DE10027218A1 - Artifizielle genetische Markierung mit synthetischer DNA - Google Patents
Artifizielle genetische Markierung mit synthetischer DNAInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum (gleichzeitigen) Nachweis einer oder mehrerer in einen oder mehrere Organismen oder in eine oder mehrere Zellen fremd eingeführten Nucleinsäure(n), wobei die eingeführte(n) Nucleinsäure(n) (eine) artifizielle Sequenz(en) unfaßt/umfassen, die den Nachweis der Identität der eingeführten Nucleinsäure(n) und die selektive Vermehrung erlaubt/erlauben, umfassend die Untersuchung des Organismus/der Organismen oder der Zelle(n) auf das Vorhandensein der artifiziellen Sequenz(en), und gegebenenfalls Identifizierung der artifiziellen Sequenz(en) mittels Hybridisierung mit einem Chip und/oder Sequenzierung. Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zum Nachweis einer in einen Organismus oder eine Zelle fremd eingeführten Nucleinsäure, wobei die eingeführte Nucleinsäure mindestens eine artifizielle Sequenz umfaßt, die mit mindestens einem universellen Primer unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert, das die folgenden Schritte umfaßt: (a) Amplifikation des Bereichs der eingeführten Nucleinsäure, der sich (ai) zwischen der mindestens einen artifiziellen Sequenz und einer Sequenz in der eingeführten Nucleinsäure oder (aii) zwischen mindestens zwei artifiziellen Sequenzen befindet, oder der in (ai) oder (aii) definierten Sequenzen mittels PCR oder einer anderen Amplifikationsmethode unter Verwendung des mindestens einen universellen Primers und eines Primers, der unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit ...
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum (gleichzeitigen) Nachweis einer
oder mehrerer in einen oder mehrere Organismen oder in eine oder mehrere Zellen
fremd eingeführten Nucleinsäure(n), wobei die eingeführte(n) Nucleinsäure(n) (eine)
artifizielle Sequenz(en) umfaßt/umfassen, die den Nachweis der Identität der
eingeführten Nucleinsäure(n) und die selektive Vermehrung erlaubt/erlauben,
umfassend die Untersuchung des Organismus/der Organismen oder der Zelle(n) auf
das Vorhandensein der artifiziellen Sequenz(en), und gegebenenfalls Identifizierung
der artifiziellen Sequenz(en) mittels Hybridisierung mit einem Chip und/oder
Sequenzierung. Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zum Nachweis einer
in einen Organismus oder eine Zelle fremd eingeführten Nucleinsäure, wobei die
eingeführte Nucleinsäure mindestens eine artifizielle Sequenz umfaßt, die mit
mindestens einem universellen Primer unter stringenten Hybridisierungsbedingungen
hybridisiert, das die folgenden Schritte umfaßt: (a) Amplifikation des Bereichs der
eingeführten Nucleinsäure, der sich (ai) zwischen der mindestens einen artifiziellen
Sequenz und einer Sequenz in der eingeführten Nucleinsäure oder (aii) zwischen
mindestens zwei artifiziellen Sequenzen befindet, oder der in (ai) oder (aii)
definierten Sequenzen mittels PCR oder einer anderen Amplifikationsmethode unter
Verwendung des mindestens einen universellen Primers und eines Primers, der
unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit der Sequenz in der eingeführten
Nucleinsäure hybridisiert, oder unter Verwendung des mindestens einen universellen
Primers; und (b') Übertragung des Amplifikationsproduktes oder des codierten
Translationsproduktes auf mindestens einen Chip, auf dem sich in einem geordneten
Muster Rezeptoren befinden, die das Amplifikationsprodukt, einen Einzelstrang
davon oder das codierte Translationsprodukt spezifisch binden, und Inkubation unter
Bedingungen, die eine nachweisbare Bindung des Rezeptors an das
Amplifikationsprodukt, den Einzelstrang davon oder das codierte Translationsprodukt
erlauben; und (c') Nachweis, ob eine Bindung des Amplifikationsproduktes, des
Einzelstrangs davon oder des codierten Translationsproduktes an den Rezeptor
stattgefunden hat; und/oder (b") gegebenenfalls Spaltung der Amplifikationsprodukte
mit einem im Bereich der Primerbindungsstelle spaltenden Restriktionsenzym und
Ligation von Amplifikationsprodukten zu einem Concatemer; und/oder (c")
Sequenzierung des Amplifikationsproduktes oder des Concatemers. Schließlich
betrifft die Erfindung einen Chip, der die Durchführung der erfindungsgemäßen
Verfahren erlaubt.
DNA ist ein natürlich vorkommendes Molekül, das in der Natur als linearer
Datenträger dient. Eine Sequenzabfolge von vier Nucleotiden, umfassend die Basen
Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin, trägt die genetische Information, die in 64
verschiedenen Codontripletts 20 Aminosäuren codiert. Neben der reinen
Sequenzinformation trägt die DNA auch Strukturinformation auf der Ebene der RNA
und der colinearer Proteine. Auch die Art der Wechselwirkung der Moleküle
untereinander auf der Funktionsebene ist als Information in der DNA bereits
festgelegt.
Der Informationsgehalt der DNA wird in Organismen durch einen komplexen
enzymatischen Apparat streng konserviert und mit hoher Präzision von Generation
zu Generation weitergetragen. Die Natur erhält somit die genetische Information über
Jahrmillionen sehr stabil, aber sie räumt den Organismen aus Gründen der Evolution
eine geringe Fehlerrate ein, die zu Sequenzdivergenzen in verschiedenen Arten
führt.
Auch artfremde DNA kann durch gentechnische Methoden in Organismen
eingebracht werden, die dann in gleicher Weise stabil vererbt werden kann. Solche
gentechnisch mit zusätzlichen Funktionen ausgestattete Organismen nennt man
transgene oder gentechnisch veränderte Organismen (GVO). Artfremde DNA in
transgenen Organismen kann aus natürlichen Sequenzfolgen bestehen, die aus
Organismen isoliert werden. Natürliche Sequenzen sind durch evolutionäre Prozesse
entstandene Sequenzfolgen. Artifizielle DNA-Sequenzen können durch
Manipulationen des Organismus aus natürlichen Sequenzen abgeleitet werden durch
beispielsweise "in vitro"-Mutagenese. Auch das Bezugssystem spielt eine Rolle. Eine
natürliche DNA-Sequenz aus dem einen Organismus, in einen anderen, artfremden
Organismus gebracht, die so nicht in diesem Organismus bezüglich der Position
und/oder der Sequenz vorkommt, erzeugt eine artifizielle Gensequenz in diesem
veränderten System. Eine durch gentechnologische Methoden herbeigeführte
Veränderung der Position einer DNA-Sequenzfolge innerhalb eines Organismus und
auch innerhalb einer Art ist in strenger Definition auch artifiziell.
Die immense Anzahl der Kombinationsmöglichkeiten der vier Nucleotide in
verschiedenen Sequenzvarianten läßt Sequenzräume entstehen, die von natürlich
vorkommenden Molekülen in den Organismen nur zu einem Bruchteil realisiert
werden. Die Entwicklung der Genome mit ihrem Informationsgehalt ist daher
historisch.
DNA-Sequenzen können daher auch vollständig artifizielle Sequenzfolgen sein.
Artifizielle Sequenzfolgen findet man so in der Natur nicht und sind nicht durch
evolutionäre Prozesse entstanden. Bis zu einer bestimmten Länge kommen
bestimmte DNA-Sequenzfolgen aber auch rein statistisch gesehen in verschiedenen
Organismen vor.
Synthetische DNA kann sowohl aus natürlichen, durch evolutionäre Prozesse
entstandenen Sequenzfolgen, aus diesen abgeleiteten, durch menschlichen Einfluß
entstandenen, artifiziell modifizierten Sequenzvarianten, sowie aus vollständig
artifiziellen Sequenzfolgen bestehen. Rein artifizielle DNA-Sequenzfolgen können
nur synthetisch hergestellt werden, da es keine natürlichen Quellen für sie gibt.
