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DE10032529A1 - Diagnose von bedeutenden genetischen Parametern innerhalb des Major Histocompatibility Complex (MHC) - Google Patents

Diagnose von bedeutenden genetischen Parametern innerhalb des Major Histocompatibility Complex (MHC)

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DE10032529A1
DE10032529A1 DE10032529A DE10032529A DE10032529A1 DE 10032529 A1 DE10032529 A1 DE 10032529A1 DE 10032529 A DE10032529 A DE 10032529A DE 10032529 A DE10032529 A DE 10032529A DE 10032529 A1 DE10032529 A1 DE 10032529A1
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DE
Germany
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oligonucleotides
mhc
nucleic acids
pna oligomers
diagnosis
Prior art date
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Ceased
Application number
DE10032529A
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English (en)
Inventor
Alexander Olek
Christian Piepenbrock
Kurt Berlin
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Epigenomics AG
Original Assignee
Epigenomics AG
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Publication date
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Abstract

Die vorliegende Erfindung beschreibt Nukleinsäuren zur Diagnose von einem Satz genetischer Parameter innerhalb des Major Histocompatibility Complexes (MHC), umfassend einen mindestens 20 Basenpaare langen revers komplementären oder identischen Abschnitt einer chemisch vorbehandelten genomischen DNA sowie einen Satz Oligomersonden (Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere), die zur Detektion des Cytosin-Metylierungszustandes in Nuleinsäuren dienen. Diese Sonden sind für die Diagnose von genetischen Parametern innerhalb des MHC besonders geeignet.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren, Oligo­ nukleotide, PNA-Oligomere und ein Verfahren zur Diagnose von bedeutenden genetischen Parametern innerhalb des Ma­ jor Histocompatibility Complex (MHC).
Die nach den methodischen Entwicklungen der letzten Jahre in der Molekularbiologie gut studierten Beobachtungsebe­ nen sind die Gene selbst, die Übersetzung dieser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschal­ tet wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Ge­ ne in bestimmten Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit Ausmaß und Charakter der Methylierung der Gene bzw. des Genoms korrelierbar. Insofern äußern sich pathogene Zustände in einem veränderten Methylierungsmuster einzel­ ner Gene oder des Genoms.
Der Major Histocompatibility Complex (MHC) beschreibt ei­ ne Gruppe von Genen mit immunologischen und nicht­ immunologischen Funktionen und wird bei allen Vertebraten gefunden ("Both man & bird & beast": comparative organi­ zation of MHC genes. 1995, Trowsdale J, Immunogenetics; 41: 1-17; Evolving views of the major histocompatibility complex. 1997, Gruen JR and Weissman SM, Blood; 90: 4252-­ 4265). Beim Menschen erstreckt er sich über einen Bereich von 3,6 Millionen Basenpaaren auf dem kurzen Arm von Chromosom 6 (6p21.3) und ist wesentlich an der Immunant­ wort beteiligt. Er ist komplett sequenziert, hoch poly­ morph und weist die höchste Gendichte im ganzen menschli­ chen Genom auf. So werden von den insgesamt auf Chromosom 6 geschätzten 3500 Genen 224 identifizierte Genloci dem MHC zugerechnet, was bedeutet, dass 3 mal so viele Gene in der Region des MHC lokalisiert sind wie aufgrund sei­ ner Größe zu erwarten wäre. Der MHC wird unterteilt in die drei Regionen: Klasse 1, 2 und 3. Alle Gene der Klas­ se 1 sind zwischen 3 und 6 kb groß. Sie sind auf jeder Zelle vorhanden und werden als Transplantationsantigene bezeichnet, d. h. sie sind verantwortlich für die Absto­ ßung von fremdem Gewebe. Die Gene der Klasse 2 sind zwi­ schen 4 und 11 kb groß. Die Genprodukte sind an der Wech­ selwirkung zwischen Zellen, die für die Immunantwort be­ nötigt werden, beteiligt. Die Klasse 3 weist die höchste Gendichte auf. Hier sind sowohl Gene lokalisiert, die nicht im Immunsystem involviert sind als auch die Komple­ mentfaktoren, die als Komponenten des Serums mit Antikör­ per-Antigen Komplexen interagieren.
Die primäre immunologische Funktion der MHC Moleküle be­ steht darin, antigene Peptide auf den Oberflächen von Zellen zu binden; dies dient zur Erkennung von Antigen spezifischen T-Zell Rezeptoren von Lymphocyten. Die Be­ deutung der T-Zellen steht in engem Zusammenhang mit in­ trazellulären Infekten und Tumoren. Da MHC Moleküle eine zentrale Rolle bei der Regulation der Immunantwort spie­ len, haben sie wahrscheinlich auch einen entscheidenden Anteil an der Kontrolle und Suszeptibilität von Erkran­ kungen. Es wird angenommen, dass der MHC mit genetischen Erkrankungen wie rheumatischer Arthritis (The association of HLA-DM genes with rheumatoid arthritis in Eastern France. 2000, Toussirot E et al., Hum Immunol; 61(3): 303-­ 308), Diabetes (In vivo evidence for the contribution of human histocompatibility leukocyte antigen (HLA)-DQ mole­ cules to the development of diabetes. 2000, Wen L et al., J Exp Med; 191(1): 97-104), speziell Typ I Diabetes (The aetiology of Type I diabetes. 1999, Chowdhury TA, Mijovic CH, Barnett AH, Baillieres Clin Endocrinol Metab.; 13(2): 181-195), und Insulin abhängige Diabetes mellitus (IDDM) (Identification of a new susceptibility locus for insulin-dependent diabetes mellitus by ancestral haplotype congenic mapping. 1995, Ikegami H, Makino S, Yamoto E, Kawaguchi Y, Ueda H, Sakamoto T, Takekawa K, Ogihara T, J Clin Invest.; 96(4): 1936-1942), hereditärer Hämochroma­ tose (Haemochromatosis in the new millennium. 2000, Pow­ ell LW et al., J Hepatol; 32(1 Suppl): 48-62), speziell die genetische Hämochromatose (GH) (HFE codon 63/282 (H63D/C282Y) dimorphism in German patients with genetic hemochromatosis. 1998, Gottschalk R, Seidl C, Loffler T, Seifried E, Hoelzer D, Kaltwasser JP, Tissue Anti­ gens; 51(3): 270-275) und die milde Form der Hämochromatose (HFE mutations analysis in 711 hemochromatosis probands: evidence for S65C implication in mild form of hemochroma­ tosis. 1999, Mura C, Raguenes O, Ferec C, Blood; 93(8): 2502-2505), Schizophrenie (Schizophrenia, rheuma­ toid arthritis and natural resistance genes. 1997, Rubin­ stein G, Schizophr Res; 25(3): 177-181), HIV (The human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Vpu protein inter­ feres with an early step in the biosynthesis of major histocompatibility complex (MHC) class I molecules. 1997, Kerkau T et al., Exp Med; 185(7): 1295-1305), Myositis (Mapping of a candidate region for susceptibility to in­ clusion body myositis in the human major histocompatibil­ ity complex. 1999, Kok CC et al. 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Jun; 11(6): 603-606), Nephritis (Genetic suscepti­ bility to lupus nephritis. 1998; Tsao BP, Lupus; 7(9): 585-590) und vielen anderen Erkrankungen in Zusam­ menhang steht.
