DD158918A5 - Verfahren zur erzeugung eines verbesserten clonierungsverktors - Google Patents

Abstract

Es werden verbesserte Vektoren und Verfahren fuer die Expression geclonter Gene prokaryotischen oder eukaryotischen Ursprungs und Verfahren zur Erzeugung derartiger Vektoren beschrieben, wobei die verbesserten Vektoren Promotoren und Operatoren von Lambda-Phagen aufweisen und vorzugsweise kein aktives cro-Gen oder kein aktives N-Gen enthalten, die Vektoren mindestens eine weniger als etwa 300 Basenpaare von den Promotoren und Operatoren entfernte Endonuclease-Erkennungsstelle fuer das Clonen erwuenschter Gene haben und von Nutzen sind, was auch von den Verfahren unter Einsatz der Vektoren fuer die Erzeugung einer Reihe von prokaryotischen, eukaryotischen und Viruspolypeptiden, Hormonen, Enzymen, Antigenen, Proteinen und Aminosaeuren gilt.

Description

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Anwendungagebiet der Erf indang ι

Die Erfindung betrifft verbesserte Vektoren and Methoden für die. Erzeugung äeralriger Vektoren und die Expression geclonter Gene* Die hier beschriebenen Vektoren und Methoden sind durch die verbesserte Expression geclonter Gene, besonders solcher eukaryotischen Uraprungs in prokaryοtischen Wirten gekennzeichnet· Wie aus der folgenden Beschreibung hervorgehen dürfte, können solche Vektoren und Methoden zur Verbesserung der Erzeugung von Polypeptiden, Proteinen und Aminosäuren in Wirtszellen angewandt werden»

Charakteristik der bekannten technischen Losungen;

Die Erzeugungamenge eines Proteins in einer Wirtszelle wird durch drei Hauptfaktoren bestimmt: Die Anzahl der Kopien seines Gens innerhalb der Zelle, den Wirkungsgrad, mit dem diese Genkopien trancribiert werden, und den Wirkungsgrad, mit dem die resultierende Mesaenger-RHA ("mHNA¹¹) übersetzt wird. Der Wirkungsgrad der Transcription und der Translation (die zusammen die Expression darstellen) ist seinerseits von den Hucleotidsequenzen abhängig, die normalerweise vor d'er gewünschten Kodierungssequenz sitzen. Diese Nucleotid-Sequenzen oder Expressions-Kontroll-Sequenzen definieren unter anderem die Stelle, an der RITA-Polymerase wirksam wird (die Promotor-Sequenz), um die Transcription zu initiieren, und an der sich Ribosomen an die mRUA (das Produkt der Transcription) binden und mit ihr in Wechsel-irkung treten, um die Translation zu initiieren.

Nicht alle derartigen Expressions-Kontroll-Sequenzen funktionieren mit dem gleichen Wirkungsgrad. Es empfiehlt sich daher

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häufig, die spezifische Kodierungssequenz für ein erwünschtes Protein von ihren benachbarten Nucleotid-Sequenzen zu trennen und sie stattdessen mit anderen Expressions-Kontro11-Sequenzen su verschmelzen, um auf diese Weise höhere Expressionsgrade zu erzielen. Wenn das erfolgt ist, kann das neu gebildete ΕΙΪΑ-Fragment in ein Plasmid oder Bakteriophagen-Derivat mit höherer Kopienanzahl eingefügt werden, um die Anzahl von Genkopien innerhalb der Zelle zu erhöhen und dadurch die Ausbeute an verwirklichtem Protein reiter zu verbessern.

Da die Über-Produktion von seibat normalerweise nicht-toxischen Genprodukten für Wirtszellen schädlich sein and zu verringerter Stabilität von bestimmten Wirt-Vektor-Systemen führen kann, müßte eine gute Expressions-Kontroll-Sequenz neben ihrer Fähigkeit, den Wirkungsgrad von Transcription und Translation von geclonten Genen zu verbessern, auch steuerbar aein, um die Expression während des Bakterienwachsturns zu modulieren. Zum Beispiel sind die bevorzugten Expressions-Kontroll-Sequenzen diejenigen, die inaktiviert «erden können, damit sich die Wirtszellen ohne übermäßige Ansammlung von Gen-Produkten vermehren können, und dann aktiviert werden können, um die Expression großer Mengen der gewünschten Proteinprodukte zu fördern·

Verschiedene Expressions-Kontroll-Sequenzen, die einige der oben angeführten Kriterien erfüllen, sind zur Verbesserung der Expression von Proteinen und Polypeptiden in Bakterienwirten verwendet worden. Dazu gehören zum Beispiel die Operator-, Promotor- und Ribosombince- und -wechselwirkungasequenzen des Lactose-Operons von E» coli (z. B· K_e Itakura, u. a., "Expression In Escherichia coll Of A Chemically Synthesized Gene For The Hormone Somatostatin" (Expression eines chemisch synthetisierten Gens für das Hormon Somatostatin in Bscherichia coli)_T Science, 198, S..1056 - 1063 (1977); D. V. Goeddel, u.a., "Expression In Escherichia coli Of Chemically Synthesized Genes For Human Insulin¹¹ (Expression chemisch synthetisierter Gene

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für Human-Ins al in. in Eaeherlchia coli), Proc» Hatl, Acaä> Sei« USA, 76, S· 106 - 110 (1979)), die entsprechenden Sequenzen des Tryptophan-Synthetase-Systems von E» coli (JoS.. Emtage, a,a*_P "Influenza Antigenio Determinants Are Expressed From Haemagftlatinin Genes Clonded in Esoherichia coli" (Grippe-Antigen-Detenninanten werden aas in Escherichia coli geclonten Haemagglat t inin-Genen verwirklicht), lature, 283, S, 171 - 174 (1980); J. A. Martial, α. a·,·"Human Grovith Hormone: Complementary DHA Cloning And Expression in Bacteria" (Human-Wachstumshormon: Komplementäres DHA-Cloning und Expression in Bakterien), Science, 205, S· 602 - 606 (1979), und die Haupt-Operator- und Promotorregionen von Phage X (H. Bernard,- u. a·, "Construction Of Plasmid Cloning Vehicles That Promote Gene Expression From The Bacteriophage Lambda Pj₁ Promotor"(Konstraktion von Plasmid-Cloningvehikeln» die die Gen-Expreasion von dem Bakteriophage Lambda P_L Promotor fördern), Gene, 5, S. 59 - 76 (1979)). Die Erfindung betrifft die letzte dieser Expressiona-Kontroll-Sequenzen*

Bakteriophage α enthält drei Hauptpromotoren: P-^, Pp und Ρ'·η· Es ist bekannt, daß ein Repressor-Protein, das Produkt von Phagen-Gen el, die Aktivität der Promotoren P^ und P_R steuert· Der Repressor bindet die jeweiligen Operator-Regionen — O^ und Or, — dieser Promotoren und blockiert die Initiierung der Transcription von dem entsprechenden Promotor· Darüber hinaus ist eine Kopie des cI-Gens am Chromosom eines lysogenen Stammes infolge ihrer autoregulierenden Art der Synthese (M. Ptashne, u. a*, "Autoregulation And Function Of A Repreasor In Bacteriophage A^M (Autoregulation und Funktion eines Repressors in Bakteriophage λ), Science, 194, S. 156 - 161 (1976)) in der Lage, die in einem Multi-Kopie-Plasmid vorhandenen Pt- oder Ρτ,-Promotoren vollständig zu unterdrücken (infra). Man sollte beachten, daß in Systemen, die den lac-Prornotor umfassen, die Repression des Promotors unter nicht-induzierten Bedingungen nur teilweise erfolgt (K· Itakura, u.a*, supra; D»Y. Goeddel, u,a·, supra).

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Die durch den Represser über die Promotoren P^ und P_R ausgeübte Kontrolle kann durch. Modifikation des Repressor-Proteins oder seines Gens verändert werden· Bs ist beispielsweise eine Mutation "bekannt, bei der das Repressor-Protein temperaturempfindlich ist· Wenn diese Mutation verwendet wird, können die Promotoren durch Verändern der Temperatur der Kultur und folglich der Stabilität des Repressors aktiviert oder inaktiviert werden.

Bakteriophage λ enthält auch die Gene IJ und cro« Das N-Gen steht unter Ρτ-Kontrolie· Man weiß, daß das Produkt von JJ-Gen als Anti-Terminator in Bakteriophage \ wirkt» Anti-Termination ist vorteilhaft für die Aufhebung der Transcript-Termination oder die durch die Anwesenheit von Terminations-Sequenzen, terminationsartigen Sequenzen oder Transcriptions-Verlangsamunga-Sequenzen in den betreffenden DHA-Sequenzen, die transcribiert werden sollen, verursachte Verlangeamung. Außerdem können Polaritäts-Effekte, die durch die Anwesenheit von Nonsens-Codonen in dem Promotor-Transcript eingeführt wurden, durch das N-Gen-Produkt gemildert werden (U. Franklin & C. Yanofsky, "The Jf Protein Of λ j Evidence Bearing On Transcription Termination, Polarity And The Alteration Of E. coli HNA Polymerase" (Das IT-Protein von \i Nachweis über die Transcriptions-Termination, Polarität und die Veränderung von E. coli HMA-Polymerase), in RHA Polymerase (Cold Spring Harbor Laboratory) S. 693 - 706 (1976)).