Vollständig synthetische DNA beliebigen Informationsgehalts kann, wenn sie stabil in
Organismen eingebracht wird, ebenso stabil weitervererbt werden und in genetisch
veränderten bzw. modifizierten Organismen resultieren.
Funktionale, artifizielle, synthetische Sequenzfolgen können für teilweise oder
vollständig artifizielle Gene codieren, die beispielsweise funktionale RNAs (z. B.
Suppressor RNA oder Ribozyme), künstliche Epitope, affinitätsvermittelnde
Sequenzen oder enzymatische Aktivitäten in sich tragen. Die Expression der
Funktion (z. B. Epitop) in Zielzellen könnte den Nachweis der zugeordneten
artifiziellen Genmarkierung wesentlich erleichtern. Somit kann ein mit natürlichen
oder artifiziellen synthetischen Sequenzen ausgestatteter transgener Organismus
sowohl funktionale Transgene in sich tragen, als auch bloße Sequenzmarkierungen,
deren Informationsgehalt nicht in funktionstragende RNA-Moleküle und Protein
fließen muß.
Üblicherweise wird ein GVO durch die neue Genfunktion definiert, die ihm ein in der
Zelle funktionsfähiges Transgen verleiht (z. B. Herbizidresistenz). Eine artifizielle
genetische Markierung hingegen ist biologisch gesehen ein funktionsneutrales
zusätzliches Stück DNA, dessen Sequenz keine biologisch aktive Rolle spielt. Sie ist
nichts als eine artifizielle genetische Markierung, unabhängig von der Art der
Nachweisreaktion.
Die Definition eines gentechnisch veränderten Organismus (GVO) ist unabhängig
von der Funktion der genetischen Veränderung streng formal zu fassen. Ein solcher
Organismus ist genetisch verändert aber nicht notwendigerweise transgen.
Im Zeitalter der modernen Biotechnologie und Gentechnologie, in dem die
Herstellung von gentechnologisch veränderten Organismen unterschiedlichster Art
immer mehr zur Routinearbeit wird, und in dem eine industrielle Verwertung des
Nutzens dieser Organismen auf lange Sicht unumgänglich ist, besteht ein großer
Bedarf, die hergestellten Organismen bzw. eingebrachten Vektoren mittels eines
einfachen, schnellen und kostengünstigen Verfahrens eindeutig zu identifizieren bzw.
nachzuweisen. Dies setzt eine entsprechende Markierung der Organismen bzw.
Vektoren voraus.
Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem war somit,
Mittel und Wege zur Verfügung zu stellen, die diesen Bedarf befriedigen.
Dieses technische Problem wird durch die in den Ansprüchen charakterisierten
Ausführungsformen gelöst.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum (gleichzeitigen) Nachweis
einer oder mehrerer in einen oder mehrere Organismen oder in eine oder mehrere
Zellen fremd eingeführten Nucleinsäure(n), wobei die eingeführte(n) Nucleinsäure(n)
(eine) artifizielle Sequenz(en) umfaßt/umfassen, die den Nachweis der Identität der
eingeführten Nucleinsäure(n) und die selektive Vermehrung erlaubt/erlauben,
umfassend die Untersuchung des Organismus/der Organismen oder der Zelle(n) auf
das Vorhandensein der artifiziellen Sequenz(en) und gegebenenfalls Identifizierung
der artifiziellen Sequenz(en), mittels Hybridisierung mit einem Chip und/oder
Sequenzierung.
Der Begriff "fremd eingeführte Nucleinsäure, die (eine) artifizielle Sequenz(en)
umfaßt" bedeutet, daß die Nucleinsäure ausschließlich aus einer artifiziellen
Sequenz besteht, oder (eine) artifizielle Sequenz(en) zusätzlich zu weiteren
Sequenzen enthält.
Der Begriff "artifizielle Sequenz" bezeichnet im Sinne der vorliegenden Erfindung
Sequenzen, deren Nucleotidsequenz keine natürlich vorkommende
Nucleotidsequenz ist. Dieser Begriff umfaßt also auch natürlich vorkommende
Sequenzen, deren Nucleotidsequenz durch molekularbiologische Methoden
verändert wurde. Es ist natürlich auch vorstellbar, für eine genetische Markierung
artifizielle Sequenzen mit natürlich vorkommenden Sequenzen zu kombinieren (siehe
unten).
Vorzugsweise ist eine nicht natürlich vorkommende Nucleotidsequenz eine Sequenz,
die als solche oder als Teil einer längeren Sequenz in keiner Datenbank gespeichert
ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es vorteilhafterweise, mittels einer
informativen, artifiziellen genetischen Markierung (1) Organismen (z. B.
Bakterienstämme, Pflanzensorten oder Tiere, die vegetativ oder durch Klonierung
vermehrt werden können), (2) phänotypische Merkmale im Genom von Organismen,
die mit chromosomalen Bereichen korrelieren und (3) gentechnologisch hergestellte
transgene Konstrukte schnell und einfach nachzuweisen bzw. zu identifizieren.
Darüber hinaus lassen sich auch Produkte aus transgenen Organismen
identifizieren, wenn die transgenen Konstrukte entsprechend genetisch markiert sind.
Beispielsweise kann die artifizielle Sequenz so gewählt werden, daß sie ein
artifizielles, also in der Natur nicht vorkommendes Epitop codiert, das als Teil des
Translationsproduktes des Transgens exprimiert wird. Mittels entsprechender
Antikörper kann dann das Translationsprodukt und gegebenenfalls dessen Herkunft
eindeutig identifiziert werden. Eine Identifikation solcher Translationsprodukte oder
im Falle, daß das Produkt des transgenen Organismus eine RNA ist, kann natürlich
auch auf RNA-Ebene erfolgen. Hierfür können im wesentlichen Methoden verwendet
werden, die in der vorliegenden Beschreibung in Zusammenhang mit dem Nachweis
auf DNA-Ebene diskutiert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt damit, mittels artifizieller genetischer
Markierung und deren zentraler Registrierung Systematik und Transparenz in die
Vielfalt von züchtungsbedingt veränderten Organismen und gentechnologisch, mit
verschiedenen transgenen Konstrukten veränderten Organismen zu bringen. Hier
können rechtliche Fragen wie des Urheberschutzes, aber auch Fragen der
gentechnologischen Sicherheit beantwortet werden. Somit ist es einfach,
beispielsweise transgenes Material anhand einer genetischen Markierung in
Lebensmitteln nachzuweisen, insbesondere, wenn diese genetische Markierung
bereits einer Überwachungsbehörde bekannt ist.
Die artifizielle genetische Markierung von Organismen in Chromosomen und
Episomen, sowie in Organellen mittels synthetischer DNA kann, wie gesagt, überall
dort von Vorteil sein, wo man es mit rechtlichen Fragestellungen zu tun hat, die einen
sehr genauen Nachweis der Herkunft und Identität von Organismen notwendig
machen. Zum einen können in DNA verschlüsselte Urheberrechte uns sonstige
Daten als Markierungen z. B. bei bestimmten proprietären Rechtsansprüchen auf
bestimmte transgen veränderte Organismen (GVO) von großer Bedeutung sein,
wenn man wirtschaftliche Einbußen durch den Mißbrauch von Eigentumsrechten zu
befürchten hat.
Nicht transgene, stabile Sorten bei Pflanzen, (z. B. Züchtungen, Sorten, Selektionen,
die vegetativ vermehrt oder kloniert werden, wie etwa Blumenzwiebeln) sowie
verschiedene Züchtungen bei klonierbaren Tieren und Bakterienstämme sind mittels
artifiziellen genetischen Markierungen eindeutig zu identifizieren, um gegebenenfalls
Rechtsansprüche geltend zu machen.
