DD273450A5

DD273450A5 - PROCESS FOR OBTAINING NEW POLYSACCHARIDES

Info

Publication number: DD273450A5
Application number: DD88319607A
Authority: DD
Inventors: Serge Carel; Yves-Marie Page; Christine Vanderhoven; Norman Murray; Michel Monsigny; Francis Delmotte; Anne-Claude Roche; Claire Petit
Original assignee: ��@��@��@��k��
Priority date: 1987-09-08
Filing date: 1988-09-07
Publication date: 1989-11-15
Also published as: AU609173B2; MA21370A1; TNSN88092A1; NO883967D0; NO883967L; FR2620130B1; JPH01104182A; EP0308279A1; HUT47643A; AU2107788A; OA08948A; DK497088D0; DK497088A; NZ226041A; PT88439B; FR2620130A1; PT88439A; IL87681A0; ZA886623B

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung neuer Polysaccharide, die fuer die Verwendung in der Humanmedizin und Veterinaermedizin fuer therapeutische Zwecke zu Praeparaten verarbeitet werden. Das erfindungsgemaesse Verfahren zur Gewinnung neuer Polysaccharide aus einem Bakteriophagen-Lysefiltrat einer Kultur wenigstens einer Bakterienart vom Typ Escherichia coli oder Klebsiella pneumoniae ist dadurch gekennzeichnet, dass man das Filtrat konzentriert und gleichzeitig einer Molekuelselektion durch Fuehren auf Membranen mit selektiver Permeabilitaet unterzieht, dann die Loesung der extrahierten Polysaccharide durch Chromatographie behandelt, die erste Fraktion gewinnt, dialysiert, die Loesung konzentriert und durch Chromatographie erneut fraktioniert, die erste Fraktion gewinnt und trocknet.The invention relates to a process for obtaining new polysaccharides, which are processed for use in human medicine and veterinary medicine for therapeutic purposes to preparations. The inventive method for obtaining new polysaccharides from a bacteriophage lysis filtrate a culture of at least one type of bacteria Escherichia coli or Klebsiella pneumoniae is characterized by concentrating the filtrate and at the same time subjected to a molecular selection by guiding on membranes with selective permeability, then the solution Treated extracted polysaccharides by chromatography, the first fraction wins, dialyzed, the solution concentrated and refractionated by chromatography, the first fraction wins and dried.

Description

Verfahren zur Gewinnung neuer PolysaccharideProcess for obtaining new polysaccharides

Anwendungsgebiet der Erfindung 5 Field of application of the invention 5

Die durch das erfindungsgemäße Verfahren gewonnenen Polysaccharide können für die Verwendung in der Humanmedizin und Veterinärmedizin zu immunmodulierenden Präparaten verarbeitet werdenThe polysaccharides obtained by the method of the invention may be processed into immunomodulatory preparations for use in human and veterinary medicine

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Characteristic of the known technical solutions

Bestimmte Extrakte von Enterobakterien, besonders Glykoproieine von Klebsieila pneumoniae sind durch die europäischen Patentanmeldungen 0 049 181, 0 049 182 und 0 115 988 bekannt. In der europr.schen Patentanmeldung 0 139 551 sind Verfahren zur Herstellung immunstimulierender Wirkstoffe beschrieben, die man durch die Wirkung von Bakteriophagen auf verschiedene Bakterien erhält.Certain extracts of enterobacteria, particularly glycoproieins from Klebsieila pneumoniae are known from European patent applications 0 049 181, 0 049 182 and 0 115 988. European patent application 0 139 551 describes processes for preparing immunostimulating active substances which are obtained by the action of bacteriophages on various bacteria.

Object of the invention

Ziel der Erfindung ist die Gewinnung neuer Polysaccharide mit" immunmodulierenden EigenschaftenThe aim of the invention is the production of new polysaccharides with "immunomodulating properties

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Explanation of the essence of the invention

Die Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung neuer Polysaccharide mit immunmodulierenden Eigenschaften und ausgezeichneter Verträglichkeit. Das Verfahren zur Gewinnung neuer Polysaccharide aus einem Bakteriophagen-Lysefiltrat einer Kultur wenigstens einer Bakterienart vom Typ Escherichia coli oder Klebsiella pneumoniae ist dadurch gekennzeichnet, daß man das Filtrat konzentriert und gleichzeitig einer Molekülselektion durch Führen auf Membranen mit selektiver Permeabilität unterzieht, dann die Lösung der extrahierten Polysaccharide durch Chromatographie behandelt, die erste Fraktion gewinnt, dialysiert, die Lösung konzen-The object of the invention is a process for obtaining new polysaccharides with immunomodulating properties and excellent compatibility. The process for obtaining novel polysaccharides from a bacteriophage lysis filtrate of a culture of at least one type of Escherichia coli or Klebsiella pneumoniae bacterium is characterized by concentrating the filtrate and simultaneously subjecting it to molecular selection by passing on selective permeability membranes, then extracting the solution Treated polysaccharides by chromatography, the first fraction wins, dialyzed, the solution concen-

triert und durch Chromatographie erneut fraktioniert, die erste Fraktion gewinnt und trocknet.trated and re-fractionated by chromatography, the first fraction wins and dried.

Die Polysaccharide nach der Erfindung sind ausgestattet mit sehr interessanten pharmakologischen und therapeutischen Eigenschaften. Sie sind insbesondere mit immunmodulierenden Eigenschaften versehen. Sie zeigen beim Menschen eine ausgezeichnete Verträglichkeit.The polysaccharides of the invention are endowed with very interesting pharmacological and therapeutic properties. They are especially provided with immunomodulating properties. They show in humans an excellent compatibility.

Diese neuen Polysaccharide finden als Arzneimittel beispielsweise ihre Verwendung bei der Behandlung oder Verhinderung von Krankheiten, d.e von einer Störung des Immunsystems stammen, beim Menschen oder Tier, bei der Verhinderung oder Behandlung von infektiösen Bakterien-, Viren-, PiIz- oder Parasitenangriffen, sowie in der Rheumatologe, in der Wundheilung und in der Onkologie.These new polysaccharides are useful as drugs for example in the treatment or prevention of diseases originating from a disorder of the immune system, in humans or animals, in the prevention or treatment of infectious bacterial, viral, PiIz or parasitic attacks, as well as in rheumatologist, wound healing and oncology.

Die erfindungsgemäße Verbesserung der eingangs genannten bekannten Verfahren erlaubt es, neue wasserlösliche Polysaccharide zu erhalten, die 65 bis 75 % neutrale Ösen, 18 bis 27 % Uronsäuren, 5 bis 9 % Pyruvsäure in der Form von Pyruviliden, weniger als 1 % Proteine und weniger als 0,5 % Osamine enthalten und ein Molekulargewicht über 50 000 haben.The improvement of the aforementioned known processes according to the invention makes it possible to obtain new water-soluble polysaccharides containing 65 to 75% neutral eyelets, 18 to 27% uronic acids, 5 to 9% pyruvic acid in the form of pyruvilides, less than 1% proteins and less than Contain 0.5% osamines and have a molecular weight above 50,000.

Man bezeichnet als neutrale Ösen insbesondere Hexosen, wie Glukose, Galactose oder Mannose, und als Uronsäuren insbesondere Galacturonsäure und als Osamine insbesondere Gluosamine .In particular, hexoses, such as glucose, galactose or mannose, and, in particular, galacturonic acid as uronic acids and, in particular, gluosamines as oatsines, are referred to as neutral eyelets.

Das Molekulargewicht von Polysacchariden wurde durch Messung des Sedimentationskoeffizienten beim analytischen Ultrazentrifugieren und durch Molekularsiebung bestimmt.The molecular weight of polysaccharides was determined by measuring the sedimentation coefficient in analytical ultracentrifugation and molecular sieving.

