DE10025920A1 - Verfahren und Mittel zur Behandlung von Immunreaktionen am Auge - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Mittel und ein Verfahren zur gentherapeutischen Behandlung von Hornhauterkrankungen des menschlichen oder tierischen Auges zur Unterdrückung der Transplantationsabstoßung. Es besteht aus einem Expressionskonstrukt mit einer für ein immunmodulatorisches Protein oder Polypeptid kodierenden Sequenz unter Kontrolle eines funktionellen Promotors sowie eines funktionellen Polyadenylierungssignals.

Description

Die Erfindung betrifft ein Mittel und ein Verfahren zur gentherapeutischen Behand­ lung von Hornhauterkrankungen des menschlichen oder tierischen Auges zur Un­ terdrückung der Transplantationsabstoßung.

Bei manchen Erkrankungen am Auge ist es notwendig, Fremdgewebe zu transplan­ tieren, welches meist von anderen, verstorbenen Menschen oder von Tieren stammt. Dieses übertragene oder transplantierte Fremdgewebe übernimmt die Funktion des ursprünglichen erkrankten oder zerstörten Gewebes. Das wichtigste und älteste Transplantationsverfahren am Auge stellt die Hornhautübertragung dar. Bei dieser Operation wird die getrübte Hornhaut eines menschlichen Auges entfernt und durch die klare Hornhaut eines Verstorbenen ersetzt. Auf diese Weise kann ein vorher blindes Auge wieder eine normale Sehschärfe erlangen. Von chirurgischer Seite ist dieses Operationsverfahren heute weitgehend optimiert und zu einem kaum noch verbesserungsfähigen Routineverfahren geworden. So werden jährlich in Deutschland ca. 5.000 und in den USA ca. 50.000 Patienten operiert.

Das wichtigste, bisher ungelöste Problem dieser Fremdgewebsübertragung ist die Immunreaktion, bei der das Immunsystems des Transplantatempfängers das über­ tragene Gewebe als fremd erkennt und Abwehrmechanismen entwickelt, die die Zerstörung des transplantierten Fremdgewebes bewirken.

Je nach der Wahrscheinlichkeit eines Dauererfolges der Hornhautübertragung un­ terteilt man die Patienten in solche mit einer guten Prognose und solche mit einer schlechten Prognose. 10% der Patienten mit einer guten Prognose erkranken an einer Immunreaktion und 50% der Patienten mit einer schlechten Prognose erkran­ ken an einer Immunreaktion. Folge der Immunreaktion ist die Eintrübung der trans­ plantierten Hornhaut und damit die erneute Erblindung.

Zur Unterdrückung einer Immunantwort nach der Transplantation werden nach heu­ tigem Stand der Technik immunsuppressive Medikamente eingesetzt. Die wichtigs­ ten Medikamente zur Vermeidung einer Immunreaktion nach Hornhautübertragung sind Corticosteroide, die am Auge lokal als Augentropfen eingesetzt werden. Neben einer erheblichen Mißerfolgsrate dieser Behandlung gibt es gefährliche Folgen die­ ser Therapieform, nämlich Infektionen der Hornhaut, Entstehung des grünen Stars (Glaukom) und eine Trübung der Linse. Diese Nebenwirkungen verhindern eine höhere Dosierung und damit möglicherweise eine verbesserte Erfolgsrate. Aus die­ sem Grunde wird nach anderen Möglichkeiten gesucht, die Immunantwort zu modu­ lieren oder zu verhindern.

Für einige wichtige immunsuppressive Mittel wie z. B. Cyclosporin A konnte nach Hornhautübertragung nur ein sehr geringer Effekt, dabei aber erhebliche Nebenwir­ kungen nachgewiesen werden, so dass sie klinisch nur in Ausnahmefällen einge­ setzt werden. Entsprechend ungünstig ist das Verhältnis von Wirkung zu möglicher Nebenwirkung bei dem Einsatz monoklonaler Antikörper.

