DD294500A5 - METHOD FOR PRODUCING A LARGE NUMBER OF PEPTIDE ANALOGS - Google Patents
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Abstract
Es wird ein Verfahren zur Erzeugung einer groszen Anzahl von Analoga eines gewaehlten Peptids beschrieben. Das Verfahren umfaszt die folgenden Schritte: Synthetisierung von zwei unterschiedlichen Gemischen von gleichlangen Oligonucleotiden, die an einigen bestimmten Positionen unterschiedliche Basen und am 3-Ende einige identische Basen besitzen, Mischen der beiden Gemische zur Bildung eines Gemischs von partiell doppelstraengigen, gleichlangen DNA-Sequenzen, die danach enzymatisch in vollstaendig doppelstraengige DNA-Sequenzen umgewandelt werden, Schneiden des zuletzt genannten Gemischs mit zwei verschiedenen Enzymen zur Erzeugung von DNA-Sequenzen, die an einen in aehnlicher Weise geschnittenen Vektor ligiert werden koennen, Inserieren der DNA-Sequenzen in den Vektor durch Ligation, um ein Gemisch von Vektoren zu erzeugen, die dann in einer an sich bekannten Art und Weise in einen Wirt transformiert werden, Vermehrung des Wirts zur Bildung von Kolonien, die nacheinander analysiert werden, um die DNA-Sequenzen festzustellen, die fuer ein einzelnes Protein codieren, unter Expressionsbedingungen separate Vermehrung der groszen Anzahl von Wirten zur Erzeugung einer groszen Anzahl von Analoga des gewaehlten Peptids. Auszerdem werden neue Analoga von VIP und ein Plasmid, das ein Gen enthaelt, das fuer eines der neuen Analoga von VIP codiert, offenbart.{Verfahren; Herstellung; Peptid; Oligonucleotide; Basen; 3-Ende; DNA-Sequenzen; Enzyme; Vektor}A method of generating a large number of analogs of a selected peptide will be described. The method comprises the following steps: synthesizing two different mixtures of identically long oligonucleotides having different bases at some specific positions and some identical bases at the 3-end, mixing the two mixtures to form a mixture of partially double-stranded, equally long DNA sequences, which are then enzymatically converted into completely double-stranded DNA sequences, cutting the latter mixture with two different enzymes to produce DNA sequences that can be ligated to a similarly cut vector, inserting the DNA sequences into the vector by ligation to generate a mixture of vectors, which are then transformed into a host in a manner known per se, proliferating the host to form colonies which are analyzed sequentially to detect the DNA sequences encoding a single protein encode, under expression conditions separate growth of the large number of hosts to produce a large number of analogs of the chosen peptide. In addition, new analogs of VIP and a plasmid containing a gene encoding one of the novel analogs of VIP are disclosed. manufacture; Peptide; oligonucleotides; bases; 3 'end; DNA sequences; enzymes; Vector}
Description
Charakteristik dos bekannton Standes der TechnikCharacteristic dos bekannton state of the art
Die pharmazeutische Industrie und unabhängige Wissenschaftler in der Forschung suchen ständig nach neuen Verbindungen, die «ich von nützlichen bekannten Verbindungen etwas unterscheiden, mit dem Ziel, noch wirksamere, noch spezifischere usw. Derivate zu finden. Gesetzt den Fall, die in Frage kommende bekannte Verbindung ist ein Peptid oder Polypeptid, so weiden ein oder mehrere Aminosäurereste von dessen Aminosäuresequenz durch andere natürliche oder nicht natürliche Aminosäurereste substituiert.The pharmaceutical industry and independent scientists in research are constantly looking for new compounds that "I distinguish something from useful known compounds with the aim of finding even more effective, more specific, etc. derivatives. Assuming the case that the candidate compound of interest is a peptide or polypeptide, one or more amino acid residues of its amino acid sequence are substituted by other natural or non-natural amino acid residues.
Für Screeningzwecke wäre es wünschenswert, wenn man gleichzeitig eine große Anzahl von Analoga eines gewählten Peptids herstellen könnte, um sowohl Zeit als auch Geld zu sparen.For screening purposes, it would be desirable to be able to simultaneously make a large number of analogues of a chosen peptide in order to save both time and money.
Die vorliegende Erf'idung stellt ein Verfahren zur gleichzeitigen Erzeugung einer großen Anzahl von Analoga eines gewählten Peptids, worin alle Aminosäurereste die L-Konfiguration aufweisen, zur Verfügung, und die durch das Verfahren erzeugten Analoga sind Analoga von VIP.The present invention provides a method of simultaneously producing a large number of analogs of a selected peptide, wherein all amino acid residues have the L configuration, and the analogs generated by the method are analogs of VIP.
Vasoaktives Intestinalpolypeptid (VIP) ist ein stark basisches Peptid mit einer Länge von 28 Aminosäuren mit einem C-terminalen Amid, das zur Glucagon-Secretin-Familie gehört. VIP wurde erstmals von S. Said und V. Mutt im Jahre 1970 (Said, S. I., und Mutt, V. (1970) Science 169,1217-1218) aus oberem Intestinalgewebe des Schweins isoliert und wurde später sowohl in Nervengewebe als auch in endokrinen Zellen (Said, S.l. [1982]) Vasoactive Intestinal Peptide (Raven Press, N.Y.) und (Said, S.l. [1984] Peptides 5,143-150) gefunden. Die biologischen Wirkungen von VIP umfassen die Gefäßerweiterung von Gehirnblutgefäßen, die Stimulierung der Prolaktinfreisetzung, die Stimulierung der Pankreasexokrinsekretion, die Wirkung auf die Peniserektion (Said, S. I. [1982]) Vasoactive Intestinal Peptide (Raven Press, N. Y.) und (Roslöne, W. H. [1984] Progress in Neurobiology 22,103-129) und (Mutt, V. [1083) in Brain Peptides, Herausgeber Krieger, D.T., und Autorenkollektiv), die Verstärkung des cholinergisch stimulierten Speichelflusses (Lundberg, J. M., und Autorenkollektiv [1982) Acta Physiol. Scan. 114,329-337) und die Wirkung als oberflächenaktive Substanz in der Lunge (Barnes, P. J. [1987] TIPS, 8,24-27). In jüngster Zeit wurde das für Human-VIP codierende Präkursor-Gen isoliert und sequenziert (Bodner, M., und Autorenkollektiv [1985] Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82,3548-3551) und (Linder, S., und Autorenkollektiv [1987] Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 84, 605-609). Die Sequenzdaten zeigen, daß am 3'-Ende des für VIP codierenden Gens drei zusätzliche Tripletts vorhanden sind, die für die Aminosäuresequenz Gly-Lys-Arg codieren. Es wurde gezeigt, daß C-terminale Gly-Lys-Arg oder GIy allein als Substratstellen für C-terminale Amidierung durch Peptidylglycin-a-amidierende Monooxygenase (PAMase) wirken können, was in verschiedenen Geweben nachgewiesen wurde (Bradbury, A. F., und Autorenkollektiv [1982] Nature 298,686-688) und (Eipper, B. A., und Autorenkollektiv [1983] Peptides 4,921-928) und (Glembotski, C. Cry, und Autorenkollektiv [1984] J. Biol. Chem. 259, 6385-6392) und (Gomez, S., und Autorenkollektiv [1984] FEBS Lett. 167,160-164) und (Eipper, B. A., und Autorenkollektiv [1985] Endocrinology, 116,2497-2504) und (Quafik, H., und Autorenkollektiv [1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84,261-264). Es ist offensichtlich, daß die Massenproduktion von VIP, einem Peptidhormon von breiter biologischer Wirksamkeit, mittels gentechnischer Verfahren wünschenswert ist. Obwohl das Human-Präkursor-Gen für VIP isoliert und charakterisiert wurde (Bodner, M., und Autorenkollektiv [1985] Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82,3548-3551) und (Linder, S., und Autorenkollektiv [1987] Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84,605-609), wurde über seine Expression in einem anderen Organismus bisher noch nicht berichtet. Die erfindungsgemäßen VIP-Analoga wurden in E.coli produziert.Vasoactive intestinal polypeptide (VIP) is a 28 amino acid strong base peptide with a C-terminal amide belonging to the glucagon secretin family. VIP was first isolated from upper intestinal tissue of the pig by S. Said and V. Mutt in 1970 (Said, SI, and Mutt, V. (1970) Science 169, 1217-1218) and later became both in nervous tissue and endocrine Cells (Said, Sl [1982]) Vasoactive Intestinal Peptides (Raven Press, NY) and (Said, Sl [1984] Peptides 5,143-150). The biological effects of VIP include vasodilatation of cerebral blood vessels, stimulation of prolactin release, stimulation of pancreatic exocrine secretion, action on penile erection (Said, SI [1982]) Vasoactive Intestinal Peptide (Raven Press, NY) and (Roslöne, WH [1984 Progress in Neurobiology 22, 103-9) and (Mutt, V. [1083] in Brain Peptides, editor Krieger, DT, and author collective), the enhancement of cholinergic stimulated salivary flux (Lundberg, JM, and author collective [1982] Acta Physiol. Scan. 114, 329-337) and the action as a surfactant in the lung (Barnes, P.J. [1987] TIPS, 8, 24-27). More recently, the human VIP-encoding precursor gene has been isolated and sequenced (Bodner, M., and Autorenkollektiv [1985] Proc Natl Acad, U.S.A., 82, 3548-3551) and (Linder, S., and Authors collective [1987] Proc Natl Acad., Sci., USA, 84, 605-609). The sequence data show that there are three additional triplets encoding the amino acid sequence Gly-Lys-Arg at the 3 'end of the gene encoding VIP. It has been demonstrated that C-terminal Gly-Lys-Arg or Gly alone can act as substrate sites for C-terminal amidation by peptidylglycine a-amidating monooxygenase (PAMase) as has been demonstrated in various tissues (Bradbury, AF, and Autorenkollektiv [ 1982] Nature 298,686-688) and (Eipper, BA, and author collective [1983] Peptides 4,921-928) and (Glembotski, C. Cry, and author collective [1984] J. Biol. Chem. 259, 6385-6392) and ( Gomez, S., and Autorenkollektiv [1984] FEBS Lett. 167, 160-164) and (Eipper, BA, and Autorenkollektiv [1985] Endocrinology, 116, 2497-2504) and (Quafik, H., and Autorenkollektiv [1987] Proc. Natl. Acad. Be. USA, 84, 261-264). It is apparent that mass production of VIP, a peptide hormone of broad biological activity, is desirable by genetic engineering techniques. Although the human precursor gene for VIP has been isolated and characterized (Bodner, M., and Autorenkollektiv [1985] Proc Natl Acad., USA, 82, 3548-3551) and (Linder, S., and Autorenkollektiv [ 1987, Proc Natl Acad., USA, 84, 605-609), has not yet been reported on its expression in another organism. The VIP analogues of the invention were produced in E. coli.
Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention
In einem erfindungsgemäßen Aspekt wird ein Verfahren zur Herstellung einer großen Anzahl von Analoga eines gewähltenIn one aspect of the invention, a method of preparing a large number of analogs of a selected one is disclosed
Peptids zur Verfugung gestellt, das folgende Stufen umfaßt:Peptide comprising the following steps:
Synthetisierung eines ersten Gemische von gleichlangen Oligonucleotiden, die an einigen definierten PositionenSynthesizing a first mixture of identically long oligonucleotides at some defined positions
unterschiedliche Basen und am 3'-Ende einige identische Basen besitzen,have different bases and at the 3'-end some identical bases,
Mischen des ersten Gemische mit einem in gleicherweise synthetisierten zweiten Gemisch von Oligonucleotiden, wobei die Basen r.m 3'-Ende der Oligonucleotido des ersten Gemischs an die Basen des 3'-Endes der Oligonucleotide des zweiten Gemische hybridisieren („annealing"), was zu einem Gemisch von partiell doppelsträngigen, gleichlangen DNA-Sequenzen führt, die danach enzymatisch in vollständig doppelstiängige DNA-Sequenzen umgewandelt werden, gleichzeitiges oder nacheinander ' erfolgendes Schneiden des Gemischs, das aus doppelsträngigen DNA-Sequenzen besteht, die am 3'-Ende eine Stelle zum Schneiden mit einem ersten Enzym und am 5'-Ende eine Stelle zum Schneiden mit einem zweiten Enzym besitzen, mit dem ersten und dem zweiten Enzym, um DNA-Sequonzen mit 3'- und 5'-Enden zu erzeugen, die an die 5'- und 3'-Enden eines inMixing the first mixture with a similarly synthesized second mixture of oligonucleotides, wherein the bases of the 3 'end of the oligonucleotide of the first mixture anneal to the bases of the 3' end of the oligonucleotides of the second mixture, resulting in a Mixture of partially double-stranded, equally long DNA sequences, which are then converted enzymatically into completely double-stranded DNA sequences, simultaneous or sequential cutting of the mixture consisting of double-stranded DNA sequences, which at the 3 'end a site for cutting with a first enzyme and at the 5 'end a site for cutting with a second enzyme, with the first and the second enzyme to produce DNA sequences with 3' and 5 'ends adjacent to the 5' end. and 3 'ends of an in
ähnlicher Weise geschnittenen Vektors ligiert werden können,similarly cut vector can be ligated
Inserieren der so geschnittenen DNA-Sequenzen in den so geschnittenen-Vektor durch Ligation, um ein Gemisch von Vektoren zu erzeugen, die anschließend in einer an sich bekannten Art und Weise in einen Wirt transformiert werden,Inserting the thus-cut DNA sequences into the thus-cut vector by ligation to generate a mixture of vectors, which are then transformed into a host in a manner known per se,
Vermehrung des Wirts zur Bildung von Kolonien, die nacheinander analysiert werden, um die DNA-Sequenzen festzustellen, diePropagating the host to form colonies which are analyzed sequentially to detect the DNA sequences that
für ein einzelnes Protein codieren,code for a single protein,
unter Expressionsbedingungen separate Vermehrung der großen Anzahl von Wirten, die Vektoren enthalten, die die identifizierten, für ein Protein codierenden Sequenzen aufweisen, um eine große Anzahl von Analoga des gewählten Peptidsunder conditions of expression, separately multiply the large number of hosts containing vectors having the identified protein coding sequences to a large number of analogs of the chosen peptide
herzustellen.manufacture.
Beispiele für beim obengenannten Verfahren zu verwendende Wirte sind Bakterien, z. B. von Genus Bacillus oder EscherichiaExamples of hosts to be used in the above method are bacteria, e.g. B. Genus Bacillus or Escherichia
coli, sowie Hefen, z.B. Saccharomyces cerevisiae.coli, as well as yeasts, e.g. Saccharomyces cerevisiae.
Beispiele für beim obengenannten Verfahren zu veivvendende Vektoren sind Bakteriophagen und Plasmide.Examples of vectors to be used in the above-mentioned method are bacteriophages and plasmids.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Aspekts ist das gewählte Peptid ein Analog des vasoaktivenIn a preferred embodiment of the aspect of the invention, the selected peptide is an analog of the vasoactive
Intestinalpolypeptids (VIP), der Vektor ist ein Plasmid und der Wirt ist E. coli.Intestinal polypeptide (VIP), the vector is a plasmid and the host is E. coli.
Im Ergebnis der Durchführung der bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde eine große AnzahlAs a result of carrying out the preferred embodiment of the method according to the invention was a large number
von VIP-Analoga hergestellt, die einen zusätzlichen erfindungsgemäßen Aspekt darstellen.of VIP analogs which represent an additional aspect of the invention.
In einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt wird somit ein VIP-Analog zur Verfugung gestellt, das ausgewählt wird aus derIn a further aspect of the invention, therefore, a VIP analog is provided, which is selected from the
aus folgendem bestehenden Gruppe:from the following existing group:
Analoga von VIP, die die folgende Aminosäuresequenz aufweisenAnalogs of VIP having the following amino acid sequence
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-X-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Y-1 2 3 4 5 6 7 0 9 10 11 12 13 14His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-X-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Y-1 2 3 4 5 6 7 0 9 10 11 12 13 14
-Lys-Gln-Leu-Ala-Val-Z-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-W 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 ( -Lys-Gln-Leu-Ala-Val-Z-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-W 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 (
worin X Thr, Ser, Pro oder AIa darstellt,wherein X represents Thr, Ser, Pro or Ala,
Y Thr, Lys, He oder AIa darstellt,Y represents Thr, Lys, He or Ala,
Z Thr, Lys, He oder Arg darstellt, undZ represents Thr, Lys, He or Arg, and
W -NH2, -COOH, GIy oder Gly-Lys-Arg darstellt,W represents -NH 2 , -COOH, Gly or Gly-Lys-Arg,
(die aus dem Verfahren resultieren und die ursprünglich hergestellt werden sollten);(which result from the process and which should be prepared originally);
Analoga von VIP, die die gleiche Aminosäuresequenz aufweisen, worin W -NH2, -COOH oder GIy darstellt,Analogs of VIP having the same amino acid sequence wherein W represents -NH 2 , -COOH or Gly,
mit Ausnahme von His in Position 1, das durch Asp ersetzt wird, wenn X = Ala, Y = He und Z = Thr, mit Ausnahme von His in Position 1, das durch Tyr ersetzt wird, wenn X = Pro, Y = Thr und Z = Lys,with the exception of His in position 1, which is replaced by Asp, if X = Ala, Y = He and Z = Thr, with the exception of His in position 1, which is replaced by Tyr, if X = Pro, Y = Thr and Z = Lys,
mit Ausnahme von Ser in Position 2, das durch Tyr ersetzt wird, und Asp in Position 8, die durch Tyr ersetzt wird, wenn X = Thr,with the exception of Ser in position 2, which is replaced by Tyr, and Asp in position 8, which is replaced by Tyr, if X = Thr,
Y = Thr und Z = Thr,Y = Thr and Z = Thr,
mit Ausnahme von Asp in Position 3, die durch GIy ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Thr und Z = Arg, mit Ausnahme von AIa in Position 4, das durch Pro ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Arg und Z = Thr, mit Ausnahme von VaI in Position 5, das durch Phe ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Thr und Z = Lys, mit Ausnahme von Asp in Position 8, die durch Asn ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Arg und Z = Arg, mit Ausnahme von Asp in Position 8, die durch GIy ersetzt wird, wenn X = Pro, Y = Thr und X = Lys,with the exception of Asp in position 3, which is replaced by GIy if X = Thr, Y = Thr and Z = Arg, with the exception of AIa in position 4, which is replaced by Pro, if X = Thr, Y = Arg and Z = Thr, with the exception of VaI in position 5, which is replaced by Phe, if X = Thr, Y = Thr and Z = Lys, with the exception of Asp in position 8, which is replaced by Asn, if X = Thr, Y = Arg and Z = Arg, except for Asp in position 8, which is replaced by GIy, if X = Pro, Y = Thr and X = Lys,
mit Ausnahme von Asp in Position 8, die durch GIn ersetzt wird, und VaI in Position 19, das durch Phe ersetzt wird, wenn X = Pro,with the exception of Asp in position 8, which is replaced by GIn, and VaI in position 19, which is replaced by Phe, if X = Pro,
Y = He und Z = Arg,Y = He and Z = Arg,
mit Ausnahme von Asp in Position 8, die durch Pro ersetzt wird, wenn X = Ser, V = He und Z = Arg, mit Ausnahme von Thr in Position 11, das durch Pro ersetzt wird, wenn X = AIa, ' = Lys und Z = Lys, mit Ausnahme von Arg in Position 12, das durch Pro ersetzt wird, wenn X = Pro, Y = Thr und Z = Thr, mit Ausnahme von Lys in Position 15, das durch Asn ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Lys und Z = lie, mit Ausnahme von Lys in Position 15, das durch Arg ersetzt wird, wenn/' = Pro, Y = He und Z = Lys, mit Ausnahme von Lys in Position 15, das durch GIn ersetzt wird, wenn X = Ala, Y = Lys und Z = Arg, mit Ausnahme von Lys in Position 15, das durch Thr ersetzt wird, wenn X = AIa1Y = lleundZ = Lys, mit Ausnahme von GIn in Position 16, das durch His ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Lys und Z = Lys, mit Ausnahme von GIn in Position 16, das durch His ersetzt wird, wenn X = Pro, Y = He und Z = Thr, mit Ausnahme von VaI in Position 19, das durch Phe ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = He und Z = He, mit Ausnahme von Asn in Position 24, das durch Lys ersetzt wird, wenn X = Pro, Y = Thr und Z = Thr, mit Ausnahme von Asn in Position 24, das durch He ersetzt wird, wenn X = Ser, Y = Lys und Z = Thr, mit Ausnahme von Asn in Position 28, das durch Asp ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Arg und Z = Lys, und X = GIy, wenn Y = Lys und Z = Lys, undwith the exception of Asp in position 8, which is replaced by Pro, if X = Ser, V = He and Z = Arg, with the exception of Thr in position 11, which is replaced by Pro, if X = Ala, '= Lys and Z = Lys, except for Arg at position 12, which is replaced by Pro, if X = Pro, Y = Thr and Z = Thr, except for Lys at position 15, which is replaced by Asn, if X = Thr, Y = Lys and Z = lie, except for Lys at position 15, which is replaced by Arg, if / '= Pro, Y = He and Z = Lys, except for Lys at position 15, which is replaced by GIn when X = Ala, Y = Lys and Z = Arg, except for Lys at position 15 which is replaced by Thr when X = Ala 1 Y = 1 and Z = Lys, with the exception of GIn at position 16 which is replaced by His when X = Thr, Y = Lys and Z = Lys, except for GIn at position 16, which is replaced by His, if X = Pro, Y = He and Z = Thr, with the exception of VaI at position 19, which is replaced by Phe if X = Thr, Y = He and Z = He, with off Assumption of Asn in position 24, which is replaced by Lys, if X = Pro, Y = Thr and Z = Thr, except for Asn in position 24, which is replaced by He, if X = Ser, Y = Lys and Z = Thr, except for Asn in position 28, which is replaced by Asp, if X = Thr, Y = Arg and Z = Lys, and X = GIy, if Y = Lys and Z = Lys, and