Es gibt Untersuchungen, die belegen, dass die Expression von MHC Genen an die Methylierung von CpG Dinukleotiden gekoppelt ist, was die Transkription negativ beeinflussen kann. Entweder direkt, indem sich die Transkriptionsfak­ toren nicht an die DNA anlagern können oder indirekt, durch Repressormoleküle, die an methylierte CpGs binden (How does DNA methylation repress transcription?, 1997; Kass SU et al., Trends Genet; 11: 444-449).
Verschiedene Ergebnisse belegen den Zusammenhang zwischen immunologischen Erkrankungen und Methylierung. Die Beziehung zwischen der Expression von HLA-DR Antigenen und der Methylierung des Gens HLA-DR alpha wurde bei systemischem Lupus erythematodes, einer generalisierten Autoimmuner­ krankung, untersucht (Low expression of human histocompa­ tibility leukocyte antigen-DR is associated with hyper­ methylation of human histocompatibility leukocyte anti­ gen-DR alpha gene regions in B cells from patients with systemic lupus erythematosus. 1985; Sano H et al., J Clin Invest, 76(4): 1314-1322). Die Beteiligung der DNA Methy­ lierung an der aberranten MHC class II Genexpression wur­ de bei Patienten mit MHC class II Defizienz Syndrome un­ tersucht (The MHC class II deficiency syndrome: heteroge­ neity at the level of the response to 5-azadeoxycytidine. 1990; Lambert M et al., Res Immunol. 141(2): 129-140). Ein Beweis für die Regulierung von MHC Genen wurde anhand ei­ nes epigenetischen Mechanismus erbracht (Methylation of class II trans activator promoter IV: a novel mechanism of MHC class II gene control. 2000, Morris AC et. al., J Immunol; 164(8): 4143-4149). Die Expression von MHC-Genen wird inhibiert, wenn Transkriptionsfaktoren nicht an den class 2 trans activator (CIITA) Promotor binden. Die In­ hibierung basiert hier auf der Methylierung der CpG Di­ nukleotide in dem pIV Promotor, dagegen führt die Inhi­ bierung der Methylierung zu einer Re-Expression der CIITA Gene. Außerdem konnte die Expression in einem transienten Transfektionsversuch nicht durch methylierte pIV DNA sti­ muliert werden. Diese Ergebnisse belegen eine epigeneti­ sche Regulierung von CIITA und lassen weiterhin den Schluß zu, dass diese epigenetische Kontrolle prinzipiell für Gene der MHC Klasse II gilt.
5-Methylcytosin ist die häufigste kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryotischer Zellen. Sie spielt bei­ spielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkripti­ on, beim genetischen Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichem Inte­ resse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5- Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Darüber hinaus geht bei einer PCR- Amplifikation die epigenetische Information, welche die 5-Methylcytosine tragen, vollständig verloren.
Eine relativ neue und die mittlererweile am häufigsten angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5- Methylcytosin beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das nach anschließender alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5- Methylcytosin wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird die ursprüngliche DNA so umgewan­ delt, dass Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden werden kann, jetzt durch "normale" molekularbiologische Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung nachgewiesen werden kann. Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll ausgenutzt wird. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersu­ chende DNA in einer Agarose-Matrix einschließt, dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit rea­ giert nur an einzelsträngiger DNA) verhindert und alle Fällungs- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek, A. et al., Nucl. Acids. Res. 1996, 24, 5064-5066). Mit dieser Methode können einzelne Zellen un­ tersucht werden, was das Potential der Methode veran­ schaulicht. Allerdings werden bisher nur einzelne Regio­ nen bis etwa 3000 Basenpaare Länge untersucht, eine glo­ bale Untersuchung von Zellen auf Tausenden von möglichen Methylierungsanalysen ist nicht möglich. Allerdings kann auch dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus geringen Probenmengen zuverlässig analysieren. Diese ge­ hen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix verloren.
Eine Übersicht über die weiteren bekannten Möglichkeiten, 5-Methylcytosine nachzuweisen, kann aus dem folgenden Ü­ bersichtsartikel entnommen werden: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255.