Der Ablauf der Immunantwort ist teilweise bekannt. Die Aktivität des Immunsystems kann über mehrere Populationen von Helfer- und Effektorzellen vermittelt werden, man unterscheidet danach als Typen der Immunantwort eine zellvermittelte (zytoto­ xische) Typ 1 (Th1) bzw. eine durch lösliche Effektormoleküle vermittelte Typ 2- Reaktion (Th2). Die Reaktionen hemmen sich in bestimmten Grenzen gegenseitig und sind gekennzeichnet durch die Ausschüttung antworttypspezifischer Zytokine. Die Immunreaktion nach Organtransplantationen ist eine im wesentlichen zellvermit­ telte (zytotoxische) Antwort vom Typ Th1 und ist von der Expression der Th1- Zytokine IL-2 und IFN-gamma begleitet. Für die Toleranzbildung ist das Überwiegen der Th2- über die Th1-Zytokinexpression von Bedeutung. In der frühen Phase nach einer Organtransplantation kommt es zu einer verstärkten Expression des IL-2- Rezeptors (CD25), sowie der Zytokine IL-2, IFN-gamma, IL-4 und IL-10. Bei der anti-CD4 (RIB 5/2) induzierten, MHC spezifischen Transplantattoleranz geht IFN­ gamma schnell zurück, während IL-4 persistiert. Es besteht ein Th1/Th2 shift. Die Th1 Antwort wird blockiert (Lehmann 1997, Transplantation 64, 1181-7).

Verschiedene Faktoren spielen bei der Polarisierung des Th1- oder Th2-Weges eine Rolle, so z. B. das Zytokinprofil der natürlichen Immunität, die Natur des Antigens sowie die Aktivität ko-stimulatorischer Moleküle und örtlich sezernierter Hormone vor dem jeweiligen genetischen Hintergrund. Die Th1-Antwort ist gegenüber intrazellulären Pathogenen, bei der Transplantatabstoßung und bei Autoimmunkrankheiten, die Th2-Antwort gegenüber intestinalen Nematoden, der Transplantattoleranz und der graft versus host Reaktion von Bedeutung (Romagnani 1997, Int Arch Allergy Immunol 113, 153-6).

Für die Unterdrückung der Abstoßungsreaktion nach Transplantation ist die Indukti­ on einer Th2-Immunreaktion sowie die Unterdrückung einer Th1-Reaktion vorteil­ haft. Da sich die Th1 bzw. Th2-Antworten gegenseitig hemmend beeinflussen, führt die Induktion einer Th2-Antwort zu einer Hemmung der Th1-Antwort, und umge­ kehrt.

T-Zell-abhängige Immunantworten werden durch eine Interaktion von T- Lymphozyten mit passendem T-Zellrezeptor (TcR) mit Antigen-präsentierenden Zel­ len (APC) eingeleitet, die dem TcR ein Antigenpeptid mit dem MHC-Molekül präsen­ tieren. Zur vollständigen T-Zellaktivierung ist diese Interaktion von TcR und MHC- Peptid aber unzureichend, und ein zweites, "kostimulatorisches" Signal muß sich aus einer adäquaten Paarung von akzessorischen Molekülen auf beiden an der In­ teraktion beteiligten Zellen ergeben. Gut definiert ist das Ko-Stimulationssystem, bei dem von der antigenpräsentierenden Zelle exprimierte Zell-Oberflächenprotein B7 (B7.1, B7.2)-Moleküle mit CD28-Molekülen interagieren, die von der aktivierten T- Zelle exprimiert werden (Janeway 1994, Current Biology Ltd., Garland Publishing Inc); diese B7-CD28-Interaktion führt zur Expression von CTLA-4 durch die T- Lymphozyten, das wegen seiner besonders hohen Affinität für B7 die Empfindlich­ keit der T-Zelle für eine Stimulation durch B7 weiter erhöht und schließlich die Transduktion eines adäquaten co-stimulatorischen Signals ermöglicht. Die Präventi­ on der Ko-Stimulation induziert eine spezifische T-Zell-Anergie in vitro und inhibiert Autoimmun- und Alloimmunantworten in vivo (Janeway 1994, Current Biology Ltd, Garland Publishing Inc. Linsley 1992, Science 257: 792-795; Lin 1994, Transplant Proc. 26: 3200-3201; Wallace 1994, Transplantation 58: 602-610; Baliga 1994, Transplantation 58: 1082-1090).