Das Produkt des von dem P^-Promotor transcribierten crp-Gens ist als sekundärer Repressor für die beiden Promotoren P-r und P^ bekannt (J. Pero, «Deletion Mapping Of The Site Of The tof Gene Product" (Deletionskartierung der Stelle des _tof-Gen-Produktes) in The Baceriophage Λ (Cold Spring Harbor Laboratory), S. 549 - 608 (1971); H. Echols, "Role Of The cro Gene In Bacteriophage λ Development" (Rolle des cro-Gens bei der Entwicklung von Bakteriophage λ) J. Mol. Biol.. 80, S. 203 - 216

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(1973)* A· Johnson, iua»> "Mechanism Of Action Of The cro Protein Of Bacteriophage Λ ^tt (Wirkungsmechanismaa des cro-Proteins von Bakteriophage λ ), Proc. STatl. Acad» Sei» USA, 75, S. t783 — 1787 (1978))» Ba daa σ ro -&6n-Pro d ukt gleichzeitig mit den verlangten Produkten der Wirt-Vektor-Kombination erzeugt wird, acheint der Einfluß dea cro-Gen-Produktea auf die Expression des Pt- oder P-o-Promotors mit der Zeit zuzunehmen· Daher ist in federn System, in dem fortgesetzte hohe Grade der Expression erwünscht sind, Deletion oder Inaktivierung des cro-Gens erforderlich·

Die Wirksamkeit des P^-Promotors für die Expression geclonter Gene ist demonstriert worden, indem das Tryptophan (trp)-Operon ^von S. coli in Phage Ά eingesetzt wurde· (IT· Franklin, "Altered Reading Of Genetic Signals Fused To The H Operon Of Bacteriophage /\ : Genetic Evidence For Modification Of Polymeraae By The Protein Product Of The N Gene" (Veränderte Deutung von mit dem !["Operon von Bacteriophage Ti verschmolzenen genetischen Signalen: Genetischer Nachweis für die Modifikation von Polymerase durch das Protein-Produkt des |I-Gens), J. Mol» Biol», 89» S. 33 - 48 (1979); A. Hopkins, u.a„, "Characterization OfA trp - Transducing Bacteriophages Made In Vitro" (Charakterisierung von in vitro erzeugten λ -trp-Unrwandlunga-Bakteriophagen), J. Mol« Biol., 107, S. 549 - 569 (1976))» In dieser modifizierten Phage können die trp-Gene entweder von ihrem eigenen Promotor oder von dem Ργ-Promotor transcribiert werden. Von durch Pj₁ vermittelter Expression wurde festgestellt, daß sie 3 bis 4mal höher war als die von dem homologen trp-Promotor erzielten Werte.

Die Wirkung von Repressor auf die durch P-r vermittelte Expression wurde gleichfalls in dieser modifizierten Phage demonstriert» Zum Beispiel war bei Fehlen von Repressor die Ρτ-gesteuerte Expression von Antranilat-Synthetase (des ersten Enzyms in dem trp-Qperon) 11mal stärker als die bei dem Enzym

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unter trjD-Förde rung in Abwesenheit von trp-Represaor "beobachtete (J. Daviaon, α. a., "Quantitative Aspects Of Gene Hxpresaion In A λ trj) Fusion Operon" (Quantitative Aapekte der Gen-Expression in einem ^ trp-Fusionsoperon), Moleο» gen. Genet«« 130, S· 3 - 20 (1374))· Doch in Anwesenheit eines aktiven el-» Gena war die durch Pt vermittelte Expression des Enzyms mindeatena um das 300-fache reduziert. Diese Untersuchungen haben auch gezeigt, daß ein fortgesetzter hoher Grad von Ρτ-vermittelter Transcription nur möglich viar, wenn das cro-Gen in dem Wirt nicht funktionell war·

Obwohl die oben beschriebenen Λ trp-Phagen die Nützlichkeit des P-r-Promotors für die Expression von eingefügten Genen demonstrieren, besteht das Problem darin, daß die Verwendung derartiger Phagen durch die Schwierigkeiten "bei der Konstruktion und der stabilen Vermehrung von cro~-Akzeptor-Phagen etwas eingeschränkt ist. Ohne solche Phagen fallen die beobachteten hohen Grade der Expression bald ab, ν,βΐιη die Menge des koproduzierten cro-Gen-Produktes zunimmt und die Transcription von dem Pt-Promoter unterbindet«,

Während der Nachteil von /^-Phagen etwas durch Cloning der λ— Kontrollelemente an einem sich autonom replizierenden Plasmid wie CoI EI oder aeinen Derivaten (J. Hedgpeth, u. a., "lambda Phage Promotor Used To Enhance Expression Of A Plasmid-Cloned Gene" (Lambda-Phagen-Promotor, der zur verstärkten Expression einea plaamid-geelonten Gens verwendet wurde), Molec gen» Genet., 163, 3. 137 - 203 (1378)) oder durch die Konstruktion kleinerer Plaamide, die nur das λ Ρτ-System enthalten (H. Bernard, u. a., supra) behoben wurde, sind diese letzeren Vektoren durch den Abstand zwischen den für die Insertion geclonter Gene verfügbaren Stellen und den P-^-Promotor benachteiligt» Zum Beispiel beträgt in den von H» Bernard, u. a», supra beschriebenen Vektoren der Abstand zwischen den Stellen der Gen-Insertion und dem Pj-Promotor am Vektorbereich von etwa 300 bis etwa

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8600 Basen· Darüber hinaus liegen die normalerweise verwendeten EcoRI und BamHI-InaertJonasteilen in den Vektoren von Bernard, u. a. nicht näher als 600 bzvn 1000 Basen an dem P^-PrO-motor· Außerdem läßt sich der Einfluß des N-Gen-Produktea auf die Transcription der erwünschten MA-Sequenzen bei den Vektoren von Bernard, u* a, nicht ohne weiteres einschätzen, da daa H-Gen-Frodukt am Plaamid aelbat kodiert ist und nicht chromosomen Ursprungs ist» Und schließlich gibt ea in der Veröffentlichung von Bernard neben dem fehlenden direkten Nachweis, daß die Vektoren von Bernard höhere Werte der Protein-Expression ergeben, keinen Hinweis, daß seine Vektoren erfolgreich bei der Expression eukaryotischer Gen-Produkte in prokaryotischen Wirten eingesetzt worden sind.

Ziel der Erfindungs

Durch die Erfindung «erden die angeführten Probleme durch die Bereitstellung eines verbesserten Vektors und eine verbesserte Methode zur Erzeugung derartiger Vektoren und die Expression geclonter Gene in Wirtszellen gelöst«

Darlegung dea Wesens der Erfindung?

In Übereinstimmung mit der Erfindung wird daher ein Vektor zur Verfügung gestellt, der mindestens eine DNA-Sequenz aufweist, die mindestens einen von einer Bakteriophage stammenden Promotor und Operator enthält, der durch mindestens eine Endonuclease-Srkennungsstelle gekennzeichnet ist, die weniger als etwa 300 Basenpaare von dem Abschnitt der DNA-Sequenz, der den Promotor und den Operator enthält, entfernt ist»

Die Hauptpromotoren von Phage λ in den erfindungsgemäßen Vektoren fördern die Transcription von in diese Vektoren eingefügten DHA-Sequenzen. Die erfindungsgemäßen Verfahren und Vektoren sind weiterhin durch die Anwesenheit zahlreicher entsprechender Erkennungsstellen für die Einfügung der erwünsch-

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ten ESA-Sequenzen in die Vektoren nahe des gewählten Promotors gekennzeichnet. Der Abstand zwischen dem gewählten Promotor on den ErkennungsateIlen beträgt vorzugsweise weniger als etwa 300 Basenpaare und noch besser weniger ala etwa 150 Basenpaar Die bevorzugten erfindungsgemäßen Vektoren sind auch diejenige in denen aktive K-Gene und aktive cro-Gene fehlen. Daher kann durch die Wahl eines entsprechenden Wirtes, d. h- eines, der ein aktives chromosomes N-Gen enthält oder dem dieses fehlt, jeder der erfindungsgemäßen Vektoren für die Expression von DNA-Sequenzen in Gegenwart des IJ-Gen-Eroduktes oder bei Fehlen desselben verwendet werden.