Die Bisulfit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen (z. B. Zechnigk, M. et al., Eur. J. Hum. Gen. 1997, 5, 94-98) nur in der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifziert und entweder komplett se­ quenziert (Olek, A. und Walter, J., Nat. Genet. 1997, 17, 275-276) oder einzelne Cytosin-Positionen durch eine "Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo, M. L. und Jones, P. A., Nucl. Acids Res. 1997, 25, 2529-2531, WO-Patent 9500669) oder einen Enzymschnitt (Xiong, Z. und Laird, P. W., Nucl. Acids. Res. 1997, 25, 2532-2534) nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung be­ schrieben worden (Olek et al., WO 99 28498).
Weitere Publikationen, die sich mit der Anwendung der Bi­ sulfit-Technik zum Methylierungsnachweis bei einzelnen Genen befassen, sind: Xiong, Z. und Laird, P. W. (1997), Nucl. Acids Res. 25, 2532; Gonzalgo, M. L. und Jones, P. A. (1997), Nucl. Acids Res. 25, 2529; Grigg, S. und Clark, S. (1994), Bioassays 16, 431; Zeschnik, M. et al. (1997), Human Molecular Genetics 6, 387; Teil, R. et al. (1994), Nucl. Acids Res. 22, 695; Martin, V. et al. (1995), Gene 157, 261; WO 97 46705, WO 95 15373 und WO 45560.
Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations- Massenspektrometrie (MALDI-TOF) ist eine sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse von Biomolekülen (Ka­ ras, M. und Hillenkamp, F. (1988), Laser desorption ioni­ zation of proteins with molecular masses exeeding 10000 daltons. Anal. Chem. 60: 2299-2301). Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende Matrix eingebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix verdampft und das Ana­ lytmolekül so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird die Ionisation des Analyten erreicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen Massen werden Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor frü­ her als größere.
MALDI-TOF Spektroskopie eignet sich ausgezeichnet zur A­ nalyse von Peptiden und Proteinen. Die Analyse von Nuk­ leinsäuren ist etwas schwieriger (Gut, I. G. und Beck, S. (1995)), DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ioniza­ tion Mass Spectrometry. Molecular Biology: Current Inno­ vations and Future Trends 1: 147-157.) Für Nukleinsäuren ist die Empfindlichkeit etwa 100 mal schlechter als für Peptide und nimmt mit zunehmender Fragmentgröße überpro­ portional ab. Für Nukleinsäuren, die ein vielfach negativ geladenes Rückgrat haben, ist der Ionisationsprozeß durch die Matrix wesentlich ineffizienter. In der MALDI-TOF Spektroskopie spielt die Wahl der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die Desorption von Peptiden sind ei­ nige sehr leistungsfähige Matrices gefunden worden, die eine sehr feine Kristallisation ergeben. Für DNA gibt es zwar mittlererweile einige ansprechende Matrices, jedoch wurde dadurch der Empfindlichkeitsunterschied nicht ver­ ringert. Der Empfindlichkeitsunterschied kann verringert werden, indem die DNA chemisch so modifiziert wird, dass sie einem Peptid ähnlicher wird. Phosphorothioatnuklein­ säuren, bei denen die gewöhnlichen Phosphate des Rück­ grats durch Thiophosphate substituiert sind, lassen sich durch einfache Alkylierungschemie in eine ladungsneutrale DNA umwandeln (Gut, I. G. und Beck, S. (1995), A procedu­ re for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 23: 1367-1373). Die Kopplung eines "charge tags" an diese modifizierte DNA resultiert in der Steigerung der Empfindlichkeit um den gleichen Betrag, wie er für Peptide gefunden wird. Ein weiterer Vorteil von "charge tagging" ist die erhöhte Stabilität der Analyse gegen Verunreinigungen, die den Nachweis unmodifizierter Substrate stark erschweren.
Genomische DNA wird durch Standardmethoden aus DNA von Zell-, Gewebe- oder sonstigen Versuchsproben gewonnen. Diese Standardmethodik findet sich in Referenzen wie Fritsch und Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laborato­ ry Manual, 1989.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Oligonukleoti­ de und/oder PNA-Oligomere zur Detektion von Cytosin- Methylierungungen und ein Verfahren bereitzustellen, wel­ ches sich zur Diagnose von genetischen und epigenetischen Parametern innerhalb des MHC besonders eignet.
Die Aufgabe wird gelöst durch Nukleinsäuren zur Diagnose von einem Satz genetischer Parameter innerhalb des Major Histocompatibility Complexes (MHC), umfassend einen min­ destens 20 Basenpaare langen revers komplementären oder identischen Abschnitt der chemisch vorbehandelten genomi­ schen DNA gemäß SEQ ID-NO: 1 oder SEQ ID-NO: 2.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Oligo­ nukleotide zur Detektion des Cytosin-Methylierungs­ zustandes in vorbehandelter genomischer DNA, umfassend jeweils mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von mindestens 13 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt der Basensequenzen gemäß SEQ ID-NO: 1 oder SEQ ID-NO: 2 ist, der mindestens ein CpG Di­ nukleotid enthält.
Dabei ist bevorzugt, dass das Cytosin des CpG Dinukleo­ tids das 5.-9. Nukleotid vom 5'-Ende des 13 mers ist.
Weiterhin ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass für jedes der CpG Dinukleotide aus einer der SEQ ID-NO: 1 oder SEQ ID-NO: 2 ein Oligonukleotid vorhanden ist.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind PNA (Pep­ tide Nucleic Acid) Oligomere zur Detektion des Cytosin- Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter genomi­ scher DNA, umfassend mindestens eine PNA Basensequenz mit einer Länge von mindestens 9 Nukleotiden, die revers kom­ plementär oder identisch zu einem Abschnitt der Basense­ quenzen gemäß SEQ ID-NO: 1 oder SEQ ID-NO: 2 ist, der min­ destens ein CpG Dinukleotid enthält.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist hierbei, dass das Cytosin des CpG Dinukleotids das 4.-6. Nukleotid vom 5'-Ende des 9 mers ist.