Die Prävention solcher Ko-Stimulation kann z. B. durch Expression löslicher Ligan­ den für B7 erfolgen, die das CD28-Molekül "sättigen" und das Erkennen der ge­ meinsamen Signalpräsenz von TcR und CD28 verhindern. So wurde ein CTLA4-lg Fusionsprotein produziert, bei dem der extrazelluläre Teil des murinen CTLA4- Moleküls und die konstante Region von menschlichem Immunglobulin gamma1 mit­ einander fusioniert sind, mCTL4-4 gamma1, das sich funktionell wie ein monoklona­ ler Antikörper gegen B7 verhält (Lane et al. Immunology 1993 Sep. 80(1): 56-61). Die Blockade des CD28-B7 T-Zell-Co-Stimulationsweges durch das Fusionsprotein CTLA4-lg induziert Toleranz gegenüber Nieren-, Lungen- und Herzallotransplanta­ ten bei Ratten und Pankreas-Allotransplantaten bei Mäusen und Ratten und eine deutliche Verlängerung des Hornhauttransplantatüberlebens bei der Maus (Lin 1994, Transplant Proc. 26: 3200-3201; Lenschow 1992, Science 257: 789-792; Yin 1995, J Immunol 155: 1655-1659; Chahine 1995, Transplantation 59: 1313-1318; Matsumura 1995, Transplantation 59: 551-558; Finck 1992, PNAS 89: 102-106; Hoffmann 1997, Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol 235: 535-540).

Die ko-stimulatorischen Signale B7/CD28 sind für die Aktivierung von Th1 Zellen von großer Bedeutung. Nach Lebertransplantation an der Ratte ist die Allograftreak­ tion durch eine Invasion von Makrophagen und CD4+ Zellen in das Transplantat und eine Th1 Reaktion charakterisiert. Nach Behandlung mit CTLA4 Fusionsprotein ist die Monozyteninvasion reduziert, und es kommt zur Expression von IL-4 und IL- 10 (Mark 1997, Langenbecks Arch Chir Suppl Kongressbd 114: 299-302). Die CD28/B7 Blockade mit CTLA4lg behindert die Th1-, nicht aber die Th2- Zytokinsynthese (Akalin 1996, Transplantation 62: 1942-1945). Sie führt nach Nie­ rentransplantation an der Ratte im Transplantat unter anderem zur Expression der Th2-Zytokine IL-4 und IL-10, bei unbehandelten Kontrollen dagegen zur Expression der Th1-Zytokine IL-2 und IFN-gamma (Sayegh 1995, J Exp Med 181: 1869-1874).

Die Inhibition ko-stimulatorischer Signale, die zur T-Zell-Aktivierung essentiell sind, hat sich im Tierversuch insofern als besonders effektiv zur Verhinderung der Transplantatabstoßung erwiesen, als sie zur Induktion von anergen T-Lymphozyten führt. Diese erkennen das betreffende Alloantigen zwar, reagieren darauf aber nicht mehr (Janeway 1994, Current Biology Ltd., Garland Publishing Inc). Eine solche Strategie hat gegenüber der Behandlung mit Immunsuppresiva den Vorteil, nur für einen rela­ tiv kurzen Zeitraum, nämlich während der Initialphase der Exposition des Empfän­ ger-Immunsystems gegenüber den Transplantat-Alloantigenen, appliziert werden zu müssen.

Es können zur Unterdrückung der Kostimulation also lösliche Liganden der an der Signalvermittlung zwischen APC und T-Zelle beteiligten Oberflächenmoleküle ein­ gesetzt werden. Dabei können diese Moleküle dem Patienten als Proteine syste­ misch oder lokal verabreicht werden, denkbar ist allerdings auch die Verabreichung geeigneter Expressionskonstrukte aus DNA, auf denen die für die Herstellung sol­ cher Inhibitoren notwendige Informationen enthalten ist, und die nach Einschleu­ sung in körpereigene Zellen diese zur Herstellung der Inhibitoren veranlassen.

Der Transport und die Expression von genetischer Information in Zellen ist weithin bekannt und beschrieben. Es werden dabei zum einen Systeme biologischer Her­ kunft, wie attenuierte oder modifizierte virale oder bakterielle Vektoren verwendet, die in ihrem genetischen "Inhalt" so verändert worden sind, dass sie eine bestimmte, erwünschte Information in der infizierten Zelle zur Expression bringen. Neben Si­ cherheitsbedenken hinsichtlich Rückmutation oder -Rekombination zu pathogenen Stämmen haben solche Vektoren den Nachteil, dass sie dem Immunsystem eine Vielzahl potentieller Erkennungsstrukturen liefern, was ihre Verwendbarkeit in the­ rapeutischen Ansätzen einschränkt. Zum anderen bedient man sich zum Gentrans­ fer physikalischer oder chemischer Methoden, wie z. B. der Lipofektion oder dem spannungsinduzierten Transfer (Elektroporation).