Wie aus der folgenden Beschreibung hervorgehen vsird, erlauben erfindungsgemäßen Vektoren und Verfahren die Konstruktion von Wirt-Vektor-Kombinationen, die eine verbesserte Expression von prokaryotisehen und eukaryotischen Produkten in Wirtzellen ermöglichen*

Ausführungsbeispiele i In den Zeichnungen zeigeni

Fig. 1i einen schematischen Umriß einer Region von Phage λ trj 44 cIAtpCro""· Es wurden nicht alle Restriktionsstellen angegeben. Die Abstände sind in λ-Einheiten wie von E. Szybalaki & W. Szybalski in ^MA Comprehensive Molecular Map Of Bacteriophag Lambda" (Eine umfassende Molekülkarte von Bakteriophage lambds Gene, 7, S· 217 - 270 (1979) beschrieben, eingezeichnet;

Fig· 2: eine schematische Skizze der Konstruktion von erfindungsgemäßen Vektoren — pPLa2, pPLa20 und pPLa23;

Fig. 3i eine schematische Skizze der Konstruktion von erfindungsgemäßen Vektoren — pPLa2311, pPLa231 und pPla8;

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Pig» 4s eine schematische Skizze der Konstruktion von erfin* dungsgemäßen Vektoren — pPLa83» pPLa831> pPI>a832, pPLc2, pPLc23» pPLc236 und pPLc28;

Fig« 5ί eine schematische Skizze der Konstruktion von erfinäiingsgemäßen Vektoren — pPLc24;

Fig. 6s die Huce lot id-Sequenz der (LP,.-Region von pPLa2311»

Pig· It die Umviandlung einer Pstl-Stelle in ß-Lactamase in eine BamHI-Stelle;

Fig. 8s ein die Proteinsynthese bei 28 ⁰G und 42 ⁰C in E, coli K12 4HX (pPLa23) und Ξ. coli M5219 (pPLa23) verfolgendes Autoradio gramm;

Fig. 9s. ein die Proteinsynthese bei 28 ⁰C und 42 ⁰G in E. coli K12&HI (pPLa23trpA₁) und E, coli K12 HI (pPLa23trpA₂) verfolgendes Autoradiograram;

Figo 10s ein die Proteinsynthese bei 28 ⁰G und 42 ⁰G in E. coli Κ12ΔΗΙ (pPLc23trpA^) verfolgendes Autoradiograrnm;

Fig, 11: ein die Proteinsynthese bei 28 ⁰G und 42 ⁰G in E, coli Κ12ΔΗΙ (pPLa23i1R_i) verfolgendes Autoradiograrnm;

Fig. 12i eine scheinatische Skizze der Konstruktion von pPLc28ST₊5 and pPLc28SV₊5-37;

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Pig. 13: die Konstruktion von pPLc28SV_t5-37 von pPlG28SV_t5 auf dem Nucleotidniveauj

Pig. 14j ein Autoradiogramm, das die Proteinaynthese bei 28 ⁰C und 42 ⁰C von E. coli Κ12Δ.ΗΙ (pPLc28SV_t5-37-9) und die Immunopräzipitation mit Serum von einem einen SV40-Tumor aufweisenden Hamster der von diesem Wirt synthetisierten Proteine nach einer Induktion bei 42 ⁰C im Vergleich mit der Immunopräzipitation von authentischem KIein-t-Antigen, das in Nierenzellen von mit SV40 infizierten afrikanischen Grünen Meerkatzen mit dem gleichen Antiserum synthetisiert wurde, verfolgt.

Beste Art der Durchführung der Erfindung

Zum besseren Verständnis der hier erläuterten Erfindung dient die folgende ausführliche Beschreibung.

In der Beschreibung werden folgende Begriffe verwendet:

lucleetid - eine Monomer-Einheit von DNA oder HNA, die aus einer Zuckerkomponente (Pentose), einem Phosphat und einer stickstoffhaltigen heterozyklischen Base besteht* Diese Base ist über den Glycosid-Kohlenstoff (1'-Kohlenstoff der Pentose) mit der Zuckerkomponente verbunden, und diese Kombination von Base und Zucker wird ein Nucleosid genannt. Die Base kennzeichnet das Nucleotid. Die vier DNA-Basen sind Adenin (¹¹A"), Guanin ("G"), Cytosin ("C") und Thymin ("T"). Die vier RNA-Basen sind A, G, C und Uracil ("U"),

DNA-Sequenz - Eine lineare Anordnung von Nucleotiden, die miteinander durch Phosphodiester-Bindungen zwischen dem 3¹- und 5'-Kohlenstoff benachbarter Pentosen verbunden sind«

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GGdon — Bine DKUL-Seqcienz von drei nucleotiden (ein Triplett), die durch ihre Template- oder Messenger-RNA (ⁿmRITA^tt) eine Aminosäure, ein Tranalations-Startaignal oder ein Translations— Terminationasignal kodiert· Zum Beispiel kodieren die Hucleotidtripletta TTA, TTG, GTT, CTG, GTA und CTG für das Aminoaäure-Leucin ("Leu")» TAG, TAA und TGA aind Translations-Stoppsignale und ATG ist ein Translations-Startsignal»

Polypeptid - Sine lineare Anordnung von Aminosäuren, die miteinander durch Peptidbindungen zwischen den oC -Amino- und Carboxygruppen benachbarter Aminosäuren verbunden sind·

Struktur gen - Eine UEfA-Se quenz, die durch ihre mRSiA eine für ein spezifisches Polypeptid charakteristische Sequenz von Aminosäuren kodiert·

Transcription - Der Prozeß der Erzeugung von rnRHA von einem Strukturgen·

Translation - Der Prozeß der Erzeugung eines Polypeptids von

Expression - Der Prozeß, den ein Strukturgen zur Erzeugung eines Polypeptids durchläuft· Es handelt sich um eine Kombination von Transcription und Translation.

Plasmid - line nicht-chromosome doppelsträngige DNA-Sequenz, die ein intaktes "Replikon" aufweist, so daß sich das Plasmid in einer Wirtszelle replizieren kann. Wenn das Plasmid in einem einzelligen Organismus untergebracht «ird, können die Eigenschaften dieses Organismus infolge der DNA des Plaamids

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verändert oder transformiert werden. Zum Beispiel transformiert ein daa Gen für Tetracyclin-Resistenz (Tet ) tragendes Plasmid eine zuvor gegenüber Tetracyclin empfindliche Zelle in eine diesem gegenüber resistente· Eine durch ein Plasmid oder einen Vektor transformierte Wirtszelle wird als "Transformant" bezeichnet·

Phage oder Bakteriophage - Bakterienviren, von aenen viele aas in eine Proteinhülle oder -mantel ("Capsid") eingekapselten DNA-Sequenzen bestehen·

Cloning-Vehikel oder Vektor - Ein Plasmid, eine Phagen-DNA oder andere DNA-Sequenz, die sich in einer Wirtszelle replizieren kann, gekennzeichnet durch eine oder eine geringe Anzahl von Endonuclease-Erkennungssteilen oder Restriktionsstellen, an denen derartige DKA-Sequenzen in einer vorher bestimmbaren V/eise abgebrochen werden kennen, ohne daß sich daraus der Verlust einer wesentlichen biologischen Punktion der DNA ergibt, z. B. Heplikation, Erzeugung von Coat-Proteinen oder Verlust von Promotor— oder Bindestellen, und die eine Markierungssubstanz enthalten, die zur Verwendung bei der Identifizierung transformierter Zellen, z. B. Tetracyclin-Resistenz oder Ampicillin -Resistenz, geeignet ist·

Cloning - Der Prozeß der Gewinnung einer Population von Organismen oder MA-Sequenzen, die von einem derartigen Organismus oder einer solchen Sequenz durch asexuelle Vermehrung gewonnen wurden»

Rekombinant-DNA-Molekül oder Hybrid-DNA - Ein Molekül, das aus Segmenten von DNA von verschiedenen Genomen (der gesamten DNA einer Zelle oder eines Virus) besteht, die hintereinander außerhalb von lebenden Zellen vereinigt worden sind und die

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higkeit haben, einige Wirtszellen zu infizieren und darin zurückgehalten werden können*

Expressions-Kontroll-Sequenz - Eine Sequenz von Nucleotiden* die die Expression von Genen steuert und reguliert, wenn sie operativ mit diesen Genen verknüpft ist*

Die erfindungsgemäßen Wirtszellen

Pur die erfindungsgemäßen Wirt-Vektor-Kombinationen kann eine beliebige aus der großen Anzahl verfügbarer Wirtszellen verwendet werden. Die Selektion eines bestimmten Wirtes ist von einer Reihe von im Fachgebiet bekannten Faktoren abhängig. Zu diesen gehören beispielsweise die Verträglichkeit mit dem gewählten Vektor, die Toxizität der durch das Hybridplasmid kodierten Proteine, die leichte Gewinnung des vorgesehenen Proteins» Expressions-Charakteristika, Bio-Sicherheit and Kosten. Eine Ausgewogenheit dieser Faktoren muß unter dem Gesichtspunkt, daß nicht alle 'Wirte gleich -wirksam für die Expression eines bestimmten Rekombinant-DNA-Moleküls sind, ermittelt werden. Innerhalb dieser allgemeinen Richtlinien können nützliche Wirte Stämme von S ₁ ... coli, Psetidomonas, Bacillus aubtilis, Bacillus stearothermophilua und anderer Bazillen, Hefen und andere Fungi, tierische oder pflanzliche Wirte wie Tier- (einschließlich Human-) oder Pflanzenzellen in Kultur oder andere Wirte aeino

Die bevorzugten erfindungsgemäBen Wirtszellen sind Ξ. coli Stämme K12 el. All (K12 M72 lac_e Δ trpEA2 Sm^R (λο!857

ve cull

^Ham7¹am53^^{HI bio}~^ ("Κ12ΔΗΙ«) (H. Bernard, ti. a., supra) und M5219 (K12 172 lao^ trp^ am^R(} cI857jÄHI bio252)) ("845219") (H. Greer, »The kiJ Gene Of Bacteriophage λ« (Das kil-Gen von Bakteriophage λ ) Virology, 66, S. 589 - 604 (1975)) oder mieder andere Stamm, der entweder ein chromosomisch- oder plasmid-kodiertes cI1857-Gen (oder dessen Äquivalent) enthält*

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Beide Stämme weisen eine defekte, nicht-exzidierbare λ -Prophage auf, die ein Mt*tant-<3l-Gen trägt. Das Mutant-Gen kodiert für einen temperaturempfindlichen Represser, so daß die Transcription von dem Pt-Promotor möglich ist, damit er durch Einstellen der Temperatur aktiviert werden kann — bei 28 C ist der Repressor aktiv und die Transcription von dem Pt-Promotor wird unterbunden, aber bei 42 ⁰G ist der Repressor inaktiviert und die Transcription von dem Pj-Promotor wird in Gang gebracht*

Die Δ HI-Deletion der Prophage verschiebt einen Teil des cro-Gens and alle anderen Gene weiter nach rechts von cro in der Prophage (M · Castellazzi, α« a», "Isolation And Characterization Of Deletions In Bacteriophage X Residing As Prophage ^ S. coil K12^W (Isolierung und Charakterisierung von Deletionen in Bacteriophage A , die als Prophage in S. coli K12 vorhanden ist), Mol, gen» Genet·, 117, S. 211 - 218 (1972)).