Die nach dem Verfahren der Erfindung erhaltenen Polysaccharide können aus verschiedenen Bakterien- oder Mikroorganismenstämmen ohne irgendeine Beschränkung extrahiert werden. Man nimmt indessen ganz besonders jene, die aus Stämmen von Escherichia coli und Klebsieila pneumoniae stammen, welchThe polysaccharides obtained by the process of the invention can be extracted from various bacterial or microorganism strains without any limitation. In particular, however, those derived from strains of Escherichia coli and Klebsieila pneumoniae, which are

Ι beim Institut Pasteuer von Paris hinterlegt sind, besonders unter den Nummern 62.23 und 58.5.Ι deposited with the Institut Pasteuer of Paris, in particular under points 62.23 and 58.5.

Das Studium der Struktur dieser Polysaccharide mit Hilfe verschiedener Techniken, wie der Chromatographie in Gasphase, der Massenspektrometrie, der Elektrophorese, der Aminosäurenautoanalyse, der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie, der kernmagnetischen Resonanz und der analytischen Ultrazentrifugieren, gestattete es, die Zusammensetzung, wie sie oben erwähnt wurde, zu präzisieren. Es ist festzustellen, daß die Peptidunterfraktion nicht für die pharmakologischen Aktivitäten dieser Polysaccharide verantwortlich ist.The study of the structure of these polysaccharides by various techniques such as gas phase chromatography, mass spectrometry, electrophoresis, amino acid autoanalysis, high performance liquid chromatography, nuclear magnetic resonance and analytical ultracentrifugation allowed the composition as mentioned above to specify. It should be noted that the peptide subset is not responsible for the pharmacological activities of these polysaccharides.

Die molekulare Zusammensetzung der neuen Polysaccharide enthält pro Galactosemolekül 0,2 bis 0,4 Glukosemoleküle, 2 bis 2,5 Mannosemoleküle, 1 Galacturonsäuremolekul und 1 Pyruvsäuremolekül.The molecular composition of the new polysaccharides contains per molecule of galactose 0.2 to 0.4 glucose molecules, 2 to 2.5 Mannosemoleküle, 1 Galacturonsäuremolekul and 1 Pyruvsäuremolekül.

Die wasserlöslichen Polysaccharide werden aus Bakteriophagen-Lysaten einer Kulcur wenigstens einer Bakterienart vom Typ Escherichia coli und Klebsiella pneumoniae isoliert. Diese verschiedenen Lysate können nach einer besonders in der europäischen Patentanmeldung 0 139 551 beschriebenen Technik hergestellt werden. Das Verfahren zur Gewinnung dieser Lysate vom bakteriellen Lysetyp beruht auf einer Folge von wenigstens zwei unerläßlichen Stufen, nämlich einer Bakteriophagen-Lyse, dann der Beseitigung der nichtlysierten Bakterien und der Bakterienbruchscücke durch Filtration, Zentrifugieren usw. Dieses Verfahren kann ausgehend von einem Bakterium oder auch unter Benutzung aufeinanderfolgender Bakterien unterschiedlicher Arten oder sogar unter gleichzeitiger Benutzung von Bakterien unterschiedlicher Arten durchgeführt werden.The water-soluble polysaccharides are isolated from bacteriophage lysates of a Kulcur at least one type of bacteria Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae. These various lysates can be prepared by a technique particularly described in European Patent Application 0 139 551. The process for obtaining these lysates of the bacterial lysis type is based on a series of at least two indispensable stages, namely a bacteriophage lysis, then the removal of the non-lysed bacteria and the bacterial Bruchcücke by filtration, centrifugation, etc. This method can be based on a bacterium or under Using successive bacteria of different types or even with the simultaneous use of bacteria of different types are performed.

Es wurde gefunden, daß es möglich ist, das Verfahren zu verbessern, indem man das chemisch nicht definierte Kulturmedium durch ein synthetisches definiertes, vollständig dialysierbaras Medium, wie die Zusammensetzungen des angereicherten Mediums M_g nach Adams (M. H. Adams, Bacteriophages Interscience New York, Seite 446, 1959) oder das Medium nach Rogers (H. J. Rogers, Infect. Immuno., Seite 4445, 1973) ersetzt .It has been found that it is possible to improve the process by passing the chemically undefined culture medium through a synthetic, fully dialysable, medium such as Adams enriched medium M _g (MH Adams, Bacteriophages Interscience, New York, page 446, 1959) or the medium according to Rogers (HJ Rogers, Infect. Immuno., Page 4445, 1973).

Dieses Medium kann dann vorteilhafterweise durch Benutzung von Vorrichtunger, mit selektiver Molekülpermeabilität beseitigt werden. Die Benutzung dieser Vorrichtungen gestattet eine Konzentrierung der Lysefiltrate und erleichtert das Arbeiten mit geringen Volumina. Das Ultrafiltrat kann beispielsweise durch Lyophilisieren zur Trockene gebracht werden .This medium can then be advantageously eliminated by the use of devices with selective molecular permeability. The use of these devices allows concentration of the lysis filtrate and facilitates working with small volumes. The ultrafiltrate can be brought to dryness, for example, by lyophilization.

Die Technik der Molekülselektion gestattet es, das Kulturmedium besonders durch Benutzung von Membranen mit selektiver Permeabilität, insbesondere? von Ultrafiltern, zu entfernen, und ebenso wird nach der gleichen Methode die Konzentrierung von Lysefiltraten realisiert. Die Membranen mit selektiver Permeabilität können unterschiedlicher Natur sein, wie beispielsweise aus Celluloseacetat, auf der Basis von Polysulfönen, aromatischer Polymere, Vinylchlorid- und Acrylnit.ri].-mischpolymere und auf der Basis von Polysulfonen auf I'ciyethylenträgern. Diese Membranen können in ebener Form, Röh·- renform oder außerdem in der Form von Hohlfasern oder Spiralen vorliegen. Die Membranen gestatten eine Konzentrierung von Molekülen eines Molekulargewichts oberhalb oder gleich 10 000 und so eine Beseitigung des Kulturmediums von Molekülen geringen Molekulargewichts durch Dialyse. Es ist erwünscht, eine Konzentrierung von etwa dem 30fachen zu erhalten .The technique of molecule selection allows the culture medium to be particularly characterized by the use of membranes with selective permeability, in particular? of ultrafilters, and also the lysis filtrate concentration is realized by the same method. The selective permeability membranes may be of a different nature, such as cellulose acetate based on polysulfones, aromatic polymers, vinyl chloride and acrylonitrile mixed polymers, and polysulfone-based polysilane based polymers. These membranes may be in planar form, tubular form, or in the form of hollow fibers or spirals. The membranes permit concentration of molecules of molecular weight above or equal to 10,000, thus eliminating the culture medium of low molecular weight molecules by dialysis. It is desirable to obtain a concentration of about 30 times.

Nach einer Variante kann man mit einer vorausgehenden Reinigungsphase durch Behandlung der erhaltenen Lösung mit einem Alkanol mit geringem Molekulargewicht, wie Ethanol, MethanolIn a variant, a preliminary purification phase may be carried out by treating the resulting solution with a low molecular weight alkanol such as ethanol, methanol

1 oder Isopropanol, arbeiten.1 or isopropanol, work.

Dann wird das Konzentrat durch Chromatographie auf einer Säule gereinigt. Mehrere Chromatographietypen sind für die Verwendung des Verfahrens geeignet und lassen sich mit ausgezeichneten Resultaten durchführen.Then the concentrate is purified by chromatography on a column. Several types of chromatography are suitable for the use of the method and can be performed with excellent results.

