DD298108A5 - Irreversible bombesinantagonisten - Google Patents

Abstract

Die Erfindung beschreibt ein Peptid der Formel I:RABCTrpAlaValXYTWIworin bedeuten: R eine Gruppe der Formel4(ClCH2CH2)2NC6H4CO, 3(ClCH2CH2)2NC6H4CO, ClCH2CH2NHCO,{irreversible Bombesinantagonisten; Peptid; cis- oder trans-Isomere; lineare oder verzweigte aliphatische Kette; Benzylgruppe; Phenylgruppe; pharmazeutisch akzeptable Salze; pharmazeutische Zusammensetzung}

Description

4-(CICH₂CH₂J₂N-C₆H₄-CO-, 3-(CICH₂CH₂)₂N-C₆H4-CO-, CICH₂CH₂NHCO-, CICH-CH-CO-, BrCH=CH-CO-, CH₂-CCICO-, CH₂=CBrCO-

(entweder eis- oder trans-lsomere),

CH₂-CH-CH₂-CO-, HC = C-CO-, ClCH₂CH₂CH₂N(NO)CO-,

\ / O ClCH₂CO-CH(R₁)NHCOiCH₂)₂C0-;

A eine Valenzbindung oder ein GIy, Leu-Gly, Arg-Leu-Gly, Gln-Arg-Leu-Gly-Rest; B eine Valenzbindung oder ein Asn- oder Thr-Rest;

C ein GIn oder His-Rest;

X ein GIyoderein ala-Rest;

Y eine Valenzbindung oder ein His(R₂), his(R₂), Phe, phe, Ser, ser, AIa oder ala-Rest; T eine Valenzbindung oder ein Leu, leu, Phe oder phe-Rest; W eine Gruppe der Formel OH, NH₂, NH(CH₂)₄CH₃, NH(CH₂)₂C₆H₅, Met-R₃, Leu-R₃, Me-R₃, oder

NIe-R₃; R₁ Wasserstoffatom, eine lineare oder verzweigte aliphatische Kette mit 1 bis

11 Kohlenstoffatomen, eine Benzyl- oder Phenylgruppe; R₂ Wasserstoffatom oder Tos, Dnp oder Bzl-Gruppe und R₃ eine Amino-, Hydroxy-, Methoxy- oder Hydrazingruppe

und pharmazeutisch akzeptable Salze davon.

2. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Peptid nach Anspruch 1 oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz eines derartigen Peptide in Zumischung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmittel oder Träger enthält.

3. Verfahren zur Herstellung eines Peptids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Aminosäuren und/oder Aminosäurederivate in der gewünschten Sequenz und/oder Peptidfragmente, die diese Aminosäuren oder deren Derivate in der gewünschten Sequenz enthalten, kondensiert werden, um das gewünschte Peptid zu ergeben, daß die Karbonsäureendgruppen für die Peptidbindung aktiviert werden, daß die restlichen Gruppen geschützt werden und daß die Schutzgruppen bei der resultierenden Verbindung abgespalten werden und/oder daß das resultierende Peptid in ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon umgewandelt wird.

4. Verwendung der Peptide nach Anspruch 1 zur Herstellung eines geeigneten pharmazeutischen Präparates für die Behandlung von humanen Neoplasmen.

5. Verwendung der Peptide nach Anspruch 1 zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates, welches als ein Antagonist gegen Effekte, die durch Bombesin hervorgerufen werden, nützlich ist.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Peptidderivate, auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese enthalten, auf Verfahren zu deren Herstellung und auf deren Anwendung als therapeutische Mittel.

In der vorliegenden Beschreibung stimmen die Symbole und Abkürzungen mit jenen überein, die in der Peptidchemie allgemein verwendet werden (vgl. Eur. J. Biochem. 11984] 138,9-37). Folglich stellen die drei Buchstaben-Aminosäuresymbole die L-Konfiguration der chiralen Aminosäuren dar. D-Aminosäuren sind durch kleine Buchstaben gekennzeichnet· ζ. B. ala = D-AIa. Andere Symbole und Abkürzungen, die verwendet sind, sind: AA, Aminosäure; AcOEt, Ethylacetat; BBS, Bombesin; Boc, t-Butoxycarbonyi; BuOH, n-Butylalkohol; BOP, Benzotriazolyloxy-tris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorophosphat; DCC, N.N'-dicyclohexylcarbodiimid; DMF, Dimethylformamid; DMSO, Dimethylsulfoxid; Dnp, 2,4-Dinitrophenyl; EGF, Epidermis-Wachstumsfaktor; EtOH, Ethylalkohol; FAB (oder FD)-MS, Massenspektroskopie mit Hilfe von Stoßprozessen durch angeregte

