DD284110A7

DD284110A7 - PROCESS FOR OBTAINING PROTEINS FROM MICROORGANISMS

Info

Publication number: DD284110A7
Application number: DD23159181A
Authority: DD
Inventors: Eberhard Lippert; Utta Kretzschmar
Original assignee: Univ Berlin Humboldt
Priority date: 1981-06-20
Filing date: 1981-06-20
Publication date: 1990-11-07

Abstract

Die Erfindung beinhaltet ein Verfahren zur Extraktion von mikrobiellem Protein fuer die Herstellung von Nahrungsmitteln. Das Ziel der Erfindung ist es, das mikrobielle Protein mit einer hohen Ausbeute und hohen Reinheit des Proteinisolats zu gewinnen, die hinsichtlich des Nucleinsaeuren- und Lipidgehalts unter 2% liegt. Gleichzeitig ist die Aufgabe gestellt, die oben genannten Ziele unter Vermeidung einer alkalischen Belastung des Proteins zu erreichen, da diese zu negativen Proteinmodifizierungen hinsichtlich ernaehrungsphysiologischer und verarbeitungstechnologischer Eigenschaften fuehrt. Das Wesen der Erfindung besteht aus diesem Grunde darin, dasz das biologische Material in einer sauren Vorbehandlungsstufe einerseits auf einen hocheffektiven Extraktionsprozesz vorbereitet wird und andererseits einer fast vollstaendigen Nucleinsaeurenextraktion unterliegt. Dieser Vorbehandlungsstufe folgt dann nach einer Waschstufe ohne wesentliche Hilfsstoffzusaetze die saure Extraktion.The invention includes a method for extracting microbial protein for the production of foodstuffs. The object of the invention is to obtain the microbial protein with a high yield and high purity of the protein isolate, which is less than 2% in terms of nucleic acid and lipid content. At the same time, the object is to achieve the abovementioned objectives while avoiding an alkaline load on the protein, since this leads to negative protein modifications with regard to nutritional and processing-technological properties. The essence of the invention for this reason is that the biological material is prepared in an acid pretreatment step on the one hand for a highly effective extraction process and on the other hand to an almost complete Nucleinsaeurenextraktion subject. This pretreatment step is then followed by a acidic extraction after a washing step without any essential auxiliary additives.

Description

Field of application of the invention The invention relates to a method for obtaining microbial protein for the production of foodstuffs. Characteristic of the known technical solutions

Die Gewinnung des mikrobiellen Proteins kann bekanntlich durch chemische, physikalische oder mechanische Aufschlußverfahren bzw. -methoden erreicht werden. Bei den chemischen Verfahren überwiegt der alkalische Aufschluß, bei dem vorbehandelte bzw. nichtvorbehandelte Mikroorganismen einstufig bzw. zweistufig im alkalischen Bereich zwischen pH 8,0 bis 12,0 und Temperaturen von 70-170⁰C behandelt werden. Die meisten dargestellten Verfahren enthalten nicht alle Angaben, die für eine umfassende Einschätzung des jeweiligen Verfahrensprinzips notwendig sind. Doch wird bei den bekannten Verfahren der Nachteil deutlich, daß beschriebene Lösungswege auf dereine Seite zu guten Ergebnissen hinsichtlich des Anteils an extrahiertem Proteinführen, die daraus gewonnenen Proteinisolate aber nicht den Anforderungen genügen, auf der anderen Seite die Anforderungen an ein Proteinisolat erfüllt werden, die Ausbeuten an gefälltem Protein gegenüber der Reinproteinmenge im biologischen Ausgangsmaterial aber unbefriedigend sind. Nur solche Verfahren zur Gewinnung von Protein aus Mikroorganismen kann man als optimal bezeichnen, deren Bedingungen nicht nur 2u hohen Anteilen an extrahiertes Protein an sich führen, sondern wo dieses Protein auch weitgehend isoelektrisch fällbar ist und letztendlich eine hohe Ausbeute an gefälltem Protein gegenüber der Reinproteinmenge im biologischen Ausgangsmaterial von über 70% bei relativ geringer Stufenzahl des Verfahrens erreicht wird und wo die Produkte nicht nur einen hohen Reinproteingehalt von über 85%, sondern auch niedrige Nucleinsäuren- und Lipidgehalte von jeweils unter 2% haben.The recovery of the microbial protein can be achieved by chemical, physical or mechanical digestion methods or methods known. In the chemical process outweighs the alkaline digestion in which pretreated or pretreated microorganisms are treated in one stage or two stages in the alkaline range between pH 8.0 to 12.0 and temperatures of 70-170 ⁰ C. Most of the methods presented do not contain all the information necessary for a comprehensive assessment of the respective procedural principle. However, in the known methods, the drawback becomes clear that described solutions on the one hand lead to good results in terms of the proportion of extracted protein, but the protein isolates obtained therefrom do not meet the requirements, on the other hand, the requirements for a protein isolate are fulfilled However, precipitated protein is unsatisfactory compared to the amount of pure protein in the biological starting material. Only such methods for obtaining protein from microorganisms can be said to be optimal, the conditions of which lead not only to high levels of extracted protein per se, but where this protein is also largely isoelectric precipitable and ultimately a high yield of precipitated protein compared to the pure protein amount in the biological starting material of more than 70% at relatively low levels of the process is achieved and where the products not only have a high pure protein content of about 85%, but also low nucleic acid and lipid content of less than 2%.