X = AIa, wenn Y = Asn und Z = Arg,X = Ala if Y = Asn and Z = Arg,
(die als Mutanten aus einem Durchgang der bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens entstanden) und Analoga von VIP, die die gleiche Aminosäuresequenz aufweisen, worin W -NH2, -COOH oder -Gly-Lys-Arg darstellt,(which resulted as one-pass mutants of the preferred embodiment of the method of the invention) and analogs of VIP having the same amino acid sequence wherein W represents -NH 2 , -COOH or -Gly-Lys-Arg,
mit Ausnahme von Ser in Position 2, das durch Phe ersetzt wird, wenn X = Pro, Y = Thr und X = Arg, mit Ausnahme von Asp in Position 3, die durch VaI ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Lys und Z = Me, mit Ausnahme von AIa in Position 4, das durch Pro ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Thr und Z = Lys, mit Ausnahme von VaI in Position 5, das durch Phe ersetzt wird, wenn X = Pro, Y = Thr und Z = He, mit Ausnahme von Phe in Position 6, das durch Thr ersetzt wird, wenn X = Ala, Y = Thr und Z = Thr, mit Ausnahme von Asp in Position 8, die durch VaI ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Thr und Z = Thr, mit Ausnahme von Thr in Position 11, das durch Pro ersetzt wird, wenn X = Pro, Y = Thr und Z = Lys, mit Ausnahme von Thr in Position 11, das durch Pro ersetzt wird, wenn X = Pro, Y = He und Z = Arg, mit Ausnahme von Leu in Position 13, das durch Arg ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Lys und Z = Arg, mit Ausnahme von Leu in Position 13, das durch GIn ersetzt wird, wenn X.= Pro, Y = Lys und Z = Lys, mit Ausnahme von Leu in Position 13, das durch Pro ersetzt wird, wenn X = Pro, Y = Thr und Z = Thr,with the exception of Ser in position 2, which is replaced by Phe, if X = Pro, Y = Thr and X = Arg, with the exception of Asp in position 3, which is replaced by VaI, if X = Thr, Y = Lys and Z = Me, with the exception of AIa in position 4, which is replaced by Pro, if X = Thr, Y = Thr and Z = Lys, with the exception of VaI in position 5, which is replaced by Phe, if X = Pro, Y = Thr and Z = He, except for Phe at position 6, which is replaced by Thr when X = Ala, Y = Thr and Z = Thr, with the exception of Asp at position 8, which is replaced by VaI, if X = Thr, Y = Thr and Z = Thr, except for Thr in position 11, which is replaced by Pro, if X = Pro, Y = Thr and Z = Lys, with the exception of Thr in position 11, which is replaced by Pro is replaced when X = Pro, Y = He and Z = Arg except for Leu at position 13 which is replaced by Arg when X = Thr, Y = Lys and Z = Arg except for Leu at position 13 which is replaced by GIn if X. = Pro, Y = Lys and Z = Lys, with Ausna hme of Leu in position 13, which is replaced by Pro, if X = Pro, Y = Thr and Z = Thr,
mit Ausnahme von Leu in Position 13, das durch Pro ersetzt wird, wenn X = Pro, Y = ThrundZ = Arg,with the exception of Leu in position 13, which is replaced by Pro, if X = Pro, Y = ThrundZ = Arg,
mit Ausnahme von Leu in Position 13, das durch Arg ersetzt wird und Lys in Position 15, das durch GIn ersetzt wird, wenn X = Ser, Y = Thr und Z = Thr,with the exception of Leu in position 13, which is replaced by Arg and Lys in position 15, which is replaced by GIn, if X = Ser, Y = Thr and Z = Thr,
mitAusnahmevon Lys in Position 15, das durch GIn ersetzt wird, wenn X = Pro, Y = Lys und Z = Arg, mit Ausnahme von Lys in Position 15, das durch Asn ersetzt wird, wenn X = Ser, Y = Lys und Z = Arg, mit Ausnahme von VaI in Position 19, das durch Asp ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Lys und Z = Lys, mitAusnahmevon VaI in Position 19, das durch GIy ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Lys und Z = Thr, mit Ausnahme von Asn in Position 24, das durch Asp ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Thr und Z = IIe, mit Ausnahme von Asn in Position 24, das durch Asp ersetzt wird, wenn X = Ala, Y = He und Z = Arg, mit Ausnahme von Asn in Position 24, das durch Lys ersetzt wird, wenn X = Ser, Y = Me und Z = Thr, mit Ausnahme von Ser in Position 25, das durch Tyr ersetzt wird, wenn X = Pro, Y= Me und Z = Thr und mit Ausnahme von He in Position 26, das durch VaI ersetzt wird, wenn X = Ser, Y = ThrundZ = He, (die als Mutanten aus einem zweiten Durchgang der bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens entstanden).with the exception of Lys in position 15, which is replaced by GIn, when X = Pro, Y = Lys and Z = Arg, with the exception of Lys in position 15, which is replaced by Asn, if X = Ser, Y = Lys and Z = Arg, except for VaI at position 19, which is replaced by Asp when X = Thr, Y = Lys and Z = Lys, except VaI at position 19, which is replaced by GIy when X = Thr, Y = Lys and Z = Thr, except for Asn in position 24, which is replaced by Asp if X = Thr, Y = Thr and Z = IIe, except for Asn in position 24, which is replaced by Asp, if X = Ala, Y = He and Z = Arg, except for Asn in position 24, which is replaced by Lys if X = Ser, Y = Me and Z = Thr, with the exception of Ser in position 25, which is replaced by Tyr, if X = Pro, Y = Me and Z = Thr and with the exception of He in position 26, which is replaced by VaI, if X = Ser, Y = ThrundZ = He, (which are mutants from a second round of the preferred embodiment of the invention procedural originated).
Alle Aminosäurereste im erfindungsgemäßen VIP-Analog weisen die L-Konfiguration auf.All amino acid residues in the VIP analog of the invention have the L configuration.
In einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt wird ein Plasmid zur Verfügung gestellt, das ein Gen enthält, das eine DNA-Sequenz besitzt, die für ein erfindungsgemäßes VIP-Analog codiert.In another aspect of the invention, there is provided a plasmid containing a gene having a DNA sequence encoding a VIP analog of the invention.
Alle erfindungsgemäßen VIP-Analoga besitzen ähnliche Eigenschaften wie natürliches Human-VIP. Somit sind die erfindungsgemäßen VIP-Analoga als potentielle wirksame Bestandteile in neuen Pharmazeutika wie duch in Kosmetika (zur Wasseranlagerung der Haut) nützlichAll VIP analogues of the invention have similar properties to natural human VIP. Thus, the VIP analogues of the present invention are useful as potential active ingredients in new pharmaceuticals such as cosmetics (for hydration of the skin)
Die neuen Pharmazeutika sind dazu gedacht The new pharmaceuticals are meant for that
1) bei der Behandlung von Asthma und bei der Konstriktion der oberen Luftwege im allgemeinen und bei der Vasodilation in den Lungen im besonderen,1) in the treatment of asthma and in the constriction of the upper airways in general and in the vasodilation in the lungs in particular,
2) als lokal angewandte äußere Vasodilatoren, z. B. bei der Peniserektion,2) as locally applied external vasodilators, e.g. B. at the penile erection,
3) bei der Behandlung von VIPOMA (ein VIP, das Intestinaltumor hervorbringt, der durch einen Wasserverlust von 5-15 Litern pro Tag zum Tode führt),3) in the treatment of VIPOMA (a VIP producing intestinal tumor leading to death by a water loss of 5-15 liters per day),
4) bei der Behandlung von Störungen des Blutflusses, Blutdruckes, der Intestinalmotilität und der Harnblase,4) in the treatment of disorders of blood flow, blood pressure, intestinal motility and bladder,
5) für die Verstärkung der Salivation, ζ. B. bei der Behandlung von blockierter oder reduzierter Salivation (ζ. Β. infolge der Verabreichung von Antipsychosemedikamenten oder Antidepressiva), und5) for the reinforcement of salivation, ζ. In the treatment of blocked or reduced salivation (ζζΒ due to the administration of antipsychotic drugs or antidepressants), and
6) für die Stimulierung der Pankreassaftsekretion verabreicht zu werden.6) for the stimulation of pancreatic juice secretion.
Das pharmazeutische Präparat einschließlich der Wirkstoffe hängt von der Verabreichungsart und der zu behandelnden speziellen Störung ab. Ein nasales oder orales Spray ist geeignet, wenn Asthma behandelt werden soll. Wäßrige Lösungen oder Tabletten zur oralen Verabreichung werden bei anderen Indikationen geeignet sein. Bei allen Arten von pharmazeutischen Präparaten befindet sich der Wirkstoff in einer Beimischung mit pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoffen und/oder Streckmitteln, die normalerweise in der Pharmazie verwendet werden.The pharmaceutical preparation, including the active ingredients, depends on the mode of administration and the particular disorder to be treated. A nasal or oral spray is suitable for treating asthma. Aqueous solutions or tablets for oral administration will be useful in other indications. For all types of pharmaceutical preparations, the active ingredient is in admixture with pharmaceutically acceptable carriers and / or diluents normally used in pharmacy.