Stamm M5219 enthält außerdem eine Bio252-Deletion, die alle Gene nach links von cIII, einschließlich kil in der Prophage verschiebt» Darüber hinaus verwirklicht Stamm M5219 bei Temperatureinwirkung ein funktionelles N-Gen-Produkt von einem chromosomen jJ-Gen. Andererseits hat Stamm K12ÜHI zwei gelbbraune Mutationen in H, die es funktionell IT-negativ machen·

Daher können die beiden Stämme experimentell die Expression von dem Ρ,-Promotor in Gang bringen oder abbrechen» Außerdem ermöglicht eine Wahl von Κ12Δ HI oder M5219, daß die durch P_L vermittelte Transcription in Abwesenheit oder in Gegenwart von dem N-Gen-Produkt abläuft, und da weder E. coli Κ12ΔΗΙ noch E» coli M5219 ein funkticnelles cro-Gen-Produkt verwirklicht, wird in ihnen dis bäkundäre Repression von P,--vermittelter Expression verhindert.

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Konstruktion verschiedener Auaführunpsformen erfindunftsgemäßer

Vektoren

Obwohl ea verachiedene gut bekannte Quellen für die Phagen λ — Promotoren gibt, wurde für die folgenden erläuternden Beiapiele für die Konstruktion von erfindungsgemäßen Vektoren Phage A trp 44 cIAt« cro* ala Quelle für Phage- λ -Promotoren gewählt«

Die Erzeugung von Phage λ trp 44 cIAtg cro** -wird von I. Franklin ^ttThe M-Operon of Lambda: Extent And Regulation .4a Observed In Fusiona To The Tryptophan Operon Of Sscherichia CoIi" (Das N-Operon von Lambdas Umfang und Regulierung anhand von Beobachtungen bei Puaionen mit dem Tryptophan Operon von Escherichia soli) in The Bacteriophage X (Cold Spring Harbor Laboratories), S· 621 — 638 (1971) beschrieben. Durch die At^-Mutation in dem el-Gen wird der Repreaaor thermolabil (M. Lieb, "Studies Of Heat-Indue ible Lambda Bacteriophages· I. Order Of Genetic Sites And Properties Of Mutant Prophages" (Untersuchungen durch von Wärme induzierbaren Lambda Bakteriophagen, I. Reihenfolge der genetischen Stellen und Eigenschaften von Mutant-Prcphagen), J» Molo BiOl₁*, 16, S. 149 - 163 (1966)). Die cro~*-Mutation verhindert die sekundäre Repression der P-r-Funktion· Natürlich sollte man beachten, daß cro -Phagen, obwohl sie für langfristige Expression weniger bevorzugt., werden, in den erfindungsgemäßen Vektoren verwendet werden können. Die Phage trägt auch ein funktionelles ΪΤ-Gen und einen aktiven P^-Promotor. Die Phage ergibt um das 3- bis 4-fache höhere Werte der trp-Enzym-Bxpression als sie durch den homologen trp-Promptor selbst erzielt werden können (N. Franklin, supra)»

λ trp 44 cIAtp cro"* MA wurde durch Phenolextration von CsClgereinigten Phagenpartikeln hergestellt. Die Struktur der EtOt Region dieser Phage iat in Fig. .1 enthalten·

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Der Ρτ-Promotor und öle benachbarten Operatoren (0^) sind zusammen mit dem Beginn der N-Gen-Sequenz innerhalb einer Verlängerung von DNA, etwa 100 Basenpaare lang, definiert und liegen mit etwa 73>4 % auf der λ -Darstellung (Fig. 1) (T, Maniatia» u. a*, "Recognition Sequences Of Repressor And PoIymerase In Operators Of Bacteriophage A ⁿ (Erkennungssequenzen von Repressor und Polymerase in Operatoren von Bakteriophage λ), Cell, 5, S. 109 - 113 (1975); J. Dahlberg & P. Blattner, "Sequence Of Promotor-Operator Proximal Region Of The Mag or Leftward RITA Of Bacteriophage "X " (Sequenz von Promotor-Operator-Proximal-Region der am weitesten links liegenden RHA von Bakteriophage λ), Nucleic- Acids Res», 2, S. 1441 - 1458 (1975)). In gleicher Weise sind der P„-Promotor und der benachbarte Operator (O₁₃) zusammen mit dem Beginn der cro-Gen-Sequenz innerhalb einer Verlängerung von MA, die mit etwa 76»6 % auf der λ-Darstellung (Pig. 1) liegt, definiert (T. Maniatis, u.a., supra).

Jede der verschiedenen, für die Isolierung dieser Regionen von Phagen-λ -DNA zur Verfugung stehenden Möglichkeiten kann zur Herstellung von Clonen, die die erwünschten Promotor-Sequenzen enthalten, angewendet werden· Beispielsweise können verschiedene Kombinationen von Restriktionsenzymen zur Spaltung der erwünschten Regionen von der Phagen-λ-DNA verwendet werden (Pig. 1). Diese Pragmente können anschließend direkt zur Erzeugung von Clonen verwendet werden, oder die Fragmente können weiter behandelt werden, um sie vor dem Clonen durch im Pachgebiet bekannte Methoden abzubrechen oder zu verlängern«

Nach der Herstellung des entsprechenden DNA-Pragmentes kann dieses in eines der zahlreichen Cloriingvehikel oder einen der zahlreichen Vektoren eingefügt werden. Beispielsweise können nützliche Cloningvehikel aus Segmenten* von chromosomen, nicht-chromosomen und synthetischen DNA-Sequenzen wie verschiedenen bekannten Derivaten von SV40 und bekannten Bakte-

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rienplasmiden, ζ» Β· Plaamiden von E. coli, einschließlich Col Bl, pCR1, pBE322,, pMB9 und deren Derivate, Plaamiden einea größeren Wirtabereichea, z. B· EP4, Phagen-DNAn, z· B. den zahlreichen Derivaten von Phage X , anderen DNA-Phagen, Pilamenteoua, einaträngigen DNA-Phagen, z, B· MI3, und Vektoren, die von Kombinationen von Plasm id- und Phagen-DNAn abgeleitet wurden, oder Hefeplasmiden wie dem 2 /U-Plaamid oder Derivaten davon beatehen»

Außerdem können in jedem apeziellen Cloningvehikel verachiedene Stellen für die Einfügung daa Phagen λ -MA-Pragmentea verwendet «erden» Dieae Stellen werden gewöhnlich durch die Reatriktiona-Endonucleaae, die aie abbricht, bezeichnet» Zum Beiapiel atehen in pBR322 verachiedene Reatriktionaateilen für die Einfügung dea MA-^agmentea zur Verfügung (F· Bolivar, u. a., "Conatruction And Characterization Of New Cloning Vehicles II. Α· Multi-Purpoae Cloning Syatem" (Konstruktion und Charakteriaierung neuer Cloningvehikel II, Ein Mehrzweck-Cloning-Syatem),. Gene, 2, S. 95 - 113 (1977); J. .G· Sutcliffe, "pBR322 Reatriction Map Derived From the DNA-Sequence: Accurate DHA Size Markera Up To 4361 Nucleotide Paira Long" (Von der DIA-Sequenz abgeleitete pBR322-Reatriktionakarte: Genaue DUA-Größen-Markierungaaubatanzen bia zu 4361 Nucleotidpaare lang) Nucleic.. Acida Re a., 5, S. 2721 - 2728 (1978)). Siehe auch Fig. 2 und 4· Ea iat aelbatveratändlich klar, daß ein erfindungagemäß nützlichea Cloningvehikel keine Reatriktionaatelle für die Einfügung äea Phagen- λ -DNA-Fragmentea haben muß. Stattdeaaen könnte daa Vehikel durch alternative Mittel mit dem Fragment verbunden aein, damit der vorgesehene erfindungagemäße Vektor erzeugt wird·

A# Erfindungagemäße Vektoren, die den Pj-Promotor in der Gegenzeiger-Orientierung in bezug auf den Ursprung der Replikation enthalten - - + - -

1. pPLa23

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Gemäß Fig. 2. wurde 6in verbesserter erfindungsgemäßer Vektor pPLa23 in einer Reihe von Schritten erzeugte Diese sind in Pig, 2 dargestellt and werden anschließend näher erläutert»

(a) Zwischen-Plaamid pPIa2

Die oben isolierte Λ trp 44 ClAt₂ cro" EKA wurde mit BamHI und EcoRI digeriert, um ein von etwa 7"1,3 % bia 81,02 % auf der λ Karte reichendes Fragment zu ezzidieren (Fig· 1 und 2)· In gleicher Weise wurde pBR322 mit BamHI und BcoRI digeriert, und das Phagen-Λ -DNA-Fragment anateile des exzidierten EcoRI-BamHI-pBr322~Fragmentes eingesetzt (Fig. 2).