Diese Chromatographie kann vom Molekularsiebtyp sein, indem man aufeinanderfolgende Durchgänge auf Gelen benutzt, die in einer ersten Stufe den Ausschluß von Molekülen mit geringem Molekulargewicht und in einer zweiten Stufe die Abtrennung von Molekülen mit hohem Molekulargewicht gestatten.This chromatography can be of the molecular sieve type by using successive runs on gels which, in a first step, permit the exclusion of low molecular weight molecules and, in a second step, the separation of high molecular weight molecules.

Diese Chromatographien können vom Af finitätschromatographietyp sein, ^i dem man auf Gel unlöslich gemachte Lektine oder auf Gel unlöslich gemachce Antikörper vom Typ IgG oder IgM benutzt. Die Antikörper können aus Serum von gegen die gesuchten Polysaccharide immunisierten Wirbeltieren stammen, insbesondere von Kaninchen, Ratten, Meerschweinchen und Mäusen. Die Antikörper können polyklonalen oder monoklonalen Ursprungs sein und nach den für den Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden. Die Lektine und die Antikörper werden auf d^n inerten Gelen vom Agarosetyp oder vom PoIyacrylamidtyp unlöslich gemacht, die vorher mit bekannten Techniken, wie beispielsweise mit Paranitrophenylchlorformiat, aktiviert wurden.These chromatographies may be of the affinity chromatography type using gel-insoluble lectins or gel-insoluble antibodies of the IgG or IgM type. The antibodies may be derived from serum of vertebrates immunized against the desired polysaccharides, particularly rabbits, rats, guinea pigs and mice. The antibodies may be polyclonal or monoclonal in origin and prepared by methods known to those skilled in the art. The lectins and antibodies are insolubilized on the inert agarose or polyacrylamide type gels previously activated by known techniques such as paranitrophenyl chloroformate.

Diese Chromatographien können vom Ionenaustauschchromatographietyp sein. Die benutzten Träger können beispielsweise Polyacrylamidgele oder durch Diethylaminoethylgruppen substituierte Cellulosegele oder substituierte Polystyrol-Divinylbenzolharze sein.These chromatographies may be of the ion exchange chromatographic type. The carriers used may be, for example, polyacrylamide gels or diethylaminoethyl-substituted cellulose gels or substituted polystyrene-divinylbenzene resins.

Die erste Trennung durch Chromatographie kann vorteilhafterweise vom Affinitätstyp mit auf inertem Gel immobilisierten Antikörpern oder vom Ionenaustauschtyp sein.The first separation by chromatography may advantageously be of affinity type with antibodies immobilized on inert gel or of ion exchange type.

Die zweite Trennung durch Chromatographie ist vorzugsweiseThe second separation by chromatography is preferred

ο- 2 73 4 5ο- 2 73 4 5

vom Ionenaustauschtyp.of the ion exchange type.

Die diversen Chromaiiographieoperafcionen erfolgen mit Hilfe üblicher Verfahren, insbesondere unter Verwendung der Differentialrefraktometrie, der Spektrophotometrie, der Spektrofluorometrie oder der Analyse neutraler Hexosen nach der Schwefelsäure-Resorcin-Methode.The various chromatographic operations are carried out by means of conventional methods, in particular using differential refractometry, spectrophotometry, spectrofluorometry or the analysis of neutral hexoses by the sulfuric acid-resorcinol method.

Die Fraktion, die den bei der Erfindung gesuchten Polysacchariden entspricht, kann sodann dialysiert oder ultrafiltriert und nach Verfahren wie Zerstäubung oder Lyophiiisierung getrocknet werden.The fraction corresponding to the polysaccharides sought after in the invention may then be dialyzed or ultrafiltered and dried by methods such as atomization or lyophilization.

Die Arzneimittel nach der Erfindung können mit einer antibiotischen Substanz, wie Tetracyclines einer Antivirussubstanz, v/ie synthetischen Nukleotiden, die die Virusnukleinsäuresynthese überlagern, mit einer Antipilzsubstanz, wie Buclosamid, oder einer Anciparasitensubstanz, wie C>.' ~.rochin, kombiniert werdenThe pharmaceutical compositions according to the invention may be combined with an antibiotic substance, such as tetracyclines of an antiviral substance, synthetic nucleotides superimposing viral nucleic acid synthesis with an antifungal substance, such as buclosamide, or an anciparasite substance, such as C 1. ~ .rochin, combined

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Bei einer anderen Ausführungsform können die Arzneimittel nach der Erfindung mit anderen Produkten und pharmazeutischen Zusammensetzungen, wie einem Antitumormittel (cytostatischem Mittel), einem Immunsuppre^risivum (Ciclosporin, anti-In another embodiment, the pharmaceutical compositions may according to the invention with other products or pharmaceutical compositions as an anti-tumor agent (cytostatischem means), a Immunsuppre ^r isivum (cyclosporine, anti-

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lymphocytären Aminoglobulinen), einem antimitotischen Mittel, wie den Persäurederivaten, oder einem entzündungshemmenden Mittel, wie Indomethacin, vereinigt werden.lymphocytic aminoglobulins), an antimitotic agent such as the peracid derivatives, or an antiinflammatory agent such as indomethacin.

Die Arzneimittel nach der Erfindung können auch mit makromolekularen Trägern gekoppelt werden, die ihre biologische Verfügbarkeit oder ihre Zielwirkung verbessern oder ihre Toxizität vermindern. Beispielsweise, aber nicht beschrär.kend können diese Träger Liposomen, Antikörper, Proteine oder andere Makromoleküle sein.The pharmaceutical compositions of the invention may also be coupled with macromolecular carriers that enhance their bioavailability or their targeting effect or reduce their toxicity. By way of example, but not limitation, these carriers may be liposomes, antibodies, proteins or other macromolecules.

Die angewendete Dosierung unterliegt großen Veränderungen in Abhängigkeit von der Zusammensetzung des Arzneimittels, der vorgeschriebenen Indikation, der Verabreichungsform und des Alters des behandelten Patienten. Die Bestimmung der verwendeten Dosierungen bleibt der Beurteilung des Arztes oder des Tierarztes überlassen, wie es übliche Praxis bei den Behandlungen von Modulationen der Immunantwort ist.The dosage used will vary greatly depending on the composition of the drug, the prescribed indication, the form of administration and the age of the patient being treated. The determination of the dosages used is left to the judgment of the physician or the veterinarian, as is common practice in the treatment of modulations of the immune response.

Beispielsweise kann die Dosierung Dosen von 50 pg/Tag b.^; ö 50 mg/Tag auf oralem Weg beim Menschen bei der Verhinderung oder Prophylaxe von Infektionen oder postoperativen infektiösen Komplikationen, bei den Behandlungen chronischer oder ' rezidivierender Infektionen der Atemwege oder Harnwege zulassen. Die übliche Dosis auf parenteralem Weg kann je nach dem behandelten Patienten und' der fraglichen Erkrankung 50 μτη bis bis 50 mg/Tag beim Menschen betragen.For example, the dosage can be doses of 50 pg / day b. ^; o Allow 50 mg / day by oral route in humans in the prevention or prophylaxis of infections or postoperative infectious complications in the treatment of chronic or recurrent respiratory or urinary tract infections. The usual parenteral dose may be 50 μτη to 50 mg / day in humans, depending on the patient being treated and the disease in question.

Als Arzneimittel können die Polysaccharide nach der Erfindung auf oralem, perlingualem, parenteralem, transkutanem, perkutanem oder örtlichem Weg oder über die Luftwege verabreicht werden.As medicaments, the polysaccharides of the invention may be administered by oral, perlingual, parenteral, transdermal, percutaneous or local routes or by the airways.