Beispielsweise bei Fermentationsprozessen in der Herstellung von Lebensmitteln
oder in der Pharmaindustrie ist der Einsatz von genetisch artifiziell markierten
Organismen möglich. Neben vereinfachten Methoden der Stammpflege,
beispielsweise bei der präzisen Identifikation fermentativ aktiver Bakterien definierter
Eigenschaften ist es auch möglich, durch den Gebrauch von artifiziell genetisch
markierten Bakterien oder Pilzstämmen, sich Informationen über die definierte
Zusammensetzung von Mischpopulationen zu verschaffen.
In gleicher Weise ist es möglich, mittels aytifizieller genetischer Markierung
Zellpopulationen, die ex vivo zur genetischen Manipulation für Gentherapie und/oder
Immuntherapie herangezogen werden, dauerhaft zu markieren und das Schicksal
der Zellpopulationen im Organismus in vivo zu verfolgen.
Zur genetischen Differenzierung und Identifizierung von Organismen werden zum
Teil mit aufwendigen Verfahren genetische Unterschiede in der Genausstattung der
verschiedenen Organismen analysiert. Mit artifiziellen genetischen Markierungen
kann diese aufwendige Arbeit vermieden werden.
Mittels der Bioinformatik kann man zusätzlich Algorithmen anwenden, mit denen
artifizielle Sequenzen zur genetischen Markierung selektiert werden, die möglichst
kein natürliches Vorkommen haben bzw. in der Natur gar nicht bekannt sind.
Eukaryoten gehen bei der sexuellen Reproduktion durch die Meiose, wobei das
Erbgut insbesondere die Chromosomen neu verteilt und gemischt werden. Aber auch
innerhalb von Kopplungsgruppen (Chromosomen) phänotypischer Vererbung wird
Material durch Crossover neu rekombiniert. Nur wenn genetische Marker sehr nahe
bei einem Gen oder einer Gengruppe liegen, das/die phänotypischen Einflüsse auf
die Eigenschaften des Organismus hat/haben, ist die
Rekombinationswahrscheinlichkeit des genetischen Austausches von Markern mit
den verantwortlichen Genen gering genug, um die Sicherheit der Cosegregation von
Markern und Markiertem zu gewährleisten.
Artifizielle genetische Markierung mit synthetischer DNA kann bei der Identifikation
und dem Nachweis von phänotypischen Eigenschaften bei der Selektion geeigneter
Merkmalskombinationen nach sexuellen Prozessen eine Rolle spielen, sofern es
gelingt, die Markierung an entsprechenden Loci auf den Chromosomen zu
positionieren und stabil zu integrieren, beispielsweise durch "site directed in vivo
mutagenesis".
Im Umweltrecht könnte die artifizielle genetische Markierung und deren Analyse zur
Kontrolle von GVOs bei der Identifikation der Herkunft und Art von transgenem
Material nachhaltig verbessert werden.
Insbesondere ist es mit solchen Verfahren möglich, ein Maximum an Transparenz
über die Verbreitung von Transgenen zu schaffen.
Die genaue Identität und Herkunft eines Transgens und dessen Verbreitung könnte
zur Risikoabschätzung im Falle des Nachweises eines vertikalen Gentransfer eines
GVO mit Wildpopulationen oder Prozesse des horizontalen Gentransfers ermittelt
werden.
In der Regel aber wird man mit der Methode aber gerade auch den Normalfall be-
und nachweisen können. Normalerweise findet kein ungewollter Gentransfer
zwischen verschiedenen Arten statt und Transgene, wie andere Gene auch, sind
äußerst stabil und vagabundieren nicht. Bei der genetischen Manipulation in der
modernen Pflanzenzüchtung könnte man jedoch mittels des erfindungsgemäßen
Verfahrens ungewollten horizontalen Gentransfer identifizieren, vermeiden und
entsprechende Transgene eliminieren.
Bei der enzymatischen Fermentation können durch moderne molekulare
Evolutionssysteme u. a. neue Gene für enzymatische Varianten mit verbesserten
Eigenschaften entstehen. Markierte Stämme, die solche Gene in sich tragen, sind
durch artifizielle genetische Markierung leicht von Kontaminanten zu unterscheiden.
Beispielsweise könnten Transgene auf diese Art und Weise in DNA codierte
Versionsnummern bzw. Update-Nummern tragen.
Ein deutlicher Vorteil der Verwendung artifizieller genetischer Markierungen
gegenüber dem klassischen Nachweis der Identität verschiedener transgener
Genkonstrukte unterschiedlicher Herkunft bei GVOs ist die Unabhängigkeit des
Nachweises von der Art des Konstruktes. Transgene Konstrukte können bei
verschiedensten Firmen identisch bzw. sehr ähnlich sein. In diesem Fall bekommt
man keine oder nur schwer Informationen über den Urheber des Konstruktes auch
bei transparenter Firmenpolitik. Aber auch bei sehr unterschiedlichen Konstrukten
hat man u. U. keine Information über die genaue Konfiguration der beteiligten
Sequenzen. Möglicherweise versagt dabei die üblicherweise verwendete
generalisierte Nachweisreaktion für die Transgene. Darüber hinaus könnte es für
Firmen von Vorteil sein, alle Daten für die Konstruktion eines Transgens in einer
Datenbank zu hinterlegen und der Öffentlichkeit eine Identifikationsmöglichkeit des
Transgenkonstruktes durch eine artifizielle genetische Markierung zu gewährleisten,
ansonsten aber die Art des Konstruktes nicht offenzulegen.
Die Identität von Organismen ist mit Hilfe von genetischen Markierungen eindeutig
darstellbar. Quantitative Nachweisverfahren könnten auch die Gelegenheit bieten,
relative Häufigkeiten von Organismen darzustellen (z. B. Gemische verschiedener
fermentativ aktiver Bakterien in der Lebensmitteltechnologie).
Die besonderen Vorteile der artifiziellen genetischen Markierung von Transgenen
liegen also in dem direkten Zugang zur Identifikation eines Transgenkonstrukts als
solches durch eine eindeutige Möglichkeit der Zuordnung von Information zum
Konstrukt, in der Unabhängigkeit des Nachweises vom jeweiligen Transgenkonstrukt,
und in der Möglichkeit der zentralen und systematischen Erfassung und Verwaltung
von Transgenen.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind oder umfassen die artifizielle(n)
Sequenz(en) Restriktionsendonuclease-Erkennungsstellen, Transkriptions
promotersequenzen und/oder Replikationsinitatoren (ORIs).
Es können jedoch auch andere cis-aktive Elemente zur Durchführung des
erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Vorhandensein der
artifiziellen Sequenz(en) mittels PCR, LCR oder einer anderen
Amplifikationsmethode untersucht.
Methoden zum Nachweis der artifiziellen Sequenzen sind dem Fachmann bekannt
und umfassen die PCR (Polymerasekettenreaktion)-Technik, die DNA-Arraytechnik
und Sequenzierungsverfahren von DNA. Aber auch Nachweisverfahren wie
beispielsweise die "strand displacement" Amplifikation, LCR (Ligase chain reaction),
RFLP (restriction fragment length polymorphism) oder AFLP (amplified fragment
length polymorphism) in Verbindung mit optischer (z. B. Fluoreszenz,
Chemilumineszenz oder Biolumineszenz), elektrischer oder
massenspektrometrischer Detektion (MALDI-TOF) sind geeignet, die artifiziellen
Sequenzen nachzuweisen.
Für den Nachweis einer artifiziellen genetischen Markierung von Organismen mit
synthetischer DNA geht man davon aus, daß man z. B. mittels der PCR-Methode
jedes beliebige DNA-Fragment soweit vervielfältigen kann, daß es über den
Hintergrund genomischer DNA hinaus vermehrt und dadurch analysierbar wird.