Weiterhin ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass für jedes der CpG Dinukleotide aus einer Basensequenz gemäß SEQ ID- NO: 1 oder SEQ ID-NO: 2 ein Oligonukleotid vorhanden ist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Satz von Oligomersonden zur Detektion des Cytosin- Methylierungszustandes und/oder von Single Nucleotide Po­ lymorphismen in chemisch vorbehandelter genomischer DNA, umfassend mindestens 10 der erfindungsgemäßen Oligonukle­ otid oder PNA Sequenzen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine An­ ordnung von unterschiedlichen erfindungsgemäßen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomersequenzen, wobei diese an definierte Stellen einer Festphase gebunden sind. Bevor­ zugt ist dabei, dass diese auf einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters ange­ ordnet sind.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Satz von Primeroligonukleotiden umfassend mindestens zwei Oligo­ nukleotide, deren Sequenzen jeweils mindestens einem 18 Basenpaare langen Abschnitt der Basensequenzen gemäß SEQ ID-NO: 1 oder-SEQ ID-NO: 2 entsprechen oder revers komple­ mentär zu ihnen sind. Bevorzugt ist erfindungsgemäß da­ bei, dass diese kein CpG Dinukleotid enthalten. Weiterhin ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass mindestens ein Primer an eine Festphase gebunden ist.
Ein weiterer besonders bevorzugten Gegenstand der vorlie­ genden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere zur Di­ agnose von Autoimmunerkrankungen, zur Diagnose von rheu­ matischer Arthritis, zur Diagnose von Diabetes, besonders bevorzugt zur Diagnose der Diabetes vom Typ I Diabetes oder von Insulin abhängiger Diabetes mellitus (IDDM), zur Diagnose von hereditärer Hämochromatose, besonders bevor­ zugt zur Diagnose von genetischer Hämochromatose (GH) o­ der der milden Form der Hämochromatose, zur Diagnose von Schizophrenie, zur Diagnose von Multipler Sklerose, zur Diagnose von Systemischem Lupus Erythematodes, zur Diag­ nose von Sarkoidose, zur Diagnose von primärer Gallenzir­ rhose, zur Diagnose von Myositis, zur Diagnose von Psori­ asis, zur Diagnose von Nephritis, zur Diagnose von Krebs, insbesondere von Hals- oder Kopfkrebs, zur Diagnose von IgA Nephropathie, zur Diagnose von Bluthochdruck, zur Di­ agnose von Behcets Krankheit, zur Diagnose von der Gee- Heubner-Herter-Thaysen-Krankheit (Zöliakle), zur Diagnose von Myasthenia gravis, zur Diagnose von Spondylarthropathia, zur Diagnose von Tuberkulose, zur Diagnose von hypertropher Kardiomyopathie, zur Diagnose von der Base­ dow-Krankheit, zur Diagnose von juveniler rheumatischer Arthritis, zur Diagnose von Epilepsie, bevorzugt der idi­ opathischen generalisierten Epilepsie oder der juvenilen myoklonischen Epilepsie, zur Diagnose von der Takayasu- Krankheit, zur Diagnose von multiplen immunopathologi­ schen Krankheiten, zur Diagnose für die Suszeptibilität für Lepra, zur Diagnose für die Suszeptibilität für Mala­ ria und/oder zur Diagnose für die Suszeptibilität für Leishmania durch Analyse von Methylierungsmustern inner­ halb des MHC.
Ein weiterer Gegenstand ist auch die Verwendung der er­ findungsgemäßen Nukleinsäuren gemäß SEQ ID-NO: 1 oder SEQ ID-NO: 2 für die Diagnose von bedeutenden genetischen Pa­ rametern innerhalb des MHC.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Diagnose von bedeutenden genetischen Parametern innerhalb des MHC durch Analyse von Cytosin- Methylierungen in Sätzen von Oligonukleotiden oder PNA- Oligomeren nach einem der voranstehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte aus­ führt:
  • a) in einer genomischen DNA Probe wandelt man durch che­ mische Behandlung an der 5-Position unmethylierte Cyto­ sinbasen in Uracil, Thymidin oder eine andere vom Hybri­ disierungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base um;
  • b) aus dieser chemisch vorbehandelten genomischen DNA amplifiziert man Fragmente unter Verwendung von Sätzen von erfindungsgemäßen Primeroligonukleotiden und einer Polymerase;
  • c) man hybridisiert die Amplifikate an einen Satz von er­ findungsgemäßen Oligonukleotid oder PNA Sonden;
  • d) man detektiert und visualisiert die hybridisierten Amplifikate.
Bevorzugt ist erfindungsgemäß dabei, dass mehr als zehn unterschiedliche Fragmente amplifiziert werden, die 100- 2000 Basenpaare lang sind. Weiterhin ist bevorzugt, dass man die chemische Behandlung mittels einer Lösung eines Bisulfits, Hydrogensulfits oder Disulfits durchführt. Be­ sonders bevorzugt ist auch, dass die Polymerase eine hit­ zebeständige DNA-Polymerase ist.
Weiterhin ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass die Ampli­ fikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt wird. Bevorzugt ist auch, dass die an den Amplifikaten angebrachten Markierungen an jeder Position der Festphase, an der sich eine Oligonukleotidsequenz be­ findet, identifizierbar sind. Weiterhin ist besonders er­ findungsgemäß bevorzugt, dass man eine erfindungsgemäße Anordnung verwendet und dass die Festphasenoberfläche aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kup­ fer, Nickel, Silber oder Gold besteht.