Die entsprechenden pharmazeutischen Zusammensetzungen können fest oder flüssig sein und in gewöhnlich in der Human- oder Veterinärmedizin verwendeten pharmazeutischen Formen vorliegen, wie beispielsweise als die einfachen oder dragierten Tabletten, die Retardtabletten, die Pastillen, die Granalien, die Pulver, die Lösungen, die Sirupe, die Suppositorien,The corresponding pharmaceutical compositions may be solid or liquid and may be in pharmaceutical forms commonly used in human or veterinary medicine, such as the simple or coated tablets, the prolonged-release tablets, the lozenges, the granules, the powders, the solutions, the syrups, the suppositories,

-ΙΟΙ die lyophilisierten oder nichtlyophilisierten injizierbaren Präparate, die Kapseln, die Cremes, die GnIe, die Salhen, die Lotionen, die Tropfen, die Augentropfen oder die Aerosole. Die Wirkstoffe können in Trägerstoffe eingearbeitet werden, die üblicherweise in diesen pharmazeutischen Zusammensetzungen benutzt werden, wie Talkum, Magnesiumstearat, kolloidale Kieselsäure, Saccharose, Sorbit, Mannit, die wäßrigen oder nichtwäßrigen Vehikel, die Fettkörper tierischen oder pflanzlichen Ursprungs, die Paraffinderivate, die GIykole, die verschiedenen Befeuchtungs- oder Emulgiermi '.el und die Konservierungsmittel.-ΙΟΙ lyophilized or non-lyophilized injectable preparations, capsules, creams, gnies, salads, lotions, drops, eye drops or aerosols. The active compounds may be incorporated in excipients commonly used in these pharmaceutical compositions, such as talc, magnesium stearate, colloidal silicic acid, sucrose, sorbitol, mannitol, the aqueous or nonaqueous vehicles, the fats of animal or vegetable origin, the paraffin derivatives, the glycols, the various moistening or emulsifying agents and the preservatives.

AusfuhrungsbeispieleExemplary embodiments Beispiel 1example 1

rien_der_Gattung_Klebsiella_und Escherichiarien_der_Gattung_Klebsiella_ and Escherichia

Das Bakterium der Gattung Klebsiella, Art pneumoniae, ist vom Serotyp K 68, hinterlegt beim Institut Pasteur in Paris unter der Nummer 58.5.The bacterium of the genus Klebsiella, Art pneumoniae, is of serotype K 68, deposited at the Institut Pasteur in Paris under the number 58.5.

Das Bakterium der Gattung Escherichia, Art coli, ist vom Serotyp 0119: B 14, hinterlegt beim Institut Pasteur in Paris unter der Nummer 62.23.The bacterium of the genus Escherichia, Art coli, is of the serotype 0119: B 14, deposited at the Institut Pasteur in Paris under the number 62.23.

Der Phage, homolog zu Klebsiella, gehört zu der morphologischen Gruppe C. (Nomenklatur des Unterkomitees für Taxonomie der Bakteriophagen des Internationalen Komitees für Virustaxonomie der I. A. M. S.), er hat einen icosaedrischen Kopf, einen kurzen Schwanz, ist schwierig sichtbar zu machen, die Hülse und die Endscheibe sind nicht feststellbar. Auf Gelosemedium nehmen die Lysebereiche 0,5 bis 3 mm ein und haben sehr unregelmäßige Form mit verwischten Konturen und einem klaren Zentrum. Die Klone sind selten.The phage, homologous to Klebsiella, belongs to the morphological group C. (Nomenclature of the Subcommittee on Taxonomy of Bacteriophages of the International Committee for Viral Taxonomy of the IAMS), it has an icosahedral head, a short tail, is difficult to visualize the pod and the end plate can not be detected. On gel medium, the lysis areas occupy 0.5 to 3 mm and have very irregular shape with blurred contours and a clear center. The clones are rare.

. Der Coliphage gehört zu der morphologischen Gruppe C. (No-, The coliphage belongs to the morphological group C. (No-

menklatur des Unterkomitees für Taxonoinie der Bakteriophagen des Internationalen Komitees für Virustaxonomie der I. A. M. S.), er hat einen isometrischen Kopf, einen sehr kurzen Schwanz, ist schwierig sichtbar zu machen, seine Hülse und seine Endscheibe sind nicht feststellbar. Auf Gelosemedium haben die Lysebereiche einen Durchmesser von 1 bis 1,5 mm, eine runde Form, regelmäßige Konturen, ein verschleierteshe has an isometric head, a very short tail, is difficult to visualize, his sleeve and its end disc are not detectable. On gel medium, the lysis areas have a diameter of 1 to 1.5 mm, a round shape, regular contours, a veiled one

r+ Zentrum und zerfließende Kloner + center and deliquescent clones

Die beiden Bakterienstä'mme werden mit Hilfe einer Gärvorrichtung in einem vollständig dialysierbaren synthetischen Medium der folgenden Zusammensetzung gezüchtet:The two bacterial strains are cultured by means of a fermentation device in a fully dialysable synthetic medium of the following composition:

180,00 mg180.00 mg

417,00 mg417.00 mg

104,00 mg104.00 mg

22,00 mg22.00 mg

47,00 mg47.00 mg

68,00 mg68.00 mg

0,50 mg0.50 mg

1,00 mg1.00 mg

0,50 mg0.50 mg

NH₄ClNH ₄ Cl 1,001.00 gG L-ArgminL-argmin 1515 KH₂PO₄ KH ₂ PO ₄ 3,003.00 gG L-GlutaminL-glutamine Na₂PO₄-12H₂ONa ₂ PO ₄ -12H ₂ O 6,006.00 gG L-Lysin . HClL-lysine. HCl MgSO₄-7H₂QMgSO ₄ -7H ₂ Q 4,554.55 gG L-MethioninL-methionine D-GlukoseD-glucose 140,00140.00 gG L-PhenylalaninL-phenylalanine L-ThreoninL-threonine 2020 L-LeucinL-leucine 78,0078,00 mgmg Folsäurefolic acid L-HistidinL-histidine Inositolinositol HClHCl 60,0060,00 mgmg Nicotinamidnicotinamide L-IsoloucinL-Isoloucin 78,0078,00 mgmg Pyridoxal . HClPyridoxal. HCl L-ValinL-valine 67,0067,00 mgmg Panthotenatpantothenate 2525 L-TryptophanL-tryptophan 15,0015.00 mgmg Cholinchloridcholine chloride Thiamin . HClThiamine. HCl

Das Medium wird mit einem Inoculum von Klebsiella pneumoniae beimpft, das sich in stationärer Wachstumsphase befindet. Die Anfangsdichte beträgt 1 . 10 Bakterien je Milliliter. Die Kultur wird bei 37 ⁰C unter mäßigem Rühren gehalten.The medium is inoculated with an inoculum of Klebsiella pneumoniae, which is in stationary growth phase. The initial density is 1. 10 bacteria per milliliter. The culture is kept at 37 ^° C. with moderate stirring.

Am Ende der Latenzphase, d. h. etwa 60 min nach der Beimpfung, werden die Bakterien durch ihre homologen Phagen infiziert, wobei die optimale Infektionsanzahl 0,03 ist.At the end of the latency phase, d. H. About 60 minutes after inoculation, the bacteria are infected by their homologous phages, the optimal number of infections being 0.03.