Jedoch eignen sich auch lineare Amplifikationsmethoden zur Durchführung des
erfindungsgemäßen Verfahrens. Umfaßt die artifizielle Sequenz beispielsweise einen
Promotor, können gegebenenfalls nach geeigneter Linearisierung "run off"-
Transkripte erzeugt werden, deren Vorhandensein bzw. Informationsgehalt
beispielsweise mittels Hybridisierung mit einem Chip direkt nachgewiesen bzw.
analysiert werden kann.
Der Nachweis definierter DNA-Fragmente ist bei natürlich vorkommenden DNAs
(z. B. genomischer DNA) von der Lokalisation verschiedener idealer
Sequenzparameter in den natürlichen Basenabfolgen abhängig (z. B. kompatible
PCR-Primersequenzen, Restriktionsschnittstellen (Polymorphismen), LCA-
kompatible Sequenzen etc.). Bei artifiziellen, frei definierbaren Sequenzen ist dies
anders.
Die Wahl der zum Nachweis einer beliebigen, künstlich erzeugten DNA-Sequenz
notwendigen PCR-Primerpaare hat hier deutlich größere Freiheitsgrade, als in
natürlichen Sequenzen. Die Basenfolge der zu verwendenden Primersequenzen ist
frei definierbar. Die Kombination verschiedener Primersequenzen zu Primerpaaren
für die Nachweisreaktion der zwischen den Primern liegenden synthetischen
teilweise oder vollständig artifiziellen Sequenz ist ebenso frei definierbar und muß
nur funktionale Erfordernisse (z. B. Kompatibilität der Primer in der PCR-Reaktion)
erfüllen.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren,
vorzugsweise zusätzlich mit den technischen Merkmalen der vorstehend
beschriebenen ersten Ausführungsform, zum Nachweis einer in einen Organismus
oder eine Zelle fremd eingeführten Nucleinsäure, wobei die eingeführte Nucleinsäure
mindestens eine artifizielle Sequenz umfaßt, die mit mindestens einem universellen
Primer unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert, das die folgenden
Schritte umfaßt:
- a) Amplifikation des Bereichs der eingeführten Nucleinsäure, der sich
- a) zwischen der mindestens einen artifiziellen Sequenz und einer Sequenz in der eingeführten Nucleinsäure oder
- b) zwischen mindestens zwei artifiziellen Sequenzen befindet, oder der in (ai) oder (aii) definierten Sequenzen mittels PCR oder einer anderen Amplifikationsmethode unter Verwendung des mindestens einen universellen Primers und eines Primers, der unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit der Sequenz in der eingeführten Nucleinsäure hybridisiert, oder unter Verwendung des mindestens einen universellen Primers; und
- b) (b') Übertragung des Amplifikationsproduktes oder des codierten Translationsproduktes auf mindestens einen Chip, auf dem sich in einem geordneten Muster Rezeptoren befinden, die das Amplifikationsprodukt, einen Einzelstrang davon oder das codierte Translationsprodukt spezifisch binden, und Inkubation unter Bedingungen, die eine nachweisbare Bindung des Rezeptors an das Amplifikationsprodukt, den Einzelstrang davon oder das codierte Translationsprodukt erlauben; und
- c) (c') Nachweis, ob eine Bindung des Amplifikationsproduktes, des Einzelstrangs davon oder des codierten Translationsproduktes an den Rezeptor stattgefunden hat; und/oder
- d) (b") gegebenenfalls Spaltung der Amplifikationsprodukte mit einem im Bereich der Primerbindungsstelle spaltenden Restriktionsenzym und Ligation von Amplifikationsprodukten zu einem Concatemer; und/oder
- e) (c") Sequenzierung des Amplifikationsproduktes oder des Concatemers.
Der Nachweis der fremd eingeführten Nucleinsäure kann ausschließlich über die
mindestens eine artifizielle Sequenz erfolgen oder aber Sequenzen in der
eingeführten Nucleinsäure mit einbeziehen. Beispielsweise kann für die Amplifikation
der universelle Primer, der mit der mindestens einen artifiziellen Sequenz oder einem
Teil davon hybridisiert, mit einem Primer kombiniert werden, der an eine andere
artifizielle oder nicht artifizielle Sequenz in der eingeführten Nucleinsäure hybridisiert
(Fig. 1A). In diesem Fall würde die Amplifikation zu einem Amplifikationsprodukt
führen, das sowohl Sequenzen der eingeführten Nucleinsäure als auch artifizielle
Sequenzen umfaßt. Alternativ dazu kann der Nachweis der fremd eingeführten
Nucleinsäure über den mindestens einen universellen Primer erfolgen. In diesem Fall
hybridisiert der mindestens eine universelle Primer an zwei artifizielle Sequenzen
oder zwei Bereiche der artifiziellen Sequenzen oder an eine artifizielle Sequenz
innerhalb der eingeführten Nucleinsäure und an eine weitere artifizielle Sequenz oder
an Bereiche der artifiziellen Sequenzen (Fig. 1B). Die dabei entstehenden
Amplifikationsprodukte können somit ebenfalls Sequenzen der eingeführten
Nucleinsäure und artifizielle Sequenzen umfassen oder aber nur aus artifiziellen
Sequenzen bestehen. Für die Amplifikation kann ein universeller Primer verwendet
werden, der sowohl als 5'- als auch 3'-Primer dient, oder aber zwei universelle Primer
unterschiedlicher Sequenz, wobei der eine Primer als 5'-Primer und der andere
Primer als 3'-Primer dient. Vorzugsweise bestehen die Amplifikationsprodukte
ausschließlich aus artifiziellen Sequenzen. Ab einer Länge von 80 Basenpaaren
entstehen Sequenzen, die statistisch in ihrer Nucleotidsequenz auf der Erde seit ihrer
Entstehung einzigartig sind (Prof. Werner Arber, Nobelpreisträger). Somit ist/sind die
erfindungsgemäß verwendeten artifizielle(n) Sequenz(en) vorzugsweise 80
Basenpaare oder länger.
Primer, die für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet sind,
können ausschließlich aus natürlich vorkommenden Nucleotiden bestehen (d. h.
Desoxyribonucleotide und/oder Ribonucleotide), aber auch Nucleotidanaloga bzw.
modifizierte Nucleotide umfassen (Mischpolymere). Modifizierte Nucleotide sind dem
Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise 5,6-Dihydrouridin, Ribothymidin,
Inosin oder 1-Methylguanosin. Die Nucleotide der Primer müssen außerdem nicht
über Phosphodiester-Bindungen miteinander verknüpft sein, sondern können auch
über Phosphothioat- oder Methylphosphonat-Bindungen miteinander verknüpft sein.
Als Primer können auch Peptid-Nucleinsäuren (PNA) verwendet werden. Der Einsatz
solcher Primer kann der Optimierung von Hybridisierungsbedingungen, Stringenz,
Hybridisierungskinetik, Spezifität, Selektivität, und Hybridisierungseffizienz dienen.
Das Prinzip der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist dem Fachmann bekannt. Dem
Fachmann ist somit klar, daß Primerpaare, die in der vorliegenden Beschreibung als
PCR-Amplifikations-tauglich offenbart sind, aus einem Primer bestehen, der an einen
DNA-Strang hybridisiert, und einem weiteren Primer, der an den komplementären
DNA-Strang hybridisiert.
Der Begriff "universeller Primer" bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung, daß
dieser bzw. die artifizielle Sequenz oder der Bereich davon, an den dieser Primer
hybridisiert, so konzipiert ist, daß er generell den Nachweis der fremd eingeführten
Nucleinsäure erlaubt und zwar unabhängig von der Art und Funktion der
eingeführten Nucleinsäure. Mit anderen Worten, dieser Primer dient dazu, die Frage
zu beantworten, ob beispielsweise in einem bestimmten Lebensmittel transgenes
Material enthalten ist.