Atome (oder Feiddesorption); ECC, Ethylchlorocarbonat; Et₂O, Diethylether; GIp, !.-Pyroglutaminsäure; h-GRP (oder p-GRP), Gastrin freisetzendes Peptid vom Menschen (odervom Schwein); HOBt, 1-Hydroxybenzotriazol; I.D., innerer Durchmesser; MeOH, Methylalkohol; m.p.. Schmelzpunkt; n.d., nicht festgestellt; Nie, L-Norleucin; NMM, N-Methylmorpholin; NMR, kernmagnetische Resonanz; OSu, N-Hydroxysuccinimidyl; PE, Petroleumether40-70°C; RP-PLC, Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie; SCLC, Kleinzellen-Lungenkarzinoma; TFA,Trifluoressigsäure; THF, Tetrahydrofuran; TLC, Dünnschichtchromatographie; Tos, p-Toluolsulfphonyl.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Diese Erfindung stellt ein Peptid mit der Formel I zur Verfügung:

R-A-B-C-Trp-Ala-Val-X-Y-T-W I

worin bedeuten: R eine Gruppe der Formel

4-(CICH₂CH₂I₂N-C₆Hc-CO-, 3-(CICH₂CH₂I₂N-C₆H₄-CO-, CICH₂CH₂NHCO-, CICH=CH-CO-, BrCH=CH-CO-, CH₂=CCICO-,

(entweder eis- oder trans-lsomere),

CH₂-CH-CH₂-CO-, CH = C-CO-, ClCH₂CH₂N(NO)CO-,

O ClCH₂CO-CH(R₃.) NHCO (CH₂J₂CO-;

A eineValenzbindung oder ein GIy, Leu—Gly.Arg-Leu-Gly.Gln-Arg-Leu-Gly-Rest; B eine Valenzbindung oder ein Asn- oder Thr-Rest;

C ein GIn oder His-Rest;

X einGlyodereinala-Rest;

Y eine Valenzbindung oder ein HiS(R₂), his(R₂), Phe, phe, Ser, ser, AIa oder ala-Rest; T eineValenzbindung oder ein Leu, leu, Phe oder phe-Rest;

W eine Gruppe der Formel OH, NH₂, NH(CH₂I₄CH₃, NH(CH₂I₂C₆H₅, Met-R₃, Leu-R₃, He-R₃, oder NIe-R₃; R₁ Wasserstoff atom, eine lineare oder verzweigte aliphatische Kette mit 1 bis 11 Kohlenstoffatomen, eine Benzyl-oder Phenylgruppe;

R₂ Wasserstoff atom oder Tos, Dnp oder Bzl-Gruppe und R₃ eine Amino-, Hydroxy-, Methoxy- oder Hydrazingruppe.

Salze dieser Peptide mit pharmazeutisch akzeptablen Säuren werden von dieser Erfindung mit erfaßt. Derartige Säureadditionssalze können von einer Vielzahl von anorganischen und organischen Säuren abgeleitet werden, beispielsweise Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, lodwasserstoffsäure. Salpetersäure, Sulfaminsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Maleinsäure, Succinsäure, Weinsäure, Zimtsäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Benzoesäure, Salizylsäure, Gluconsäure, Ascorbinsäure und verwandte Säuren. Bevorzugte aliphatische Ketten, die durch R, dargestellt werden können, enthalten Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, Iso-Propyl-, η-Butyl- und Iso-Butyl-Gruppen.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Peptide kann nach klassischen Lösungsverfahren vervollständigt werden. Die Herstellung besteht im wesentlichen aus geeigneten aufeinanderfolgenden Kondensationen von geschützten Aminosäuren oder Peptiden. Die Kondensationen werden so ausgeführt, daß die resultierenden Peptide die gewünschte Sequenz an Aminosäureresten aufweisen.

Die Aminosäuren und die Peptide, die nach den Verfahren kondensiert werden können, die in der Peptidchemie bekannt sind, sind an den Amino- und Carboxylgruppen, die an der Peptidbindungsbildung nicht involviert sind, durch geeignete Schutzgruppen blockiert, die durch Säure- oder Alkalibehandlung oder durch Hydrolyse entfernt werden können. Zum Schutz der Aminogruppe können beispielsweise die folgenden Schutzgruppen verwendet werden: Benzyloxycarbonyl, t-Butoxycarbonyl, Trityl, Formyl, Trifluoracetyl, o-Nitrophenylsulphenyl, 4-Methyloxybenzyloxycarbonyl, S-FluorenylmethoxycarbonyljS.B-Dimethoxy-alpha-alpha'-dirnethylbenzyloxycarbonyloder Methylsulphonylethoxycarbonyl. Zum Schutz der Carbonylgruppe können die folgenden Schutzgruppen beispielsweise verwendet werden: Methyl, Ethyl, t-Butyl, Benzyl, p-Nitrobenzyl oder Fluorenylmethyl, Amid, Hydrazid, t-Butoxycarbonylhydrazid oder Benzyloxycarbonylhydrazid. Die Hydroxyfunktionen der Hydroxyaminosäuren und die Iminofunktion von Histidin können durch geeignete Schutzgruppen (während der gesamten Synthese oder nur während einiger Herstellungsschritte) geschützt werden oder können ungeschützt bleiben. Zum Schutz der Hydroxyfunktion können die folgenden Schutzgruppen beispielsweise verwendet werden: t-Butyl, Benzyl, Acetyl. Zum Schutz der Imidazoliminofunktion können beispielsweise die folgenden Gruppen verwendet werden: 2,4-Dinitrophenyl, Tosyl, Benzyl. Schutzgruppenabspaltungsreaktionen werden nach Verfahren durchgeführt, die als solche in der Peptidchemie bekannt sind.