Allgemeine Strategie zur Erhaltung von for VIP-Analoga codierenden DNA-Sequenzen, die In einem E.-coli-Expressionsvektor clonlert werdenGeneral Strategy for the Preservation of DNA Sequences Coding for VIP Analogs Cloned in an E. coli Expression Vector
Es war geplant, eine große Anzahl von künstlichen Genen, die für VIP-Analoga codieren, direkt in nur einer Cionierstufe als Teile eines E.-coli-Plasmidexpressionsvektors zu erhalten. Die Synthesestrategie nutzte das Prinzip eines Verfahrens, das erstmals von Simonesits A., Kalman, M., Cserpän, J., und Kari, C. (1984) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 14,321) zur Gewinnung einer großen Anzahl künstlicher E.-coli-Promoterderiv?te beschrieben worden war. Kurz gesagt wurden zwei einzelsträngige Oligodesoxyribonucleotide chemisch synthetisiert und durch ihro 3'-terminalen Komplementärsequenzen hybridisiert („annealed") (Itakura, K. [1982] TIBS, 7,443). Der so gewonnene Pbrtialduplex umfaßte die gesamte VIP codierende Region und enthielt zusätzliche terminale Sequenzen, die zum Cionieren eingesetzt werden. Die beiden Oligodesoxyribonucleotide wurden durch nicht eindeutige chemische Synthesen gewonnen, so daß das Gemisch aller vier aktivierten Nucleotidmonomere an bestimmten vorbestimmten Positionen, die sich außerhalb der „annealing"-Region befanden, verwendet wurde. Der hybridisierte („annealed") Partialduplex wurde durch eine beiderseitig gestartete („primed") Synthese, die durch DNA-Polymerase (Klenow-F'-jment) bewirkt wurde, in ein doppelsträngiges DNA-Gemisch umgewandelt, das alle möglichen Homoduplexe enthielt. Diese wurden dann mit zwei verschiedenen Restriktionsendonucleasen geschnitten, deren Schnittstellen „upstream" und „downstream" von der für VIP codierenden Region lagen, und das Schnittgemisch wurde mit dem in geeigneter Weise geschnittenen Expressionsvektor pPEX ligiert. Das HgierteGemisch wurde in die kompetenten E. coli Zellen transformiert und die VIP-verwandte Codiersequenzen enthaltenden Rekombinanten wurden durch Koloniehybridisierung selektioniert. Die positiven Rekombinanten wurden weiter durch Nucleotidsequenzierung analysiert, um die in der clonierten VIP-Codierregion erhaltenen besonderen Mutationen zu identifizieren. Während des Entwurfs der synthetischen Oligodesoxyribonucleotide wurde berücksichtigt, daß sie für eine Methioninextension, die der VIP-codierenden Region vorangeht, und für eine GIy-(VIPa-Analoga) oder eine Gly-Lys-Arg-(VIPb-Analoga)-Extension am Carboxy-Terminus codieren müssen. Methionin wurde mit eingeschlossen, damit die VIP-Analoga aus dem Fusionsprotein durch CNBr-Schneiden freigesetzt werden können, während die Carboxy-Terminus-Extensionen als Substratstellen für durch Peptidylglycin-a-amidierende Monooxygenase (PAMase) katalyiserteAmidierung dienen können (Bradburg, A.F., Finnie, M. D. A., und Smyth, D.C. (19821 Nature 298,686). Die Positionen der gemischten chemischen Kopplungen (.couplings") innerhalb der Nucleotidsequenzen wurden so gewählt, daß sie in den vorbestimmten Codonen X, Y und Z lagen, so daß nach Durchführung der in Schema 1 gezeigten Stufen die maximale Anzahl , von Aminosäurevariationen für X, Y und Z erhalten wurden. Durch Wählen der ersten (für Codon X) oder der zweiten (für die Codone Y und Z) Base der Zielcodone als ge.nischte Positionen, können 4 Aminosäuren von je «irei Codonvariationen erhalten werden, was nach der Expression zusammen 64 mögliche VIP-Analoga ergibt.It was planned to obtain a large number of artificial genes encoding VIP analogues directly in just one step of cionization as part of an E. coli plasmid expression vector. The synthesis strategy exploited the principle of a method first described by Simonesits A., Kalman, M., Cserpän, J., and Kari, C. (1984) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 14,321) to obtain a large number of artificial E. coli promoter residues. Briefly, two single-stranded oligodeoxyribonucleotides were chemically synthesized and annealed by their 3'-terminal complementary sequences (Itakura, K. [1982] TIBS, 7, 433) .The thus obtained pBR tial duplex comprised the entire VIP coding region and contained additional terminal sequences The two oligodeoxyribonucleotides were obtained by ambiguous chemical syntheses so that the mixture of all four activated nucleotide monomers was used at certain predetermined positions outside the annealing region. The annealed partial duplex was converted to a double-stranded DNA mixture containing all possible homoduplexes by a primed synthesis effected by DNA polymerase (Klenow-F'-jment). These were then cut with two different restriction endonucleases, whose sites were upstream and downstream from the VIP coding region, and the cut mixture was ligated with the appropriately cut expression vector pPEX. The hydrogenated mixture was transformed into the competent E. coli cells and the recombinants containing the VIP-related coding sequences were selected by colony hybridization. The positive recombinants were further analyzed by nucleotide sequencing to identify the particular mutations obtained in the cloned VIP coding region. During the design of the synthetic oligodeoxyribonucleotides, it was considered that it is for a methionine extension preceding the VIP coding region and for a GIy (VIPa analog) or a Gly-Lys-Arg (VIPb analog) extension at the carboxy Need to encode the term. Methionine was included to allow the VIP analogues to be released from the fusion protein by CNBr cutting, while the carboxy-terminus extensions can serve as substrate sites for peptidyl-glycine-α-amidating monooxygenase (PAMase) catalyzed amidation (Bradburg, AF, Finnie , MDA, and Smyth, DC (19821 Nature 298,686). The positions of the mixed chemical couplings ("couplings") within the nucleotide sequences were chosen to be in the predetermined codons X, Y, and Z, such that after performing the in Scheme 1 shows the maximum number of amino acid variations for X, Y, and Z. By choosing the first (for codon X) or the second (for the codons Y and Z) base of the target codons as compounded positions, 4 Amino acids are obtained from each "irei codon variations, resulting in a total of 64 possible VIP analogues after expression.
Das VIP 1-Oligonucleotid, das in Schema 1 als der Oberstrang des hybridisierten Partialduplexes gezeigt ist, enthält zwei gemischte Positionen (N), während der untere Strang, VIP2-Oligonucleotjd, nur eine enthält. Das VIP2-Oligonucleotid wurde inThe VIP 1 oligonucleotide shown in Scheme 1 as the top strand of the hybridized partial duplex contains two mixed positions (N), while the bottom strand, VIP2 oligonucleotide, contains only one. The VIP2 oligonucleotide was in
zwei Varianten hergestellt, die die oben angeführten Informationen für C-terminale Extensionen tragen (VIP2a und VIP2 b-Oligonucleotide in Schema 1). Um sowoh' VIPa- als auch VIPb-Analoga zu erhalten, wurden zwei getrennte Experimente mit den OligonucleotidenVIPI + VIP2abzw. VIP1 +VIP2b durchgeführt.prepared two variants that carry the information given above for C-terminal extensions (VIP2a and VIP2b oligonucleotides in Scheme 1). To obtain both VIPa and VIPb analogs, two separate experiments were performed with the oligonucleotides VIPI + VIP2. VIP1 + VIP2b performed.
Das durch Klenow-Polymerasereaktion gewonnene doppelsträngigeDNA-Gemisch enthielt Homoduplexmoleküle, die durch Cionieren in einen Expressionsvektor getrennt wurden. Im Prinzip sollten alle Rekombinanten nur einen Typ von Mutantengen, das für ein bestimmtes VIP-Analog codiert, enthalten.The double-stranded DNA mixture obtained by Klenow polymerase reaction contained homoduplex molecules which were separated by cionization into an expression vector. In principle, all recombinants should contain only one type of mutant gene coding for a particular VIP analog.
pPEX VektorpPEX vector
pPEX ist ein hochwirksamer E.coli Expressionsvektor, der aus einem rac-Fusionspromotor-Vektor Laint23, von uns als pPEX bezeichnet, konstruiert wurde (Borus, J., Lukacsovich/T., Baliko, G., und Venetianer, P. [1986] Gene 42,97). Der Laint23-Vektor, der unter rac-Promoterkontrolle ein Fusionsprotein exprimiert, das aus 280 Aminosäuren von E.-coli ß-Galactosidase und einem Teil dör bakteriellen CAT (Chloramphenicolacetyltransferase) zusammengesetzt war, wurde durch Eliminieren einer einzigartigen Barn HI-Stelle und durch Austausch einerzwischen den CIaI- und Eco Rl-Stellen gelegenen CAT-Codierregion Jurch eine synthetische Polyclonierregion modifiziert. Die so gewonnene relevante Region des pPEX-Vektors wird in Schema 2 gezeigt. Der Vektor enthält die einzigartigen Bam Hl-, Kpn I, Sacl-, Apa I- und Eco Rl-Stellen in der Polyclonierregion und mit Hilfe der Barn HI-Stellen und beliebiger anderer der einzigartigen Stellen können ß-Galactosidasegenfusionen erfolgen. Wenn die VIP-codierenden Gene in die Bam Hl- und Eco Rl-Stellen des pPEX-Vektors cloniert werden, codieren die erhaltenen Genfusionen für 314 bzw. 316 Aminosäuren lange ß-Galactosidase-VIPa- bzw. ß-Galactosidase-VIPb-Fusionsproteine, von denen 284 Aminosäuren aus dem Fusionspartner abgeleitet werden (Schema 1).pPEX is a highly potent E. coli expression vector constructed from a rac fusion promoter vector Laint23, referred to by us as pPEX (Borus, J., Lukacsovich / T., Baliko, G., and Venetianer, P. [1986 Gene 42,97). The Laint23 vector expressing under rac promoter control a fusion protein composed of 280 amino acids of E. coli β-galactosidase and a portion of the bacterial CAT (chloramphenicol acetyl transferase) was isolated by elimination of a unique Barn HI site and exchange a CAT coding region located between the CIaI and EcoRI sites modified by a synthetic polycloning region. The relevant region of the pPEX vector thus obtained is shown in Scheme 2. The vector contains the unique Bam HI, Kpn I, SacI, Apa I and Eco RI sites in the polycloning region, and with the aid of Barn HI sites and any of the other unique sites, β-galactosidase gene fusions can be made. When the VIP-encoding genes are cloned into the Bam HI and Eco RI sites of the pPEX vector, the gene fusions obtained encode for 314 and 316 amino acid long β-galactosidase-VIPa and β-galactosidase-VIPb fusion proteins, respectively. of which 284 amino acids are derived from the fusion partner (Scheme 1).
