DD287730A5

DD287730A5 - PROCESS FOR OBTAINING AND STABILIZING TRIACYLGLYCEROLLIPASES

Info

Publication number: DD287730A5
Application number: DD33230189A
Authority: DD
Inventors: Dietrich Haferburg; Peter Guenther; Ibrahima Balde; Utta Kretzschmer; Eberhard Lippert; Hans-Peter Kleber
Original assignee: Karl-Marx-Universitaet Leipzig,De; Humboldt-Universitaet Zu Berlin,De
Priority date: 1989-09-01
Filing date: 1989-09-01
Publication date: 1991-03-07

Abstract

Die Erfindung betrifft ein mikrobielles Verfahren zur Herstellung von Triacylglycerollipase. Das Ziel besteht in der Erhoehung der Exkretion und der Stabilisierung der ausgeschiedenen Lipase. Die Aufgabe wird darin gesehen, sowohl die Exkretion auf phaenotypischem Wege zu steigern wie auch durch Zugabe stabilisierender Praeparate die Lipaseaktivitaet konstant zu halten. Die Aufgabe wird geloest durch Zusatz von Hefezellhuellen zu einem komplexen Kulturmedium.{mikrobielles Verfahren; Triacylglycerollipase; Lipaseaktivitaet; Lipasestabilisierung; Enzymaktivitaet; Pseudomonasa aeruginosa; Hefezellhuellen; Stearinsaeure; Wachstumsstimulatoren}The invention relates to a microbial process for the production of triacylglycerol lipase. The goal is to increase the excretion and stabilize the excreted lipase. The object is seen to increase the excretion in a phenotypic way as well as to keep the lipase activity constant by adding stabilizing preparations. The task is solved by adding yeast cell sources to a complex culture medium {microbial method; triacylglycerol lipase; lipase activity; Lipasestabilisierung; Enzymaktivitaet; Pseudomonas aeruginosa; Hefezellhuellen; stearic acid; growth stimulators}

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Lipasen, das die Stabilisierung der Enzymaktivität einschließt. Die Lipase kann zur schonenden Hydrolyse von Carbonsäureestern und zur stereoselektiven Synthese von Estern und Carbonsäurederivaten verwendet werden.The invention relates to a process for the preparation of lipases, which includes the stabilization of the enzyme activity. The lipase can be used for the gentle hydrolysis of carboxylic acid esters and for the stereoselective synthesis of esters and carboxylic acid derivatives.

Characteristic of the known state of the art

Er ist bekannt, daß Mikroorganismen unter bestimmten Kultivierungsbedingungen Lipase in das Kulturmedium ausscheiden. Bakterien, Hefen oder Pilze werden zu diesem Ziel auf komplexen Nährmedien, z. B. Peptone, Malzextrakt, Caseinhydrolysate, Trockenmilchpräparatü, oder synthetischen Nährmedien, z. B. mit n-Alkanen, Triglyceric*en oder anderen Estern langkettiger Fettsäuren als Kohlenstoff- und Energiequelle kultiviert.It is known that microorganisms secrete lipase into the culture medium under certain culture conditions. Bacteria, yeasts or fungi are added to this target on complex nutrient media, eg. Peptones, malt extract, casein hydrolysates, dried milk preparations, or synthetic nutrient media, e.g. B. with n-alkanes, triglycerides or other esters of long-chain fatty acids as carbon and energy source cultivated.

In vielen Fällen läßt sich der Exkretionsverlauf der Lipase durch einen Anstieg der Aktivität in der mittleren bis späten exponentiell Wachstumsphase nachweisen; dem Aktivitätsmaximum folgt ein Abfall der Lipaseaktivität, der in synthetischen Nährmedien schneller verläuft als in Nährmedien mit komplexen Supplementen. Komplexe Zusätze ei schweren jedoch die Reinigung der extrazellulären Lipase.In many cases, the excretion course of the lipase can be detected by an increase in activity in the middle to late exponential growth phase; The activity maximum is followed by a decrease in lipase activity, which is faster in synthetic nutrient media than in nutrient media containing complex supplements. Complex additives are more serious, however, the purification of extracellular lipase.

Object of the invention

Die Erfindung hat das Ziel, den Export mikrobleller extrazellulärer Lipasen aus intakten Zellen zurw Kultivierungsmedium zu beschleunigen und die Aktivität des ausgeschiedenen, extrazellulären Enzyms zu stabilisieren.The invention aims to accelerate the export of microbial extracellular lipases from intact cells to the culture medium and to stabilize the activity of the excreted extracellular enzyme.