Stringente Hybridisierungsbedingungen sind dem Fachmann bekannt und können in
Abhängigkeit von beispielsweise der Länge des zu verwendenden Primers oder der
Sonde einfach bestimmt werden (siehe, z. B., Sambrook et al., Molecular Cloning, a
Laboratory Manual, 2nd edition (1989), CSH Press, Cold Spring Harbor, N.Y.;
Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates
and Wiley Interscience, N.Y. (1989) oder Higgins and Hames, Nucleic Acid
Hybridization, a Practical Approach, IRL Press Oxford, Washington DC (1985)).
Stingente Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise Hybridisierung in 6 ×
SSC und 0,1% SDS bei 65°C oder in 50% Formamid und 4 × SSC bei 42°C und
anschließendes Waschen in 0,1 × SSC und 0,1% SDS bei 65°C. Unstringente
Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise Hybridisierung und anschließendes
Waschen in 4 × SSC und 1% SDS bei 50°C.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält
die eingeführte Nucleinsäure mindestens eine weitere artifizielle Sequenz, die mit
mindestens einem speziellen Primer unter stringenten Hybridisierungsbedingungen
hybridisiert, wobei der mindestens eine spezielle Primer mit einem weiteren Primer,
der unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer weiteren Sequenz in der
eingeführten Nucleinsäure hybridisiert, oder mit einem weiteren speziellen Primer,
der unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer weiteren artifiziellen
Sequenz hybridisiert, die Amplifikation eines Bereiches der eingeführten
Nucleinsäure erlaubt, der die mindestens eine artifizielle Sequenz umfaßt.
Somit sind die weiteren artifiziellen Sequenzen, an die die speziellen Primer
hybridisieren, auf dem entsprechenden DNA-Strang immer 5'-seitig zu den
artifiziellen Sequenzen angeordnet, an die die universellen Primer hybridisieren.
Der Begriff "spezielle Primer" bedeutet im Sinne der vorliegende Erfindung, daß ein
Nachweis einer fremd eingeführten Nucleinsäure mittels dieser Primer spezifisch für
die Art und/oder Funktion der eingeführten Nucleinsäure ist. Mit anderen Worten, im
Gegensatz zu dem universellen Primer, der generell den Nachweis aller auf diese
Weise markierten Transgene erlaubt, dient der spezielle Primer dazu, entweder ein
spezifisches transgenes Konstrukt oder eine Gruppe von transgenen Konstrukten,
die beispielsweise von einer bestimmten Firma (Urheber) hergestellt wurden,
nachzuweisen.
Beim Nachweis des Urheberrechts beispielsweise an einem Transgen und der
Möglichkeit des Nachweises von verschiedenen Transgenen im Umweltrecht liegen
unterschiedliche Bedürfnisse der Anwender der Methode zugrunde.
Während spezielle, also individuelle urheberspezifische Primerpaare alle
Transgenkonstrukte eines bestimmten Urhebers aus der Gesamtheit aller Urheber zu
amplifizieren vermögen, ist der Zweck von universellen Primerpaaren der, allen
Kontrollinstanzen bekannt zu sein, so daß unabhängig vom jeweiligen Urheber alle
Transgenkonstrukte amplifiziert werden können. Spezielle Primerpaare können wenn
gewünscht von den Urhebern geheim gehalten werden.
Verschiedene Primerpaare kann man um die jeweilige Markierung herumschachteln
(Fig. 2). Da mittels der universellen Primer die 5'-flankierenden speziellen
Primersequenzen experimentell ermittelt werden können, ist es in dieser
Ausführungsform besonders wichtig, daß die Zuordnung zu individuellen Firmen nur
den Kontrollbehörden bekannt ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die mindestens zwei
Sequenzen und/oder die mindestens zwei weiteren Sequenzen räumlich
voneinander getrennt.
Diese Ausführungsform ermöglicht es vorteilhafterweise, beispielsweise mittels PCR
größere Sequenzabschnitte zu amplifizieren, in denen umfangreichere Informationen
gespeichert werden können.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die in Schritt (c) erfaßten
Daten in digitalisierter Form gespeichert.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Speicherung in einem
Zentralspeicher.
Diese Ausführungsform erlaubt es, artifizielle genetische Markierungen von Zellen
und Lebewesen zum Zwecke der Transparenz und Überwachung zentral zu erfassen
und gentechnologische Daten weltweit und in einem einheitlichen System zur
Markierung und Verwaltung von Transgenen zu speichern.
Durch die Speicherung aller verfügbarer Daten registrierter Transgene ermöglicht der
Zentralspeicher eine leichte Kontrolle über Bestand, Art und Urheber von
Transgenen. In einem "trust center" könnten alle Daten verwaltet werden.
Der Gesetzgeber kann dafür sorgen, daß Transgene nur dann rechtlich zulässig sind
und folgend konstruiert und in den Verkehr gebracht werden dürfen, wenn sie
registriert worden sind und deren Identität durch eine eindeutige artifizielle
genetische Markierung beweisbar ist. Die Herkunft des Genkonstruktes (Urheber),
die Art des Konstruktes (die verwendeten Gensequenzen), das Datum der
Registrierung, der Organismus, in den das Genkonstrukt eingebracht wurden, etc.,
d. h. alle Daten das Transgen betreffend, müssen nachvollziehbar sein.
Die ZKBS (= zentrale Kommission für biologische Sicherheit in Deutschland) könnte
dem Gesetzgeber einen solchen Vorschlag unterbreiten, der dann auch europaweit
und weltweit umgesetzt werden kann.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
codiert die eingeführte Nucleinsäure ein (Poly)peptid.
Der Begriff "(Poly)peptid" umfaßt im Sinne der vorliegenden Erfindung sowohl
Polypeptide oder Proteine, die eine Länge von ungefähr 50 bis mehreren hundert
Aminosäuren aufweisen, als auch Peptide, die eine Länge von ungefähr 5 bis 50
Aminosäuren aufweisen. Die Peptide sind vorzugsweise artifizielle Peptide, also nicht
natürlich vorkommende Peptide, die beispielsweise artifizielle Epitope darstellen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das (Poly)peptid ein
Fusionsprotein.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform ist die eingeführte
Nucleinsäure ein Transgen oder eine artifizielle Sequenz.
Ist die eingeführte Nukleinsäure ein Transgen, so erlaubt, wie vorstehend diskutiert,
die artifizielle Sequenz vorteilhafterweise einen schnellen und einfachen Nachweis
des Vorhandenseins des Transgens in einer Probe. Darüber hinaus kann die
artifizielle Sequenz auch dem Urheber dienen, das Transgen als ein von ihm
entwickeltes und hergestelltes Transgen zu identifizieren.
Besteht die eingeführte Nukleinsäure ausschließlich aus einer artifiziellen Sequenz,
so erlaubt sie, wie ebenfalls oben diskutiert, beispielsweise Organismen und/oder
phänotypische Merkmale im Genom eines Organismus zu identifizieren bzw.
nachzuweisen.
In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens ist oder enthält die eingeführte Nucleinsäure einen Erkennungscode.
Der Erkennungscode kann eine kombinatorische Codierung darstellen oder einen
chiffrierten Text enthalten, d. h. einen Text, der in eine Nucleinsäuresequenz
übersetzt ist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Erkennungscode
verschlüsselt.
Eine genetische Markierung von Organismen mittels einer verschlüsselten Nachricht
in DNA-Molekülen kann von einer autorisierten Person durch verschiedene
Techniken oder Kombinationen aus diesen heutzutage leicht nachgewiesen und
auch leicht dechiffriert werden, wenn der entsprechende Dechiffrierungsschlüssel
bekannt ist.
In der von Primerpaaren eingeschlossenen Sequenz liegt ein beträchtliches
Kodierungspotential für Information, das nur begrenzt ist durch das
Leistungsvermögen der PCR-Reaktion, genügend amplifiziertes Material
entsprechender Länge für die Nachweisreaktion zu liefern. Üblicherweise würde man
ca. 50 bp bis ca. 1000 bp Kodierungskapazität annehmen. Man könnte sich aber bei
Bedarf durchaus wesentlich längere Sequenzen vorstellen. Wie erwähnt kann in
einer artifiziellen, synthetischen DNA-Sequenz Informationen gespeichert werden wie
beispielsweise der Namen der/des Urhebers der GVOs, das Datum der
Urheberschaft, die Variante des artifiziell genetisch markierten Organismus oder die
Variante des Transgens oder beides, der Code der Urheberrechte (z. B.