Bereits 1994 beschrieben Mashour et al. (Mashour et al. 1994, Gene Ther 1: 122-126) die Expression von Reportergenen in Mäusen nach Transfektion mit adenoviralen Vekoren. Ähnliches berichten Budenz et al. (Budenz et al. 1995, Invest. Ophtalmol Vis Sci 36: 2211-2215). Auch ist die Transfektion von Endothelzellen der Hornhaut von Kaninchen mittels adenoviraler Vektoren bekannt, dabei wurde die Expression des Reportergens lacZ beobachtet (Larkin 1996, Transplantation 61: 363-370). Ebenfalls wurde die Reportergenexpression an menschlichen Hornhaut-Endothelzellen nach adenoviralem Transfer sowie die Ex- Endothelzellen nach adenoviralem Transfer sowie die Expression von CTLA4lg in vitro beobachtet (Oral et al. 1997, Gene Ther 4: 639-647). Eine Variation der Me­ thode, die sich der sog. Lipoadenofektion bedient, wurde ebenfalls publiziert (Aran­ chibia-Carcamo et al. 1998, Transplatation 65: 62-67).

Eine Reihe weiterer Transfektionsversuche ist beschrieben. So verhindert der Ep­ stein-Barr-Virus-vermittelte Transfer von IL-10-Expressionsvektoren die Allograft- Abstoßung bei der Transplantation von Herzmuskelgewebe in Kaninchen (Brauner et al. 1997, J Thorac Cardiovasc Surg 114: 923-933).

Die Herpesvirus-induzierte Autoimmunreaktion (Herpetic Stromal Keratitis) konnte bei Mäusen durch die Applikation von CTLA4lg Fusionsprotein unterdrückt werden. (Gangappa et al. 1998, Clin Immunol Immunopathol 86: 88-94).

Der nichtvirale Reportergentransfer auf der Basis eines peptidbasierten Systems wurde bei verschiedenen Spezies, darunter Mensch, publiziert (Shrewing et al. 1997, Transplantation 64: 763-769).

Es sind etliche Verfahren zum Einbringen von Targets in Zielzellen bekannt, bei­ spielsweise Transfektion, Lipofektion, Injektion, "ballistischer Transfer" (siehe WO 91/07487 und DE 44 16 784), virale Vektoren oder Elektroporation. So ist es be­ kannt, dass sich Hornhautepithelzellen durch Elektroporation mit Reportergenen transfizieren lassen (Oshima et al. 1998, Gene Ther: 1347-54).

Hantelförmige Expressionskonstrukte sind in WO 98/21322 beschrieben.

Aus der WO 98/56417, sowie der WO 96/31229 und EP 0 682 039 ist bekannt, dass sich die Abstoßungsreaktion durch Inhibition kostimulatorischer Signale unterdrü­ cken lässt.

Bislang ist die Unterdrückung einer Abstoßungsreaktion nach Hornhauttransplanta­ tion durch die Expression geeigneter Gene nach Kenntnis der Anmelderin bisher nicht beschrieben worden. Die bisherigen Erkenntnisse zur Entstehung der Immun­ reaktion weisen daraufhin, dass es zur Unterdrückung einer Immunantwort wichtig ist, innerhalb des transplantierten Gewebes möglichst frühzeitig eine Expression der Th2 Zytokine IL4 und/oder der extrazellulären Domäne des CTLA4-Liganden oder anderer Hemmer der ko-stimulatorischen Signale zu ermöglichen.

Ausgehend von diesem Stand der Technik ist es Aufgabe der hier beschriebenen Erfindung, geeignete Mittel bereitzustellen, um die postoperative Unterdrückung der Abstoßungsreaktion und somit eine dauerhafte Toleranz des Transplantats zu er­ möglichen. Weiterhin ist es Aufgabe der Erfindung, den Transfer von therapeutisch wirksamen Nukleisäurekonstrukten ins Augengewebe, insbesondere die Hornhaut, zu ermöglichen, insbesondere in einer Form, in der die transferierten Nukleinsäure­ konstrukte operational aktiv sind, d. h. abgelesen werden können.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, dass sog. Expressionskon­ strukte, also DNA-Polymere, insbesondere solche, welche eine für ein immunmodu­ latorisches Protein oder Polypeptid kodierende Sequenz unter Kontrolle eines funk­ tionellen Promotors sowie eines funktionellen Polyadenylierungssignals tragen, in das Gewebe der Hornhaut oder andere das Auge umgebende Gewebeverbände so eingebracht werden, dass diese Expressionskonstrukte zur Synthese des immun­ modulatorischen Proteins oder Peptides, oder einer Mehrzahl derselben, führen.