Ausführungsbeispielembodiment
Herstellung des Gemlschs von DNA-Regionen, die für VIP-Analoga codleren MaterialienPreparation of the mixture of DNA regions containing materials more coding for VIP analogs
Restriktionsenzyme und T4-DNA-Ligase wurde von New England Biolabs bezogen. T4-Polynuc!eotidkinase und Klenow-Polymerase wurden von Boehringer, (y-32P) ATP (> 5000Ci/Mmol) und (a-32P) dATP (800Ci/Mmol) wurden von Amersham, gegen BSA-VIP-Konjugate gerichtete Kaninchen-Antiseren wurden von Dr. Per Askelöf (SBL, Stockholm, Schweden) bereitgestellt. Immunoblot-Testkits, die Anti-Kaninchen-lgG-alkalisches-Phosphatase-Konjugat und Farbentwicklungsreagenzien BCIP/NBT enthielten, wurden von Bio-Rad gekauft. T,RNase wurde von Calbiochem gekauft.Restriction enzymes and T4 DNA ligase was purchased from New England Biolabs. T4 polynucleotide kinase and Klenow polymerase were prepared by Boehringer, (y- 32 P) ATP (> 5000 Ci / mole) and (α- 32 P) dATP (800 Ci / mole) were directed by Amersham against BSA-VIP conjugates Rabbit antisera were used by Dr. med. Provided by Askelöf (SBL, Stockholm, Sweden). Immunoblot test kits containing anti-rabbit IgG alkaline phosphatase conjugate and color developing reagents BCIP / NBT were purchased from Bio-Rad. T, RNase was purchased from Calbiochem.
OllgodesoxyribonucleotldeOllgodesoxyribonucleotlde
CCGGATCCATATGCACTCTGACGCTGTTTTCNCTGACAACTACACT-CGTCTGANAAAACAGCTGGCT (VIP 1-Oligonucleotid),CCGGATCCATATGCACTCTGACGCTGTTTTCNCTGACAACTACACT-CGTCTGANAAAACAGCTGGCT (VIP 1 oligonucleotide),
AAGAATTCAGCCGTTCAGGATAGAGTTCAGGTACTTTNTAACAGCC-AGCTGT (VIP 2 a-Oligonucleotid),AAGAATTCAGCCGTTCAGGATAGAGTTCAGGTACTTTNTAACAGCC-AGCTGT (VIP 2 a-oligonucleotide),
AAGAATTCAACGTTTGCCGTTCAGGATAGAGTTCAGGTACTTTNTA-ACAGCCAGCTGT (VIP 2 b-Oligonucleotid) undAAGAATTCAACGTTTGCCGTTCAGGATAGAGTTCAGGTACTTTNTA-ACAGCCAGCTGT (VIP 2 b oligonucleotide) and
CAGGGTGAAACGCAGGTCCCCAGCGGC (Iac Z27-mer Primer) Oligonucleotide wurden durch die Phosphoramiditchemie (Pharmacia Gene Assembler) auf einem DNA-Syntheseautomaten hergestellt und durch Elektrophorese auf Polyacrylamidgelen, die 8 M Harnstoff enthielten, gereinigt. Die Oligonucleotide wurden mit (γ-32Ρ) ATP mit Hilfe von T4-Polynucleotidkinase (Maniatis, T., Fritsch, E. F., und Sambrook, J. [1982] Molecular Cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N. Y.) 5'-phosphoryliert, wenn sie entweder als Hybridisiersonde oder als Sequenzierprimer verwendet werden sollten.CAGGGTGAAACGCAGGTCCCCAGCGGC (Iac Z27-mer primer) Oligonucleotides were prepared by phosphoramidite chemistry (Pharmacia Gene Assembler) on a DNA synthesizer and purified by electrophoresis on polyacrylamide gels containing 8M urea. The oligonucleotides were probed with (γ- 32 Ρ) ATP using T4 polynucleotide kinase (Maniatis, T., Fritsch, EF, and Sambrook, J. [1982] Molecular Cloning: A laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY) are 5'-phosphorylated if they should be used either as a hybridization probe or as a sequencing primer.
lOOpmol VIP1-Oligonucleotid wurden mit lOOpmol VIP2a- oder mit VIP2b-Oligonucleotiden in 50 μΙ Wasser vermischt, das Gemisch wurde3 Minuten bei 90°Cgehalten und dann in etwa einer Stunde auf Zimmertemperatur abgekühlt. Die Lösung wurde auf 100μΙ aufgefüllt und enthielt 1OmM Tris-HCI, pH8,2, 5mM MgCI2, je 50μΜ dCTP, dGTP und TTP, 5μΙ (α-32Ρ) dATP (etwa 62,5pmol) und 1 μΙ 5 Einheiten/μΙ Klenow-Polymerase. Nach 15Min. wurden 10μΙ des 1 niM dDNTP-Gemischs (das alle 4 Desoxynucleosid-5'-Triphosphate enthielt) zugegeben, und die Lösung wurde 15Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Die DNA wurde mit Hilfe von 1 μΙ 10pg/pl Hefeträger-tRNA (ctRNA) durch Ethanolpräzipitation präzipitiert und durch Gelelektrophorese mit 10%igem Acrylamid und 8 M Harnstoff bei 400V in 2 Stunden gereinigt (Geldicke 0,4mm). Das Gel wurde durch Radioautographie untersucht, die radioaktive Hauptbande wurde ausgeschnitten und 12 Stunden bei 370C in 300μΙ einer S0-mM-Lösung aus NaCI und 0,1 % SDS eingeweicht. Das Überstehende wurde mit Phenol extrahiert und die Präzipitation erfolgte durch Zugabe von 1 μΙ von 10μg/μl ctRNA, 30μΙ von 3 M NaOAc, pH 5,2 und 900 μΙ Ethanol in einem Flüssigstickstoffbad. Die Zentrifugierung (14000U/min"', 3min) ergab ein radioaktives Pellet, das mit Ethanol gewaschen, getrocknet und in sterilem Wasser aufgelöst wurde.100 μl of VIP1 oligonucleotide was mixed with 100 μl of VIP2a or VIP2b oligonucleotides in 50 μl of water, the mixture was held at 90 ° C for 3 minutes and then cooled to room temperature in about one hour. The solution was made up to 100 μΙ and contained 10 mM Tris-HCl, pH 8.2, 5 mM MgCl 2 , 50 μΜ dCTP, dGTP and TTP, 5 μΙ (α- 32 Ρ) dATP (about 62.5 pmol) and 1 μΙ 5 units / μΙ Klenow polymerase. After 15min. were added 10μΙ of the 1 niM dDNTP mixture (containing all 4 deoxynucleoside 5'-triphosphates) and the solution became 15min. incubated at room temperature. The DNA was precipitated by ethanol precipitation with the aid of 1 .mu.l 10pg / .mu.l of yeast carrier tRNA (ctRNA) and purified by gel electrophoresis with 10% acrylamide and 8 M urea at 400 V in 2 hours (bead thickness 0.4 mm). The gel was examined by radioautography, the radioactive major band was excised and soaked in a 300μΙ S0 mM solution of NaCl and 0.1% SDS for 12 hours at 37 0 C. The supernatant was extracted with phenol and precipitation was carried out by adding 1 μΙ of 10 μg / μl ctRNA, 30 μΙ of 3 M NaOAc, pH 5.2 and 900 μΙ ethanol in a liquid nitrogen bath. Centrifugation (14000 rpm, 3 min) gave a radioactive pellet which was washed with ethanol, dried and dissolved in sterile water.
20pmol der wie oben beschrieben gewonnenen radioaktiven VIP-DNA wurden 20 Stunden bei 37 0C mit je 200 Einheiten Bam Hl und EcoRI in 200μΙ 10OmM NaCI, 5OmM Tris-HCI, pH7,5,1OmM MgCI2,1 mM DTT (salzreicher Puffer) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten lang auf 6O0C erhitzt, (zweimal) mit Phenol extrahiert, und die DNA wurde wie oben beschrieben durch Ethanolpräzipitation (zweimal) aus der Wasserphase zurückgewonnen, anschließend mit Ethanol gewaschen, getrocknet und in sterilem Wasser erneut aufgelölst. Die Analyse des Gemische durch Elektrophorese mit 10%igem Acrylamid und 8 M Harnstoff zeigte, daß nur etwa 50% des Duplexes geschnitten worden waren und die DNA-Fraktion, die durch beide Enzyme geschnitten worden war, betrug nur etwa 30%. Trotzdem wurde dieses Gemisch zur Clonierung in Barn Hl-Eco HI-geschnittenem pPEX-Vektor verwendet.20pmol the findings as described above radioactive VIP-DNA were 20 hours at 37 0 C with 200 units of Bam HI and Eco RI in 200μΙ 10OmM NaCl, 5OmM Tris-HCl, pH7,5,1OmM MgCl 2, 1 mM DTT (buffer salt-rich) treated. The reaction mixture was heated for 10 minutes at 6O 0 C and extracted (twice) with phenol, and the DNA was as described above by ethanol precipitation recovered (twice) from the water phase, then washed with ethanol, dried and aufgelölst resuspended in sterile water. Analysis of the mixture by electrophoresis with 10% acrylamide and 8 M urea showed that only about 50% of the duplex had been cut and the DNA fraction cut by both enzymes was only about 30%. Nevertheless, this mixture was used for cloning in Barn HI Eco HI cut pPEX vector.