Patennummer) und/oder Verweise auf die Dokumentation des Organismus,
beispielsweise eine Webseite, Datenbank oder eine Publikation.
In der ersten Stufe eines zweistufigen Systems zur Verschlüsselung von
Urheberdaten in einem DNA-Code zur artifiziellen genetischen Markierung von
Organismen bekommt der Urheber der Sequenz Primerpaare zur Amplifikation der
eingeschlossenen artifiziellen Sequenz zugeordnet, deren Identität nur er kennt.
Für diese Primerpaare kann er nun in einer zweiten Stufe die zwischen den Primern
liegende DNA-Sequenz mit Informationen füllen, die (a) nur einen Erkennungscode
(Signatur) darstellt oder (b) eine direkt in DNA codierte Information trägt oder (c) eine
Information trägt, die zusätzlich noch kryptographisch verschlüsselt ist, so daß ein
Interessierter auch dann die Daten nicht lesen und identifizieren kann, wenn er die
Primer zur Amplifikation des entsprechenden PCR-Fragmentes besitzt und den
Primärcode (b) kennt, mit dem alphanumerische Zeichen in DNA codierte Information
umgesetzt werden kann.
Für eine Biotechnologiefirma könnte es durchaus interessant sein, die Daten eines
Transgens oder eines Organismus für Dritte zunächst nicht detailliert identifizierbar
zu machen. Die Überwachungsbehörde möchte aber möglichst einfach transgenes
Material verschiedener Herkunft nachweisen können.
Diese Firma könnte aber ein Interesse daran haben, den Nachweis durch Dritte (z. B.
die Überwachungsbehörde) zuzulassen, daß der GVO in seiner Eigenschaft
genetisch verändert zu sein identifiziert wird. Weitergehende Informationen, die die
genaue Identität des transgenen Organismus betreffen können aber nur dann
erhoben werden, wenn dieser Nachweis durch sie genehmigt wird. Die Firma würde
einer Überwachungsbehörde in diesem Fall die PCR-Primer zur Identifikation zur
Verfügung stellen, mit der das genetisch markierende DNA-Fragment als solches
z. B. mittels Arraytechnologien nachgewiesen werden kann. Die
Überwachungsbehörde stellt somit die Ebene der zentralen Erfassung dar, deren
Aufgabe es ist, transgenes Material zu kontrollieren und zu identifizieren. Die genaue
Identität des Organismus aber und weitergehende Informationen über diesen
Organismus würden weiter chiffriert in der Hand der Firma bleiben, oder wären nur
zugänglich über ein zentrales Datenbankregister. D. h. der Urheber stellt die Ebene
der dezentralen Erfassung dar. Mittels der weitergehenden Informationen kann er
überprüfen, ob Dritte sein Material benutzen.
Die Informationsdichte von Arraytechnologien ist so groß, daß sehr viele zentral
erfaßte, artifizielle genetische Markierungen auf einem Träger zum Nachweis der
korrespondierenden Transgenkonstrukte abgebildet werden können. Zum Nachweis
individueller detaillierter Informationen kann eine codierende Sequenz dann auch
sequenziert, decodiert und gegebenenfalls dechiffriert werden.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die Verschlüsselung eine
kryptographische Verschlüsselung.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist der Rezeptor ein Protein, vorzugsweise ein Glycoprotein, eine spezifisch bindende
RNA oder ein Peptid, vorzugsweise ein artifizielles Peptid oder ein Antikörper, ein
Derivat oder Fragment davon.
Geeignete Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein. Fragmente bzw.
Derivate von Antikörpern sowie Verfahren zu deren Herstellung sind dem Fachmann
bekannt. Antikörperfragmente umfassen beispielsweise Fab-, F(ab)2-, Fv-, Fd- oder dAb-
Fragmente. Antikörperderivate umfassen beispielsweise scFv.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bindet der Antikörper, das Derivat
oder das Fragment davon doppelsträngige DNA sequenzspezifisch.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist der Rezeptor eine Einzelstrang-DNA.
Die Länge der Einzelstrang-DNA kann variieren, solange sie eine spezifische
Hybridisierung mit zu untersuchenden Nucleinsäuren erlaubt. D. h. die Einzelstrang-
DNA kann ein Oligonucleotid mit einer Länge von ungefähr 12 bis 30 Nucleotiden
oder ein Polynucleotid mit einer Länge von ungefähr 30 bis mehreren hundert
Nucleotiden sein. Der Begriff "spezifisch hybridisieren" bedeutet dabei, daß unter
stringenten Hybridisierungsbedingungen (siehe oben) nur Nucleinsäuremoleküle
miteinander hybridisieren, die eine komplementäre Nucleotidsequenz aufweisen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform befindet sich auf dem Chip in jeder
Position des geordneten Musters ein Rezeptor mit einer anderen Bindungsspezifität.
Es ist jedoch auch vorstellbar, daß sich an mehreren Positionen des Chips
Rezeptoren mit der gleichen Bindungspezifität befinden.
In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens werden vor den Schritten (a), (b") und (c") folgende Schritte durchgeführt:
- a) Spaltung der eingeführten Nucleinsäuren, die zuvor mit einem Sequenz-Tag versehen wurden, mit einem Restriktionsenzym, das nicht im Tag schneidet;
- b) Isolierung der mit dem Tag versehenen Spaltprodukte;
- c) hälftige Teilung der Spaltprodukte und Ligation der Hälften mit verschiedenen Linkern;
- d) Spaltung des Ligationsproduktes aus (iii) mit einem Typ II Restriktionsenzym, das die Bindungsstelle in den Linkern aufweist und in den eingeführten Nucleinsäuren spaltet, so daß ein Bereich der eingeführten Nucleinsäuren mit dem Linker verbunden bleibt; und
- e) head-to-tail-Ligation der eingeführten Nucleinsäuren.
Geeignete Tags sind Affinitäts-Tags, die die Isolierung der Spaltprodukte erlauben.
Das in Schritt (i) verwendete Restriktionsenzym besitzt eine Erkennungssequenz von
vorzugsweise 7, 6 oder 4 Nucleotiden.
Die von Velculescu et al. (Science 270 (1995), 484-487) beschriebene SAGE-
Technik eignet sich besonders als Nachweismethode für das erfindungsgemäße
Verfahren, da sie einen effizienten und gleichzeitigen Nachweis einer großen Anzahl
von Transgenkonstrukten erlaubt. Der Nachweis mittels Chip-Technologie hingegen
erlaubt nur einen qualitativen bzw. semiquantitativen Nachweis von Transgenen. Da
die SAGE-Technologie einen quantitativen Nachweis erlaubt, ist sie bei
entsprechenden Fragestellungen somit auch besonders als zusätzliche
Nachweismethode geeignet.
In dieser Ausführungsform erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren nicht nur einen
qualitativen Nachweis von Transgenen, d. h. die Beantwortung der Frage, ob, und
wenn ja, welche Transgene welcher Firma in einer Probe vorhanden sind, sondern
auch einen quantitativen Nachweis, d. h. die Beantwortung der Frage, wieviele
Transgene einer Firma in einer Probe vorhanden sind. Mittels des Sequenz-Tags
kann auch die Transkriptionsaktivität der Transgene auf RNA-Ebene analysiert
werden. Dazu wird die RNA mittels eines Primers, der an den Sequenz-Tag
hybridisiert, revers transkribiert. Die RNA ist dann entsprechend ihrer Häufigkeit in
dem Concatemer vorhanden.