Die Kondensation zwischen einer Aminogruppe eines Moleküls und einer Carboxylgruppe eines anderen Moleküls, zur Bildung der Peptidbindung kann mit Hilfe eines aktivierten Acylderivates durchgeführt werden, beispielsweise ein gemischtes Anhydrid, ein Azid oder ein aktivierter Ester, oder auch durch direkte Kondensation zwischen einer freien Aminogruppe und einer freien Carboxylgruppe, in der Gegenwart eines Kondensationsmittels, beispielsweise Dicyclohexylcarbodiimid atleine oder zusammen mit einem Mittel, welches die Racemisierung verhindert, beispielsweise N-Hydroxysuccinimid oder 1 -Hydroxybenzotriazol, oder

zusammen mit einem Aktivierungsmittel, beispielsweise 4-Dimethylaminopyridin. Die Kondensation kann in einem Lösungsmittel durchgeführt werden, beispielsweise Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Pyridin, Acetonitril, Tetrahydrofuran oder N-Methyl-2-pyrrolidon.

Die Reaktionstemperatur kann in einem Bereich von —30⁰C bis Raumtemperatur liegen. Die Reaktionszeit beträgt im allgemeinen von 1 bis 120 Stunden.

Das Herstellungsschema, die Schutzgruppen und die Kondensationsmittel werden so ausgewählt daß das Risiko der Racemisierung verhindert wird.

Biologische Aktivität

Die erfindungsgemäßen Peptide weisen einen starken Antagonismus gegen »in vitro" und „in vivo" Wirkungen auf, die durch Bombesin hervorgerufen werden, beispielsweise die Kontraktion der glatten Muskulatur, die Modifizierung des Verhaltens vom zentralen Ursprung und die Mitogenese.

Bombesin (BBS) ist ein Tetradecapeptid der Formel Glp-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-VaM3ly-His-Leu-Met-NH2, welches ursprünglich von der Haut eines Frosches isoliert war. Die biologische Aktivität liegt in dem C-terminalen Bereich des Moleküls: BBS(6-14)nonapeptid ist ebenso wirksam wie die Stammverbindung. Das menschliche Gegenstück von Bombesin ist ein 27 Aminosäure-Peptid, bekannt als Gastrin freisetzendes Peptid (h-GRP). Bombesin und bombesinartige Peptide zeigen eine Anzahl von biologischen Wirksamkeiten auf (J.H.Walsch [1983] in „Brain Peptides", D.T.Krieger, M.J.Brownsteinund J.B. Martin [Hrsg.], Wiley Interscience Publ., S. 941—960), einschließlich autokrines Wachstum fördernde Wirkungen bei menschlichen Kleinzellen-Lungenkarzinoma (SCLC) (F.Cutfrtta et al. [1985] Cancer Survey, 4,707-727), autokrine und/oder parakrine Stimulierung von Prostatis-Krebszellenwucheiung beim Menschen (M.Bologna et al.. Cancer, im Druck) und die Modulation des EGF-Rezeptors (I.Zachary und E. Rozengurt [1985] Cancer Surveys, 4,729-765).

Ein Bombesinantagonist könnte durch Konkurrenz mit dem natürlichen Liganten für den bzw. die Rezeptoren die Auslösung der Kaskade von Ereignissen inhibieren, die zur abnormalen Zellwucherung führen.

Verschiedene Annäherungen in dieser Richtung wurden durch verschiedene Forschungsgruppen versucht. Eine Serie von C-terminalen Bombesin Nona- und Decapeptiden, die durch Aminosäurenstreichung, -inversion oder -substitution charakterisiert sind, war das Ziel einer früheren Patentanmeldung der vorliegenden Anmelder (Europäische Patentanmeldung Nr.89102283.2). Diese Peptide zeigen jedoch, wie andere BBS Antagonisten üblicherweise eine moderate Affinität für den BBS-Rezeptor.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen, die einen Alkylierungsanteil aufweisen, verhalten sich als Rezeptor-Antagonisten entweder, wenn sie in Kombination mit Bombesin verabreicht worden sind oder wenn sie 24 Stunden vor einer Exposition mit Bombesin verabreicht werden.

Biologische Untersuchungsergebnisse

Die Bindungsaffinität der erfindungsgemäßen Verbindungen zu Bombesinrezeptoren wurden an Maus-Swiss 3T3-Fibroplasten bestimmt (I.Zachary und E.Rozengurt 11985] Pro. Natl. Acad. Sei. USA, 82 7616-7620). (Tabelle 1).