Schneiden des pPEX-Vektors mit Bam Hl und Eco RlCutting the pPEX vector with Bam HI and Eco RI
2\ig pPEX 13 wurden mit 10-10 Einheiten von Bam Hl und EcoRl 4 Stunden bei 370C in 20μΙ salzreichem Puffer behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde auf ein Agarosegel (0,5%) gegeben und die Elektrophorese erfolgte 1 Stunde in TAE-Puffer (4OmM Tris-Acetat, 2mM EDTA, pH7,5) bei 60 V in Gegenwart von Ethidiumbromid. Die lineare Vektorbande wurde ausgeschnitten, elektroeluiert, zweimal mit Phenol extrahiert, mit Ethanol präzipitiert, mit Ethanol gewaschen und getrocknet. Das Pellet wurde in sterilem Wasser aufgelöst. 2 \ ig PPEX 13 were treated with 10-10 units of Bam HI and Eco RI for 4 hours at 37 0 C in 20μΙ high salt buffer. The reaction mixture was placed on an agarose gel (0.5%) and electrophoresed in TAE buffer (40 mM Tris-acetate, 2 mM EDTA, pH 7.5) at 60 V in the presence of ethidium bromide for 1 hour. The linear vector band was excised, electroeluted, extracted twice with phenol, ethanol precipitated, washed with ethanol and dried. The pellet was dissolved in sterile water.
0,2 μg mit Barn Hl-Eco Ri-geschnittener pPEX-Vektor und etwa 5 pmol Barn Hl-Eco RI-VIP-DNA, die wie oben beschrieben gewonnen worden waren, wurden in einem Reaktionsgemisch von 20μΙ, das 5OmMTHs-HCI, pH 7,5,1OmM MgCI2,1OmM DTT, 1 mM ATP und 80 Einheiten T4-DNA-Ligase enthielt, 12 Stunden bei 15°C umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde in JM101 E.coliZellen (Genotyp (A(lac-proAb), |F', traD36,proAB), laclqZAM 15) Messing, J„Crea, R., und Seeburg, P.H. (1981] Nucleic Acids Res. 9,309-321) mittels einer gefrorenen Kultur (Hanahan, D. in DNA-cloning, Vol. I, Hrsg. Glover, D. M. IRC Press Limited [1985], S. 109-135. Protokoll 3) transformiert. Arr.picillinresistente Kolonien wurden mittels 32P-markierter VIP1-Oligonucleotidsonde zur Koloniehyridisierung ausgesucht (Grunstein, M., und Hogness, D. S. [1085] Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72,3961-3965). Etwa 80-90% der Kolonien waren bei diesem Test nach VIPa- und VIPb-Mutanten positiv. 120 Kolonien aus beiden Serien wurden zur Plasmidherstellung und Sequenzierung verwendet.0.2 μg of Barn HI-Eco Ri-cut pPEX vector and about 5 pmol of Barn HI-Eco RI-VIP DNA, obtained as described above, were dissolved in a 20μΙ reaction mixture containing 5OmMTHs-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl 2 , 10 mM DTT, 1 mM ATP and 80 units of T4 DNA ligase were reacted at 15 ° C for 12 hours. The reaction mixture was assayed in JM101 E. coli cells (genotype (A (lac-proAb), | F ', traD36, proAB), lacl q ZAM 15) Messing, J "Crea, R., and Seeburg, PH (1981) Nucleic Acids Res. 9, 309-321) using a frozen culture (Hanahan, D. in DNA cloning, Vol. I, Ed. Glover, DM IRC Press Limited [1985], pp. 109-135, Protocol 3). Arr. Picillin resistant colonies were selected using 32 P-labeled VIP1 oligonucleotide oligonucleotide probe for colony-hyridization (Grunstein, M., and Hogness, DS [1085] Proc Natl Acad., USA 72, 3961-3965). About 80-90% of the colonies were positive for VIPa and VIPb mutants in this assay. 120 colonies from both series were used for plasmid production and sequencing.
Plasmidherstellung und SequenzierungPlasmid production and sequencing
Eine einzelne Kolonie wurde in 3 ml LB-Medium, das 100 Mg/mI Ampicillin enthielt, inokuliert und die Kultur wurde bei 37"C 12-16 Stunden lang geschüttelt. Die Plasmid-DNA wurde durch ein schnelles alkalisches Extraktionsverfahren (Birnboim, H. C. und DoIy, J. [1979] Nucleic Acids Res., 7,1513-1523) hergestellt. Die Plasmid-DNA wurde weiter mit 5 Einheiten Τ,-RNase in ΙΟΟμΙ Lösung, die 1OmM Tris-HCI, pH8,0,1 mM EDTA enthielt, 30 Minuten lang bei 370C behandelt, anschließend erfolgte eine Extraktion mit Phenol und eine Präzipitation mit Ethanol. Das Pellet wurde in 30μΙ sterilem Wasser aufgenommen. Die Didesoxynucleotidsequenzierung wurde an einer Hind lll-linearisierten Plasmidmatrize (0,2-0,4 μg) mittels 5'-32P-phosphoryliertem Iac 27-mer Sequenzierprimer (0,25pmol) und mit Wärmedenaturierung wie bei Hong, G.F., (1982) Bioscience Reports 2,907 beschrieben, durchgeführt. Sequenzierungsreaktionen für 24 Clone wurden gleichzeitig durchgeführt.A single colony was inoculated into 3 ml of LB medium containing 100 μg / ml ampicillin and the culture was shaken at 37 ° C for 12-16 hours The plasmid DNA was purified by a rapid alkaline extraction procedure (Birnboim, HC and DoIy, J. [1979] Nucleic Acids Res., 7, 1513-1523) .The plasmid DNA was further processed with 5 units of Τ, RNase in ΙΟΟμΙ solution containing 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA treated for 30 minutes at 37 ° C., followed by extraction with phenol and precipitation with ethanol The pellet was taken up in 30 μl sterile water Dideoxynucleotide sequencing was performed on a Hind III-linearized plasmid template (0.2-0.4%) μg) using 5'- 32 P-phosphorylated lac 27-mer sequencing primer (0.25 pmol) and heat denaturation as described in Hong, GF, (1982) Bioscience Reports 2,907. Sequencing reactions for 24 clones were performed simultaneously.
Expression von VIP-AnalogaExpression of VIP analogs
Mit pPEX-VIP-Analog-Plasmiden transformierte E.coli Zollen JM101 wurden bei 37°C unter Schütteln mit 250U min"1 in 1 ml LB-Medium, das 0,1 mg/ml Ampicillin enthielt, gezüchtet. Als die Zelldichte bei A = 600nm 0,5 erreichte, wurden die Zellen entweder durch Zugabe von IPTG (Endkonzentration 2,5mM) und vierstündigem Schütteln mit 250U min"1 bei 370C oder durch Zugabe von Lactose (Endkonzentration 1 %) und zwanzigstündigem Schütteln bei 250U min"1 induziert. Nach der Induktion wurden die Zellen durch Zentrifugieren bei 12000U min"' 1 Minute lang in einer Eppendorf-Zentrifuge gesammelt, 3 Minuten lang bei 1000C in 300μΙ Lysepuffer (0,125M Tris-HCI, pH6,8,30% Glycerol, 2% SDS, 6M Harnstoff und 1M 2-Mercaptoethanol) lysiert, und anschließend ließ man 30μΙ nicht induzierte Extrakte und 30μΙ induzierte Extrakte nach Laemmli, Großbritannien (1970) Nature, 227,680-685, zur Überwachung des Grades der Proteinexpression, wie durch Coomassiebrilliantblau-Färbung der Gele angezeigt wird, über SDS-10%ige Polyacrylamidgelo laufen. Wie aus den Gelen geschätzt wurde, betrug die Menge des exprimierten Fusionsproteins mehr als 60% der gesamten Zellproteine.With PPEX-VIP analog plasmids E. coli JM101 transformed inches were incubated at 37 ° C with shaking at 250U min "1 in 1 ml of LB medium containing 0.1 mg / ml ampicillin. When the cell density at A = 600 nm reached 0.5, the cells were either by the addition of IPTG (final concentration 2.5mM) and four hours of shaking with 250U min "1 at 37 0 C, or by adding lactose (final concentration 1%) and twenty hours shaking at 250U min" 1 induced. After induction, the cells were 1 minute collected by centrifugation at 12000U min "'in an Eppendorf centrifuge for 3 minutes at 100 0 C (in 300μΙ lysis buffer 0.125M Tris-HCl, pH6,8,30% glycerol , 2% SDS, 6M urea and 1M 2-mercaptoethanol), and then 30μΙ uninduced extracts and 30μΙ induced extracts were allowed to Laemmli, UK (1970) Nature, 227, 680-685 to monitor the level of protein expression, such as Coomassie Brilliant Blue Staining of the gels is shown to run over SDS-10% polyacrylamide gel. As estimated from the gels, the amount of expressed fusion protein was more than 60% of total cell proteins.
Immunologische Erkennung/immunologischer Nachweis von ß-Galactosldase-VIP-AnalogaImmunological detection / immunological detection of β-galactosidase VIP analogs
Man ließ 6^I-Aliquoten von nicht induzierten und 6μΙ von 50fach verdünnten induzierten Proben parallel auf SDS-10%igen Polyacrylamidgelen laufen und die Hälfe der Gele wurde mit Coomassie-Brilliantblau gefärbt, und die andere Hälfte der Gele wurde auf Nitrocelluloscpapiere elektrophoretisch übertragen. Diese Nitrocellulosepapiere wurden mit einem polyclonalen Kaninchenserum, das gegen BSA-VIP gerichtete Antikörper enthielt, inkubiert, und das Immunoblot wurde durch Behandlungen mit Ziegen-Anti-Kaninchen-1 gG-konjugierter alkalischer Phosphatase und BCIP/NBT-Farbentwicklerlösung (Bio-Rad-Immunoblot-Testkit) nach den Anweisungen des Herstellers entwickelt. Bei den VIP-Analoga enthaltenden Fusionsproteinen wurde eine sehr kräftige Immunofärbung erhalten.6 ^ I aliquots of uninduced and 6μΙ of 50-fold diluted induced samples were run in parallel on SDS-10% polyacrylamide gels and half of the gels were stained with Coomassie Brilliant Blue and the other half of the gels were electrophoretically transferred to nitrocellulose papers. These nitrocellulose papers were incubated with a polyclonal rabbit serum containing antibodies directed against BSA-VIP, and the immunoblot was performed by treatments with goat anti-rabbit 1 gG-conjugated alkaline phosphatase and BCIP / NBT color developing solution (Bio-Rad Immunoblot Test kit) according to the manufacturer's instructions. Very strong immunostaining was obtained with the VIP analogs-containing fusion proteins.