Weiterhin ist bevorzugt, dass die Amplifikation von meh­ reren DNA-Abschnitten in einem Reaktionsgefäß durchge­ führt wird. Bevorzugt ist erfindungsgemäß auch, dass die Markierungen der Amplifikate Fluoreszenzmarkierungen sind. Weiterhin ist bevorzugt, dass die Markierungen der Amplifikate Radionuklide sind. Bevorzugt ist auch, dass die Markierungen der Amplifikate ablösbare Molekülfrag­ mente mit typischer Masse sind, die in einem Mas­ senspektrometer nachgewiesen werden. Besonders bevorzugt ist es erfindungsgemäß, dass die Amplifikate oder Frag­ mente der Amplifikate im Massenspektrometer nachgewiesen werden. Hierzu ist es erfindungsgemäß vorteilhaft, dass zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer die erzeugten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen.
Erfindungsgemäß ganz besonders bevorzugt ist es, dass man die Detektion mittels Matrix assistierter Laser Desorpti­ ons/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchführt und vi­ sualisiert.
Bevorzugt ist das Verfahren, wobei die genomische DNA aus einer DNA-Probe erhalten wurde, wobei Quellen für DNA z. B. Zelllinien, Biopsien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin eingebettetes Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologi­ sche Objektträger und alle möglichen Kombinationen hier­ von umfasst.
Bevorzugt ist auch ein Verfahren, zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Indi­ viduen, wobei diese nachteiligen Ereignisse mit Methylie­ rungsmustern innerhalb des MHC in Zusammenhang stehen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Ver­ wendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei man be­ deutende genetische Parameter innerhalb des MHC diagnos­ tiziert.
Schließlich ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Kit, bestehend aus einem Bisulfit enthal­ tenden Reagenz, Sätze von erfindungsgemäßen Primern zur Herstellung der erfindungsgemäßen Amplifikate, Oligo­ nukleotide und/oder PNA-Oligomere sowie eine Anleitung zur Durchführung und Auswertung eines erfindungsgemäßen Verfahrens.
Die vorliegende Erfindung beschreibt also einen Satz von mindestens 10 Oligomersonden (Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren), die zur Detektion des Cytosin- Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter genomi­ scher DNA (SEQ ID-NO: 1 oder SEQ ID-NO: 2) dienen. Mit die­ sen Sonden ist die Diagnose von genetischen und epigene­ tischen Parametern innerhalb des Major Histocompatibility Complexes (MHC) möglich. Ferner wird ein Verfahren be­ schrieben, das für die Diagnose von genetischen und epi­ genetischen Parametern innerhalb des MHC bestimmt ist.
Aus der vorgenannten chemisch vorbehandelten DNA werden mindestens 20 Basenpaare lange Abschnitte aus SEQ ID-NO: 1 oder SEQ ID-NO: 2 für die Diagnose benutzt. Als Detektoren für diese Abschnitte werden entweder revers komplementäre bzw. identische Oligonukleotide mit einer Länge von 13 Nukleotiden verwendet oder aber revers komplementäre bzw. identische PNA Oligomere mit einer Länge von 9 Nukleoti­ den.
Sowohl die Oligonukleotide als auch die PNA-Oligomere enthalten mindestens ein CpG Dinukleotid. Das Cytosin des entsprechenden CpG Dinukleotids ist vom 5'-Ende des Oli­ gonukleotids aus gesehen das 5.-9. Nukleotid. Das Cyto­ sin des CpG Dinukleotids hingegen ist vom 5'-Ende des PNA Oligomers aus betrachtet das 4.-6. Nukleotid. Entschei­ dend ist, dass im jeweiligen Satz von Oligonukleotiden oder PNA Oligomeren für jedes der CpG Dinukleotide ein Oligonukleotid aus SEQ ID-NO: 1 oder SEQ ID-NO: 2 vorhanden ist.
Wichtig ist in diesem Zusammenhang ferner, dass man zur Diagnose von genetischen Parametern innerhalb des MHC nicht einzelne CpG Dinukleotide, sondern die Mehrzahl der in den Sequenzen vorhandenen CpG Dinukleotide analysieren muss. In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens sind alle in den Sequenzen vorhandenen CpG Dinukleo­ tide zu untersuchen.
In einer bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Ver­ fahrens sind die Oligonukleotide oder PNA-Oligomere an definierten Stellen an eine Festphase gebunden.
Bevorzugt sind unterschiedliche Amplifikate auf der ebe­ nen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagona­ len Gitters angeordnet.
Die Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere werden vorzugsweise zur Diagnose von rheumatischer Arth­ ritis, Diabetes, hereditärer Hämochromatose, Schizophre­ nie, Multipler Sklerose, Systemischem Lupus Erythemato­ des, Sarkoidose, Zirrhose, Myositis, Psoriasis, Nephri­ tis, Krebs, insbesondere Hals- oder Kopfkrebs, IgA Neph­ ropathie, Bluthochdruck, Behcets Krankheit, Gee-Heubner- Herter-Thaysen-Krankheit, Myasthenia gravis, Spondy­ larthropathia, Tuberkulose, hypertropher Kardiomyopathie, Basedow-Krankheit, juveniler chronischer Arthritis, Epi­ lepsie, idiopathischer generalisierter Epilepsie oder von juveniler myoklonischer Epilepsie, der Takayasu- Krankheit, multiplen immunopathologischen Krankheiten, für die Suszeptibilität von Lepra, für die Suszeptibili­ tät von Malaria und/oder für die Suszeptibilität von Leishmania durch Analyse von Methylierungsmustern inner­ halb des MHC verwendet.
Auch die im Anhang aufgelisteten Nukleinsäuren gemäß SEQ ID-NO: 1 oder SEQ ID-NO: 2 werden vorzugsweise verwendet für die Diagnose von genetischen und epigenetischen Para­ metern innerhalb des Major Histocompatibility Complexes (MHC) verwendet.