Der Effekt bei der Mitogenese wurde bei ruhenden und zusammenfließenden Swiss 3T3 Zellen bestimmt, die in einem serumfreien Medium gehalten wurden (A. N. Corps et al., [1985] Biochem. J. 231,781-785). In einem ersten Satz von Experimenten wurden Analoga allein oder in Kombination mit Bombesin verabreicht. In einem zweiten Satz von Experimenten wurden die Zellen zuvor mit den alkylierenden Peptiden vorbehandelt, gewaschen, 24 Stunden bei 37 °C gelassen und dann Bombesin ausgesetzt. In beiden Fällen wurden die DNA-Synthese als (H³)Thymidin-Einbau bestimmt (Tabelle 2).

Die Mitogenwirkung von Bombesin und seinen Analoga wurde ebenfalls als Aktivierung der Protein-Tyrosin-Kinase bestimmt, die ein 115KD-Protein (p115) phsophoryliert, welches mit dem Bombesinrezeptorkomplex assoziiert war (D.Cirilloet al. [1986] Mol. Cell. Biol. 6,4641—4649) (Tabelle 3). Zusätzlich war die Aussetzung mit diesen Peptiden in dem 0,1- bis 50-pM-Bereich mit einer signifikanten Reduktion beim Wachstum von SCLC-Zellinien (beispielsweise NCI-H345, NCI-N 592, NCI-H128), ebenso wie bei den prostatatischen Carcinomzellinien (beispielsweise DU 145 und PC3) verbunden.

Die parenterale Verabreichung dieser Peptide bei Dosen im Bereich zwischen 1 ng/kg bis 100 mg/kg an nackte Mäuse war mit einer beachtlichen Wachstumsreduktion der oben genannten transplantierten menschlichen SCLC und prostatischen Carcinomzellinien verbunden.

Tabelle 1

Bindungsaffinität von Bombesien

Alkylierungsanaloga an Maus-Swiss 3T3-Fibroplasten

Verbindung	ID50 (nM)	12,6 + 3,8
I	1363 ± 266	11100
Il	438 ±111	14000
III	1815 + 330	214 ±30
IV	0,7 ± 0,2
V	1336+199
Vl	648+290
Referenzpeptide
BBS
Spantid
(pro2) Spantid
[Leu13 Ψ (CH2-NH)LeU14IBBS

Tabelle 2

(H³)Thymidin-Einbau in Maus-swiss 3T3-Fibroplasten

Verbindung

Faltenzunahme über dem basalen Wert

5nM

5OnM

0,5 μΜ

5μΜ

% Inhibition in der Gegenwart von 25 nM BBS

A B

0,5 μΜ 5μΜ 0,5 μΜ 5μΜ

I	N. D.	N.D.	1	0,6	1	0,6	9±6	56 ±4	12±3	0	0	53 + 8
It	N.D.	N.D.	1,0	1,0	0	50 ±10	0	20 ±12
III	N. D.	N.D.	2,3	3,4	0	0	51 ±11	0
IV	N.D.	N.D.	3.2	2,2	13±8	32 ±9	0	29 ±10
V	N.D.	1,8	1.8	2,5	0	0	0
Vl	N.D.	1.0	1.0	1,0	0	0	39 ±14
Referenzpeptide
BBS 3,C	) ± 1
[Leu13 Ψ (CH2-NH)LeU14JBBS	29 ± 10	0

A = Analoga sind in Kombination mit BBS gegeben

B = Zellen sind mit Analoga vorbehandelt, gewaschen, 24 Stunden lang bei 37"C gelassen und dann BBS ausgesetzt worden.

Tabelle 3

Phosphorylierung des p115-Proteins, welches mit dem Bombesin-Rezeptor verbunden ist

Verbindung	Minimale aktive Dosis (nM)	3
I	>4000	>10000
Il	>1000	> 10000
III	500	>200
IV	500
V	>2000
Vl	>1000
Referenzpeptide:
BBS
Spantid
(pro2)Spantid
[LeU13UMCHr-	NH)LeU14IBBS

Die Peptide mit der Formel I finden daher bei der Therapie von humanen Neoplasmen Anwendung, die in ihrem Wachstum und in der Progression durch Peptide der GRP-Familie entweder direkt oder zusammen mit anderen Wachstumsfaktoren moduliert

werden.

Zusätzlich können diese Alkylierungsanaloga bei der Behandlung der klinischen Symptome verwendet werden, die mit diesen Krankheiten verbunden sind und die auf Grund der Hypersekretion der GRP-artigen Peptide auftreten.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auf übliche Weise verabreicht werden, beispielsweise parenteral, zum Beispiel durch intravenöse Injektion oder Infusion, oder durch intramuskuläre, subkutane, intrakavitäre und intranasale Verabreichung.

Die Dosis hängt vom Alter, Gewicht und Zustand des Patienten oder von der Verabreichungsart ab.

Auf der Basis der ,in vitro" und ,in vivo" Daten bei Mäusen kann abgeschätzt werden, daß die therapeutischen Dosen bei Menschen im Bereich von 1 ng/kg bis 100 mg/kg, einmal bis 6mal am Tag liegt.

Die Erfindung stellt ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfugung, die eine Verbindung gemäß Formel (I) als aktive Substanz in Verbindung mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Trägern enthalten.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen werden üblicherweise nach üblichen Methoden hergestellt und in einer pharmazeutisch geeigneten Form verabreicht. Beispielsweise können Lösungen für die intravenöse Injektion oder Infusion als Träger beispielsweise steriles Wasser enthalten oder sie können vorzugsweise in der Form von sterilen wäßrigen

isotonischen Kochsalzlösungen vorliegen.