Der resultierende Vektor wurde als pPLa2 bezeichnet, wobei das ^wa^M ala Hinweis auf die Gegenzeiger-Orientierung des Pr-Promo~ tors in bezug auf den Ursprung der Replikation dient· Die V-Information an diesem Molekül reicht von der BamHI-Stelle der Phage (71,3 % λ ) bis zur EcoRI-Stelle (81,02 % λ) und umfaßt daa Gen-N, die O^P^-Region, Gene rex und el (Mutante), die Οτ^Ρτ,-Region, Gene cro (Mutantef) und eil und einen Teil von Gen 0 (Fig· 1 und 2)*

E« coli C600 (CaClp-kompetent) wurde mit dem oben hergeatellten pPLa2 unter entsprechenden Bedingungen und entsprechender Eindämmung transformiert· Transformanten wurden bei 34 ⁰G auf LB-Platten ausgewählt, die mit 10 pfu von Phage ^

(M. Lieb, supra) geimpft worden waren und auch 100 /Ug/ml Carbenicillin enthielten· Das gewählte λ -DNA-Fragment enthält das clAtp-Gen, und daher werden dieses Fragment enthaltende Transformanten bei 34 ⁰C gegenüber Phage λ _οι_βΕΓ~^Κι;ι·^&^η*^θ resistent sein· Außerdem enthält das gewählte pBR322-Fragment das Gen für Ampicillin-Reaiatenz, so daß Wirte, die mit diesem Gen intakt aufweisenden Plasmiden transformiert wurden, sich in Kulturen vermehren, die dieses Antibiotikum enthalten, mit Auanahme derjenigen Wirte, die nicht auf diese Weise transformiert wurden*

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Die Orientierung dea Ausgangssegmentes wird wie in pBR322 vorhanden angenommen, wie sich gewöhnlich zeigt (Sutcliffe, α· a·, supra)♦

Zwanzig Transformanten wurden ausgewählt und die Kulturen bei 34 ⁰C in LB-Iedium» daa 100 ,ag/ml Carbenicillin und 10"²M MgCl₂ enthielt, gezüchtet» Um aicher au gehen, daß ea aich bei diesen Iransform&nten um echte, ein cI-Gen aufweisende Transfer*- manten handelte und nicht einfach um Bakterien, die nicht in der Lage sind, Λ -Phage zu adsorbieren, wurden Aliquoten der Kulturen mit entweder Λ _ci_ear oder λ _vir infiziert (F. Jacob & E. Wollman "Etude Genetique d'un Bacteriophage Tempere d¹ Eacherichia Coli« I· Le Systeme Gen§tique du Bacteriophage λ ", Ann.» Inat» Paateur« 87, S· 653 - 690 (1954))» Alle zwanzig Tranaformanten zeigten Resistenz gegenüber ^₀I₀ _, ^nd Senaitivität gegenüber A-_vlr·

Porm-1-ΐΒΆ von einem dieaer zwanzig Transformanten wurde mit Hilfe von Standardverfahren isoliert, mit ScoRI und BamHI eingeschränkt und gegenüber Standardmarkierungasübstanz gemessen» Die DNA wies zwei Bänder auf, die den erwarteten Größen dea pBR322-Fragmentea und dea Phage- Ti -Fragmentes entsprachen*

(b) Zwischen-Plasmid pPLa20 — Eliminierung von BgIII-Fragmenten von pPLa2

Die "λ -Region von pPLa2 enthält vier Bglll-Stellen, die bei 73,77, 78,80, 80,16 und 80,28 % λ liegen (Fig. 1 und 2) (V, Pirotta, "Two Restriction Endonucleasea From Bacillus Globigi (2wei Restriktions-Bndonucleasen von BaciEas Globigi), Nucleic Acids Res, 3, 3. 1747 - 1760 (1976); H, Szybalski 8c W. Szybalski, ¹¹A Comprehensive Molecular Map Of Bacteriophage Λ" (Eine umfassende Moleküldarstellung von Bakteriophage Λ ) Gene, 7, S, 217 - 270 (1979)).

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Zar Sliminierung von Bglll-Fragmenten zwischen 73»77 % λ und 80,28 % λ wurde pPLa2 DNA mit BgIII digeriert, bei einer DIA-Konzentration von weniger ala 1 /Ug/ml religiert und in E, coli

W6 ( λ ) (Cad« kompetent) mit einem chromosomen λ -Repressor r€2c c.

el transformiert, um die Ρτ-abhängige Transcription zu beruhigen (Pig· 2)» Gegenüber Carbenicillin resiatente Clone wurden durch Vermehren in I-Bouillon, die 100 ^/Ug/ml Carbenicillin enthielt, ausgewählt und auf den Verlust von Λ _ -Funktion hin unter Verwendung eines T* rll 638 Mutanten ausgesondert. Die λ__ -Funktion verhindert die Vermehrung der T. rll 638 Mutante (B· Howard, "Phage λ Mutants Deficient in rll Exclusion" (Phagen-λ Mutanten, unzulänglich bei rll-Exklusion), Science, S. 1588 - 1589 (1967))· Daher demonstrierte das Unvermögen dieser BglII-eingeschränkten Transformanten, die Vermehrung der T* rll 638 Mutante im Vergleich mit der nicht stattfindenden Vermehrung der Mutante in mit ppla2 transformierten Wirten zu verhindern, daß die rex-Funktion durch die Bglll-Deletion aus dem pPLa2-Hekombinant-DUA-Molekül eliminiert -«orden ist.

Die Restriktions-Analyse der Rekombinant-DNA-Moleiräle dieser BglII-eingeschränkten Transformanten ergab das Vorhandensein einer einzigen BgIII-Steile· Außerdem erzeugte die Digerierung mit EcoRI und BamHI zwei Fragmente — eines, das dem erwarteten pBR322-Fragment entspi-ach und das andere bis zur erwarteten Größe (1900 Basenpaare) des Phagen-λ-DNA-Fragmentes nach der Bliminierung des Teiles zwischen den Bglll-Stellen 73,77 % X und 80,28 % λ · Dieses modifizierte Plasmid vsurde als pPLa20 bezeichnet» Sein λ -DHA-Inaert erstreckt sich von der BamHI-Stelle (71,3 %) bis zur Bglll-Stelle (73,77 %) und von äer BglI3 Stelle (80,28 %) bis zur Ec£RI-Stelle (81,02 SS)· Es enthält Gen N, die 0 P^-Region und einen Teil von Gen 0 (Fig. 1).

Während sich der Rest dieses Beispiels für die Konstruktion von Ausführungsformen von erfindungsgemäßen Vektoren auf den P_T-Promotor konzentriert ·— wobei der P_R-Promotor mit dem BgIII-

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Bglll-Fragment von pPLa2 eliminiert wurde — sollte man sich im klaren aein, daß ähnliche Manipulationen zur Eliminierung dea Ρχ-PromotGrs von pPLa2 und zur Konstruktion eines den P^- Promotor zurückhaltenden Vektora hätten angewandt werden können· Außerdem könnten erfindungagemäSe Vektoren durch ähnliche Mittel, in denen der Pj₁- und der P_R-Promotor anwesend sind» ao daß die beiden Promotoren gemeinsam, oder gegeneinander zur Vermittlung der Expression der eingefügten DlA-Sequerizen wirken, konstruiert werden·

(c) pPla23 - Einfügung einer EcoRI-Stelle ein kurzes Stück hinter P_L

Das an pPLa20 vorhandene Bglll-BamHI-ffragment enthält eine einzige Hae IH-St eile (73,1 % λ , Fig. D, die etwa 150 nucleotide hinter Pt liegt (B₉ Allet und R. Soiem "Separation And Analysis Of Promotor Sites in Bacteriophage ^ DHA By Specific Sndonucleases" (Trennung und Analyse von Promotorsteilen in Bakteriophage-λ-ESN^-A mit Hilfe spesif iacher Indonucleasen), J. Mol. Biol.. 85, S. 475 - 484 (1975)). Diese Stelle kann in eine ScoRI-Stelle durch bündig-endende Ligation eines offenen Hae III-Sndea an ein offenea EcoRI-Ende, das vorher bündig endete, durch Verlängerung dea zurückgezogenen 3'-Endes mit DKA-PoIymerase I in Gegenwart von Deaoxyribonucleosidtriphosphaten umgewandet werden (K. Backman, u>a», "Conatruc-tion Of Plasmida Carrying The el Gene Of Bacteriophage /\ " (Konstruktion von Plaamiden, die daa cI-Gen von Bakteriophage Λ tragen), Proc. gatl. Acad. Sei. U.S.A., 73, S. 4174 - 4178 (1976)). Einzelheiten der Verfahrensweise werden später beschrieben und sind in Fig. 2 dargestellt.