Durch die überwiegend angewandten alkalischen Reaktionsbedingungen ist nicht auszuschließen, daß Proteinmodifizierungen durch Vorgänge wie Racemisierung, Maillard-Reaktion, Dephosphorylierung, NH₃- und H₂S-Abspaltung und Lysinoalaninbildung auftreten, die die Qualität des Proteinmaterials herabsetzen. Die Anwendung extremer alkalischer Bedingungen führt nicht nur zu einer unvertretbar hohen Proteinhydrolyse, sondern auch zu einer Verschlechterung der Proteinlöslichkeit. Weitere Belastungen arn Protein treten auch durch sich hinsichtlich der üpidreduzierung notwendig machender Maßnahmen zur Vorbehandlung des biologischen Ausgangsmaterials bzw. zur Nachbehandlung des gefälltenDue to the predominantly applied alkaline reaction conditions, it can not be ruled out that protein modifications occur through processes such as racemization, Maillard reaction, dephosphorylation, NH ₃ and H ₂ S cleavage and lysinoalanine formation, which reduce the quality of the protein material. The application of extreme alkaline conditions not only leads to unacceptably high protein hydrolysis, but also to a deterioration in protein solubility. Further burdens on the protein also occur due to measures necessary for the suppression of the suppuration of the biological starting material or for the aftertreatment of the precipitate

Protein up. In addition to the previously emphasized alkaline extraction and the acid extraction process offers a way to obtain the

mikrowellen Proteins. Allerdingssind noch nicht solche Verfahren bekannt, diezurgleichzeitigen Erfüllung der oben genannten Kriterien für ein optimales Priteingewinnungsverfahren führen.Microwave protein. However, such methods are not yet known which result in the simultaneous fulfillment of the above criteria for an optimal protein recovery process.

So führt eine Säurebehandlung von Torula-Hefen (US 3833 552) bei einer Molarität von 0,25-0,5, bei einer Temperatur von 60-100^eC, einer Reaktionszeit bis zu 30min und Anwendung verschiedener Mineralsäuren zu nicht annähernd vertretbaren Proteinausbeuten und nach experimenteller Überprüfung beim Einsatz von Salzsäure (1,0M) zu einer Proteinextraktion, die 65% nicht überschreitet. Außerdem erwies sich der extrahierte Proteinanteil als nicht fällbar. Es kann angenommen werden, daß der Nucleinsäuregehalt den Anforderungen nicht genügt.Thus, an acid treatment of Torula yeast (US 3833 552) at a molarity of 0.25-0.5, at a temperature of 60-100 ^e C, a reaction time up to 30min and application of various mineral acids to not nearly acceptable protein yields and after experimental testing using hydrochloric acid (1.0M) for a protein extraction that does not exceed 65%. In addition, the extracted protein content proved to be undeliverable. It can be assumed that the nucleic acid content does not meet the requirements.

