DD234689A1 - PROCESS FOR OBTAINING BIOTENSIDES - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Biotensiden. Das Ziel ist die Steigerung der Wachstumsrate von P. aeruginosa, verbunden mit erhoehter Exkretion von oberflaechenaktiven Substanzen. Die Aufgabe wird darin gesehen, durch verfahrenstechnische Massnahmen die Exkretion von Biotensiden durch P. aeruginosa-Staemme wesentlich zu foerdern. Die Aufgabe wird geloest durch den Zusatz von (NH4)2Fe(SO4)2 zum vorzugsweise synthetischen Kulturmedium.The invention relates to a method for obtaining biosurfactants. The aim is to increase the growth rate of P. aeruginosa, associated with increased excretion of surface-active substances. The object is seen to significantly promote the excretion of biosurfactants by P. aeruginosa strain by procedural measures. The object is achieved by the addition of (NH4) 2Fe (SO4) 2 to the preferably synthetic culture medium.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von extrazellulären Lipiden, insbesondere von Rhamnolipiden, die als Bioemulgatoren Bedeutung erlangen können.The invention relates to a method for obtaining extracellular lipids, in particular rhamnolipids, which can acquire significance as bioemulsifiers.
Es ist bereits bekannt, daß Stämme von Pseudomonas aeruginosa nach Wachstum auf bestimmten komplexen und synthetischen Medien Rhamnolipide in das Medium ausscheiden. Die Exkretion beginnt in der späten exponentiellen Wachstumsphase. Nach Literaturangaben sinkt die Oberflächenspannung auf einen Minimalwert von 40mN/m. Die Wachstumsdynamik der Mikroorganismen hängt von den Kultivierungsbedingungen ab. Durch eine — meist empirisch begründete — Wachstumsoptimierung wird mit komplexen Supplementen (Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt u.a.) oder mit definierten Verbindungen (anorganische Spurensalze, Vitaminen) die logarithmische Phase verkürzt und die Wachstumsrate erhöht. Die Auswahl einer geeigneten C- und N-Que!le, das C:N-Verhä!tnis sowie die Wachstumsdynamik beeinflussen in erheblichem Ausmaß Biosynthese und Exkretion von Metaboiiten. Als anorganische Spurensalze und/oder Vitamine wurden bisher vorwiegend die folgenden Verbindungen eingesetzt: Maisquellwasser/Hefeextrakt/Eisen/(ll)-sulfat, Eisen(lll)-chlorid/ Zinkillj-sulfat/ManganiiD-sulfat/KupferillJ-sulfat/CobaltilO-chlorid/Natriummolybdat/Kaliumjodid/Borssäure, Pepton. Der positive Einfluß dieser Verbindungen oder ihrer Kombinationen auf das Wachstum von P. aeruginosa ist deutlich, jedoch ist die Biosynthese von Rhamnolipid oder/und die Exkretion in das Kulturmedium — als die eigentlich erwünschte physiologische Leistung — in einigen Nährmedien teilweise oder vollständig gehemmt, in keinem Fall aber gesteigert. Die ausgeschiedenen oberflächenaktiven Verbindungen werden üblicherweise durch Extraktion mit Ether oder Ethylacetat separiert oder durch Ausfällen nach Ansäuren, wobei aber bei Anwenden der letzteren Methode ein tagelanges Stehen der Lösung in der Kälte in Kauf genommen werden muß.It is already known that strains of Pseudomonas aeruginosa secrete rhamnolipids into the medium upon growth on certain complex and synthetic media. The excretion begins in the late exponential growth phase. According to literature, the surface tension drops to a minimum value of 40mN / m. The growth dynamics of the microorganisms depends on the cultivation conditions. Through a - mostly empirically justified - growth optimization is shortened with complex supplements (yeast extract, peptone, meat extract u.a.) or with defined compounds (inorganic trace salts, vitamins), the logarithmic phase and increases the growth rate. The selection of a suitable C and N chain, the C: N ratio and the dynamics of growth have a significant influence on the biosynthesis and excretion of metaboiites. The following compounds have been predominantly used as inorganic trace salts and / or vitamins: corn steep liquor / yeast extract / iron / (II) sulfate, iron (III) chloride / zinc sulfate / manganese di sulfate / copper sulfate / cobaltil chloride / Sodium molybdate / potassium iodide / boric acid, peptone. The positive influence of these compounds or their combinations on the growth of P. aeruginosa is clear, however, the biosynthesis of rhamnolipid and / or the excretion into the culture medium - as the actually desired physiological performance - is partially or completely inhibited in some nutrient media, in none Case but increased. The precipitated surface-active compounds are usually separated by extraction with ether or ethyl acetate or by precipitation after acidification, but when using the latter method, a day-long standing of the solution in the cold must be accepted.