Bevorzugt werden als Expressionskonstrukte sog. minimalistische Hantelkonstrukte, d. h. hantelförmige, lineare doppelsträngige kovalent geschlossene Nukleinsäuremo­ leküle, eingesetzt, wie sie beispielsweise in der DE 196 48 625 beschrieben sind. Diese bieten den Vorteil, keine Sequenzen zu enthalten, die nicht dem unmittelba­ ren Zweck der Behandlung dienen, und sind deswegen kleiner sowie auch hinsicht­ lich des Charakters der durch die DNA selber induzierten Immunantwort sicherer. Das hierbei wesentliche Problem ist, dass in bakterieller DNA vorkommende un­ methylierte Sequenzen der generellen Basenfolge NNCGNN (mit N: jede Base, C: Cytosin; G: Guanin) eine starke immunstimulatorische Wirkung haben können, und dabei vor allem den zytotoxischen, also Transplantat-Abstoßungs-vermittelnden Arm der Immunantwort stärken. Die besagten minimalistischen Hantelkonstrukte minimieren die Anzahl der auf ihnen enthaltenen immunstimulatorischen Sequenz­ elemente und damit die stärke des DNA-induzierten cytotoxischen Stimulus.

Als Transfektionsmethode kommt prinzipiell jede Methode in Frage, welche DNA in Zellen zur Expression bringen kann, also v. a. Lipofektion, peptidvermittelte Methoden, Elektroporation oder der ballistische Transfer, wie er beispielsweise in der EP 0 686 697 beschrieben ist. Die zuletzt genannte Methode, der Transfer durch Be­ schuß des zu transfizierenden Gewebes mit stark beschleunigten Partikeln, ist ge­ nerell sehr effektiv, da die DNA direkt in den Kern der zu transfizierenden Zellen transportiert wird. Alle anderen nicht-viralen Methoden leiden unter einer z. T. gerin­ gen Effizienz dieses Kerntransports. Die Natur der ballistischen Transfermethode bringt es allerdings auch mit sich, dass ein Teil des Gewebes durch die Behandlung geschädigt wird, und dass Partikel in dem transfizierten Gewebe abgeladen werden. Es konnte ferner festgestellt werden dass auch die direkte, postoperative Transfek­ tion von Implantaten mittels einer sog. "Gene Gun" (Bio-Rad, München, WO 95/19799) zur deutlichen Verzögerung der Abstoßungsreaktion bei hornhauttrans­ plantierten Mäusen führt, und dass in der ophtalmologischen Untersuchung des behandelten Auges keine Schädigungen entdeckt werden konnten, die den Gebrauch der Methode beim Patienten ausschließen würden.

Die Erfindung eignet sich aber auch zur Behandlung von Stammzellen oder Stamm­ zelltransplantaten, besonders des Limbusepithels. Stammzellen kommen überall dort vor, wo Zellen kontinuierlich erneuert werden müssen. Sie sind die Reservezel­ len für die Zellproliferation und teilen sich immer dann, wenn ein Bedarf für Zeller­ neuerung besteht. Aufgabe der Zellerneuerung ist es, die Anzahl der Zellen kon­ stant zu erhalten, so dass einerseits nicht zu viele Zellen gebildet, und andererseits ein plötzlicher Zellverlust ausgeglichen werden kann. Bei Bedarf können einzelne Stammzellen zu Teilungszellen werden. Das Epithel der Hornhautoberfläche ist ei­ nem konstanten Prozeß der Zellerneuerung unterworfen, bei dem abgeschilferte Zellen durch neue ersetzt werden müssen. Nur die unterste Zellschicht enthält Zel­ len, die sich teilen können. Dadurch entsteht eine vertikale Wanderungsbewegung. Gleichzeitig besteht eine horizontale Zellwanderungsbewegung vom Limbus zum Zentrum. Stammzellen gibt es nur im basalen Limbusepithel. Die Regeneration der Augenoberfläche beispielsweise nach Verätzungen wird maßgeblich von der Integri­ tät des Limbusepithels beeinflußt. Ein Verlust aller Stammzellen führt zu schwersten Wundheilungsstörungen. Eine medikamentöse Therapie der Limbusinsuffizienz ist nicht möglich. Lediglich eine Limbustransplantation verbessert die Situation und führt zur Wundheilung. Allogene Transplantate bieten jedoch wenig Aussichten auf Erfolg, da in das transplantierte Gewebe Gefäße einwachsen und sehr wahrschein­ lich eine Immunreaktion folgt. (Kenyon 1989, Ophthalmology 96(5): 709-22).