Suspensionen oder Lösungen für die intramuskulären Injektionen können zusammen mit der aktiven Verbindung einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, zum Beispiel steriles Wasser, Olivenöl, Ethyloleat, Glycole (z.B. Propylenglycol) und, falls erforderlich, eine geeignete Menge von Lidocainhydrochlorid enthalten.

Weiterhin wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Behandlung von neuroendocrinen Neoplasmen (beispielsweise Kleinzellen-Lungencarcinome und protastatische Carcinome) oder zur Behandlung der klinischen Symptome vorgeschlagen, die mit diesen Krankheiten bei Patienten, die daran leiden, verbunden sind, wobei das Verfahren darin besteht, daß diesen Patienten eine

erfindungsgemäße Zusammensetzung verabreicht wird.

Chemie Verfahren:

a) TLC wurde auf vorbeschichteten Platten aus Silicagel 60 F₂₅₄ (Merck), Schichtdicke 0,25 mm. Länge 20cm, mit den folgenden

Eluenten durchgeführt:

System A: n-Butanol/Essigsäure/Wasser = 600/150/150 (Volumen) System B: Chloroform/Methanol/NH^OH 30% = 500/364/154 (Volumen) System C: Chloroform/Methanol = 90/10(Volumen) System D: Dichloromethan/Diethylester = 90/10 (Volumen) System E: Acetonitril/Wasser/Ameisensäure = 80/20/10 (Volumen)

b) Eine analytische RP-HPLC wurde mit Hilfe eines Hewlett Packard Mod. 1084-Gerätes auf einer LiChrosorbHibarRP-18 Kolonne (Merck) 250 χ 4mm I.D.,

Teilchendurchmesser 5 μιη, durchgeführt. Die folgenden Laufmittel wurden verwendet:

A = KH₂PO₄ 2OmM, pH3,5/Acetonitril 9/1 (Volumen)

B = KH₂PO₄ 2OmM, pH 3,5/ Acetonitril 3/7 (Volumen)

Die Elution würde eingestellt auf einen linearen Gradienten von 60%bis 90% B über eine Zeitspanne von 20 Minuten (System

A) oder von 30 bis 70 % B über eine Zeitspanne von 15 Minuten (System B) und anschließend wurde die Elution für eine Dauer von 15 Minuten isokratisch durchgeführt, mit einer Flußrate von 1 ml/min.

Die Peptide werden durch ihre Retentionszeit (RT) charakterisiert

c) Eine präparative RP-HPLC wurde durchgeführt, wobei ein Delta Prep 3000 Gerät (Waters) mit einer Deltapak-Kolonne (Waters), 300 χ 19mm I.D.,

Teilchendurchmesser IOpm, verwendet wurde. Die folgenden Laufmittel wurden verwendet:

A = 0,05% TFA in Wasser

B = 0,05% TFA in Acetonitril/Wasser 7/3 (Volumen)

Flußrate = 24ml/min; Wellenlänge der Detektion = 220nm.

Die Elutionsverfahren werden bei den einzelnen Beispielen angegeben.

In jedem Fall wurden Fraktionen durch analytische RP-HPLC geprüft und solche Fraktionen, die eine Reinheit von mehr als 98% aufwiesen, wurden gesammelt. Nach der Entfernung von Acetonitril wurde die Lösung lyophilisiert.

d) Eine Aminosäurenanalyse wurde mit sauren Hydrolysaten durchgeführt (entweder 22 Stunden lang bei 110⁰C in 6 N HCI + 0,1 % Phenol oder 16 Stunden lang bei 100°C in 3 N Mercaptoethansulfonsäure (in beiden Fällen unter Stickstoffatmosphäre). Nur natürliche Aminosäurereste wurden bestimmt. Aufgrund der teilweisen Zersetzung unter normalen Hydrolysebedingungen wurde Trp nur in Hydrolysaten mit Mercaptoethansulfonsäure bestimmt.

Beispiel 1

Herstellung von 4-{CICH₂CH₂)₂N(yH₄CCM"hr-Gln-Trp-Ala-VaW3ly-^eu-4Vlet-NH₂(l).