Trotz vielfacher Versuche zur Verfahrensoptimierung gelingt es bisher nicht, die Exkretion von Biotensiden, insbesondere Rhamnclipiden, in tragbaren Ausbeuten bei begrenzter Kultivierungsdauer zu stimulieren.Despite many attempts to optimize the process, it has not hitherto been possible to stimulate the excretion of biosurfactants, in particular rhamnclipids, in portable yields with limited cultivation time.
Die Erfindung hat das Ziel, die Wachstumsrate von P. aeruginosa zu erhöhen und die Exkretion von oberflächenaktiven Substanzen zu steigern.The invention aims to increase the growth rate of P. aeruginosa and increase the excretion of surfactants.
Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention
Die Erfindung hat die Aufgabe, durch verfahrenstechnische Maßnahmen die Exkretion von Biotensiden durch die eingesetztenThe invention has the object, by procedural measures, the excretion of biosurfactants by the used
P. aeruginosa-Stämme wesentlich zu fördern.P. aeruginosa strains essential to promote.
Es wurde überraschenderweise gefunden, daß (NHa)2Fe(SCUh einen wesentlichen wachstumsfördernden Einfluß auf P.It has surprisingly been found that (NHa) 2 Fe (SCUh has a substantial growth-promoting influence on P.
aeruginosa ausübt, wenn es einem vorzugsweise synthetischen Kulturmedien zugesetzt wird.aeruginosa when added to a preferably synthetic culture media.
Die gestellte Aufgabe wird deshalb dadurch gelöst, daß Stämme von P. aeruginosa in einem flüssigen synthetischen Medium unter Verwendung von Glucose, Glycerol, Alkanen als Kohlenstoffquelle und Ammoniumsulfat u.a. als Stickstoffquelle gezüchtet werden. Erfindungsgemäß wird als wachstumsfördernder Zusatz Ammoniumeisen(ll)-sulfat in einer Konzentration von 0,1 bis lOOmg/l, vorzugsweise 1 bis 10mg/!, dem Kulturmedium zugesetzt.The stated object is therefore achieved in that strains of P. aeruginosa in a liquid synthetic medium using glucose, glycerol, alkanes as carbon source and ammonium sulfate u.a. be grown as a nitrogen source. According to the invention, ammonium iron (II) sulfate in a concentration of 0.1 to 100 mg / l, preferably 1 to 10 mg / l, is added to the culture medium as a growth-promoting additive.
Die Züchtung wird submers im diskontinuierlichen Verfahren bei 300C vorgenommen. Der pH-Wert während der Kultivierung beträgt 6 — 7,5 Ammoniumeisen(ll)-sulfat wird dem Medium in einer Konzentration von 0,01 mg/100mi bis 10mg/100ml zugegeben.The cultivation is carried out submerged in a batch process at 30 0 C. The pH during cultivation is 6-7.5 ammonium iron (II) sulfate is added to the medium in a concentration of 0.01 mg / 100mi to 10mg / 100ml.
Die Erfindung soli nachstehend an Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.The invention will be explained in more detail below with reference to exemplary embodiments.
Es wird ein auf einen pH-Wert von 7,2 eingestelltes synthetisches Medium verwendet, das aus 7g K2HPO1I, 3g KH2PO4, 0,1 g MgSO4 7 H2O und 1 g (NHa)2SO4 in 11 destillierten Wasser hergestellt wird. Als einzige Kohlenstoffquelle dient Glycerol (30 ml/!). Dieses Medium wird mit Ammoniumeisensulfat in den nachstehenden Mengen versetzt. 100 ml dieses Mediums werden in 500ml fassende Erlenmeyer-Kolben gegeben und mit einem Inoculum von P. aeruginosa 196 Aa beimpft, so daß die optische Dichte, gemessen bei 60önm, zwischen 0,03-0,05 beträgt. Das Inoculum wird durch Abschwemmen von 18h alten Schrägager-Kulturen mit synthetischem Medium gewonnen. Die Züchtung wird bei 300C unter Schütteln durchgeführt. Die stalagmometrisch gemessene Oberflächenspannung des zellfreien Kulturfiltrates ist oberhalb der kritischen Micellbildungskonzentration ein Maß für die Biotensid-Konzentration. Die kritische Micellbildungskonzentration beträgt 126 mg/ I und ist, in Abhängigkeit vom Kuitivierungsverfahrsn, bei einer Oberflächenspannung zwischen 23-31 mN/m erreicht.A synthetic medium adjusted to a pH of 7.2 is used, which consists of 7 g K 2 HPO 1 I, 3 g KH 2 PO 4 , 0.1 g MgSO 4 H 2 O and 1 g (NH 2 ) 2 SO 4 in 11 distilled water is produced. The only carbon source is glycerol (30 ml /!). This medium is mixed with ammonium iron sulfate in the following amounts. 100 ml of this medium are placed in 500 ml Erlenmeyer flasks and inoculated with an inoculum of P. aeruginosa 196 Aa, so that the optical density, measured at 60 nm, is between 0.03-0.05. The inoculum is recovered by flushing 18h old slant cultures with synthetic medium. The cultivation is carried out at 30 0 C with shaking. The stalagmometrically measured surface tension of the cell-free culture filtrate is above the critical micelle concentration a measure of the biosurfactant concentration. The critical micelle formation concentration is 126 mg / l and, depending on the citation method, is achieved at a surface tension between 23-31 mN / m.