In einem weiteren Verfahren (DP 2042 571) ist die Wirkung der sauren Extraktion abhängig von einer kurzzeitigen Vorbehandlung im extrem alkalischen Bereich (pH 13,0). Die Erreichung eines pH-Wertes von 1,0 erfordert dann nicht nur hohe Säurenmengen, sondern führt auch noch zu einer hohen Salzbelastung. Außerdem sind die aufgeführten Bedingungen der kombinierten Wirkung für Hefen nicht übertragbar, wobei auch schon die mit bakterieller Biomasse als Ausgangsorganismus erreichten Proteinstickstoffkonzentrationen des Isolats von 12% nicht ausreichend sind. Die ungenügenden Reinheitsgrade können z.T. durch unvertretbar hohe Nucleinsäurengehalte des Isolats erklärt werden und dadurch, daß die im Alkalischen durch Nucleinsäuren· und Lipidhydrolyse entstehenden Reaktionsprodukte vor der sauren Extraktion nicht durch einen Separationsschritt abgetrennt werden und somit ein Teil bei der Proteinfällung mitgefällt wird.In another method (DP 2042 571), the effect of acid extraction depends on short-term pretreatment in the extremely alkaline range (pH 13.0). The achievement of a pH of 1.0 then not only requires high amounts of acid, but also leads to a high salt load. In addition, the listed conditions of the combined action for yeasts are not transferable, and even the protein nitrogen concentrations of the isolate of 12% achieved with bacterial biomass as the starting organism are not sufficient. The insufficient purity levels can z.T. can be explained by unacceptably high nucleic acid contents of the isolate and by the fact that the reaction products formed in the alkaline by nucleic acid and lipid hydrolysis are not separated by a separation step prior to the acid extraction and thus a part is precipitated in the protein precipitation.

Object of the invention

Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung eines Proteinisolates aus Mikroorganismen für die Herstellung von Nahrungsmitteln. Das Verfahren ermöglicht eine maximale Ausbeute an Reinprotein, eine sehr hohe Reinheit des Proteinisolats und damit die Einhaltung der Grenzwerte für Restnucleinsäuren und Restlipide von unter 2%, ohne daß eine Nachbehandlung des Isolats erfolgen muß. Dabei wird das Protein unter Bedingungen gewonnen, die eine mit negativen Veränderungen des Proteins verbundene alkalische Belastung gänzlich ausschließen bzw. nur in einer der eigentlichen Proteinextraktion vorangestellten Vorbehandlungsstufe eine betont milde Alkalibeeinflussung bewirken.The aim of the invention is a process for obtaining a protein isolate from microorganisms for the production of foodstuffs. The method enables a maximum yield of pure protein, a very high purity of the protein isolate and thus compliance with the limits for residual nucleic acids and residual lipids of less than 2%, without the need for post-treatment of the isolate. In this case, the protein is obtained under conditions which entirely exclude an alkaline stress associated with negative changes in the protein or cause a markedly mild influence on the alkalis only in a pretreatment stage preceding the actual protein extraction.

Explanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, bei der Proteinextraktion aus Mikroorganismen ein Verfahren zu erreichen, das eine hohe Reinproteinausbeute und eine hohe Reinheit des Isolats garantiert, wobei durch Alkalien induzierte negative Proteinmodifizierungen weitestgehend ausgeschlossen sind. Die negativen Proteinmodifizierungen, ausgelöst insbesondere durch Alkalieinwirkung bei höheren Temperaturen, umfassen vorwiegend Racemisierung, Proteinhydrolyse, Maillard-Reaktion, Dephosphorylierung, Verringerung der Proteinlöslichkeit, NH₃- und H₂S-Abspaltung und Bildung von Lysinoalanin. Gleichzeitig liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, Proteinisolate mit niedrigen Restlipidgehalten von unter 2% zu erreichen, ohne daß eine diesbezügliche Vorbehandlung am biologischen Material bzw. eine Nachbehandlung am Isolat erfolgen muß. Die Zielstellungen sollen auch gleichzeitig unter dem Gesichtspunkt erreicht werden, daß eine hohe Fällbarkeit des extrahierten Proteins, eine optimale Koagulatbildung beim Fällvorgang und ein geringer Hilfsstoffeinsatz bei der Extraktion gesichert sind. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß das biologische Material zur Vorbereitung auf die Proteinextraktion und zur weitestgehenden Nucleinsäurenreduzierung bei einem pH vonO,7-1,5 mit einer äthanolischen Mineralsäurelösung bei 50-60°C 30-70 min vorbehandelt wird, wobei die Äthanolkonzentration 10-35 Vol.-% beträgt. Anschließend erfolgt eine Waschung des Sediments mit Leitungswasser. Das nach weiterer Zentrifugation erhaltene Sediment wird auf eine bevorzugte Trockensubstanzkonzentration von 6-7% suspendiert und mit einer anorganischen Säure oder einem anorganisch-organischen Säurengemisch bei einem pH-Wert von 1,0-2,0 und einer Temperatur von 110-160⁰C während einer Zeit von 0,5-6 min zur Extraktion gebracht. Nach Abkühlung erfolgt die Trennung der Zellreste von der Proteinlösung, der dann eine isoelektrische Fällung, entweder bei Raumtemperatur oder in der Hitze (80⁰C), folgt. Zur Verringerung des Salzgehaltes kann das Isolat am IP mit phosphorsaurem Wasser nachgewaschen werden. Die Mengen an Phosphorsäure bei der Extraktion des mikrowellen Proteins sind dann optimal, wenn sie den PjCvMengen der bei diesem Prozeß eingesetzten Hefen entsprechen, um somit im Falle einer Rezirkulation dieses Ablaufs in die Fermentation den Phosphatbedarf damit decken zu können. Das Ziel der Erfindung kann hinsichtlich der sehr guten Ausbeuten und hohen Reinheit und unter Umgehung negativer Proteinmodifizierungen auch dann erreicht werden, wenn die Vorbehandlung unter äthanolisch-alkalischen Bedingungen bei pH 9-10,50°C, 5-10 min lang durchgeführt wird.The invention has for its object to achieve a method in protein extraction from microorganisms that guarantees a high pure protein yield and a high purity of the isolate, with alkali-induced negative protein modifications are largely excluded. The negative protein modifications, in particular due to alkali action at elevated temperatures, include predominantly racemization, protein hydrolysis, Maillard reaction, dephosphorylation, reduction of protein solubility, NH ₃ and H ₂ S cleavage, and formation of lysinoalanine. At the same time, the object of the invention is to achieve protein isolates with low residual lipid contents of less than 2%, without any need for pretreatment of the biological material or post-treatment on the isolate. The objectives should also be achieved at the same time from the point of view that a high precipitability of the extracted protein, optimal coagulation during the precipitation process and a low use of excipients are ensured during the extraction. According to the invention, the object is achieved by pretreating the biological material in preparation for protein extraction and to the greatest extent possible nucleic acid reduction at pH of from 7 to 1.5 with an ethanolic mineral acid solution at 50-60 ° C. for 30-70 min, the ethanol concentration 10-35 vol.%. This is followed by washing the sediment with tap water. The sediment obtained after further centrifugation is suspended to a preferred dry matter concentration of 6-7% and with an inorganic acid or an inorganic-organic acid mixture at a pH of 1.0-2.0 and a temperature of 110-160 ⁰ C. brought to extraction for 0.5-6 min. After cooling, the cell residues are separated from the protein solution, followed by isoelectric precipitation, either at room temperature or in the heat (80 ^° C.). To reduce the salt content, the isolate can be washed at the IP with phosphoric acid water. The amounts of phosphoric acid in the extraction of the microwave protein are optimal if they correspond to the PjCvMengen of the yeasts used in this process, so as to be able to cover in the event of a recirculation of this process in the fermentation phosphate needs. The object of the invention can be achieved in terms of very good yields and high purity and bypassing negative protein modifications even if the pretreatment under ethanol-alkaline conditions at pH 9-10,50 ° C, carried out for 5-10 min.