25,2mg (0,096mmol) von (p-bis(2-chloroethyl)amin)benzoesäure wurden mit 5ml destilliertem DMF gelöst und 60mg (0,064mmol) von H-Thr-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Leu-Met-NH2 · HCI (EP-Patentanmeldung Nr.89102283.2) wurden aufeinander folgend zugegeben; die Lösung wurde auf 5°C abgekühlt und 0,0176ml NMM (0,16 mmol) und 0,0425g BOP (0,096mmol) wurden hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, dann wurde sie tropfenweise bei einer Temperatur von 5°C in 100 ml einer 10%igen Zitronensäurelösung hineingegeben. Die Mischung wurde bei einer Temperatur unterhalb von 10°C eine Stunde lang gerührt, dann filtriert und mit Wasser bis zur Neutralität gewaschen: 66,1 mg des rohen Produktes (90% Ausbeute) wurden erhalten. Das Produkt wurde durch präparative RP-HPLC gereinigt, wobei mit einem Gradienten von 60% bis 90% an Laufmittel B in Laufmittel A über eine Dauer von 30 Minuten gefahren wurde (Flußrate 35ml/min): 33mg Produkt I (50% Ausbeute) wurden erhalten: Rf_A0,61; RT_A = 8,66; FAB-MS: m/z1147 (MH⁺); AAVerhältnisse: Thr 0,98 (1), GIu 1, AIa 0,97 (1), VaI 0,95 (1), GIy 1,04 (1),Leu 1,02 (1), Met 0,90 (1) (Trp n.d.).

Beispiel 2

Herstellung von

4-(CIC₂CHj)JNC₆H₄CO-ThT-GIn-TrP-AIa-VaI-GIy-LeU-NIe-NH₂ (II).

0,2g (0,216 mmol) von H-Thr-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Leu-Nle-NHz · HCI (hergestellt nach dem Verfahren, welches in der Europäischen Patentanmeldung Nr.89102283.2 für H-Thr-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Leu-Met-N^ - HCI) beschrieben ist, wurden mit0,085g (0,324mmol) (p-bis(2-chloroethyl)amin)benzoesäure,0,143g (0,324mmol) POB und0,059ml NMM (0,537mmol) in 17 ml destilliertem DMF zur Reaktion gebracht, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist Das Rohprodukt wurde durch präparative RP-HPLC gereinigt, wobei diese mit einem Gradienten von 45% bis 90% an Laufmittel B in Laufmittel A über eine Dauer von 20 Minuten durchgeführt wurde: 0,122g (50% Ausbeute) an Produkt Il wurden erhalten: RF_A0,75; RT_A 10,39; FAB-MS: m/z 1129 (MH⁺); AA Verhältnisse: Thr0,97(1), GIu 1,AIa 034(1),VaI0,96(1), GIy(D,Leu0,92(1), Nie0,87(1) (Trp n.d.).

Beispiel 3

Herstellung von

₂₂₂₆₄ργ(ρμ₂()

Nach der gleichen Vorgehensweise wie für Beispiel 1 beschrieben ist, wurden 63mg (0,24 mmol) (p-Bis(2-chloroethyOaminJbenzoesäure und 200 mg (0,16mmol)

HCI · H-Thr-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-(Dnp)-Leu-Met-NH₂ (hergestellt aus Boc-Thr-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-OH) (eigene Europäische Patentanmeldung Nr.89102283.2) und HCI. H-His(DnpM-eu-Met-NH₂ (F.Angelucci und R. de Castiglione (19751 Experientia, 507-508) unter Anwendung des Verfahrens, welches in dergleichen Patentanmeldung für analoge Verbindungen beschrieben ist, zur Reaktion gebracht, wodurch 161 mg (70% Ausbeute) der rohen Verbindung III erhalten wurden. Das Produkt wurde durch präparative RP-HPLC gereinigt, die mit einem Gradienten von 60% bis 90% an Laufmittel B in Laufmittel A über eine Dauer von 20 Minuten gefahren wurde: 60mg (26% Ausbeute) an Produkt III wurden erhalten: Rf_A0,70; RT_A 14,45; RT_B 24,82; FAB-MS: m/z 1451 (MH⁺); AA Verhältnisse: Thr 1,05 (1),Glu1, GIy 1,03(1), AlaO,99(1), VaI 0,95 (1), Met 0,90(1), Leu 0,97(1), (Trp und His n.d.).

Beispiel 4 Herstellung von

65mg (0,05 mmol) der Verbindung (III) wurden in 3ml eines 0.02M Phosphatpuffers mit pH8 suspendiert und mit 2-Mercaptoethanol behandelt. Die resultierende klare Lösung konnte 20 Minuten lang reagieren, dann wurde sie unter Rühren in 300ml Et₂O gegossen. Der Niederschlag wurde filtriert, sorgfältig mit Et₂O gewaschen, dann zwischen Bu-OH und Wasser

verteilt. Die organische Phase wurde auf ein kleines Volumen konzentriert, und das Peptid wurde durch Verdünnung mit AcOEt/ Et₂O ausgefällt: 50 mg der rohen Verbindung (IV) (71 % Ausbeute) wurden erhalten. Das Produkt wurde durch präparative RP-HPLC gereinigt, die mit einem Gradienten von 40% bis 90% an Laufmittel B im Laufmittel A für eine Dauer von 30 Minuten gefahren wurde: 25mg (36% Ausbeute) an IV wurden erhalten: Rf_A 0,39; RT_A9,26; RT„ 19,41; FAB-MS: m/z 1284 (MH⁺); AA Verhältnisse: Thr 1,05 (1); GIn (1), GIy 1,03(1), AIa 0,99 (1), VaI 0,95 (1), Met 0,88 (1), His 0,91 (1) (Trpn.d.).