Der Vorteil der Behandlung von Stammzellen mit dem erfindungsgemäßen Mittel ist daher offensichtlich, wird dadurch doch die auf die Abstossung des Transplantats gerichtete Immunabwehr gezielt unterdrückt, ohne dass eine Infektionsgefahr geför­ dert wird.

Die Erfindung eignet sich aber auch zur Behandlung der virusinduzierten Keratitis. So haben experimentelle Untersuchungen gezeigt, dass das lymphozytäre Infiltrat in der Hornhaut während der Entwicklungsphase der Herpes simplex Keratitis vorran­ gig Th1 Zellen enthält, welche IL2 und IFN-Gamma produzieren, während IL4 pro­ duzierende Th2 Zellen an der Abheilung beteiligt sind (Niemialtowski 1992, J Immu­ nol 148: 1864-70). Das Ziel einer Therapie besteht darin, die Immunabwehr gezielt zu unterdrücken, ohne die Infektion zu fördern. Im Tierexperiment ist dies bereits gelungen. Durch die systemische und intracorneale Gabe von IL10 vor der HSV- Infektion konnte die Entzündung der Hornhaut erheblich reduziert werden, ohne die Abwehrkraft zu schwächen (Tumpey 1994, J Immunol 153: 2258-65). Ebenso konn­ te die Entzündung durch Gabe von Anti-Interferon-gamma und anti-IL2 bei aller­ dings geschwächter Abwehrkraft reduziert werden (Hendricks 1992, J Immunol 149: 3023-3028).

Bevorzugt werden als Expressionskonstrukte für die Unterdrückung der Transplan­ tationsabstoßung bzw. der virusinduzierten Keratitis solche, die die Cytokine IL-4, IL-10, den extrazellulären Teil von CTLA4 oder Inhibitoren anderer ko­ stimulatorischer Signale, zum Beispiel nicht-signalinduzierende Antikörper gegen CD-40 oder CD-40-Ligand zur Expression bringen. Bevorzugte Promotoren sind der Immediate-Early-Promotor des Cytomegalievirus sowie andere virale Promotoren (SV40) und gewebespezifische Promotoren, insbesondere für Hornhautzellen des Auges spezifische Keratingenpromotoren.

Ein wesentlicher Vorteil der Erfindung ist, dass durch die Expression der biologisch aktiven Proteine durch die Zellen des Gewebes, in dem sie wirken sollen, die Not­ wendigkeit der Stabilisierung durch Fusion mit Fremdpeptiden wegfällt, wie sie z. B. für das CTLA-4 durch Fusion mit Immunoglobulinpeptiden verwendet wird. Die exprimierten bioaktiven Proteine werden dadurch kleiner und können leichter im Gewebe diffundieren. Dies ist ein wesentlicher Vorteil der Verwendung von Expressionsvektoren für Proteine und Peptide gegenüber der Verwendung rekombinanter Proteine und Peptide.

Weitere vorteilhafte Maßnahmen sind in den übrigen Unteransprüchen enthalten. Die Erfindung wird anhand von Ausführungsbeispielen und Figuren wie folgt näher dargestellt:

1. Synthese der DNA-Polymere (Hantelkonstrukte)

Expressionsvektor für murines CTAL4: 10 mg Plasmid pG mCTLA4 wurden mit Re­ striktionsenzym EcoRI (MBI, Leon Rot) und Haarnadel-Oligodesoxyribonukleotid AATTCGGCCG GCCGTTTTCG GCCGGCCG (TIB, Berlin) analog der in DE 196 48 625 enthaltenen Vorschrift zu Hantelkonstrukten umgesetzt.