Reinigung von exprimierten ß-Galactosidase-VIP-Analog-Fuslonsproteinen In der Größenordnung von 1 Liter E.coli JM101 Zollen, die die pPEX-VIP-Analog-Plasmide trugen, wurden in 1 Liter LB-Medium, das 0,1 mg/ml Ampicillin enthielt, bei 370C mit 250U min"' geschüttelt. Wenn die optische Dichte (OD) bei 600nm 0,5 erreicht hatte, wurden die Zellen mit Lactose (Endkonzentration 1 %) induziert und 20 Stunden lang bei 37°C mit 250 U min"1 geschüttelt. Nach der Induktion wurden die Zellen durch zehnminütiges Zentrifugieren bei 2 000 χ g und 4°C geerntet, mit 40ml TBS, pH 7,6, gewaschen und in 30 ml TBS, die 10μΜ PMSF und 0,5mM EDTA enthielt, erneut suspendiert. Die Zellsuspension wurde anschließend gefroren und getaut und in einem Branson-Beschallungsgerätmit5 Impulsen von je einer Minute beschallt, anschließend bei 17000 x gund4°C30Minuten lang zentrifugiert. Das das Fusionsprotein enthaltende Pellet wurde in 50ml 6M Guanidiumchlorid enthaltendem 1%igem 2-Mercaptoethanol nach Goeddel, D. V., und Autorenkollektiv (1979) PNAS (USA), 76,106-110, homogenisiert und 60 Minuten lang bei 60000 χ g zentrifugiert. Die klare, bernsteinfarbene überstehende Flüssigkeit, die das Fusionsprotein enthielt, wurde mit 6M Guanidiumchlorid 1 %-2-Mercaptoethanol auf 100ml verdünnt und 172 ml TBS wurden tropfenweise unter starkem Rühren zugefügt, was dazu führte, daß der größte Teil des Fusionsproteins präzipitierte und der größte Teil der Wirtsproteine in Lösung blieb. Die Aufschlämmung wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten lang gerührt, bevor 30 Minuten lang bei 10°C mit , 10000 χ g zentrifugiert wurde. Das so gewonnene Pellet enthält den größten Teil des ß-Galactosidase-VIP-Analog-Fusionsproteins.Purification of expressed β-galactosidase VIP analogue-fuslone proteins On the order of 1 liter of E. coli JM101 cells carrying the pPEX-VIP analogue plasmids were added to 1 liter of LB medium containing 0.1 mg / ml ampicillin, shaking at 37 0 C with 250U min "" When the optical density had (OD) at 600nm reached 0.5, the cells (1% final concentration) was mixed with lactose and induced for 20 hours at 37 ° C and 250th U min "1 shaken. After induction, cells were harvested by centrifugation at 2,000 g and 4 ° C for ten minutes, washed with 40 ml of TBS, pH 7.6, and resuspended in 30 ml of TBS containing 10 μM PMSF and 0.5 mM EDTA. The cell suspension was then frozen and thawed and sonicated in a Branson sonicator with 5 pulses of one minute each, then centrifuged at 17,000 x g for 4 ° C for 30 minutes. The pellet containing the fusion protein was homogenized in 50 ml of 1% 2-mercaptoethanol containing 6M guanidium chloride according to Goeddel, DV, and Autorenkollektiv (1979) PNAS (USA), 76, 106-110, and centrifuged at 60,000 g for 60 minutes. The clear, amber supernatant containing the fusion protein was diluted to 100 ml with 6M guanidium chloride 1% -2-mercaptoethanol and 172 ml TBS was added dropwise with vigorous stirring which resulted in most of the fusion protein precipitating and largest Part of the host proteins remained in solution. The slurry was stirred at room temperature for 30 minutes before being centrifuged at 10 ° C for 30 minutes at 10,000 x g. The pellet thus obtained contains most of the β-galactosidase VIP analog fusion protein.
Schneiden des Fusionsproteins mit CNBrCutting the fusion protein with CNBr
Das teilweise gereinigte ß-Galactosidase-VIP-Analog-Fusionsprotein wurde durch Homogenisierung in 25 ml 70%iger HCOOH gelöst und 1,5g CNBr wurden pro Gramm Präzipitat zugegeben. Die Lösung wurde 70 Stunden bei Raumtemperatur gerührt undThe partially purified β-galactosidase-VIP analog fusion protein was dissolved by homogenization in 25 ml of 70% HCOOH and 1.5 g of CNBr was added per gram of precipitate. The solution was stirred at room temperature for 70 hours and
anschließend bei Raumtemperatur mittels eines Rotationsverdampfers unter reduziertem Druck eingedampft. 20ml 5OmM HCI in Methanol wurden pro Gramm Fusionsprotein zu dem Rückstand gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde die Aufschlämmung 10 Minuten lang bei 4°C mit 2000 x g zentrifugiert und das Überstehende wurde gesammelt.then evaporated at room temperature by means of a rotary evaporator under reduced pressure. 20 ml of 50 mM HCl in methanol were added to the residue per gram of fusion protein and stirred at room temperature overnight. Then, the slurry was centrifuged at 2000 x g for 10 minutes at 4 ° C, and the supernatant was collected.
Reinigung der VIP-Analoga Das die VIP-Analoga enthaltende Überstehende wurde erstens entwederPurification of the VIP Analogs The supernatant containing the VIP analogs either became either
- gefriergetrocknet und der das VIP-Analog enthaltende Rückstand wurde in 1%iger TFA gelöst und auf HPLC (Cig-Bondapack, Umkehrphase) gereinigt,freeze-dried and the residue containing the VIP analog was dissolved in 1% TFA and purified on HPLC (Cig-Bondapack, reverse phase),
oder zweitens _or secondly _
- vor der HPLC-Stufe einer wie im folgenden beschriebenen Reinigung unterzogen.- subjected to purification as described below prior to the HPLC step.
- Zur-der das VIP-Analog enthaltenden sauren Methanolphase wurde festes NaCI (0,2g/ml) und 4 Volumeneinheiten eiskalter Diethylether zugefügt.To the acidic methanol phase containing the VIP analog, solid NaCl (0.2 g / ml) and 4 volumes of ice cold diethyl ether were added.
Das Präzipitat (das das VIP-Analog enthielt) wurde auf einem Glassintertrichter (Porengröße Nr,3) gesammelt und durch Waschen mit 5ml 1M Essigsäure gelöst. Das gelöste VIP-Analog wurde auf einer Sephadex-C25-Säule (7 cm lang, Durchmesser 2 cm) entsalzt, und gefriergetrocknet, bevor eü in 1%iger TFA gelöst und durch HPLC auf einem 20-40%igen linearen Acetonitrilgradienten in 1 %iger TFA gereinigt wurde. Das VIP-Analog wurde bei 33%igem Acetonitril eluiert. Das gereinigte VIP-Analog wurde dann in biochemischen und biologischen Testsystemen getestet.The precipitate (containing the VIP analog) was collected on a sintered glass funnel (pore size No. 3) and dissolved by washing with 5 ml of 1M acetic acid. The dissolved VIP analog was desalted on a Sephadex C25 column (7 cm long, 2 cm in diameter) and lyophilized before being dissolved in 1% TFA and analyzed by HPLC on a 20-40% linear acetonitrile gradient in 1%. TFA was purified. The VIP analog was eluted with 33% acetonitrile. The purified VIP analog was then tested in biochemical and biological test systems.
Beispiel. VIPa (X= Thr, Y = Arg, Z = Lys, W = GIy)Example. VIPa (X = Thr, Y = Arg, Z = Lys, W = Gly)
Das Fusionsprotein ß-Galactosidase- VIPa wurde wie oben beschrieben in einem Liter Ld-Medium, das 0,1 mg/ml Ampicillin enthielt, exprimiert und gereinigt. Das Fusionsprotein wurde mit CNBr geschnitten und das so gewonnene VIPa wurde weiter wie oben beschrieben gereinigt und in den folgenden Testsystemen getestet:The fusion protein β-galactosidase-VIPa was expressed and purified as described above in one liter of Ld medium containing 0.1 mg / ml ampicillin. The fusion protein was cut with CNBr and the VIPa thus obtained was further purified as described above and tested in the following test systems:
1) Radioimmuntest (RIA)1) Radioimmunoassay (RIA)
2) Radiorezeptortest2) Radioreceptor test
3) Stimulation der Produktion von cyciischem Adenosin-3':5'-Phosphat3) Stimulation of cyciic adenosine 3 ': 5'-phosphate production
4) Hydrogencarbonatsekretion in Katzen in vivo4) Bicarbonate secretion in cats in vivo
1) Radioimmuntest (RIA)1) Radioimmunoassay (RIA)
Im VIP-RIA-Kit, das von den Penninsula Laboratories (USA) bezogen worden war, wird rekombinantes VIPa als VIP erkannt, wenn nach den Empfehlungen des Herstellers auf der Grundlage des Verfahrens von Fahrenkrug, J., und Schaffalitzky De Muckadell, O. (1977) J. Lab. Clin. Med. 89,1379-1388 gemessen wird.In the VIP RIA kit purchased from Penninsula Laboratories (USA), recombinant VIPa is recognized as VIP when, according to the manufacturer's recommendations, based on the method of Fahrenkrug, J., and Schaffalitzky De Muckadell, O. (1977) J. Lab. Clin. Med. 89, 137-1388.
2) Radiorezeptortest2) Radioreceptor test
Der Radiorezeptortest wurde an Membranen von Rattenhirnrinde durchgeführt, und zwar mil Chloramin-T-iodiertem '26I-VIP (Halldon, G., und Autorenkollektiv [1986] Reg. Pep-16,183-188) bei einer Konzentration von 0,5mM, wobei die Verdrängung des markierten VIP durch gereinigtes VIP aus Schweinedarm und durch rekombinantes VIPa aus E.coli, wie von Abens, J., und Autorenkollektiv (1984) Peptides 5,375-377, beschrieben, untersucht wurde. Die Äff inität des rekombinanten VIPa war innerhalb des Versuchsfehlers mit dem aus Schweinedarm gereinigtem VIP mit einem Kd-Wert von 1,5-1,8 nm bei Gleichgewicht identisch, was beweist, Jaß rekombinantes VIPa ein Ligand mit hoher Affinität von VIP-Rezeptoren ist und in einer Art und Weise bindet, die von derjenigen von VIP, das aus anderen Quellen gewonnen wurde, nicht zu unterscheiden ist.Radioreceptor assays were performed on rat cerebral cortex membranes with chloroamine T-iodinated '26 I-VIP (Halldon, G., and Autorenkollektiv [1986] Reg. Pep-16, 183-188) at a concentration of 0.5 mM displacement of the labeled VIP by purified VIP from porcine intestine and by E.coli recombinant VIPa as described by Abens, J., and Autorenkollektiv (1984) Peptides 5,375-377. The affinity of the recombinant VIPa was identical to the porcine intestine purified VIP having a Kd value of 1.5-1.8 nm at equilibrium within the experimental error, proving that recombinant VIPa is a high affinity ligand of VIP receptors and bind in a manner indistinguishable from that of VIPs obtained from other sources.