Beispiel 1 wird wiederholt, anstelle von P. aeruginosa 196 Aa wird mit P. aeruginosa M2 beimpft.Example 1 is repeated, instead of P. aeruginosa 196 Aa is inoculated with P. aeruginosa M 2 .
Ammonium- Züchtungs- optische Oberflächen- VerdünnungAmmonium growth optical surface dilution
eisen(ll)- dauer Dichte spannungIron (II) - permanent density voltage
sulfatsulfate
mg/l . . h mN/m 1:10mg / l. , h mN / m 1:10
— 24 0,5 43,3- 24 0.5 43.3
— 48 0,6 28,8 48,7 2 24 0,75- 48 0.6 28.8 48.7 2 24 0.75
2 48 1,1 25,1 36,62 48 1.1 25.1 36.6
Eine Exkretion von Biotensiden erfolgt auch durch ruhende Zellen in gepufferten und belüfteten Medien mit einem Kohlenstoffsubstrat.Excretion of biosurfactants also occurs by resting cells in buffered and aerated media with a carbon substrate.
Beispiel 1 wird ohne Zusatz von Ammoniumeisen(ll)-sulfat wiederholt. Nach 27 h Kultivierungsdauer hat die Bakteriensuspension eine optische Dichte von 0,72 erreicht, die Oberflächenspannung des zellfreien Kulturfiltrates beträgt 6OnIWm. Die Zeilen werden unter sterilen Bedingungen geerntet und in 100ml eines sterilen Mediums folgender Zusammensetzung suspendiert 1 /15 mol/l Phospatpuffer pH = 5,0,2% Glycerol. Der Ansatz wird bei 30°C geschüttelt. Nach den angegebenen Zeiten wird ein Aliquot entnommen und nach Zentrifugation im zellfreien Überstand die Oberflächenspannung gemessen.Example 1 is repeated without the addition of ammonium iron (II) sulfate. After 27 hours of culture, the bacterial suspension has reached an optical density of 0.72, the surface tension of the cell-free culture filtrate is 6OnIWm. The cells are harvested under sterile conditions and suspended in 100 ml of a sterile medium of the following composition 1/15 mol / l phosphate buffer pH = 5.0.2% glycerol. The batch is shaken at 30 ° C. After the times indicated, an aliquot is taken and, after centrifugation in the cell-free supernatant, the surface tension is measured.
Zeit 19 43 67 91 115 139 163 288Time 19 43 67 91 115 139 163 288
Oberflächenspan nung 26,3 27,7 27,7 26,3 28,5 -28,5 29,2 32,2 32,2Surface tension 26.3 27.7 27.7 26.3 28.5 -28.5 29.2 32.2 32.2
Nach 19h ist das 10fache der kritischen Miceilbildungskonzentration von Rhamnolipid {1,3g/l) im Ansatz nachweisbar. Der in Beispiel 2 verwendete Stamm Pseudomonas aeruginosa M2 trägt die Hinterlegungsnummer ZIMET 11013.After 19 h, 10 times the critical peak concentration of rhamnolipid (1.3 g / l) is detectable. The strain Pseudomonas aeruginosa M 2 used in Example 2 has the deposit number ZIMET 11,013th
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0282942A2 (en) * | 1987-03-17 | 1988-09-21 | University Of Iowa Research Foundation | Method for producing rhamnose |
| EP0613950A1 (en) * | 1993-03-04 | 1994-09-07 | AUF ANALYTIK UMWELTTECHNIK FORSCHUNG GmbH | Tensides from regrowing raw materials |
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1984
- 1984-11-08 DD DD84269261A patent/DD234689A1/en not_active IP Right Cessation
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ENJ | Ceased due to non-payment of renewal fee |