Expressionsvektor für murines Interleukin 4: 10 mg Plasmid pG mlL4 wurden mit Restriktionsenzym EcoRI (MBI, Leon Rot) und Haarnadel-Oligodesoxyribonukleotid AATTCGGCCG GCCGTTTTCG GCCGGCCG (TIB, Berlin) analog der in DE 196 48 625 enthaltenen Vorschrift zu Hantelkonstrukten umgesetzt.

Das Reportergen Luciferase (zur Methodik siehe das Handbuch der Firma Prome­ ga, Madison, Wisconsin, USA, unter http://www.promeqa.com/tbs/tm033/tm033.html ) wurde als Marker verwendet, um die erfolgreiche Behandlung von Hornhautzellen mittels ballistischen Transfer und damit die erfolgreiche Umsetzung der Erfindung nachzuweisen.

Expressionsvektor für Luciferase: 10 mg Plasmid pMOL Lux wurden mit Restrikti­ onsenzym Eco31l (MBI, Leon Rot) und Haarnadel-Oligodesoxyribonukleotid AGGGCGGCCG GCCGTTTTCG GCCGGCCG und GGGACGGCCG GCCGTTTTCG GCCGGCCG (TIB, Berlin) analog der in DE 198 26 758 enthaltenen Vorschrift zu Hantelkonstrukten umgesetzt.

2. Keratoplastik

Die Technik der Transplantation der Hornhaut im Mausmodell ist genau beschrieben worden ("Orthotopic corneal transplantation in the mouse - a new surgical technique with minimal endothelial cell loss": Er-Ping Zhang et al. 1996, Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol 234: 714-719). Kurz dargestellt läuft diese wie folgt ab: Die Trans­ plantation der Hornhaut wird in 5 Monate alten BALB/c (H-2d) Mäusen durchgeführt. MHC-differente C3h(H-2k) Mäuse dienen als Spender. Empfängermäuse werden mit einer Mischung aus 6 mg/kg Körpergewicht Xylazine (Rompun, Bayer) und 75 mg/kg Körpergewicht Ketamine Hydrochlorid (Ketanest, Parke-Davis) betäubt. Die Spenderhornhaut wird mit einer Catroviejo-Schere entnommen. Die Hornhaut wird in das Empfängerauge mit 8 Nähten eingenäht. Am Ende der Operation werden die Augenlider für 24 Stunden zugenäht. Die Mäuse werden 11 Tage lang mit Cortison behandelt (5 × täglich, 2 Tropfen Spersadex Lösung).

3. Ballistischer Gentransfer in Mäuseaugen

Die Transfektion der Hornhaut erfolgt am Tag 11 mit einem kommerziell erhältlichen Apparat zum ballistischen Transfer (Modell "Helios", Bio-Rad, München). Für jede Transfektion wird 0.1-0.5 mg Gold (1,6 µm; Bio-Rad) eingesetzt, welches nach Vorschrift des Herstellers mit 1 µg minimalistischen Genepressionsvektoren codie­ rend für murines CTLA4 und/oder murines Interleukin 4 (Zusammensetzung der Beladung variiert ja nach experimentellen Parametern) beladen wurde. Die 1,6 µm großen Goldpartikel werden mit Helium unter Druck (200 psi) auf das transplantierte Auge am Tag 10 nach Operation beschleunigt.

Zur Messung der Expression von Transgenen wurden minimalistische Expressions­ vektoren, kodierend für Luciferase, in die nativen Hornhäute von Mäusen mit der gleichen Methodik eingebracht, wie oben für CTLA4 und IL-4 beschrieben. Die Hornhäute wurden zum Zeitpunkt der Messung entnommen, in flüssigem Stickstoff schockgefroren, homogenisiert und nach bekannten Methoden (s. oben: Katalog von Promega Inc. Madison, Wisconsin, USA) auf die Expression von Luciferase untersucht. Die Ergebnisse der Messungen sind in Fig. 1 gezeigt. Daraus ist ein Maximum der Expression schon nach 24 Stunden erkennbar. Die dargestellten Messwerte sind Mittelwerte von 3 Messungen.