Die Entwicklung der Lyse wird mit Hilfe eines Zellzählers verfolgt. Wenn weniger als 10 Bakterien je Milliliter ver-The development of lysis is monitored by means of a cell counter. If less than 10 bacteria per milliliter are used

blieben sind, wird das Medium erneut mit einem Inokulum von Escherichia beimpft, das sich in stationärer Wachstumsphase befindet. Die Anfangsdichte dieser neuen Kultur ist 5 . 10 Escherichia je MilliliterOnce again, the medium is again inoculated with an inoculum of Escherichia, which is in stationary growth phase. The initial density of this new culture is 5. 10 Escherichia per milliliter

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Am Ende der Latenzphase, d. h. unter diesen experimentellen Bedingungen 20 min nach der zweiten Beimpfung, werden die Bakterien durch die Coliphagen infiziert. Die Infektionsanzahl ist optimal 0,1.At the end of the latency phase, d. H. Under these experimental conditions, 20 minutes after the second inoculation, the bacteria are infected by the coliphages. The number of infections is optimal 0.1.

Die Entwicklung der Lyse wird mit Hilfe eines Zellzählers verfolgt. Wenn weniger als 10 Escherichia je Milliliter .verblieben sind, wird die Kultur angehalten, indem sie durch eine sterilisierende Filtermembran von 0,22 μπι geführt wird.The development of lysis is monitored by means of a cell counter. If less than 10 Escherichia per milliliter. Remained, the culture is stopped by passing through a sterilizing filter membrane of 0.22 μπι.

Das Filtrat wird sodann dialysiert und durch tangentiale Ultrafiltration konzentriert. Die resultierende Lösung kann durch Lyophilisieren getrocknet oder direkt auf eine Kolonne mit einem Durchmesser von 5 cm und einem Gehalt von 1 1 DEAE Trisacryl aufgegeben werden. Die Entwicklung erfolgt durch einen Gradienten einer Natriumphosphatlösung, deren Konzentration von 50 bis 650 mM variiert. Der pH-Wert dieser Lösung ist 7,5. Die der ersten Elutionsspitze entsprechenden Fraktionen (Feststellung neutraler Hexosen nach der Schwefelsäure-Resorcinmethode) werden vereinigt und gegen eine Natriumphosphatlösung von 10 mM und pH 7,5 dialysiert. Die erhaltene Fraktion wird dann auf eine Säule mit einem Durchmesser von 2,5 cm und einem Gehalt von 500 ml DOWEX-Harz 50-X2^(R) von 100 bis tes Wasser) aufgeben.The filtrate is then dialyzed and concentrated by tangential ultrafiltration. The resulting solution can be dried by lyophilization or applied directly to a column with a diameter of 5 cm and a content of 1 l DEAE Trisacryl. The development is carried out by a gradient of a sodium phosphate solution whose concentration varies from 50 to 650 mM. The pH of this solution is 7.5. The fractions corresponding to the first elution peak (determination of neutral hexoses by the sulfuric acid-resorcinol method) are combined and dialyzed against a sodium phosphate solution of 10 mM and pH 7.5. The resulting fraction is then applied to a 2.5 cm diameter column containing 500 ml DOWEX resin 50-X2 ^(R) of 100 to tes water).

50-X2^(R) von 100 bis 200 Maschen (Eluiermittel: destillier-50-X2 ^(R) from 100 to 200 mesh (eluant: distillate

Die der ersten Elutiorsspitze entsprechenden Fraktionen (Feststellung durch Refraktometrie oder neutrale Hexosen nach der Resorcinmethode) werden mit Soda IN oder 5 %igem Ammoniak neutralisiert, vereinigt und lyophilisiert. Man erhält die gereinigten gesuchten Polysaccharide, deren molare Zusammensetzung folgende ist: pro 1 Galactosemolekül 0,2 Glukosemoleküle, 2,2 Mannosemoleküle, 1 Galacturonsauremole-The fractions corresponding to the first peak of Elutior (determined by refractometry or neutral hexoses according to the resorcinol method) are neutralized with soda IN or 5% ammonia, combined and lyophilized. The purified, sought after polysaccharides are obtained whose molar composition is as follows: per molecule of galactose 0.2 glucose molecules, 2.2 mannose molecules, 1 galacturonic acid molecule

kül und 1 Pyruvsäuremolekül in der Form von Pyruvilidenkül and 1 Pyruvsäuremolekül in the form of pyruvilides

Beispiel 2Example 2

Die Polysaccharide werden nach der Arbeitsweise des Beispieles 1 erhalten, wobei man nur das üakterium des Stammes Klebsiella pneumoniae verwendet. Die Zusammensetzung der erhaltenen Polysaccharide ist folgende: 69 % neutrale Hexosen, 0,25 % Glukosamin, 7 % Pyruvsäure, 22,7 % Galacturonsäure und 0,86 5 Proteine.The polysaccharides are obtained according to the procedure of Example 1, using only the Üakterium of the strain Klebsiella pneumoniae. The composition of the resulting polysaccharides is as follows: 69% neutral hexoses, 0.25% glucosamine, 7% pyruvic acid, 22.7% galacturonic acid and 0.86 5 proteins.

Example 3

Das Lysefiltrat der Bakterienstämme Escherichia coli und Klebsiella pneumoniae, erhalten gemäß dem Verfahren des Beispiels 1, wird gegen einen Natriumphosphatpuffer mit 150 mM und pH 7,4. dialysiert. Das Filtrat wird sodann auf eine Säule mit einem Durchmesser von 5 cm und einem Gehalt von 500 ml GF 2000 Trisacryl -Gel aufgegeben, auf welchem in kovalenter Weise 1,5 mg spezifische Antikörper je Milliliter Gel fixiert sind. Nach 1 h Inkubation wird die Säule mit dem Vierfachen ihres Volumens eines Phcsphatpuffers mit 150 mM bei pH 7,4 gewaschen. Die E.lution erfolgt mit einer Lösung des gleichen Puffers mit einem Gehalt von 2 M Magnesiumchlorid. Eine Fraktion gleich dem 2fachen Volumen der Säule wird zurückgehalten und gegen destilliertes Wasser dialysiert. Diese Fraktion wird lyophilisiert und enthält die Polysaccharide mit folgender molarer Zusammensetzung: je 1 Galactosemolekül 2,5 Mannosemolekülse, 0,3 Glukosemoleküle, 1 Galacturonsauremoiekul, 1 Pyruvsäuremolekül in der Form von Pyruviliden.The lysis filtrate of the bacterial strains Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae, obtained according to the method of Example 1, is assayed against a sodium phosphate buffer of 150 mM and pH 7.4. dialyzed. The filtrate is then applied to a 5 cm diameter column containing 500 ml of GF 2000 Trisacryl gel on which are covalently fixed 1.5 mg of specific antibody per milliliter of gel. After 1 h of incubation, the column is washed with four times its volume of a phosphate buffer of 150 mM at pH 7.4. The E.lution is carried out with a solution of the same buffer containing 2 M magnesium chloride. A fraction equal to twice the volume of the column is retained and dialyzed against distilled water. This fraction is lyophilized and contains the polysaccharides having the following molar composition: 1 galactose molecule, 2.5 mannose molecule shells, 0.3 glucose molecules, 1 galacturonic acid moecul, 1 pyruvic acid molecule in the form of pyruvilides.

Pharmacological investigations

Die Aktivitäten der Polysaccharide nach der Erfindung beim Tier und beim Menschen wurden mit den nach den Beispielen 1 und 2 erhaltenen Produkten getestet.The activities of the polysaccharides according to the invention in animals and man were tested with the products obtained according to Examples 1 and 2.

-14-Aktivierung von alveolaren Makrophagen-Murcincn -14- Activation of alveolar macrophage Murcincn

Dieser Test verdeutlicht das Phänomen einer Aktivierung von Makrophagen aufgrund ihrer cytostatischen oder cytotoxischen Aktivität: gegen Tumorzellen.This test illustrates the phenomenon of activation of macrophages due to their cytostatic or cytotoxic activity: against tumor cells.