Die Erfindung betrifft auch eine Sequenzierstation und geeignete Software, die die
Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erlauben.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die eingeführten
Nucleinsäuren Doppelstrang-cDNAs, und vor Schritt (i) wird folgender Schritt
durchgeführt: Generierung von Doppelstrang-cDNA aus mRNA des Organismus oder
der Zelle unter Verwendung eines mit einem Sequenz-Tag versehenen 3'-Primers.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
werden vor den Schritten (a), (b") und (c") folgende Schritte durchgeführt:
- a) Generierung von Doppelstrang-cDNA aus mRNA des Organismus oder der Zelle unter Verwendung eines mit einem Tag versehenen 3'-Primers;
- b) Spaltung der cDNA mit einem Restriktionsenzym, das nicht im Tag schneidet; (iii) Isolierung der mit dem Tag versehenen Spaltprodukte;
- c) hälftige Teilung der Spaltprodukte und Ligation der Hälften mit verschiedenen Linkern;
- d) Spaltung des Ligationsproduktes aus (iv) mit einem Typ II Restriktionsenzym, das die Bindungsstelle in den Linkern aufweist und in der cDNA spaltet, so daß ein Bereich der cDNA mit dem Linker verbunden bleiben; und
- e) head-to-tail-Ligation der cDNA-Fragmente.
Das in Schritt (ii) verwendete Restriktionsenzym besitzt eine Erkennungssequenz
von vorzugsweise 7, 6 oder 4 Nucleotiden.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform ist der 3'-Primer ein oligo
dT-Primer, ein universeller oder ein spezieller Primer.
Analog zu dem oben erwähnten Primer, der an den Sequenz-Tag bindet, eignen sich
diese Primer auch dazu, Aussagen über die Transkriptionsaktivität des
entsprechenden Transgens zu machen.
In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Tag Biotin oder
Digoxygenin.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignen sich jedoch auch
andere affinitätsvermittelnde Agenzien, die Polymerase-kompatibel sind.
In einer zusätzlichen besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt der
obengenannte Bereich 8 bis 20 Nucleotide.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform umfaßt der obengenannte
Bereich 9 bis 14 Nucleotide.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung einen Chip wie vorstehend definiert.
Mittels der auf dem Chip befindlichen Rezeptoren, die jeweils spezifisch für ein
Unternehmen sind, eignet sich der erfindungsgemäße Chip vorteilhafterweise, in
einem Arbeitsschritt zu analysieren, von welchem oder welchen von hunderten von
Unternehmen Transgene in einem Produkt enthalten sind. Aufgrund der hohen
Kapazität ist es vorstellbar, daß auf dem erfindungsgemäßen Chip alle weltweit
existierenden Unternehmen, die in dieser Branche tätig sind, über ihren individuellen
Rezeptor repräsentiert sind.
Die Figuren zeigen:
Fig. 1 Schematische Darstellung der Möglichkeiten, wie artifizielle Sequenzen
amplifiziert werden können. = fremd eingeführte
Nucleinsäure. = artifizielle Sequenz. = Primer,
der in der fremd eingeführten Nucleinsäure hybridisiert. =
universeller Primer, der an die artifizielle Sequenz hybridisiert.
Fig. 2 Schematische Darstellung, wie verschiedene Primerpaare um eine
genetische Markierung herum angeordnet sein können. P1 und P1' sind
universelle Primer. P2. . .Pn und P2'. . .Pn' stellen spezielle Primer dar.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Die genetische Markierung soll den Namen des Urhebers des GVOs, das Datum der
Urheberschaft, die Bezeichnung der Variante des artifiziell genetisch markierten
Organismus, die Bezeichnung der Variante des Transgens, die
Patentanmeldungsnummer und Verweise auf die Dokumentation des Organismus
enthalten. Die zu chiffrierende und codierende Information ist also beispielsweise:
Xgen AG, 12. 02. 1995, Zea mays 1234, Konstrukt 123456/99,
PCT/EP99/12345, www.Xgen-AG.com/transparency
Diese Information wird mittels eines kryptographischen Verfahrens chiffriert und
anschließend mittels eines Quadruplettcodes in DNA codiert:
ATGATATTGCCGTCTGTGCAACGATGAAACCCAGGATTAGATGATCCAGATCAG TGATFCATGATGATCCACCACAGTGGGTGAGTTACCCACAGATTATTAACCACC CACATTGATGATGATTTTAAAGAGAGACATGAGAGAGACATCATGATCAGATGTT GATGTCACCAGTGATGCAGACGCAGTGATGACGACGACTGATGACGATGGAAA AGTAGATGACAGATGATCAGATGATGACACACGTAAAAAGATGAAAGTTTAGGA CCCAGATGAGGGATGGAGTAGCCACATGAT. . .
ATGATATTGCCGTCTGTGCAACGATGAAACCCAGGATTAGATGATCCAGATCAG TGATFCATGATGATCCACCACAGTGGGTGAGTTACCCACAGATTATTAACCACC CACATTGATGATGATTTTAAAGAGAGACATGAGAGAGACATCATGATCAGATGTT GATGTCACCAGTGATGCAGACGCAGTGATGACGACGACTGATGACGATGGAAA AGTAGATGACAGATGATCAGATGATGACACACGTAAAAAGATGAAAGTTTAGGA CCCAGATGAGGGATGGAGTAGCCACATGAT. . .
Auf dem Markt erhältliche Maiskörner lassen sich wie folgt auf Vorhandensein der
artifiziellen genetischen Markierung untersuchen: Zwei Primer, die an die obigen
unterstrichenen Sequenzen bzw. komplementären Sequenzen in gegenläufigem
Sinne hybridisieren werden an aus den Maiskörnern isolierte DNA hybridisiert.
Anschließend wird eine PCR durchgeführt. Die PCR-Bedingungen wie z. B.
Hybridisierungs-Zeit und -Temperatur, Elongationszeit, etc. hängen von dem
verwendeten Primer und dem zu amplifizierenden DNA-Fragment ab und können
ohne weiteres vom Fachmann bestimmt werden (siehe Sambrook et al. und Ausubel
et al., Ios. cit.). Die Amplifikationsprodukte werden aufgeschmolzen und die
Einzelstränge werden auf einen Chip übertragen, der mit 6144 unterschiedlichen
Einzelstrang-DNAs bestückt ist und zwar unter Bedingungen, die eine Hybridisierung
erlauben. Diese Bedingungen hängen von den zu hybridisierenden DNA-
Einzelsträngen ab und können ebenfalls vom Fachmann bestimmt werden (siehe
Sambrook et al. und Ausubel et al., loc. cit.). Der Nachweis des Vorhandenseins
obiger Sequenz in den Maiskörnern wird durch Bindung eines Peroxidase-markierten
anti-ds DNA spezifischen monoklonalen Antikörper nachgewiesen.
Claims (25)
1. Verfahren zum (gleichzeitigen) Nachweis einer oder mehrerer in einen oder
mehrere Organismen oder in eine oder mehrere Zellen fremd eingeführten
Nucleinsäure(n), wobei die eingeführte(n) Nucleinsäure(n) (eine) artifizielle
Sequenz(en) umfaßt/umfassen, die den Nachweis der Identität der
eingeführten Nucleinsäure(n) und die selektive Vermehrung erlaubt/erlauben,
umfassend die Untersuchung des Organismus/der Organismen oder der
Zelle(n) auf das Vorhandensein der artifiziellen Sequenz(en) und
gegebenenfalls Identifizierung der artifiziellen Sequenz(en), mittels
Hybridisierung mit einem Chip und/oder Sequenzierung.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die artifizielle(n) Sequenz(en)
Restriktionsendonuclease-Erkennungsstellen, Transkriptionspromotersequen
zen und/oder Replikationsinitiatoren (ORIs) sind oder umfassen.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Vorhandensein der artifiziellen
Sequenz(en) mittels PCR, LCR oder einer anderen Amplifikationsmethode
untersucht wird.