Ebenso wurden Expressionsvektoren für IL-4 und IL-10 in Mäusecorneae einge­ bracht. Die Ergebnisse der Expression, ermittelt mit einem handelsüblichen ELISA für die betreffenden Genprodukte, sind in Fig. 2 dargestellt. Mit der ballistischen Methode wurden Corneae wie beschrieben transfiziert. Es wurden mit Expressions­ vektoren für die bezeichneten Gene beschichtete Goldpartikel der Grösse 1 µm ein­ gesetzt, als Kontrolle wurden Mäuseaugen mit unbeschichtetem Gold analog be­ handelt. Man erkennt eine von einem niedrigen Basalniveau um zwei Grössenor­ dungen erhöhte Expression des transfizierten Zytokingens im Falle des IL-4, sowie eine ebenfalls deutlich erhöhte Expression des IL-10, allerdings von einem, mut­ masslich durch die Transfektionsmethode, bereits erhöhtem Niveau. Die dargestell­ ten Messwerte sind Mittelwerte von 3 Messungen.

Die Ergebnisse der Transplantatüberlebensuntersuchung sind in den Fig. 3 und Fig. 4 dargestellt. In Fig. 3 ist die Anzahl der bis zur klinisch manifesten Abstossungsre­ aktion des Tranplantats vergangenen Tage auf der Y-Achse über den verschiede­ nen Gruppen aufgetragen; in Fig. 4 auf der X-Achse.

Claims (14)

1. Mittel zur gentherapeutischen Behandlung von Hornhauterkrankungen des menschlichen oder tierischen Auges zur Unterdrückung der Transplantati­ onsabstoßung, bestehend aus einem Expressionskonstrukt mit einer für ein immunmodulatorisches Protein oder Polypeptid kodierenden Sequenz unter Kontrolle eines funktionellen Promotors sowie eines funktionellen Polyadeny­ lierungssignals.

2. Mittel nach Anspruch 1, wobei das Expressionsprodukt das Zytokin Interleu­ kin 4 (IL-4) zur Expression bringt.

3. Mittel nach Anspruch 1, wobei das Expressionsprodukt das Zytokmn lnterleu­ kin 10 (IL-10) zur Expression bringt.

4. Mittel nach Anspruch 1, wobei das Expressionsprodukt den extrazellulären Teil von CTLA4 (CD 152) zur Expression bringt.

5. Mittel nach Anspruch 1, wobei das Expressionsprodukt Inhibitoren von ko­ stimulatorischen Signalen, insbesondere nicht-signalinduzierende Proteinli­ ganden von CD-40 oder CD-40-Ligand, oder B7.1, B-7.2 oder CD-28, darun­ ter insbesondere Antikörper gegen CD-40 oder CD-40-Ligand, oder B7.1, B- 7.2 oder CD-28, zur Expression bringt.

6. Mittel nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Promoto­ ren ausgewählt sind aus der Gruppe des Immediate-Early-Promotor des Cy­ tomegalievirus (CMV) oder des viralen Promotors (SV40) oder für Hornhaut­ zellen des Auges gewebespezifische Keratingenpromotoren.

7. Mittel nach wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Expressionskonstrukte hantelförmige, lineare doppelsträngige kovalent ge­ schlossene Nukleinsäuremolekülein sind.

8. Mittel nach Anspruch 1, wobei dieses in das Gewebe der Hornhaut oder an­ dere das Auge umgebende Gewebeverbände so eingebracht wird, dass die­ se Expressionskonstrukte zur Synthese des immunmodulatorischen Proteins oder Peptides, oder einer Mehrzahl derselben, führen.

9. Arzneimittel bzw. Impfstoff enthaltend das Mittel nach Anspruch 1 bis 8 zur Anwendung in der Gentherapie.

10. Verfahren zur Behandlung von Hornhauterkrankungen des menschlichen oder tierischen Auges, bei dem die Hornhaut oder Teile derselben mit einem Mittel nach Anspruch 1 bis 8 behandelt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Mittel via Transfektion, Lipofektion, Injektion, ballistischen Transfer, virale Vektoren, Elektroporation oder jedes andere Mittel in Zellen der Hornhaut oder Teile derselben eingebracht wird.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei isolierte Hornhautzellen mit dem Mittel nach den Ansprüchen 1 bis 8 behandelt werden.

13. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei Stammzellen des Limbuse­ pithels des menschlichen oder tierischen Auges mit dem Mittel nach den An­ sprüchen 1 bis 8 behandelt werden.

14. Hornhautzellen, behandelt mit einem Mittel nach den Ansprüchen 1 bis 8.