Sechs pMol von pBR322 wurden mit EcoRI digeriert«, Nach Abtöten des Enzyms durch Hitze wurde die DNA ausgefällt und in 250/Ul eines Puffers gelöst, der 50 mM Tri-HGl (pH-Wert 7,8), 5 mM MgCIp, 1 mM β-Mercaptoäthanol, 2 /UM von jedem der vier

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Deaoxyribonucleoaidtriphoaphate (mit A -^P-dATP (345 Ci ³²p/ mMol)) und 50 /dg BSA/ml enthielt· Seche Einheiten von BNA-Polymerase I von B» coli (Worthington) wurden zugegeben und daa Gemisch wurde 90 Minuten lang bei 16 ⁰C inkubiert. Dieser Prozeß führte zur Windigen Endung der offenen 3*-EcoRI-Steile in dem linearisierten pBR322.

Hach der Wärme-Inaktivierung des Enzyms norde daa Gemisch auf 50 mM HaCl, 7 mK ß-Mercaptoäthanol eingestellt und die WA mit BamHi digerierte Die Fragmente wurden durch Elektrophorese auf. einem 1,4 %igen Agarosegel getrennt and durch Autoradiographie verfolgt* Eine Gelacheibe, die daa größere der beiden Fragmente enthielt — pPR322, daa eine offene BemHi-Stelle und eine bundig-endende EcoRI-Stelle enthielt — wurde ausgeschnitten und bei -90 ⁰C eingefroren. Diese Stücke Agarose wurden anschließend 20 Minuten lang mit 20 000 U/min zentrifugiert (SS34-Rotor von Sorvall). Die ausgeschleuderte obenstehende Flüssigkeit wurde entfernt und die Gefrier- und Zentrifugierschritte noch zweimal wiederholt. Unter diesen Bedingungen werden etwa 30 % der innerhalb der Agaroaescheibe enthaltenen DlA in die obenstehende Flüssigkeit ausgeschleudert. Die ausgeschleuderte DHA wurde aus den zusammengenommenen obenstehenden Flüssigkeiten ausgefällt und in 10 ,ul 10 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,4), 50 mM UaCl, 7 mM (5-Mercaptoäthanol gelöst·

Zwei pMol von pPLa20 wurden mit BgIII und BamHI digeriert und die Fragmente auf Agarosegel getrennt. Das kleinere Fragment (Bglll-BamHI) wurde aus dem Gel wie oben beschrieben eluiert und mit BapRI, einem Iaoschizomer von Haelll, digeriert (A. Kiss, tua», ^MA New Sequence-Specific Endonuclease (Bsp) From Bacillua Sphaericua" (Eine neue Sequenz-spezifische Endonucleaae (Bsp) von Bacillua Sphaericus), Gene, 1. S· 323 329 (1977)), um ein Gemisch von BamHI-BspRI und BapRI-Bglll-Fragmenten zu erzeugen, wobei die letzteren den Ρτ-Promotor tragen. Die Enzyme BgIII und BamHI bilden identische offene

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Enden, so daß ein offenes Bglll-Snde mit einem offenen BamHI-Snde verbunden werden kann und umgekehrt·. Darüber hinaus ist das Ergebnis irgendeiner Ligation nicht mehr ein Substrat für BgIII oder BamHI, sondern ist durch das Enzym Sau3Al (Mbol) erkennbar (V· Pirotta,*supra)·

Zwei pMol des oben genannten größeren pBR322-EcoRI-BamHI-Fragmentes wurden mit 0,8 pMol des Gemische von BamHI-BspRI-¹¹¹¹⁽³ BspRI-Bglll-Fragmenten verbunden. Nach der Ligation (die offene BamHI-Stelle an dem pBR322-Fragment steht für die Ligation mit irgendeiner der offenen BgIII- oder BamHI-Stellen des pPLa20-Fragmentes zur Verfügung und die bundig-endende Ec_oRI-Stelle des pBR322-Fragmentes steht für die Ligation mit den Bs-pRI- (Haelll)-Stellen des pPLa20-Fragmente3 zur Verfugung) wurde das Gemisch mit BamHI digeriert, um diejenigen Rekombinant-Holeküle auszuschließen, die das unerwünschte, in den pBR322-Vektor eingefügte BamHI-BspRI-Fragment enthielten. Das resultierende Gemisch wurde in E. coll M5219 transformiert, and die Transformanten wurden hinsichtlich Resistenz gegenüber Carbenicillin ausgewählt. Inagesamt wurden 23 Transformanten gewonnen. Alle diese Transformanten waren gegenüber Tetracyclin (ebenfalls von pBR322 getragen) empfindlich, weil die BamHI-Restriktion von pBR322 dazu führte, daß das für Tet^r kodierende Gen in dem modifizierten Plasmid nicht mehr intakt war (Fig. 2).

Die fortgesetzte Anwesenheit des P^-tragenden Ba-pRI-Bglll-Pragm^ntes in diesen Clonen wurde durch Digerieren der DUA mit HincII überprüft* Da pBR322 zwei HincII-Stellen enthält (J. Sutcliffe, supra) und das erwartete Λ -Pj-Fragment eine einzige HincH-Steile enthält (73,4 % λ, Fig. 1) (B. Allet und Ro Solem, supra), müßten richtig konstruierte Rekombinant-DKA-Moleküle drei HincII-Stellen enthalten. Von den gewonnenen 23 Transformanten enthielten fünf die drei vorausgesagten HincII-Stellen. Drei davon hatten eine einzigartige EcoRI-

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Stelle» die darauf bindeutet, daß in diesen Clonen die einwandfreie Verbindung zviischen der BapRI (Haelll)-Stelle des pPLa20-Fragmentea und der bündig-endenden EcoRI-Stelle des pBR322-Fragmentea hergestellt worden iat. Diesen drei Clonen fehlte au.cn eine BamHI-Stelle, viie aus der erwarteten Ligation des Bglll-Endea des pPLa20-Pragmentea mit dem BamHI-Ende des p3R322-Fragmentes vorausgesagt worden war« Eines dieser Clone wurde für die weiteren Arbeiten gewählt und als pPLa23 bezeichnet (Pig. 2)·

pPLa23 besteht aus einem pBR322-Pragment, das von der BamHI-Stelle (Basenpaar 377 von p3R322) bis zur Ec_oRI-Stelle (Basenpaar 4362 von pBR322) reicht (J. Sutcliffe, supra) (Pig. 2). Der restliche. Teil von pBR322 wurde in pPla23 durch das Pragment % trp 44 clAt cro"* DNA ersetzt, das sich zwischen der Haelll-Stelle bei 73,3 % λ (jetzt einer rekonstruierten EcoRI-Stelle) und der Bglll-Stelle bei 73,77 % X (jetzt einer Sau3A-Stelle) befindet (Pig. 2). Die Größe dieses Fragmentes wurde mit Hilfe der Agarosegel-Slektrophorese auf etwa 300 Basenpaare geschätzt» Innerhalb dieses Fragmentes befinden sich die O^P^-Region und die ersten 115 Nucleotide des N-Gen-Transcriptes (J. Dahlberg & P. Blattner, supra). Die Richtung der Transcription des P^- Promotors geht von der Bglll-Stelle zur Haelll-Stelle und verläuft im gleichen Sinne wie die Transcription von dem A-Lactamase-Promotor von p3R322 (J. Dahlberg & P. Blattner, supra, J. Sutcliffe, supra),

Zwei Merkmale des Plasmids sind von besonderem Interesses 1) Die für den P-r-Promotor und für das β -Lactamase-Gen kodierenden Regionen sind an einem einzigen HaeII-Fragment vorhanden, dargestellt durch die HaeII-SteIlen am Basenpaar 2720 und 436 von pBR322 (Pig. 3) (J. Sutcliffe, supra; B. Allet und R. Solem, supra, V. Pirotta, supra). 2) Der Ausgangspunkt der Replikation befindet sich an einem 370 Basenpaare-HaeII-Pragment neben dem β -Lactamase-tragenden Haell-Fragment (Pig. 3).

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Sin funktioneller Ausgangspunkt der Replikation verlangt, daß die Verbindung um die Haell-Steile herum an Position 2720 aufrechterhalten bleibt (A· Oka, u.a., "Nucleotide Sequence Of Small GoI El Derivates. Structure Of The Regions Essential For Autonomous Replication And Golicin El Immunity" (Hucleotid-Sequenz kleiner GoI El Derivate. Struktur der Regionen, die für autonome Replikation und Colic in El Immunität wesentlich sind),-Hol, 'gen. Genet.., 172, S. 151 - 159 (1979)). Diese Merkmale von pPLa23 wurden zur Einführung einer zweiten Markierungssubstanz für antibiotische Resistenz in den Vektor eingesetzt·

2. pPXa231 und pPLa2311 — Einfügung einer Kanamycin-Resistenz-Markierungssubstanz in pPla23

In Fig. 3 sind die zur Herstellung anderer erfindungsgemäßer Vektoren von pPLa23 angewandte Schritte wiedergegeben» Biese Schritte werden.anschließend ausführlicher beschrieben*

Ein für Resistenz gegenüber Kanamycin kodierendes HaeII-Fragment wurde von Plasmid pMK20 gewonnen (M. Kahn, u.a., "Plasmid Gloning Vehicles Derived From Plasmids CoIEl, F, R6K und EE2" (Von den Plaamiden CoIEl, F, R6K und RK2 abgeleitete Plasmid-Cloningvehikel), Methods in Enzymology, 68, S. 268 - 280 (1979)). Der Ausgangspunkt der Replikation an Plasmid pMK20 liegt hauptsächlich innerhalb eines 359—Basenpaare-HaelI-Fragmentes. Der Ausgangspunkt überspannt aber auch die Verbindungsstelle zwischen diesem Fragment und einem benachbarten Haell-Fragment (M. Kahn, u.a«, supra). Die ilucleotid-Sequenz um diese Haell-Stelle herum ist mit der Sequenz identisch, die in pBR322 um die Haell-Stelle herum an Position 2720 gefunden wurde (A* Oka, u.a., supra, J. Sutcliffe, supra).