Ferner wird ein Verfahren zur Diagnose von bedeutenden genetischen Parametern innerhalb des MHC durch Analyse von Cytosin-Methylierungen und Single Nucleotide Poly­ morphismen in genomischen DNA-Proben beschrieben. Dazu geht man in folgenden Schritten vor:
Im ersten Verfahrensschritt wird eine genomische DNA Pro­ be derart chemisch behandelt, dass an der 5'-Position un­ methylierte Cytosinbasen in Uracil, Thymin oder eine an­ dere vom Hybridisierungsverhalten her dem Cytosin unähn­ liche Base verwandelt werden.
Die zu analysierende genomische DNA wird bevorzugt aus den üblichen Quellen für DNA erhalten, wie z. B. Zellli­ nien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks- Flüssigkeit, in Paraffin einbettetes Gewebe, beispiels­ weise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prosta­ ta, Lunge, Brust oder Leber, histologische Objektträger und alle möglichen Kombinationen hiervon.
Bevorzugt wird dazu die oben beschriebene Behandlung ge­ nomischer DNA mit Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit) und anschließender alkalischer Hydrolyse verwendet, die zu einer Umwandlung nicht methylierter Cytosin-Nukleobasen in Uracil führt.
Im zweiten Verfahrensschritt werden aus der chemisch vor­ behandelten genomischen DNA Fragmente unter Verwendung von Primeroligonukleotiden amplifiziert.
Bevorzugt werden mehr als 10 unterschiedliche Fragmente amplifiziert, die 100-2000 Basenpaare lang sind.
In einer bevorzugten Variante des Verfahrens führt man die Amplifikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durch, wobei vorzugsweise eine thermostabile DNA- Polymerase verwendet wird.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass die Amplifikation von mehreren DNA-Abschnitten in einem Reaktionsgefäß durchführt wird.
In einer bevorzugten Variante des Verfahrens umfasst der Satz von Primeroligonukleotiden mindestens zwei Oligo­ nukleotide, deren Sequenzen jeweils revers komplementär oder identisch zu einem mindestens 18 Basenpaare langen Abschnitt der Basensequenzen gemäß SEQ ID-NO: 1 oder SEQ ID-NO: 2 sind. Die Primeroligonukleotide sind vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass sie kein CpG Dinukleotid enthalten.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass bei der Amplifika­ tion mindestens ein Primer an eine Festphase gebunden ist.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist ferner, dass unterschiedli­ che Oligonukleotid und/oder PNA-Oligomersequenzen auf ei­ ner ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sind.
Die Festphasenoberfläche besteht bevorzugt aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Ni­ ckel, Silber oder Gold.
Im dritten Verfahrensschritt hybridisiert man die Ampli­ fikate an einen Satz von mind. 10 Oligonukleotid oder PNA-Oligomer Sonden.
Die genannten Oligonukleotide umfassen mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von 13 Nukleotiden, die re­ vers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt der im Anhang aufgeführten Basensequenzen ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das Cytosin des CpG Dinukle­ otids ist das 5. bis 9. Nukleotid vom 5'-Ende des 13 mers aus betrachtet. Für jedes CpG Dinukleotid ist ein Oligo­ nukleotid vorhanden.
Die genannten PNA-Oligomere umfassen mindestens eine Ba­ sensequenz mit einer Länge von 9 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt der Basen­ sequenzen gemäß SEQ ID-NO: 1 oder SEQ ID-NO: 2 ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das Cytosin des CpG Dinukleotids ist das 4. bis 6. Nukleotid vom 5'-Ende des 9 mers aus gesehen. Für jedes CpG Dinukleotid ist ein Oligonukleotid vorhanden.
Im vierten Verfahrensschritt entfernt man die nicht hybridisierten Amplifikate.
Im letzten Verfahrensschritt detektiert man die hybridi­ sierten Amplifikate.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass an den Amplifika­ ten angebrachte Markierungen an jeder Position der Fest­ phase, an der sich eine Oligonukleotidsequenz befindet, identifizierbar sind.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass die Markierungen der Amplifikate Fluoreszenzmarkierungen sind.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass die Markierungen der Amplifikate Radionuklide sind.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass die Markierungen der Amplifikate ablösbare Molekülfragmente mit typischer Masse sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass die Amplifikate, Fragmente der Amplifikate oder zu den Amplifikaten kom­ plementäre Sonden im Massenspektrometer nachgewiesen wer­ den.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass zur besseren De­ tektierbarkeit im Massenspektrometer die erzeugten Frag­ mente eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass man die Detektion mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchführt und visualisiert.
Wiederum bevorzugt ist ein Verfahren zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, wobei diese nachteiligen Ereignisse mit bedeutenden genetischen Parametern innerhalb des MHC in Zusammenhang stehen.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Verwendung eines Ver­ fahrens zur Diagnose bedeutender genetischer Parameter innerhalb des MHC.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist zudem ein Kit, bestehend aus einem Bisulfit enthaltenden Reagenz, einen Satz von Primeroligonukleotiden umfassend mindestens zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils mindestens einen 18 Basenpaaren langen Abschnitt der Basensequenzen gemäß SEQ ID-NO: 1 oder SEQ ID-NO: 2 entsprechen oder zu ihnen komplementär sind zur Herstellung der Amplifikate, Oligo­ nukleotide und/oder PNA-Oligomere sowie eine Anleitung zur Durchführung und Auswertung des beschriebenen Verfah­ rens.
Das folgende Beispiel bezieht sich auf ein Fragment des Gens HLA-A, in dem eine bestimmte CG-Position auf Methy­ lierung untersucht wird.
