen wurden anschließend mit der murinen Myelom- Zelllinie SP2/0-Ag 14 fusioniert. Als Fusionsreagenz wurde Polyethylenglykol 4000 (Merck) verwendet. Die Fusion wurde mit einer Modifikation der Original Köh ler/Milstein-Methode durchgeführt. Die Zellen wurden auf 24 Well-Kulturplatten verteilt. Als Medium wurde Dulbecco mod. Eagle's Medium mit 10% fötalem Käl berserum und HAT zur Selektion eingesetzt. Nach etwa zwei Wochen wurden die gewachsenen Zellclone in die Vertiefungen einer 48 Well-Platte transferiert und kodiert.About three weeks after the last application, the antigen was found on three administered the following days (10 µg in 0.1 ml IV). The next day (day 4) the mouse was killed after taking a blood sample, the spleen was removed and the Spleen cells isolated. The spleen cells were then removed with the murine myeloma Cell line SP2 / 0-Ag 14 fused. Polyethylene glycol 4000 was used as the fusion reagent (Merck) used. The fusion was made with a modification of the original Köh ler / Milstein method carried out. The cells were placed on 24-well culture plates distributed. Dulbecco mod. Eagle's Medium with 10% fetal calf berserum and HAT used for selection. After about two weeks, the grown cell clones are transferred to the wells of a 48 well plate and coded.
Von 1728 gewachsenen Clonen wurde der Kulturüberstand genommen und mittels Aktivator wurden Maus IgG positive Überstände auf Spezifität geprüft (ELISA). Von den getesteten Zelllinien wurden 108 Zelllinien als spezifisch für FVII-Aktivator identifiziert und kryokonserviert.The culture supernatant of 1728 grown clones was taken and by means of Activator, mouse IgG positive supernatants were tested for specificity (ELISA). Of The cell lines tested were 108 cell lines specific for FVII activator identified and cryopreserved.
Die zwei Hybridoma-Zelllinien mit den Bezeichnungen DSM ACC2453 und DSM ACC2454 wurden für weitere Untersuchungen ausgewählt. Die Spezifität der von diesen Zelllinien gebildeten Antikörper wurde mit dem BIACORE bestätigt und die Bindungskinetik untersucht. Die beiden monoklonalen Antikörper sind vom Typ des IgG1.The two hybridoma cell lines named DSM ACC2453 and DSM ACC2454 were selected for further investigation. The specificity of Antibodies formed in these cell lines were confirmed with the BIACORE and the Binding kinetics examined. The two monoclonal antibodies are of the type of IgG1.
Claims (9)
- a) eine Probe, die die Protease oder ihr Proenzym enthalten soll, mit einem auf einem festen Träger fixierten ersten Antikörper von Anspruch 1 allein oder in Mischung inkubiert und auswäscht, dann einen zweiten, markierten Antikör per zugibt und abermals auswäscht und das vom zweiten Antikörper oder anderen monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern hervorgerufene Signal misst oder
- b) auf einem Träger die in der zu untersuchenden Probe enthaltene Protease oder ihr Proenzym fixiert und sie mit einem markierten Antikörper von An spruch 1 allein oder in Mischung oder mit einem unmarkierten der erfin dungsgemäßen Antikörper und anschließendem Nachweis des monoklona len Antikörpers detektiert oder
- c) einen auf einem Träger fixierten Antikörper von Anspruch 1 allein oder in Mischung mit einer auf die Protease oder ihr Proenzym zu untersuchenden Probe in Gegenwart einer markierten Protease oder ihres Proenzyms ver setzt und das durch die Markierung hervorgerufene Signal misst.
- a) a sample, which is to contain the protease or its proenzyme, incubated and washed out with a first antibody of claim 1 fixed on a solid support, alone or in a mixture, then adds and rinses a second, labeled antibody by and the second antibody or other signal produced by monoclonal or polyclonal antibodies or
- b) the protease or its proenzyme contained in the sample to be examined is fixed on a carrier and detected with a labeled antibody of claim 1 alone or in a mixture or with an unlabelled antibody according to the invention and subsequent detection of the monoclonal antibody or
- c) a fixed antibody of claim 1 alone or in admixture with a sample to be examined for the protease or its proenzyme in the presence of a labeled protease or its proenzyme and measures the signal caused by the label.
die die Protease und/oder ihr Proenzym enthaltende Proteinlösung an einem festen Träger inkubiert, an die zuvor ein gegen die Protease gerichteter monoklonaler Antikörper von Anspruch 1 allein oder in Mi schung gekoppelt wurde und
nach Auswaschen des festen Trägers die daran fixierte Protease und/oder ihr Proenzym mit Reagentien inkubiert, die deren Aktivi tätsbestimmung erlauben. 5. A method for determining the activity of the protease activating the blood coagulation factor VII or its proenzyme in protein solutions, characterized in that
which incubates the protease and / or its proenzyme containing protein solution on a solid support, to which a monoclonal antibody directed against the protease of claim 1 has been coupled alone or in admixture and
after washing out the solid support, the protease fixed thereon and / or its proenzyme are incubated with reagents which allow their activity to be determined.
ihre die Blutgerinnungsfaktoren VIII/VIIIa oder V/Va inaktivierende Wirkung oder
ihre die Blutgerinnungszeiten verkürzende Wirkung in globalen Ge rinnungstests oder
ihre Plasminogen-Aktivatoren aktivierende Wirkung oder
ihre den FVII aktivierende Wirkung.7. The method according to claim 5, characterized in that the activity of the protease or its proenzyme is measured by
their inactivating effect on blood coagulation factors VIII / VIIIa or V / Va, or
their effect of shortening blood clotting times in global coagulation tests or
their plasminogen activators activating effect or
their activating effect on the FVII.
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