Ein Gemisch von pPLa23 und pMK20 wurde bis zur Vollständigkeit mit Haell digeriert, religiert und in E. coli M5219

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₂ Kompetent) transformiert (Flg·. 3)· Einwandfrei transformierte Kolonien worden auf der-Grundlage ihrer Resistenz gegenüber/ Carbenicillin und Kanamycin ausgewählt* da nur Clone» die das» ß-Lactamase-Gen von pBR322 and da» Kanamycin-Gen von pMK20 enthalt en» eine doppelte ent ibiot lache- Realsten» aufweisen werden« Bs worden zwölf doppel-r^sistente Transforraanten gewählt* Plasmid-DSA wurde von diesen Transförmanten wie vorher isoliert and durch HaeII~Re strikt ion and Fragment— Messung auf: einem 6 %igen Acrylamid gel analysiert.» Fünf dieser Clone hatten nur drei Haell—Fragmente —ein HaeXI-Fragment* das dem Haell—Fragment von pPLa23 entspricht» das den P_x-PrO-motor and ß—liactamase-Gen trägt„ ein dem; Haell-Fragment von pMKaO entaprechendea Hagll-Fragment,, das das Gen für Kanamycin-Reaiateiiz: trägt» und ein kleines HaelX-Fragment* das; gleichfall a vom pMKZO abgeleitet wurde and für die Plasmid—Replika— tion erforderlich ist (Fig., 3)·

Die fünf gewählten Clone worden weiterhin untersacht,, um. die Orientierung; des» das Kanamycin-Gen enthaltenden. HaeIX-Fragmentea von pMK2Q in, bezug auf" die rekonstruierte EcoRI-Stelle in dem Haell-Fragaent von pPLa23 zn bestiinmen* Von dem das Kanamycin-Gen enthaltenden. Haell-Fragment von pMK20 ist bekannt» daß es > eine einglgartijga as^imnetriache HJndHI-'StelIe enthält (M» " JEahttv^:'tte^ smsreu fFigw 3^> Sahey bietet diese Stelle eine Möglichkeit; gqy Bgat£mn«ng der/ Orientierong; des Fragmentea·

Sie fünf glone wurden mj-fc HindHI und ScoRI digeriert, und die reaaltlerencteni Fragmente, wurden wie zuvor gemessen» Vier der fünf Clone hatten den größeren Teil des Hindlll-geapaltenen» Kanamycin-Gen. enthaltenden Haell-Fragmentea von, TtHfKgQ neben dem den Ausgangspunkt enthaltenden kleinen HaeIX-Fragment * Bin ^: Clon hatte Sie} entgegengesetzte Orientierung· Diese beiden Gruppen von denen wurden wO Iktirlich als pPLa23t bzw· pPIa23t1 beaeichnet i¥ig* 3).

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pPla2311 murde willkürlich aus den oben konstruierten Plaaraiden ausgewählt, und die Sucleotid-Sequenz der P^-Region wurde best imiat.

Yor der Sequenzierung "wurden zwei Gruppen von Restriktions-Fragmenten von pPLa2311 hergestellt — EcoRI-HincII-Fraginente und HincII-EcoRI-XhoI-Fragmente (in Fig. 3 nicht angegeben). In beiden Fällen ^urde pPLa2311 mit dem ersten Restriktionsenzym digeriert, und die' resultierenden Fragmente -wurden unter Verwendung von Polynucleotid-Kinase (P-L Biochemicals) mit

^J P markiert. Anschließend wurden die Fragmente mit dem zweiten Restriktionaenzym oder einem Paar Enzymen, im Falle von EcoRI-Xhol, digeriert, und die Fragmente wurden auf einem 6 folgen Agarosegel getrennt. Die Sequenzierung erfolgte in herkömmlicher Weise unter Anwendung der Verfahrensweise von A. Maxam & W. Gilbert, ^MA Ue^f Method For Sequencing MA" (Ein neues Verfahren für die Sequenzierung von DHA), Proc» Fa11._rAcad.,Sei. USA, 74, S.. 560 - 564 (1977).

Die Uucleotid-Sequenz dieser Region ist in Fig. 6 wiedergegeben. Sie erreicht von der Haell-Stelle in pBR322 bis zur rekonstruierten EcoRI-Stelle an der Verbindungsstelle zwischen dem "λ -Phagen-Fragment und pBR322. Die bestimmte Sequenz hat im Vergleich zu bekannten Sequenzen die folgenden Charakteristikai (1) die Nucleotid-Sequenz der CUP-*-Operator-Promotor-Region ist mit jener Sequenz dieser Region in Phage Ty identisch (T. Maniatis, u.a·, supra); (2) die Sequenz zwischen der Haell-Stelle und der Sau3A-Stelle an der Verbindungsstelle zwischen dem A-Phagen-Fragment und pBR322 ist mit der von authentischem pBR322 identisch («J« Sutcliffe, supra); (3) die Sequenz des N-Gen-Transcripts stimmt mit der bei dem mRNA-Niveau von Dahlberg Sc Greenblatt (supra) bestimmten Sequenz überein, bis auf eine Deletion eines Adenosinrestes in Position 41 des Transcriptes; und (4) die Sequenz enthält nicht das Translations-Start-Signal des K-Gens (N. Franklin & G. Bennett, "The N

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Protein Of Bacteriophage "λ , Defined By Its DNA Sequence, Ia Highly Basic" (Das N-Protein von Bacteriophage Λ , definiert durch aeine DNA-Seqtienz, ist stark basisch), Gene, 8, S« 107 119 (1979))..

3» pPLa4 und pPLa8 — Umwandlung der Patl-Stelle in dem Lactamase-Gen von pPLa2311 in eine BamHI-Stelle

Fig. 3 und 7 zeigen eine schematische Darstellung der Umwandlung der Patl-Stelle in dem ß-Lactamase-Gen von pPLa2311 in eine BamEE-Stelle» Das Plasmid pPLa2311 wurde mit Pstl linearisiert. Nach der Extraktion mit Phenol und Chloroform wurde die· DNA ausgefällt, in 25 mM NaCOOCH₃ (pH-Wert 4,5), 1 mM ZnCOOCH₃, 125 mil NaCl wieder bis auf eine Konzentration von 50 pMol/ml gelöst und 90 min lang bei 25 ⁰C mit 1,5 Einheiten Sl~Nuclease (Sigma) Je pMol DNA behandelt, um die 3'-vorstehenden Enden zu entfernen (Fig. 7). Die Reaktion wurde durch die Zugabe von EDTA bis 5 mM beendet· Sl-Nuclease wurde durch 10 min Inkubieren des Gemischs in Anwesenheit von 0,2 % SDS bei 70 ⁰C entfernt, worauf die Extraktion mit Phenol und Ghloroform folgte. Die DNA wurde durch die Zugabe von 4 VoI* 2 M NH.CCOCH-, und 14 Vol. Äthanol ausgefällt.

Die gewonnene DNA wurde stumpf-endend mit einem 10-fachen Molüberschuß von BamHI-Linker-Molekülen (Collaboratorive Research Inc.) verbunden (C. Bahl, u.a., "A General Method For Inserting Specific DNA Sequences Into Cloning Vehicles" (Eine allgemeine Methode für die Insertion spezifischer DNA-Sequenzen in Cloningvehikel), Gene, 1, S. 81 - 92 (1977)) (Fig. 7). Nach der Spaltung mit BamHI und der Religation bei niedriger DNA-Konzentration (Fig. 7) wurde das Gemisch mit Pstl gespalten, um diejenigen Moleküle dagegen auszuwählen,, die der Sl-Nuclease-Behandlung entgangen waren und eine intakte Pstl-Stelle erhalten haben· Zwei /Ug behandelte DNA wurden dann in E. coli M5219 transformiert, und Transformanten wurden auf-

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grand von Kanamycin-Resistenz ausgewählt. Insgesamt wurden Transformanten gewonnen, zwei von ihnen wiesen keine Patl-StelIe auf and hatten eine BamHI-Stelle erworben. Die Rekombinant-DUA-Moleküle dieser beiden letzteren Transformanten wurden als pPLa8 und pPLa4 bezeichnet (Fig. 3» pPla4 ist in Fig· 3 nicht gezeigt)· Die nach geneinsamer EcoRI- und BamHI-Digestion der Rekombinant-DHA-Moleküle dieser Transformanten gewonnenen Fragmente komi-grierten auf einem 1j4 ^igen Agarose·· gel mit den von pPLa2311 nach EcoRI-Pst!-Spaltung gewonnenen Fragmenten. Somit ist die Patl-Stelle in pPLa2311 durch eine BamHI-Stelle ersetzt worden»

In Fig. 7 wird der Einfluß der oben beschriebenen Reihenfolge von Schritten auf das β -Lactamase-Gen dargestellt. Wie Fig. zeigt, ist das Endergebnis der 'Konstruktion der Austausch des

Ala-Aminosäurerestes in Position 182 in dem p-Lactamase-Prote— in durch die Sequenz Arg-Ile-Arg. Da durch diese Substitution das Orientierungssystem (reading frame) des /3 -Lactamase-Gens intakt bleibt, konnte man vermuten, daß die Transformanten der rekonstruierten Clone Resistenz gegenüber Carbenicillin aufweisen wurden. Wider Erwarten waren mit pPLa4 und pPLAß transformierte Wirtszellen gegenüber Carbenicillin nicht resistent.