Explanation of the essence of the invention

Die Erfindung hat die Aufgabe, die Exkretion bzw. die Ablösung der Lipase von der äußeren Zollgrenze des produzierenden Mikroorganismus zu beschleunigen und das Aktivitätsniveau des ausgeschiedenen Enzyms sowohl im Kultivierungsansatz während der Produktionsphase wie auch im zellfreien Kulturfiltrat konstant zu halten. Es wurde überraschend gefunden, daß Hefezellhüller, die u.a. bei der Herstellung von Proteinisolaton aus Saccharomyces cerevisiae anfallen, auf die Produktion bzw. die Ausscheidung extrazellulärer Carboxylesterasen einen stimulierenden Einfluß haben. Die Aktivität des Enzyms bleibt während der Fermentation und im zellfreien Kulturmedium konstant.The object of the invention is to accelerate the excretion or detachment of the lipase from the outer customs border of the producing microorganism and to keep the level of activity of the excreted enzyme constant, both in the cultivation batch during the production phase and in the cell-free culture filtrate. It was surprisingly found that Hefezellhüller u.a. occur in the production of protein isolaton from Saccharomyces cerevisiae, have a stimulating effect on the production or excretion of extracellular carboxylesterases. The activity of the enzyme remains constant during the fermentation and in the cell-free culture medium.

Die gestellte Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß Mikroorganismen, die zur Lipaseexkretrion befähigt sind, auf einem Wachstumsmedium kultiviert werden, das Hefezellhüllen in einer Konzentration von 1-IOOg/l, vorzugsweise 10—50g/l, enthält.The stated object is achieved according to the invention by culturing microorganisms which are capable of lipase excretion on a growth medium which contains yeast cell casings in a concentration of 1 μg / l, preferably 10-50 g / l.

Die Mikroorganismen werden submers im diskontinuierlichen Verfahren zwischen 2(MO⁰C kultiviert. Der pH-Wert beträgt zu Beginn der Kultivierung zwischen 5,5-7,5. Nach einer Wachstumszeit von 5-20 Stunden werden die Zellen in einem Aliquot des Fermentationsansatzes abzentrifugiert und im zellfreien Kulturmedium die Aktivität der Lipase gemessen (D. Haferburg und H.-P. Kleber, ActaBiotechnol. 2,337-343 [1982]; C.Huggins und J.Lapides, J. Biol. Chem. 170,467-482 [1947]).The microorganisms are cultured submerged in a batch process between 2 (MO ⁰ C. The pH at the beginning of the cultivation is between 5.5 and 7.5 and after a growth time of 5 to 20 hours, the cells are centrifuged off in an aliquot of the fermentation batch and in the cell-free culture medium the activity of the lipase was measured (D.Haferburg and H.-P. Kleber, Acta Biotechnol., 2,337-343 [1982]; C. Huggins and J.Lapides, J. Biol. Chem. 170,467-482 [1947] ).

The isolation of the enzyme is carried out either by adsorption to an anion exchange ^, ζ. DOWEX1 * 2, 200-400mesh, Cl-form, or by coprecipitation in the presence of alginic acid with ethanol according to J. Wingender, S. VoIz and U. K *. Winkler, Appl. Microbiol. Biotechnol. 27, 136 (1987), or by precipitation with ammonium sulfate. It is advantageous to add stearic acid to the culture medium in a concentrate of about 10 g / l. The invention will be explained below on Auiführungsbelsplolen näiier. example 1

Ein Medium aus 5g Caseinhydrolysat in 11 Leitungswasser, das 20g/l Hefezellhüllen enthält, wird mit einem Inokulum von Pseudomonas aeruginosa 196Aa beimpft. Das Inokulum wird durch Abschwemmen von 18h alten Schrägagarkulturen gewonnen. Die Züchtung wird bei 30°C unter Schütteln durchgeführt. Nach den angegebenen Wachstumszeiten wird in einem zellfreien Aliquot des Fermentationsansatzes die Aktivität der extrazellulären üpase mit Olivenöl und mit p-Nitrophenylpalmitat gemessen. Die Volumenaktivität ist in Units (U)/ml angegeben. 1U - 1 pmol Substratumsatz/min.A medium of 5 g casein hydrolyzate in 11 tap water containing 20 g / l yeast cell casings is inoculated with an inoculum of Pseudomonas aeruginosa 196Aa. The inoculum is obtained by flushing out 18h old slants. The cultivation is carried out at 30 ° C with shaking. After the indicated growth times, the activity of the extracellular oilseed with olive oil and with p-nitrophenyl palmitate is measured in a cell-free aliquot of the fermentation batch. Volume activity is expressed in units (U) / ml. 1U - 1 pmol substrate turnover / min.