Embodiment 1

Saccharomycescerevisiae mit einem Reinproteingehalt von 32,9% in der Trockensubstanz sowie 5,1'/«Nucleinsäuren und 6,4% Lipiden wird mit Wasser, Äthanol und Schwefelsäure so suspendiert, daß Bedingungen von einer Biomassetrockensubstanzkonzentration von 23,3g/100ml bei einer Anwendungskonzentration von 20 Vol.-% Äthanol und pH 0,7 erhalten und bei 70°C 50min wirksam werden. Nach dieser Vorbehandlung und Abkühlung wird das durch Zentrifugation erhaltene Sediment mit Leitungswasser auf einen pH von 1,9 gewaschen und das nach erneuter Zentrifugation erhaltene Sediment in Wasser so suspendiert, daß eine Trockensubstanzkonzentration von 6,3% erhalten wird. 10 Volumenteile dieserSaccharomyces cerevisiae having a pure protein content of 32.9% in dry matter and 5.1 '/ "nucleic acids and 6.4% lipids is suspended with water, ethanol and sulfuric acid such that conditions of a biomass dry substance concentration of 23.3g / 100ml at an application concentration obtained from 20 vol .-% ethanol and pH 0.7 and 50 minutes at 70 ° C are effective. After this pretreatment and cooling, the sediment obtained by centrifugation is washed with tap water to a pH of 1.9 and the sediment obtained after re-centrifugation is suspended in water so that a dry matter concentration of 6.3% is obtained. 10 volumes of this

Suspension und 0,3 Volumenteile eines Säurengemisches von Essigsäure und Phosphorsäure (v/v = 2:1) werden innerhalb von 75s getrennt auf etwa 160°C erhitzt und nach Vereinigung 2ur Extraktion des Proteins 40s bei dieser Temperatur belassen. Im Anschluß daran erfolgt die Abkühlung und Abtrennung des Überstandes von den Zellresten. Die Fällung des Proteins erfolgt durch Zugabe von Natronlauge zur sauren Proteinlösung bis zum Erreichen des Isoelektrischen Punktes beim pH etwa 4,4. Zur Herabsetzung des Salzgehaltes schließt sich eine Waschung am IP mit phosphorsaurem Wasser an. Das auf diese Weise erhaltene Proteinisolat hat einen Reinproteingehalt von 91,5%, einen Restnucleinsäuren- und Restlipidgehalt von 0,9 bzw. 1,9%. Der Wirkungsgrad der Proteinextraktion beträgt 87%. Die Menge an gefälltem Protein bezogen auf die Menge an extrahiertem Protein wurde zu 89% ermittelt.Suspension and 0.3 parts by volume of an acid mixture of acetic acid and phosphoric acid (v / v = 2: 1) are heated separately to about 160 ° C. within 75 seconds and left at this temperature after combining the protein for 40 seconds. Subsequently, the supernatant is cooled and separated from the cell residues. The precipitation of the protein is carried out by addition of sodium hydroxide solution to the acidic protein solution until reaching the isoelectric point at pH about 4.4. To reduce the salt content is followed by a wash at IP with phosphate acid water. The protein isolate obtained in this way has a pure protein content of 91.5%, a residual nucleic acid and residual lipid content of 0.9 and 1.9%, respectively. The efficiency of protein extraction is 87%. The amount of protein precipitated based on the amount of protein extracted was found to be 89%.

Ausführungsbeispiel 2Embodiment 2

Unter Beibehaltung der im Ausführungsbeispiel 1 dargelegten Vorbehandlung und anschließenden Waschung kann die Proteinextraktion auch bei alleinigerAnwendung von Phosphorsäure durchgeführt werden. Zu 10 Volumenteilen einer 6,8%igen Hefesuspension werden 0,08 Volumenteile konzentrierte Phosphorsäure gegeben. Nach einer Aufheizzeit von 75s erfolgt die Extraktion bei etwa 160"C und einem pH-Wert von 1,5 35s lang. Der Wirkungsgrad der Proteinextraktion beträgt 83% und der fällbare Anteil 84%. Das nicht nachgewaschene Isolat enthielt 1,1 % Nucleinsäuren und 1,8% Lipide.Maintaining the pretreatment set forth in Embodiment 1 and subsequent washing, the protein extraction can be carried out even if phosphoric acid is used alone. To 10 volumes of 6.8% yeast suspension is added 0.08 volume of concentrated phosphoric acid. After a heat-up time of 75 s, the extraction takes place at about 160 ° C. and a pH of 1.5 for 35 seconds The efficiency of the protein extraction is 83% and the precipitable fraction 84% The uncleaned isolate contained 1.1% nucleic acids and 1.8% lipids.