Im ersten Schritt wird eine genomische Sequenz unter Ver­ wendung von Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit) und an­ schließender alkalischer Hydrolyse umgewandelt. Diese um­ gewandelte DNA dient dazu, methylierte Cytosine nachzu­ weisen. Im vorliegenden Fall werden die Cytosine des Gens HLA-A der Länge 3201 untersucht. Dazu wird mit den spezi­ fischen Primern TTTGGTTTTGATTTAGATTTGG und AAATAAACTCTCTAACTACTC ein definiertes Fragment der Länge 874 amplifiziert. Dieses Amplifikat dient als Probe, die an ein vorher an einer Festphase gebundenem Oligonukleo­ tid hybridisiert, beispielsweise TAGGTCGTTTATA, wobei sich das nachzuweisende Cytosin an Position 487 des Amplifikats befindet. Der Nachweis des Hybridisie­ rungsprodukts beruht auf Cy3 und Cy5 fluoreszensmarkier­ ten Primern, die für die Amplifikation verwendet wurden. Nur wenn in der Bisulfit behandelten DNA an dieser Stelle ein methyliertes Cytosin vorgelegen hat, kommt es zu ei­ ner Hybridisierungsreaktion der amplifizierten DNA mit dem Oligonukleotid. Somit entscheidet der Methylierungs­ status des jeweiligen zu untersuchenden Cytosins über das Hybridisierungsprodukt.

Claims (65)

1. Nukleinsäuren zur Diagnose von einem Satz genetischer Parameter innerhalb des Major Histocompatibility Complexes (MHC), umfassend einen mindestens 20 Basen­ paare langen revers komplementären oder identischen Abschnitt der chemisch vorbehandelten genomischen DNA gemäß SEQ ID-NO: 1 oder SEQ ID-NO: 2.
2. Oligonukleotide zur Detektion des Cytosin- Methylierungszustandes in vorbehandelter genomischer DNA, umfassend jeweils mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von mindestens 13 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt der Basensequenzen gemäß SEQ ID-NO: 1 oder SEQ ID-NO: 2 ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält.
3. Oligonukleotid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeich­ net, dass das Cytosin des CpG Dinukleotids das 5.-­ 9. Nukleotid vom 5'-Ende des 13 mers ist.
4. Satz von Oligonukleotiden nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass für jedes der CpG Dinukleotide aus einer der SEQ ID-NO: 1 oder SEQ ID-NO: 2 ein Oligo­ nukleotid vorhanden ist.
5. PNA (Peptide Nucleic Acid) Oligomere zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch vorbe­ handelter genomischer DNA, umfassend mindestens eine PNA Basensequenz mit einer Länge von mindestens 9 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt der Basensequenzen gemäß SEQ ID- NO: 1 oder SEQ ID-NO: 2 ist, der mindestens ein CpG Di­ nukleotid enthält.
6. PNA Oligomer nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Cytosin des CpG Dinukleotids das 4.-6. Nukleotid vom 5'-Ende des 9 mers ist.
7. Satz von PNA Oligomeren nach Anspruch 5, dadurch ge­ kennzeichnet, dass für jedes der CpG Dinukleotide aus einer Basensequenz gemäß SEQ ID-NO: 1 oder SEQ ID-NO: 2 ein Oligonukleotid vorhanden ist.
8. Satz von Oligomersonden zur Detektion des Cytosin- Methylierungszustandes und/oder von Single Nucleotide Polymorphismen in chemisch vorbehandelter genomischer DNA, umfassend mindestens 10 der Oligonukleotid oder PNA Sequenzen der Ansprüche 2 bis 7.
9. Anordnung von unterschiedlichen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomersequenzen nach einem der Ansprü­ che 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass diese an definierte Stellen einer Festphase gebunden sind.
10. Anordnung von unterschiedlichen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomersequenzen nach Anspruch 9, da­ durch gekennzeichnet, dass diese auf einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagona­ len Gitters angeordnet sind.
11. Satz von Primeroligonukleotiden umfassend mindestens zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils mindes­ tens einem 18 Basenpaare langen Abschnitt der Basen­ sequenzen gemäß SEQ ID-NO: 1 oder SEQ ID-NO: 2 entspre­ chen oder revers komplementär zu ihnen sind.
12. Satz von Primeroligonukleotiden nach Anspruch 11, da­ durch gekennzeichnet, dass diese kein CpG Dinukleotid enthalten.
13. Satz von Primeroligonukleotiden nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Pri­ mer an eine Festphase gebunden ist.
14. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von Autoimmunerkrankungen durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.
15. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von rheumatischer Arthritis durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.
16. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von Diabetes durch Analyse von Methylie­ rungsmustern innerhalb des MHC.
17. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach Anspruch 16, dadurch gekennzeich­ net, dass es sich bei der Diabetes um Typ I Diabetes oder um Insulin abhängige Diabetes mellitus (IDDM) handelt.
18. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von hereditärer Hämochromatose durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.
19. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach Anspruch 18, dadurch gekennzeich­ net, dass es sich bei der hereditären Hämochromatose um genetische Hämochromatose (GH) oder die milde Form der Hämochromatose handelt.
20. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von Schizophrenie durch Analyse von Methy­ lierungsmustern innerhalb des MHC.
21. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von Multipler Sklerose durch Analyse von Me­ thylierungsmustern innerhalb des MHC.
22. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von Systemischem Lupus Erythematodes durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.
23. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von Sarkoidose durch Analyse von Methylie­ rungsmustern innerhalb des MHC.
24. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von primärer Gallenzirrhose durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.
25. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von Myositis durch Analyse von Methylie­ rungsmustern innerhalb des MHC.
26. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von Psoriasis durch Analyse von Methylie­ rungsmustern innerhalb des MHC.
27. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von Nephritis durch Analyse von Methylie­ rungsmustern innerhalb des MHC.
28. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von Krebs durch Analyse von Methylierungs­ mustern innerhalb des MHC.
29. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach Anspruch 28, dadurch gekennzeich­ net, dass es sich bei den Krebsarten um Hals- oder Kopf krebs handelt.
30. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von IgA Nephropathie durch Analyse von Me­ thylierungsmustern innerhalb des MHC.
31. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von Bluthochdruck durch Analyse von Methy­ lierungsmustern innerhalb des MHC.
32. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von Behcets Krankheit durch Analyse von Me­ thylierungsmustern innerhalb des MHC.
33. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von der Gee-Heubner-Herter-Thaysen-Krankheit (Zöliakie) durch Analyse von Methylierungsmustern in­ nerhalb des MHC.
34. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von Myasthenia gravis durch Analyse von Me­ thylierungsmustern innerhalb des MHC.
35. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von Spondylarthropathia durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.
36. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von Tuberkulose durch Analyse von Methylie­ rungsmustern innerhalb des MHC.
37. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von hypertropher Kardiomyopathie durch Ana­ lyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.
38. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von der Basedow-Krankheit durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.
39. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von juveniler rheumatischer Arthritis durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.
40. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von Epilepsie durch Analyse von Methylie­ rungsmustern innerhalb des MHC.
41. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach Anspruch 40, dadurch gekennzeich­ net, dass es sich bei der Epilepsie um idiopathische generalisierte Epilepsie oder um juvenile myokloni­ sche Epilepsie handelt.
42. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von der Takayasu-Krankheit durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.
43. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von multiplen immunopathologischen Krankhei­ ten durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.
44. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose für die Suszeptibilität für Lepra durch Ana­ lyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.
45. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose für die Suszeptibilität für Malaria durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.
46. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose für die Suszeptibilität für Leishmania durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.
47. Verwendung der Nukleinsäuren gemäß Anspruch 1 für die Diagnose von bedeutenden genetischen Parametern in­ nerhalb des MHC.
48. Verfahren zur Diagnose von bedeutenden genetischen Parametern innerhalb des MHC durch Analyse von Cyto­ sin-Methylierungen in Sätzen von Oligonukleotiden o­ der PNA-Oligomeren nach einem der voranstehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte ausführt:
  • a) in einer genomischen DNA Probe wandelt man durch chemische Behandlung an der 5-Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil, Thymidin oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base um;
  • b) aus dieser chemisch vorbehandelten genomischen DNA amplifiziert man Fragmente unter Verwendung von Sät­ zen von Primeroligonukleotiden gemäss Anspruch 11 o­ der 12 und einer Polymerase;
  • c) man hybridisiert die Amplifikate an einen Satz von Oligonukleotid oder PNA Sonden der Ansprüche 2 bis 8;
  • d) man detektiert und visualisiert die hybridisierten Amplifikate.
49. Verfahren nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass mehr als zehn unterschiedliche Fragmente ampli­ fiziert werden, die 100-2000 Basenpaare lang sind.
50. Verfahren nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass man die chemische Behandlung mittels einer Lö­ sung eines Bisulfits, Hydrogensulfits oder Disulfits durchführt.
51. Verfahren nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerase eine hitzebeständige DNA- Polymerase ist.
52. Verfahren nach einem der Ansprüche 48 bis 51, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt wird.
53. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 48 bis 52, dadurch gekennzeichnet, dass die an den Amplifikaten angebrachten Markierungen an jeder Posi­ tion der Festphase, an der sich eine Oligonukleotid­ sequenz befindet, identifizierbar sind.
54. Verfahren nach Anspruche 53, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Anordnung gemäß Anspruch 9 oder 10 ver­ wendet und dass die Festphasenoberfläche aus Silizi­ um, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kup­ fer, Nickel, Silber oder Gold besteht.
55. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 48 bis 54, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikati­ on von mehreren DNA-Abschnitten in einem Reaktionsge­ fäß durchgeführt wird.
56. Verfahren nach Anspruch 53, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen der Amplifikate Fluoreszenzmar­ kierungen sind.
57. Verfahren nach Anspruch 53, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen der Amplifikate Radionuklide sind.
58. Verfahren nach Anspruch 53, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen der Amplifikate ablösbare Mole­ külfragmente mit typischer Masse sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden.
59. Verfahren nach einem der Ansprüche 48, 49 oder 53, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikate oder Fragmente der Amplifikate im Massenspektrometer nachgewiesen werden.
60. Verfahren nach Anspruch 58 oder 59, dadurch gekenn­ zeichnet, dass zur besseren Detektierbarkeit im Mas­ senspektrometer die erzeugten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen.
61. Verfahren nach einem der Ansprüche 58 bis 60, dadurch gekennzeichnet, dass man die Detektion mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Mas­ senspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchführt und visuali­ siert.
62. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche 48 bis 61, wobei die genomische DNA aus einer DNA-Probe erhalten wurde, wobei Quellen für DNA z. B. Zellli­ nien, Biopsien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn- Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin eingebettetes Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histo­ logische Objektträger und alle möglichen Kombinatio­ nen hiervon umfasst.
63. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche 48 bis 62 zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Er­ eignisse für Patienten oder Individuen, wobei diese nachteiligen Ereignisse mit Methylierungsmustern in­ nerhalb des MHC in Zusammenhang stehen.
64. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 48 bis 63, dadurch gekennzeichnet, dass man bedeutende genetische Parameter innerhalb des MHC diagnosti­ ziert.
65. Kit, bestehend aus einem Bisulfit enthaltenden Rea­ genz, Sätze von Primern gemäß Anspruch 11 oder 12 zur Herstellung der Amplifikate, Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere gemäß einem der Ansprüche 2 bis 8 sowie eine Anleitung zur Durchführung und Auswertung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 48 bis 63.
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