Table 1 P. aeruginosa extracellular lipase activity 196Aa after growth on casein hydrolyzate (0.5%) and with addition of 2% K'efezellhüllen

Kultivierungsdauercultivation time Lipaseaktivitätlipase Lipaseaktivitätlipase (h)(H) (U/ml)(U / ml) (U/ml)(U / ml) ohne Zusatzwithout addition mit Zusatzwith addition 1616 3,23.2 4.34.3 4040 0,060.06 4,84.8 6464 0,020.02 5,35.3 136136 00 2,42.4

Example 2 Example 1 is repeated with a nutrient medium which additionally contains 1% stearic acid. Table 2 Extracellular lipase activity of P. aeruginosa 196Aa after growth on casein hydrolyzate and with addition of 2% Yeast cell casings and 1% stearic acid

Kultivierungsdauercultivation time Lipaseaktivitätlipase (h)(H) (U/ml)(U / ml) 1616 3,73.7 4040 5,35.3 6464 6,06.0 136136 8,08.0 160160 8,48.4 184184 8,0 .8.0.

Example 3 Example 1 is repeated, replacing P. aeruginosa 196Aa with other strains of P. aeruginosa or strains

anderer Genera gearbeitet.other generals worked.

Table 3 Extracellular lipase activity of selected microorganisms after cultivation in the presence of 2% yeast cell envelopes

Stammtribe Maximale LipaseaktivitätMaximum lipase activity (U/ml)(U / ml) P. aeruginosa A 7244P. aeruginosa A 7244 2,82.8 P. aeruginosa IMET10905P. aeruginosa IMET10905 2,62.6 Acinetobacter calcoaceticus 69/VAcinetobacter calcoaceticus 69 / V 1,01.0 Torulopsis apicola H157"Torulopsis apicola H157 " 6,06.0 AspergillusnigerAspergillus niger 1.01.0

2) Die extrazelluläre Lipase aus T. apicola kann nur bei pH 5,0 mit Olivenöl oder Triolein als Substrat gemessen werden; diese Lipase spaltet spezifisch Esterbindungen mit ölsäure bzw. langkettigen ungesättigten Fettsäuren.2) T. apicola extracellular lipase can only be measured at pH 5.0 with olive oil or triolein as a substrate; this lipase specifically cleaves ester bonds with oleic acid or long-chain unsaturated fatty acids.

Example 4 Example 1 is repeated with P. aeruginosa 196Aa and the extracellular esterase activity of C.HUGGINS and J. LAPIDES, J. Biol. Chem. 170,467-482 (1947). Table 4 P. aeruginosa extracellular esterase activity 196Aa after growth on casein hydrolyzate with addition of 2% Hefezellhüllen

Kultivierungsdauercultivation time Esteraseaktivitätesterase . (h), (H) (U/ml)(U / ml) 1919 2,72.7 4343 2,32.3 115115 2,42.4 139139 2,02.0

Claims

A process for the recovery and stabilization of triacylglycerol lipases, characterized in that in the presence of yeast cell envelopes on a liquid culture medium such microorganisms are grown which are capable of excretion of lipase.

2. The method according to claim 1, characterized in that P. aeruginosa is grown.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that Paeudomonas aeruginosa 196Aa is grown.

4. The method according to claim 1-3, characterized in that submerged is cultured discontinuously at a temperature between 20 and 4O ⁰ C.

5. The method according to claim 1-4, characterized in that yeast cell casings are added in a concentration of 1-100g / l.

6. Process according to claims 1-4, characterized in that yeast cells are added in quantities of 10-50 g / l.

7. The method according to claim 1-6, characterized in that the culture medium stearic acid is added in a concentration of 10g / l.

8. The method according to A-npruch 1 and 4-7, characterized in that Acinetobactercalcoaceticus 69 V is grown.

9. The method according to claim 1 and 4 to 7, characterized in that Torulopsis apicola H157 is grown.