Die phagocytären Leukocyten der Klasse der Monocyten-Makrophagen können einem Aktivierungsprozeß unterliegen» der sich durch Eigenschaften, wie die Steigerung der Phagocytose, die Steigerung der proteolytischen Enzymsekretion, der Sauerstoff metaboliten, wie des Superoxidanions oder von Wasserstoffperoxid, und cytotoxischer Faktoren zeigt.The phagocytic leukocytes of the monocyte-macrophage class may undergo an activation process characterized by properties such as the increase in phagocytosis, the enhancement of proteolytic enzyme secretion, the oxygen metabolites such as superoxide anion or hydrogen peroxide, and cytotoxic factors.

Diese Prozesse haben teil an einer Zunahme der bakteriziden und tumoriziden Fähigkeit dieser Zellen.These processes are part of an increase in the bactericidal and tumoricidal capacity of these cells.

Ferner gestattet es dieser Aktivierungsprozeß diesen Zellen, ihre Fähigkeit einer Präsentation verschiedener Antigene gegenüber zusammenwirkenden Lymphocyten T zu steigern. Schliei3lich gestattet das Phänomen der Makrophagenaktivierung die Sekretion von Monoklinen, wie den Interferonen oder des Interleukins, die an dem Prozeß der Immunantwort teilhaben.Further, this activation process allows these cells to enhance their ability to present various antigens to co-acting lymphocytes T. Finally, the phenomenon of macrophage activation allows for the secretion of monoclinics, such as interferons or interleukins, that participate in the process of immune response.

Der Test der Maßnahme der Makrophagenaktivierung besteht darin, eine alveolare oder peritoneale Makrophagenkultur der Ratte oder der Maus oder menschliche Monocyten mit Dosen von Polysacchariden nach der Erfindung, die von 0,001 bis 50 μg/ ml variieren, zu behandeln. Dies wird folgendermaßen realisiert:The test of the measure of macrophage activation is to treat an alveolar or peritoneal rat or mouse macrophage culture or human monocytes with doses of polysaccharides of the invention varying from 0.001 to 50 μg / ml. This is realized as follows:

10 Makrophagen der Maus vom Stamm Bald c, Swiss C 57/B 16 oder DBA/2 oder der Ratte vom Stamm Kyoto oder Wistar werden in einer Mikrotitrationsplatte in ein Kulturmedium gegeben, das gegebenenfalls durch ein künstliches Serum von 1 bis 10 μΓη/ml Polymyxin ergänzt wurde.Mouse macrophages from strain Bald c, Swiss C 57 / B 16 or DBA / 2 or the rat from the strain Kyoto or Wistar are placed in a microtitration plate in a culture medium optionally with an artificial serum of 1 to 10 μΓη / ml polymyxin was added.

Man setzt dip Polysaccharide . nach der Erfindung oder denOne sets dip polysaccharides. according to the invention or the

273 4 s273 4 s

entsprechenden Puffer ohne Polysaccharide als negative Kontrolle zu. Die Zellen werden 24 h bei 37 ⁰C inkubiert. Man entfernt sondann das oben Schwimmende und wäscht die Zellen mit Kulturmediumcorresponding buffer without polysaccharides as a negative control. The cells are incubated at 37 ^° C. for 24 h. One then removes the above floating and washes the cells with culture medium

5 5

Sodann setzt man die gezielten Tumorzellen L 1210 oder P 815 einem vollständigen Medium zu. Das Verhältnis von Makrophagen zu Zielzellen ist 10. Man inkubiert sodann die Kultur während 24 h bei 37 ⁰C. Dann gibt man ein- bis zweimal 10E4B Bq mit tritium markiertes Thymidin je Vertiefung zu. Die Zellen werden nach 4 h Inkubation bei 37 ⁰C auf einem Filter aus Glasfasern gewonnen. Nach dem Trocknen der Filter wird die Radioaktivität in Gegenwart eines scintillierenden Gemisches gemessen.The targeted tumor cells L 1210 or P 815 are then added to a complete medium. The ratio of macrophages to target cells is 10. The culture is then incubated for 24 h at 37 ⁰ C. Then one to twice 10E4B Bq with tritium-labeled thymidine per well to. The cells are harvested after 4 h incubation at 37 ⁰ C on a filter made of glass fibers. After drying the filters, the radioactivity is measured in the presence of a scintillating mixture.

Die Resultate entsprechen einem Mittel von drei Messungen. Der Aktivi.erungsprozentsatz wird folgendermaßen ausgedrückt:The results correspond to a mean of three measurements. The activation percentage is expressed as follows:

A % = χ 100 κA% = χ 100 κ

R: durch die in Gegenwart von Bezugsmakrophagen gezüchteten Tumorzellen eingeführte Radioaktivität,R: radioactivity introduced by the tumor cells grown in the presence of reference macrophages,

S: durch die in Gegenwart stimulierter Mäkrophagen gezüchteter Tumorzellen eingeführte Radioaktivität,S: radioactivity introduced by tumor cells grown in the presence of stimulated mäkrophag,

Die in der Tabelle I aufgeführten Ergebenisse zeigen die Aktivität der Produkte nach den Beispielen 1 und 3.The results given in Table I show the activity of the products according to Examples 1 and 3.

-16-Tabelle I-16-Table I

27342734

5050

5 Getestetes Produkt 5 Tested product

Polysaccharide von Beispiel 1 Beispiel 3Polysaccharides of Example 1 Example 3

Muramyldipeptid (MDB) positive BezugsprobeMuramyl dipeptide (MDB) positive reference

15 Placebo15 placebo

Dosisdose

% der Aktievierung von alveolaren Makrophagen von Kyoto-Ratten% of activation of alveolar macrophages from Kyoto rats

ο,ο, OiOi Mg/mlMg / ml 58 %58% 0,0 11 Mg/mlMg / ml 62 %62% 11 Mg/mlMg / ml 6C %6C% 1010 Mg/mlMg / ml 86 %86% 0,0 0101 Mg/mlMg / ml 28 %28% 11 Mg/mlMg / ml 90 %90% 1010 Mg/mlMg / ml 92 ft92 ft 0 %0%

Inducible interferon activity in vivo in humans

Die Interferone sind eine Gruppe von Molekülen Proteinur-Sprungs, die Antiviruseigenschaften und immunmodulierende Eigenschaften zeigen. Unter normalen Bedingungen gestattet der schnelle Ausscheidungskoeffizient des Seruminterferons keine direkte Dosierung in menschlichem Serum. Es ist zur Überwindung dieser Schwierigkeit möglich, die Aktivität eines durch das Interferon induzierten Enzyms: der 2',5'-0Iigoisoadenylatsynthetase zu messen. Man konnte demonstrieren, daß dieses Enzym ein gutes Markierungsmittel des Interferons (siehe L. J. Z. Penn und B. R G. Williams, J. Virol., 49, 1984, Seiten 748 bis 753) bei den gesunden Patienten ist; seine Aktivität in den Lymphocyten des peripheren Blutes ist konstant. Im Gegensatz dazu nimmt es im Falle einer Virusinfektion oder bei · Verabreichung von exogenem Interferon stark zu.The interferons are a group of proteinuric jump molecules that exhibit antiviral properties and immunomodulatory properties. Under normal conditions, the rapid clearance coefficient of serum interferon does not permit direct dosing in human serum. To overcome this difficulty, it is possible to measure the activity of an interferon-induced enzyme, 2 ', 5'-oligoisoadenylate synthetase. It has been demonstrated that this enzyme is a good marker of interferon (see L.J.Z. Penn and B.R.G. Williams, J. Virol., 49, 1984, pages 748-753) in healthy patients; its activity in the peripheral blood lymphocytes is constant. In contrast, it greatly increases in the case of viral infection or exogenous interferon administration.