Beispiel 5

Herstellung von CICH₂CHjN(NO)CO-THr-GIn-TrP-AIa-VaI-GIy-LeU-NIe-NH₂(V).

Schritt 1

CICH₂CH₂NHCO-OSu (Va)

5,75g (0,05 mol) N-Hydroxysuccinimid wurden in 125ml AcOEt gelöst und bei einer Temperatur von 0⁰C mit 12,92 ml (0,075mmol) N-Ethyl-diisopropy(amin und 5,12ml (0,060mol) 2-Chloroethylisocyanat zur Reaktion gebracht, die aufeinander folgend tropfenweise hinzugegeben wurden. Die Reaktionsmischung wurde 48 Stunden lang heftig gerührt, dann wurde das Losungsmittel abgezogen, und der Rest wurde zwischen AcOEt und Wasser verteilt. Die organische Phase wurde über Na₂SO₄ getrocknet und auf ein kleines Volumen abgedampft. Das Produkt kristallisierte beim Stehen in der Kälte aus: 7,68g (70% Ausbeute) an Verbindung (Va) wurden erhalten: Schmelzpunkt 104-107⁰C; Rf_c 0,43; FAB-MS: m/z 220 (M⁺); ¹H-NMR (200MHz, DMSO-d₆) delta (ppm): 8,57 (t, 1 H, CH₂NHCO), 3,64 (t, 2H, CICH₂CH₂), 3,39 (m, 2H, CH₂CH₂NH), 2,75 (s, 4H, Succinimid); Elementaranalyse (C₇H₉NjO₄CI): C 38,10 (38,11), H 4,10 (4,11), N 12,67 (12,70), Cl 16,00 (16,07). CICH_zCH₂N(NO)CO-OSu (Vb)

1,100g (0,005mol) der Verbindung (Va) wurden in 12ml CH₂CI₂ gelöst und bei einer Temperatur vonO°C mit 0,800ml (0,010mol) Pyridin und 14,0 ml (0,020 mol) 1,4 N NOCI in CH₂CI₂ zur Reaktion gebracht. Die Reaktionsmischung wurde 5 Stunden lang heftig gerührt, dann mit kaltem Wasser gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und auf ein kleines Volumen eingeengt. Die Kristallisation begann bei Raumtemperatur und wurde in der Kälte vervollständigt. 0,80g (64% Ausbeute) an Verbindung (Vb) wurden erhalten: Schmelzpunkt 101-103⁰C; Rf_c0,87; FAB-MS: m/z 249(M⁺); ¹H-NMR (200MHz, DMS0-d₆) delta (ppm): 4,13 (t, 2H,CICH₂CH₂), 3,69 (t, 2H,CH₂CH₂NNO), 2,89 (s,4H,Succinimid); Elementaranalyse (C₇H₈N₃O₆CI): C33,70(33,68); H3,25(3,23), N 16,82 (16,83), Cl 14,80 (14,20)

CICH₂CH₂N(NO)CO-Thr-Gln-Trp-nAla-Val-Gly-Leu-Nle-NH₂(V) 0,185g (0,2mmol)

HCI - H-Thr-Gln-Trp—AIa-VaI-GIy-LeU-NIe-NH₂ (vergleiche Beispiel 2) wurden in einer Mischung aus 0,5 ml Hexamethylphosphorylamid und 0,5ml N-Methylpyrrolidon suspendiert und bei Raumtemperatur mit 0,028ml (0,2mmol) Triethylamin, anschließend 0,100g (0,4mmol) Verbindung (Vb) zur Reaktion gebracht. Nach einem zweistündigen Rühren wurde die Reaktionsmischung mit Wasser verdünnt: 0,150g (73% Ausbeute) der rohen Verbindung (V) wurden erhalten. Eine 50 ml Probe wurde durch präparative RP-HPLC gereinigt, die mit einem Gradienten von 10% bis 90% an Laufmitte! A in Laufmittel B für eine Dauer von 30 Minuten gefahren wurde: Rf₈ 0,59; RT_B 16,10; FAB-MS: m/z 1020 (MH⁺); ¹H-NMR (200 MHz, DMSO d₆) delta (ppm) La.: 3,60 (t,2H,CICH₂CH₂); AA-Verhältnisse: Thr0,91 (1),GIu 1,07(1), AIa 1,03(1),VaI 1,GIy 1,02(1),Leu 1,01(1), Nie 0,90(1) (Trpn.d.).

Beispiel 6

Herstellung von

CH₃(CH₂)3CH(COCH₂CI)NHCO(CH₂)₂CO-Thr-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Leu-Met-NH₂(VI) Schritt 1

BoC-NIe-CH=N₂(VIa)

4,60g (0,02 mol) Boc-Nle-OH in 40ml wasserfreiem THF wurden bei einer Temperatur von -12°C mit 2,20ml (0,02mol) NMM und 2,62 ml (0,02 mol) Isobutylchlorocarbonat zur Reaktion gebracht. Nach einer Minute wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 ml Et₂O und durch Kühlen der Lösung auf —35°C abgeschreckt. Die Salze wurden abfiltriert, und das Filtrat wurde auf -70⁰C abgekühlt.