Ausführungsbeispiel 3 -Embodiment 3 -

Saccharomyces cerevisiae mit einem Reinproteingehalt von 28,0% in der Trockensubstanz sowie 8,1 % Lipiden wird mit äthanolischer Natronlauge suspendiert, so daß eine Äthanolanwendungskonzentration von 30Vol.-% und ein pH-Wert von 10,0 resultieren. Die Vorbehandlung bei 50"C dauert 5 min. Nach anschließender Zentrifugation wird das Sediment mit Leitungswasser auf pH 9,0 gewaschen und nach weiterer Zentrifugation mit Wasser suspendiert. 10 Volumenteile dieser Suspension und 0,8 Volumenteile des Säurengemisches Essigsäure/Phosphorsäure (v/v =* 2:1) werden getrennt innerhalb von 60s auf etwa 160°C erhitzt und reagieren während 45 s bei pH 1,5 miteinander. Nach Abkühlung und Zentrifugieren wird das Protein aus dem sauren Überstand am IP gefällt. Der Wirkungsgrad der Proteinextraktion beträgt 92% und der fällbare Anteil 75%. Das Isolat enthielt 0,4% Lipide und 0,8% Nucleinsäuren.Saccharomyces cerevisiae with a pure protein content of 28.0% in the dry matter and 8.1% lipids is suspended with ethanolic sodium hydroxide solution, resulting in an ethanol use concentration of 30% by volume and a pH of 10.0. The pretreatment at 50 ° C. lasts 5 min After subsequent centrifugation, the sediment is washed with tap water to pH 9.0 and, after further centrifugation, suspended with water, 10 volumes of this suspension and 0.8 volumes of the acid mixture of acetic acid / phosphoric acid (v / v = * 2: 1) are heated separately within 60s to about 160 ° C and react with each other for 45 s at pH 1.5 After cooling and centrifuging, the protein is precipitated from the acidic supernatant at IP The efficiency of protein extraction is 92 % and the precipitable fraction 75% The isolate contained 0.4% lipids and 0.8% nucleic acids.

Claims

A process for obtaining microbial protein with the aim of obtaining a proteinogenic starting raw material for the production of human nutritional products, characterized in that in microorganisms, both yeasts and bacteria, after pretreatment with ethanolic mineral acid solution at a pH of preferably 0.7-1.5, a temperature of preferably 50-80 ⁰ C and a time of 30-70 min and subsequent washing with tap water, the extraction with an inorganic acid or an organic-inorganic acid mixture at a pH of preferably 1.0-2.0 under pressure at 110-160 ⁰ C and a time of 0.5-6min takes place and after separation of the cell residues, the precipitation of the extracted protein is carried out on IP.

2. The method according to item 1, characterized in that in the pretreatment stage, the ethanol application concentration is 10-35Vol .-% and is preferably used as the mineral acid sulfuric acid.

3. The method according to item 1, characterized in that in the pretreatment stage, the microorganisms are treated only with mineral acid.

4. The method according to item 2 and 3, characterized in that the chemicals used for the pretreatment can be used repeatedly in this process stage.

5. The method according to item 1, characterized in that the inorganic acid used for protein extraction is phosphoric acid and the acid mixture of acetic acid and phosphoric acid in a ratio of 1: 2 to 2: 1.

6. The method according to item 1, characterized in that the pH at the end of the washing process after the ethanolic-acid pretreatment is about 1.3, in order with the required for the achievement of the extraction pH of phosphoric acid in the case of recirculation of the process to be able to work to obtain the same amount of starting biomass of P ₂ O _s .

7. The method according to item 1, characterized in that the pretreated cells are brought by the washing process to such a pH, which eliminates the need for an additional use of acid for extraction.

8. The method according to item 1-7, characterized in that the biological material yeasts, in particular of the genera Candida and Saccharomyces, or bacteria, in particular thermophilic or methanol-utilizing microorganisms, in the form of native biological material or dried biomass.

9. A process for obtaining the microbial protein, characterized in that to achieve the same optimum extraction effect in the acidic stage, the pretreatment under ethanolic-alkaline conditions (pH 9-10) at 50 ⁰ C is carried out for 5-10 min, wherein in the case of ethanol application the concentration is 30% by volume.