3) Stimulation der Synthese von cyciischem Adenosln-3':5'-Phosphat3) Stimulation of the synthesis of cyciic adenosine 3 ': 5'-phosphate
Die Stimulierung der Synthese von cyciischem Adenosin-3':5'-Phosphat (cAMP) in Gewebescheiben von Rattenhirnrinde durch VIP, das gereinigt vom Schwein gewonnen wurde, und durch rekombinantes VIPa wurde untersu ht, um festzustellen, ob sich rekombinantes VIPa, nach dem Ergebnis aus Punkt 2 ein Ligand des VIP-Rezeptors, wie ein Agonis. oder wie ein Antagonist vorhalt. Die Experimente wurden folgendermaßen durchgeführt:Stimulation of the synthesis of cyciic adenosine 3 ': 5'-phosphate (cAMP) in rat cerebral cortex tissue slices by VIP purified from pig and by recombinant VIPa was examined to see if recombinant VIPa, after the Result from point 2 a ligand of the VIP receptor, such as an agonis. or like an antagonist. The experiments were carried out as follows:
Rattenhirnrindenscheiben (0,4mm x 0,4 mm) wurden in Krebs-Ringers-Hydrogencarbonatpufferpräinkubiert, in Gegenwart von 1OmM Theophyllin (ein Phosphodiesteraseinhibitor) 60 Minuten lang bei 360C mit O2/CO2 (95%/5%) (V/V) durchgeblasen. Anschließend wurden die Gewebescheiben in einem Gesamtvolumen von 600μΙ mit Schweine-VIP bei Konzentrationen von 10, 50,10OnM, 1 und 10μΜ und mit rekombinantem VIPa bei Konzentrationen von 10,50,100 und 30OnM (geschätzt von 1) 10 Minuten inkubiert. Die Inkubationen wurden durch Zugabe von 150μΙ EGTA-Lösung (10OmM) beendet und anschließend wurden die Reagenzgläser 3 Minuten lang in ein kochendes Wasserbad gehalten. Der cAMP-Gehalt wurde nach Brown, B. L., und Autorenkollektiv (1972) Adv. Cycl. Nucl. Res. 2,25-40, gemessen. Die Ergebnisse zeigen, daß das rekombinante VIPa bei einer Inkubationszeit von 10 Minuten eine Erhöhung der c AM P-Wert θ bewirkte und somit als Agonist bei der VIP-Rezeptorgekoppelten Adenylatcyclase wirkt, von der man glaubt, daß sie die physiologischen Wirkungen von VIP trägt (siehe Rostene, W.H.(1984)Progr.Neurobiol.22,103-129).Rat cortex slices (0.4 mm x 0.4 mm) were in the presence of 1OmM theophylline in Krebs-Ringers-Hydrogencarbonatpufferpräinkubiert, (a phosphodiesterase inhibitor) for 60 minutes at 36 0 C with O 2 / CO 2 ((95% / 5%) V / V) blown. Subsequently, the tissue slices were incubated in a total volume of 600μΙ with porcine VIP at concentrations of 10, 50.10OnM, 1 and 10μΜ and with recombinant VIPa at concentrations of 10.50, 100 and 30OnM (estimated at 1) for 10 minutes. The incubations were stopped by adding 150 μM EGTA solution (10 μM) and then the tubes were kept in a boiling water bath for 3 minutes. The cAMP content was determined by Brown, BL, and Autorenkollektiv (1972) Adv. Cycl. Nucl. Res. 2.25-40, measured. The results show that the recombinant VIPa at an incubation time of 10 minutes caused an increase in the c AM P value θ and thus acted as an agonist in the VIP receptor-coupled adenylate cyclase, which is believed to carry the physiological effects of VIP ( see Rostene, WH (1984) Progr. Neurobiol. 22, 103-129).
4> Biologische Wirksamkeit von VIPa4> Biological effectiveness of VIPa
Die> biologische Wirksamkeit von rekombinantem VIPa wurde ebenfalls in einem in vivo Test zur Stimulierung der Hydrogencarbonatsekretion aus Katzenpankreas nach Jorpes, J.E. und Mutt, V. (1966) Acta Physiol. Scand. 66,316-325,The> biological activity of recombinant VIPa has also been demonstrated in an in vivo assay to stimulate bicarbonate secretion from cat pancreas according to Jorpes, J.E. and Mutt, V. (1966) Acta Physiol. Scand. 66.316-325,
untersucht.examined.
Rekombinantes VIPa war in diesem Test mit 30-35% genauso wirksam wie Schweine-VIP.Recombinant VIPa was as effective at 30-35% in this test as porcine VIP.
Schema 1Scheme 1
VlP 1 OligonucleotidVlP 1 oligonucleotide
CCGGATCCATATGCACTCTGACGCTGTTTTCNCTGACAACTACACTCGTCTGANAAAACAGCTGGCT ICCGGATCCATATGCACTCTGACGCTGTTTTCNCTGACAACTACACTCGTCTGANAAAACAGCTGGCT I
TGTCGACCGACAATNTTTCATG GACTTGAGATAG GACTTG ιTGTCGACCGACAATNTTTCATG GACTTGAGATAG GACTTG ι
VIP2 0ligonucleotide 'VIP2 oligonucleotides'
N:A,C,GorTN: A, C, gort
Klenow Polymerase + dNTPKlenow polymerase + dNTP
Bam HIBam HI
CCGGATCCATATGCACTCTGACGCTGTTTTCNCTGACAACTACACTCGTCTGANAAAACAGCTGGCTGTTANAAAGTACCTGAACTCTATCCTGAAC GGCCTAGGTATACGTGAGACTGCGACAAAAGNGACTGTTGATGTGAGCAGACTNTTTTGTCGACCGACAATNTTTCATGGACTTGAGATAGGACTTG,CCGGATCCATATGCACTCTGACGCTGTTTTCNCTGACAACTACACTCGTCTGANAAAACAGCTGGCTGTTANAAAGTACCTGAACTCTATCCTGAACGGCCTAGGTATACGTGAGACTGCGACAAAGNGACTGTTGATGTGAGCAGACTNTTTTGTCGACCGACAATNTTTCATGGACTTGAGATAGGACTTG,
VIPa and VIPb DuplexeVIPa and VIPb duplexes
EcoRIEcoRI
GGCTGAATTCTT CCGACTTAAGAAGGCTGAATTCTT CCGACTTAAGAA
EcoRIEcoRI
GGC 'VAACGTTG AATTCTT CCGTTTGCAACTTAAGAAGGC 'VAACGTTG AATTCTT CCGTTTGCAACTTAAGAA
1. BamHI-undEcoRI-Spaltung1. BamHI and EcoRI cleavage
2. Clonierung in mit Bam HI und EcoRI gespaltenem pPEX-Vektor2. Cloning into Bam HI and EcoRI digested pPEX vector
3. Selektion der individuellen Mutanten durch Nucleotidsequenzierung3. Selection of individual mutants by nucleotide sequencing
ISJ CO *kISJ CO * k
Schema 1 (Fortsetzung)Scheme 1 (continued)
ß-Galacto- neAspSerTrplleHisMetHisSerAspAlaValPhe XAspAsnTyrThrArgLeu Y LysGlnLeuAlaVal Z LysTyrLeuAsnSerlleLeuAsn —atcgattcttggatccatatgcactctgacgctgttttcnctgacaactacactcgtctganaaaacagctggctgttanaaagtacctgaactctatcctgaac —tagctaagaacctaggtatacgtgagactgcgac^aaagngactgttgatgtgagcagactnttttgtcgaccgacaatntttcatggacttgagataggacttg! wbeta-galacto- neAspSerTrplleHisMetHisSerAspAlaValPhe XAspAsnTyrThrArgLeu Y Z LysGlnLeuAlaVal LysTyrLeuAsnSerlleLeuAsn -atcgattcttggatccatatgcactctgacgctgttttcnctgacaactacactcgtctganaa aaca gctggctgttanaaagtacctgaactctatcctgaac - tagctaa ga acctaggt atacgtgagactgcgac ^ aaagngactgttgatgtgagcagactnttttgtcgaccgacaatntttcatggacttgagataggacttg! w
CIaI Bam Hl GlyLysArg...CIaI Bam Hl GlyLysArg ...
GGCAAACGTTGAATTCGGCAAACGTTGAATTC
1CCGTTTGCAACTTAAG 1 CCGTTTGCAA CTTAAG
1 EcoRI 1 EcoRI
X= V= 7 = IX = V = 7 = I
ThrThr
-ACT--ACT-
-TGA--TGA-
ProPer
-CCT- -GGA-CCT GGA
AIaAla
-GCT- -CGA--GCT- -CGA-
Ser He Ue Bei allen 64 Varianten:Ser He Ue For all 64 variants:
-TCT- -ATA- -ATA- VIPa-Analoga, wenn W = GIy-TCT- ATA -ATA- VIPa analogs when W = Gly
-AGA- -TAT- -TAT- VIPb-Analoga, wenn W = Gly-Lys-Arg-AGA- -TAT- -TAT- VIPb analogs when W = Gly-Lys-Arg
Schema Sequenzierung der polyclonierenden Region des pPEX-VektorsScheme sequencing of the polycloning region of the pPEX vector
284284
ß-Galacto- lleAspSerTrplleLeu...ß-GalactolAspSerTrplleLeu ...
sidase ATCG ATTCTTGG ATCCTCTG ATG GTACCTCCTCTG AG CTCTCTG ATG G GCCCGAGTATGCGACAG CTG GAATTC sidase ATCG AT TCT TGG ATCCT CTG A TG GTACCT CCTC TG AG CTCT CTG A TG G GCCC GAGTATGCGACAG CTG GAATTC
CIaI BamHI Kpnl Sacl Apal EooRICIaI BamHI Kpnl Sacl Apal EooRI
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