In einem getrennten Reaktionskolben wurden 3,96g (0,06 mol) KOH, welches in 20 ml 50%igem EtOH gelöst war, innerhalb von 10 Minuten bei 0⁰C tropfenweise zu einer Lösung aus 6,43 g(0,03mol)N-Methyl-N-nitroso-p-toluolsulfonamid in 100ml Et₂O und 10ml Ethylenglykolmonomethylether hinzugegeben. Das somit gebildete Diazomethan wurde direkt in den Reaktionskolben destilliert, welches das zuvor gebildete und abgekühlte gemischte Anhydrid enthielt. Nach einem 20stündigen Rühren der Reaktionsmischung bei einer Temperatur von 0⁰C wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft, und der Rest wurde zwischen AcOEt und 0,5 M wäßrigem KHCO₃ verteilt. Die organische Schicht wurde bis zur Neutralität mit Sole gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum eingeengt, wodurch sich ein Öl ergab, das beim Stehen in der Kälte kristallisierte: 2,9g (57% Ausbeute) der Verbindung (VIa) wurden erhalten: Schmelzpunkt 83-85X; Rf₀ 0,51; ¹H-NMR (200MHz, DMSO-d₆) delta (ppm) i.a.: 6,00 (s, 1 H, CH=N₂); FD-MS: m/z 255 (M⁺) Elementaranalyse (C₁₂H₂₁N₃O₃): C 56,50 (56,45), H 8,30 (8,29), N, 16,47(16,46).

Schritt 2

HCI · H-NIe-CH₂CI (VIb)

2,4g (0,01 mol) BoC-NIe-CH=N₂ (VIa) wurden in 20ml 4,4 N HCI in Dioxan gelöst. Nach 5 Minuten bei Raumtemperatur wurde das Produkt mit Et₂O ausgefällt: 1,56g (78% Ausbeute) an Verbindung (VIb) wurden erhalten:

Schmelzpunkt 153-154"C; Rf_E 0,63; ¹H-NMR (200MHz, DMSO-d₆) delta (ppm) i.a.: 4,84,4,74 (2d, 2H, CH₂CI); FD-MS: m/z 199 (M⁺); Elementaranalyse (C₇H_1SNOCI₂); C42,02(42,01), H 7,54 (7,55), N 6,96(6,99),Cl 35,42(35,43).

HOOC-CHzCH₂-CO-NIe-CH₂CI (VIc)

0,60g (3mmol) HCI H-NIe-CH₂CI (VIb) und 0,33ml (3mmol) NMM wurden in 10ml DMF gelöst und bei 0°C mit 0,30g <3mmol) Succinanhydrid in 5 ml DMF zur Reaktion gebracht, welches tropfenweise innerhalb von 10 Minuten hinzugegeben wurde. Nach 30 Minuten wurde die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur gebracht und weitere 4 Stunden bei dieserTemperatur gerührt.

Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abgezogen, der Rest wurde in AcOEt aufgenommen und, nach der Filtration

des unlöslichen Materials mit 0,02 M HCI, Sole gewaschen und schließlich über Na₂SO₄ getrocknet. Das Abziehen des Lösungsmittels und das Zerreiben mit Et₂O/PE ergab 0,35g (44% Ausbeute) an Verbindung (VIc): Schmelzpunkt 114-116°C, Rf_B 0,33; ¹H-NMR (200MHz, DMSO-d₆) delta (ppm) i.a.: 4,57 (s, 2H,CH₂-CI); Elementaranalyse (Ci₁H₁₈NO₄CI): C49,74 (50,10),H 5,34 (5,31), Cl 13,16(13,44).

CHJ(CH₂)JCH(COCH₂CI)NHCO(CH₂)₂CO-Thr-Gln-Trp-HAIa-VaM3ly-Lβu-Mβt-NH_I(VI) 100mg (0,106mmol) HCI.

H-Thr-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Leu-Met-N^ (Europäische Patentanmeldung Nr.89102283.2) und 0,006ml (0,106mmol) NMM in 2 ml DMF wurden bei einerTemperaturvon 0⁰C mit 31 mg (0,120mmol) HOOC-(CHj)₂CO-NIe-CH₂CI (VIC), 19mg (0,143mmol) HOBT und 27 mg (0,133 mmol) DCC zur Reaktion gebracht. Die Reaktionsmischung wurde dann 4 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abgezogen, der Rest wurde mit warmem Isopropylalkohol trituriert, und das unlösliche Material wurde durch Filtration isoliert: 50mg (40% Ausbeute) an Verbindung (Vl) wurden erhalten: Rf_A0,42; RT_B 15,10; FAB-MS: m/z 1149(MH⁺); AA-Verhältnisse:ThrO,95(1),GIu 1,AIa 1.08(1),VaI0,97(1),GIy 1,01 (D.Leu 1,00 (1), Met 0,93 OMTrpn.d.).

Claims (1)

1. -1- 298 Patentansprüche:

   1. Ein Peptid der Formel I:

   R-A-B-C-Trp-Ala-Val-X-Y-T-W I

   worin bedeuten:

   R eine Gruppe der Formel