Die Wirkung einer einzigen oralen Verabreichung mit erhöhter Dosis an Polysacchariden nach der Erfindung wurde bei 10 freiwilligen Patienten getestet.The effect of a single oral high-dose polysaccharide dosage of the invention was tested in 10 volunteer patients.

Eine Gruppe von 5 Patienten erhielt ein Placebo, während die andere Gruppe von 5 Patienten eine einzelne Dosis von 2 mg Polysacchariden nach der Erfindung, hergestellt nach Beispiel 1, erhieltOne group of 5 patients received a placebo while the other group of 5 patients received a single dose of 2 mg polysaccharides according to the invention prepared according to example 1

5 5

Blutentnahmen erfolgten vor der Verabreichung des Produktes sowie 24 und 48 h danach. Die peripheren Leukocyten wurden isoliert und lysiert. Die Aktivität der 2 ' ,5'-Oligoisoadenylatsynthetase wurde in diesen Lysaten gemessen.Blood samples were taken before administration of the product and 24 and 48 hours thereafter. The peripheral leukocytes were isolated and lysed. The activity of 2 ', 5'-oligoisoadenylate synthetase was measured in these lysates.

Die in der Tabelle II aufgeführten Ergebnisse zeigen, daß eine einzelne Dosis von 2 mg der Produkte eine signifikante Steigerung der Aktivität der 2',5'-Oligoisoadenylatsynthetase induzierte, insbesondere 48 h nach der oralen Verabreichung.The results shown in Table II show that a single dose of 2 mg of the products induced a significant increase in the activity of 2 ', 5'-oligoisoadenylate synthetase, in particular 48 hours after oral administration.

Table II

Änderung der Aktivität der 2 ' ,5'-Oligoisoadenylatsynthetase. Die Anfangswerte wurdenChange in the activity of 2 ', 5'-oligoisoadenylate synthetase. The initial values were

mit 100 % angenommen.with 100% accepted.

0 h 24 h 48 h0 h 24 h 48 h

Placebo 100 82 109Placebo 100 82 109

2 mg des Produktes des Beispiels 1 100 145 2082 mg of the product of Example 1 100 145 208

Induktion von Inhibitorfaktoren für die LeukocytenwanderungInduction of inhibitory factors for leukocyte migration (MIF-LIF)(MIF LIF)

Eine Untersuchung gegenüber Placebo wurde mit zwei Gruppen von freiwilligen Patienten durchgeführt, die ein Placebo oder eine einzelne Dosis des Produktes gemäß Beispiel 1 auf oralem Wege mit einer einzelnen Dosierung von 2 mg erhielten. Die Verabreichung erfolgte in willkürlicher Weise im Doppelblindversuch.A placebo study was conducted with two groups of volunteer patients receiving a placebo or single dose of the product of Example 1 by oral route with a single 2 mg dose. The administration was carried out in an arbitrary manner in a double-blind experiment.

Blutabnahmen erfolgten 0 h, 24 h, 48 h, 72 h und 96 h nach der Produktverabreichung.Blood samples were taken 0 h, 24 h, 48 h, 72 h and 96 h after product administration.

Die in der Tabelle III beschriebenen Ergebnisse zeigen klar, daß das Produkt eine signifikante Hemmung der Leukocytenwanderung gegenüber dem Placebo induzierte.The results described in Table III clearly show that the product induced a significant inhibition of leukocyte migration over the placebo.

Tabelle III 0_h 24 h 48 h 96 h Table III 0 h 24 h 48 h 96 h

Placebo O 0 3 3Placebo O 0 3 3

2 mg des Produktes2 mg of the product

des Beispiels 1 0 8 22 28Example 1 0 8 22 28

Die Ergebnisse sind als Prozente der Hemmung der Wanderung ausgedrückt.The results are expressed as percent of inhibition of migration.

Die Induktion solcher löslicher Faktoren demonstiert die Wirkung der Polysaccharide nach der Erfindung auf die Mechanismen der Immunantwort.The induction of such soluble factors demonstrates the effect of the polysaccharides of the invention on the mechanisms of the immune response.

Das Interesse der Indu ^tion dieser Faktoren wird durch die nachfolgend beschriebenen kliniachen Versuche erläutert. 25The interest of inducing these factors is illustrated by the clinical trials described below. 25

Verhinderung und Behandlung chronischer und rezidivierender Infektionen der AtemwegePrevention and treatment of chronic and recurrent respiratory infections

Drei Experimentatoren untersuchten klinisch die Polysaccharide nach der Erfindung gemäß Beispiel 1 mit einer Gruppe von Patienten mit chronischer Bronchitis. Diese Patienten hatten wenigstens zwei infektiöse Episoden während der 12 Monate vor dem Versuch. Man schloß die Patienten aus, die schwere Störungen der Leberfunktionen, Nierenfunktionen oder Herzfunktionen hatten. Auch erhielten diese eine systematische Antibiotherapie, eine immunmodulierende Behandlung oder eine Corticotherapie.Three experimenters clinically examined the polysaccharides of the invention of Example 1 with a group of patients with chronic bronchitis. These patients had at least two infectious episodes during the 12 months prior to the trial. Patients were excluded who had severe disorders of liver function, renal function or cardiac function. They also received systematic antibiotherapy, immunomodulatory treatment or corticotherapy.

46 Patienten, die diese Kriterien hatten, wurden mit einer oralen Gabe von 0,06 mg Polysacchariden oder einem Placebo morgens nüchtern 20 aufeinanderfolgende Tage je Monat während drei Monaten behandelt.Forty-six patients who had these criteria were treated with oral 0.06 mg polysaccharide or placebo in the morning sober 20 consecutive days per month for three months.

Die Untersuchung wurde als Doppelblindprobe durchgeführt. Die Patienten wurden während der neun Monate beobachtet, die auf den Beginn der Behandlung folgten.The study was performed as a double-blind test. Patients were followed during the nine months following initiation of treatment.

Die in der Tabelle IV aufgeführten Ergebnisse zeigen die Wirkung des Produktes während der drei auf die Behandlung folgenden Monate.The results listed in Table IV show the effect of the product during the three months following treatment.

Table IV

Produktproduct

nach der Prozentuale Statistischeaccording to the percentage of statistical

Erfindung Placebo Verminderung Signifikanz Invention placebo reduction significance

Anzahl der infektiösenNumber of infectious

Episoden 0,57 0,91 37,4 % ρ < 0,05 Dauer der infektiösenEpisodes 0.57 0.91 37.4% ρ <0.05 duration of infectious

EpisodenEpisodes

(Tags) 5,91 11,96 50,6 % ρ < 0,05(Tags) 5.91 11.96 50.6% ρ <0.05

Dauer derDuration of

Antibiothe-Antibiothe-

rapie (Tage) 6,04 10,17 40,6% p<0,05therapy (days) 6.04 10.17 40.6% p <0.05

Diese Ergebnisse zeigen klar eine signifikante Verminderung der infektiösen Episoden, der Dauer dieser Episoden und der Antibiotherapie bei den Patienten, die mit den Polysacchariden nach der Erfindung gemäß Beispiel 1 behandelt wurden.These results clearly demonstrate a significant reduction in the infectious episodes, the duration of these episodes, and the antibiotic therapy in the patients treated with the polysaccharides of the invention of Example 1.