4. Verfahren, vorzugsweise nach Anspruch 1, zum Nachweis einer in einen
Organismus oder eine Zelle fremd eingeführten Nucleinsäure, wobei die
eingeführte Nucleinsäure mindestens eine artifizielle Sequenz umfaßt, die mit
mindestens einem universellen Primer unter stringenten
Hybridisierungsbedingungen hybridisiert, das die folgenden Schritte umfaßt:
- a) Amplifikation des Bereichs der eingeführten Nucleinsäure, der sich
- a) zwischen der mindestens einen artifiziellen Sequenz und einer Sequenz in der eingeführten Nucleinsäure oder
- b) zwischen mindestens zwei artifiziellen Sequenzen befindet, oder der in (ai) oder (aii) definierten Sequenzen mittels PCR oder einer anderen Amplifikationsmethode unter Verwendung des mindestens einen universellen Primers und eines Primers, der unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit der Sequenz in der eingeführten Nucleinsäure hybridisiert, oder unter Verwendung des mindestens einen universellen Primers; und
- b) (b') Übertragung des Amplifikationsproduktes oder des codierten Transiationsproduktes auf mindestens einen Chip, auf dem sich in einem geordneten Muster Rezeptoren befinden, die das Amplifikationsprodukt, einen Einzelstrang davon oder das codierte Translationsprodukt spezifisch binden, und Inkubation unter Bedingungen, die eine nachweisbare Bindung des Rezeptors an das Amplifikationsprodukt, den Einzelstrang davon oder das codierte Translationsprodukt erlauben; und
- c) (c') Nachweis, ob eine Bindung des Amplifikationsproduktes, des Einzelstrangs davon oder des codierten Translationsproduktes an den Rezeptor stattgefunden hat; und/oder
- d) (b") gegebenenfalls Spaltung der Amplifikationsprodukte mit einem im Bereich der Primerbindungsstelle spaltenden Restriktionsenzym und Ligation von Amplifikationsprodukten zu einem Concatemer; und/oder
- e) (c") Sequenzierung des Amplifikationsproduktes oder des Concatemers.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die eingeführte Nucleinsäure mindestens
eine weitere artifizielle Sequenz enthält, die mit mindestens einem speziellen
Primer unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert, wobei der
mindestens eine spezielle Primer mit einem weiteren Primer, der unter
stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer weiteren Sequenz in der
eingeführten Nucleinsäure hybridisiert, oder mit einem weiteren speziellen
Primer, der unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer weiteren
artifiziellen Sequenz hybridisiert, die Amplifikation eines Bereiches der
eingeführten Nucleinsäure erlaubt, der die mindestens eine artifizielle Sequenz
umfaßt.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei die mindestens zwei Sequenzen
und/oder die mindestens zwei weiteren Sequenzen räumlich voneinander
getrennt sind.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei die in Schritt (c) erfaßten
Daten in digitalisierter Form gespeichert werden.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Speicherung in einem Zentralspeicher
erfolgt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die eingeführte
Nucleinsäure ein (Poly)peptid codiert.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das (Poly)peptid ein Fusionsprotein ist.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei die eingeführte Nucleinsäure ein
Transgen oder eine artifizielle Sequenz ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die eingeführte
Nucleinsäure ein Erkennungscode ist oder enthält.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Erkennungscode verschlüsselt ist.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Verschlüsselung eine
kryptographische Verschlüsselung ist.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 14, wobei der Rezeptor ein
Protein, vorzugsweise ein Glycoprotein, eine spezifisch bindende RNA oder
ein Peptid, oder ein Antikörper, ein Derivat oder Fragment davon.
16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Antikörper, das Derivat oder das
Fragment davon doppelsträngige DNA sequenzspezifisch bindet.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 14, wobei der Rezeptor eine
Einzelstrang-DNA ist.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 17, wobei sich auf dem Chip in
jeder Position des geordneten Musters ein Rezeptor mit einer anderen
Bindungsspezifität befindet.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 14, wobei vor den Schritten (a),
(b") und (c") folgende Schritte durchgeführt werden:
- a) Spaltung der eingeführten Nucleinsäuren, die zuvor mit einem Sequenz-Tag versehen wurden, mit einem Restriktionsenzym;
- b) Isolierung der mit dem Tag versehenen Spaltprodukte;
- c) hälftige Teilung der Spaltprodukte und Ligation der Hälften mit verschiedenen Linkern;
- d) Spaltung des Ligationsproduktes aus (iii) mit einem Typ II Restriktionsenzym, das die Bindungsstelle in den Linkern aufweist und in den eingeführten Nucleinsäuren spaltet, so daß ein Bereich der eingeführten Nucleinsäuren mit dem Linker verbunden bleibt; und
- e) head-to-tail-Ligation der eingeführten Nucleinsäuren.
20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die eingeführten Nucleinsäuren
Doppelstrang-cDNAs sind, und vor Schritt (i) folgender Schritt durchgeführt
wird: Generierung von Doppelstrang-cDNA aus mRNA des Organismus oder
der Zelle unter Verwendung eines mit einem Sequenz-Tag versehenen 3'-
Primers.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 14, wobei vor den Schritten (a),
(b") und (c") folgende Schritte durchgeführt werden:
- a) Generierung von Doppelstrang-cDNA aus mRNA des Organismus oder der Zelle unter Verwendung eines mit einem Tag versehenen 3'- Primers;
- b) Spaltung der cDNA mit einem Restriktionsenzym;
- c) Isolierung der mit dem Tag versehenen Spaltprodukte;
- d) hälftige Teilung der Spaltprodukte und Ligation der Hälften mit verschiedenen Linkern;
- e) Spaltung des Ligationsproduktes aus (iv) mit einem Typ II Restriktionsenzym, das die Bindungsstelle in den Linkern aufweist und in der cDNA spaltet, so daß ein Bereich der cDNA mit dem Linker verbunden bleiben; und
- f) head-to-tail-Ligation der cDNA-Fragmente.
22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, wobei der 3'-Primer ein oligo-dT-Primer,
ein universeller oder ein spezieller Primer ist.
23. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, wobei der Tag Biotin oder Digoxygenin
ist.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 23, wobei der Bereich 8 bis 20
Nucleotide umfaßt.
25. Chip wie in einem der Ansprüche 1 oder 15 bis 18 definiert.
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100370035C (zh) * | 2005-09-08 | 2008-02-20 | 中国疾病预防控制中心营养与食品安全所 | 转基因农产品dna检测芯片及其制备方法和应用 |
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Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5429952A (en) * | 1988-02-02 | 1995-07-04 | Biocode, Inc. | Marking of products to establish identity and source |
| US5846719A (en) * | 1994-10-13 | 1998-12-08 | Lynx Therapeutics, Inc. | Oligonucleotide tags for sorting and identification |
| US5866330A (en) * | 1995-09-12 | 1999-02-02 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Method for serial analysis of gene expression |
| AU8139698A (en) * | 1997-06-05 | 1998-12-21 | Cellstore | Methods and reagents for indexing and encoding nucleic acids |
| WO1999055886A1 (en) * | 1998-04-24 | 1999-11-04 | Genova Pharmaceuticals Corporation | Function-based gene discovery |
-
2000
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-
2001
- 2001-05-31 AU AU2001270545A patent/AU2001270545A1/en not_active Abandoned
- 2001-05-31 WO PCT/EP2001/006198 patent/WO2001098533A2/de not_active Application Discontinuation
- 2001-05-31 EP EP01949371A patent/EP1315834A2/de not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004101819A1 (de) * | 2003-05-13 | 2004-11-25 | Universität Potsdam | Verfahren zur identifizierung von zellinien |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| EP1315834A2 (de) | 2003-06-04 |
| AU2001270545A1 (en) | 2002-01-02 |
| WO2001098533A9 (de) | 2002-09-19 |
| WO2001098533A3 (de) | 2003-04-10 |
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