Verhinderung postoperativer infektiöser KomplikationenPrevention of postoperative infectious complications

Die Senkung der . Immunität durch Zelleinwirkup.g (DTH) nachLowering the. Immunity by cell response (DTH) after

einem operativen Schock ist ein wohlbekanntes Phänomen. Drei Untersuchungen hatten die Wirkung einer oralen Behandlung mit den Polysacchariden nach Beispiel 1 auf das Auftreten von postoperativen infektiösen Komplikationen zum Gegenstand.An operational shock is a well-known phenomenon. Three studies focused on the effect of oral treatment with the polysaccharides of Example 1 on the occurrence of postoperative infectious complications.

58 Patienten wurden während der Dauer von 7 Tagen vor und nach dem chirurgischen Eingriff behandelt. Die Behandlungen erfolgten durch orale Verabreichung von 0,06 mg je Tag nach einer willkürlichen Doppelblindprobenmethode. Die Immunität durch Zellvermittlung wurde 7 Tage vor dem Eingriff, am Tag des Eingriffes und 7 h danach durch Messung der Hautreaktion bewertet, die als Reaktion auf 7 Antigene erhalten wurde, die eine zelluläre Immunantwort (System IMC-Test von Biomerieux) zur Folge hatten.58 patients were treated for 7 days before and after the surgical procedure. Treatments were made by oral administration of 0.06 mg per day by an arbitrary double-blind method. Immunity by cell mediation was assessed 7 days prior to surgery, on the day of surgery, and 7 hours thereafter by measuring the skin response obtained in response to 7 antigens that resulted in a cellular immune response (System IMC test from Biomerieux).

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle V aufgeführt.The results obtained are shown in Table V.

Tabelle V 20 Table V 20

Polysaccharide des Beispiels 1 Placebo Polysaccharides of Example 1 placebo

Punktzah¹unterschied im IMC-Test zwischenPoint number ¹ differed between in the IMC test

T 7 und Tag 0 -6,3 mm -11,9 mmT 7 and day 0 -6.3 mm -11.9 mm

Statistischestatistical

Signifikanz ρ < 0,01 ρ < 0,001Significance ρ <0.01 ρ <0.001

Die Erniedrigung der Immunität durch Zellvermittlung, hervorgerufen durch den chirurgischen Eingriff, ist deutlich weniger groß bei den mit dem Produkt behandelten Patienten als bei den mit Placebo behandelten Patienten. Andererseits hat während der 7 Tage nach der chirurgischen Handlung das Produkt nach der Erfindung eine viel schnellere Rückgewinnung der normalen Werte der Zellimmunität gegenüber dem Placebo zur Folge.The reduction in cell mediated immunity caused by surgery is significantly less in the patients treated with the product than in the placebo-treated patients. On the other hand, during the 7 days following the surgical procedure, the product of the invention results in a much faster recovery of normal levels of cellular immunity over the placebo.

Da die infektiöse Gefahr direkt proportional zur Punktzahl der Zellimmunität ist (siehe J. I. Gallin und Λ. S. Fauci, Advances in Host Defense Mechanisms, Herausgeber Raven Press, New York, 1986, Band 6) kann das Produkt nach der Erfindung als wirksam zur Verhinderung und zur Behandlung postoperativer infektiöser Komplikationen angesehen werden.Since the infectious hazard is directly proportional to the cell immunity score (see JI Gallin and S. S. Fauci, Advances in Host Defense Mechanisms, Ed., Raven Press, New York, 1986, Vol.6), the product of the invention can be considered effective in preventing and for the treatment of postoperative infectious complications.

Toxikologische StudienToxicological studies Spitzentoxizitättip toxicity

Eine Toxizität der Polysaccharide nach der Erfindung (Mortalität, makroskopische Untersuchung der Organe) bei der Ratte nach einer oralen Verabreichung der 20 OOOfachen Menge der therapeutischen Dosis wurde nicht beobachtet.Toxicity of the polysaccharides of the invention (mortality, macroscopic examination of the organs) in the rat after oral administration of 20,000 times the amount of the therapeutic dose was not observed.

Chronic toxicity

Eine chronische Toxizität während 4 Monaten Behandlung der Ratte und des Hundes für eine orale Tagesdosis der Polysaccharide nach der Erfindung bis zum 1800fachen der therapeutischen Dosis wurde nicht beobachtet.Chronic toxicity during 4 months treatment of the rat and dog for an oral daily dose of the polysaccharides of the invention up to 1800 times the therapeutic dose was not observed.

Miitagenizität 25 Miitagenicity 25

Die Bakterientests nach Arnes demonstrierten eine Abwesenheit von Mutagenfähigkeit der Polysaccharide nach der Erfindung.The Arnes bacterial tests demonstrated an absence of mutagenicity of the polysaccharides of the invention.

Toleranztolerance

Die Polysaccharide nach der Erfindung, dreimal nacheinander in der therapeutischen Dosis von 0,06 mg/Tag verabreicht, wurden sehr gut toleriert. Die Prüfung der biologischen Toleranz während verschiedener klinischer Versuche zeigten überhaupt keine anomal Veränderung der folgenden Parameter: Blutzusammensetzung, Hämoglobin, Elektrolyten, Harnstoff, Glykämie, Serumproteine, Creatinin, Harnsäure, Gesamtcholesterin, ALAT, ASAT, CK, alkalische Phosphatasen undThe polysaccharides of the invention administered three times in succession at the therapeutic dose of 0.06 mg / day were very well tolerated. Biological tolerance testing during various clinical trials showed no abnormal change at all in the following parameters: blood composition, hemoglobin, electrolytes, urea, glycemia, serum proteins, creatinine, uric acid, total cholesterol, ALAT, ASAT, CK, alkaline phosphatases and

1 Bilirubin. Die Toleranz wurde von den praktischen Ärzten und den Patienten als ausgezeichnet beurteilt.1 bilirubin. Tolerance was rated excellent by practitioners and patients.

Claims

-1--1-

^

invention claim

A process for obtaining novel polysaccharides from a bacteriophage lysis filtrate of a culture of at least one bacterium of the Er.cherichia coli or Klebsiell pneumoniae type, characterized in that the filtrate is concentrated and at the same time subjected to molecular selection by passage on membranes with selective permeability, then Treated solution of the extracted polysaccharides by chromatography, the first fraction wins, dialyzed, the solution concentrated and re-fractionated by chromatography, the first fraction

_2- ~ '^ 4 5 O

wins and dries.

A method according to claim 1, characterized in that the first affinity-type chromatography is immobilized antibody or ion exchange type, the second ion exchange type chromatography is and the fraction containing the polysaccharides is dried by lyophilization.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that one receives the bacterial lysis filtrate with simultaneous use of bacteria of the species Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae.

4. The method according to any one of claims 1 to 3, gekennzeich net in that polysaccharides are recovered, the 65 to 75% neutral eyelets, 18 to 27% uronic acids, 5 to 9% pyruvic acid in the form of pyruvilides, less than 0.5 % Osamine and less than 1% contain proteins and have a molecular weight above 50,000.

5. The method according to claim 4, characterized in that one obtains polysaccharides containing 65 to 75% hexoses, such as' glucose, galactose or mannose, 18 to 27% uronic acid, such as galacturonic acid, 5 to 9% pyruvic acid, less than 1% proteins and less than 0.5% glucosamine.

6. The method according to claim 5, characterized in that one obtains polysaccharides containing each Galactosemolekül 0.2 to 0.4 glucose molecules, 2 to 2.5 Mannosemoleküle, 1 Galacturonsäuremolekül and 1 Pyruvsäuremolekül.

7. The method according to claim 1, characterized in that one extracts at least one strain selected from the strains Klebsiella pneumoniae K 68 and Escherichia coli 0119, deposited at the Institut Pasteur with the numbers 58.5 and 62.23.