4· pPLa83 — Einfügung einer BamHI-Stelle dicht neben die EcoRI-Stelle von pPLa8

Plasmid pAD3 (ein Geschenk von H. Schaller) enthält eine in die BamHI-Stelle von pBR322 eingefügte Sequenz von 47 Basenpaaren. Diese Sequenz besteht aus den folgenden Einheiten — BamHI-Stelle-EcoRI-Stelle-Lactoseoperator-EcoRI-Stelle-BamHI-»Stelle. Um diese Sequenz in die rekonstruierte BamHI-Stelle von pPLa8 einfügen zu können, wurden pPLa8 und ein 10-facher Überschuß von pAD3 mit BamHI digeriert, religiert und in E. coli W6(A^,_^) transformiert (Fig. 4). Transforman-

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ten warden auf Platten ausgewählt, die Minimalmedium, 50/Ug/ml Kanamycin, 0,1 % Glucose, 40 /Ug/ml X gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-P-D-galactoaid) enthielten (J· Miller, Experiments In Molecalar Genetics (Versuche auf dem Gebiet der Molekulargenetik) (Cold Spring Harbor Laboratory), S. 48 (1972)), da das Vorhandensein von X gal-Farbstoff den Nachweis von Transformanten ermöglicht, die ein Lactoseoperator-Fragment enthalten* Tatsächlich sind in diesem Medium Lactoseoperator enthaltende Transformanten blau und daher leicht von anderen Transformanten zu unterscheiden.

Die Rekombinant-DNA-Moleküle wurden wie zuvor aus einer der blauen Kolonien isoliert und mit EooRI digeriert. Die resultierenden zwei Fragmente komigrierten im wesentlichen auf dem Agarosegel mit den zwei aus der EcoRI-BamHI-Digeation von pPLa8 gewonnenen Fragmenten, wodurch bestätigt wurde, daß das vorgesehene 47-Basenpaar-Fragment von pAD3 einwandfrei an der rekonstruierten BamHI-Stelle in pP!a8 eingefügt worden war. Das Plasmid wurde als pPLa83 bezeichnet (Fig. 4).

5· pPLa831 — Heranrücken einer BamHI-Stelle näher an den Pj-Promotor in pPla83

Um eine BamHI-Stelle näher an den P^-Promotor in pPLa83 heranzubringen, wurde das EcoRI-EcpRI-Fragment durch Digestion von pPLa83 mit EcoRI und Religation bei verdünnter DUA-Konzentration getilgt (Fig. 4). Die Transformation der resultierenden Rekombinant-DKA-Moleküle in E. coli W6 ( A,__c_) und die Vermehrung auf Platten mit Minimalmedium, wie zuvor durch X gal und Kanamycin ergänzt, ermöglichte die Selektion derjenigen Clone, die die Lactose-Operator-Region nicht mehr enthielten. Die Restriktion der DHA von einem ausgewählten Transformanten mit BamHI-XhoI und ein Vergleich der Migration der resultierenden Fragmente mit den beiden durch EcoRI-XhoI-Digestion von pPLa8 gewonnenen Fragmente ergab wie erwartet, daß die BamHI-Stelle in dem modifizierten Plasmid etwa 150 Basenpaare von dem Pt-

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Promotor entfernt «ar» Das modifizierte Plaamid wurde als pPLa831 "bezeichnet*

Ea dürfte natürlich klar sein, daß ähnliche Manipulationen wie die oben unter 3> 4 und 5 beschriebenen zur Schaffung anderer Endonuclease-Erkennungastellen, die weniger ala 300 Basenpaare von dein gewählten Promotor und den Operatoren in den erfindungagemäßen Vektoren entfernt sind, vorgenommen werden können« Beiapiele für derartige Manipulationen umfassen die unten beschriebenen.

6„'pPLa832 — Insertion einer Hindlll-Stelle in der Nähe der BamHI-Stelle von pPLa831

Plaamid pADi6 (ein Geschenk von H. Schaller) enthält ein 36-Basenpaar-Fragment,. das in die BamHI-Stelle des aus der Sequenz BamHI-Stelle-Hinälll-Stelle-Hindlll-Stelle-BamHI-Stelle bestehenden pBR322 eingefügt iato Zur Insertion dieser Sequenz an der BamHI-Stelle von pPLa831» wurden pPLa831 und ein 10-facher Überschuß von pAD33 mit BamHI gespalten, religiert und in S. coli M5219 zur Auswahl in bezug auf Kanamycin-F.esistenz transformiert (Pig. 4). Da es keine einfache Screening-Methode zur Bestimmung der richtigen Insertion des erwünschten BamHI-Fragmentes in pPla831 gibt, war die Analyse der Transformanten, die aich in Anwesenheit von Kanamycin vermehren, von der Restriktionsspaltung einzelner, willkürlich ausgewählter Clone abhängig. Unter den 32 analysierten Glonen fand sich einer, der nach der Spaltung mit Hindlll zwei Fragmente erzeugte (Fig. 4)· Die Größe dieser Fragmente war auf einem 1,4 $igen Agarosegel nicht von den nach der BamHI-HindIII-Spaltung oder Sc£HI-HindIII-Spaltung von pPLa831 gewonnenen Fragmenten zu unterscheiden. Dieses modifizierte Plasmid wurde als pPLa832 bezeichnet»

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B* Vektoren» die den Pt-Promotor in Uhrzeigerrichtung-Orientierung in bezug auf den Ursprung der Replication ent~ halten

1· pPLc2 — Cloning des Pt-tragenden Fragmentes von pPLa832

Ein äquimolares Gemisch von pBR322 und pPLa832 wurde mit BamHI und anschließend mit HindIII gespalten (Pig. 4)· Das Gemisch wurde religiert und in M5219 zur Auswahl hinsichtlich Resistenz gegenüber Carbenicillin transformiert· Da einwandfrei zubereitete Rekombinant-DKA-Moleküle dieser Konstruktion nicht mehr das intakte Gen für Tetracyclin enthalten, wurden die Transformenten auch in bezug auf Verlust der Resistenz gegenüber Tetracyclin überprüft· Das Rekombinant-DNA-Molekül wurde wieder wie zuvor von den ausgewählten Transformanten isoliert und durch Restriktion analysiert« Das ausgewählte Plasmid enthielt eine einzige Hindlll-Stelle, Durch kombinierte Hindlll-BamHI-Digestion wurden zwei Fragmente im wesentlichen komigrierend auf Agarosegel mit den durch einfache EcoRI-Digestion gewonnenen beiden Fragmenten erzeugt· Das Vorhandensein des Pj-tragenden Fragmentes wurde durch HincII-Digestion bestätigt· Dieses Enzym spaltete den Vektor in drei Fragmente, deren Größen mit der Struktur der in Fig* gezeigten Fragmente übereinstimmten. Dieses Plasmid wurde als pPlc2 bezeichnet, wobei das "c^rt zur Kennzeichnung der Orientierung im Uhrzeigersinn des P^--Promotors in bezug auf den Ursprung der Replikation dient·

2. pPLc23 — Entfernung einer EcoRI-Stelle von pPLc2

Plasmid pPLc2 enthält zwei EcoRI-Stellen ~ eine, die von dem Stamm-pBR322-Vektor abgeleitet ist, und eine dicht an der BamHI-Stelle, eingefügt durch Insertion der Hindlll-BamHI-Fragmente von pPla832 (Fig. 4). Die von pBR322 abgeleitete EcoRI-Stelle wurde durch 30 min langes Spalten von pPLc2 mit HindIII und Zhol und anschließende Digestion mit BaI31 bei 25 in 0,6 M NaCl, 12,5 mM Je CaCl₂ und MgSO., 1 mM EDTA, 20 mM Tri-HCl (pH-Wert 8,1) entfernt. Exonuclease Bal31 baut V- und

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5'-Termini schrittweise ab (H. Gray, u.a., "Extracellular Nucleasea of .Pgeudomonaa BaI31« I» Characterisation Of Single Strand-Specific Deoxyriboendonucleaae And Double-Strand Deoxyriboexonuclease Activities" (Charakterisierung von einsträngiger Desoxyriboendonacleaae- und doppelaträngiger Deaoxyriboexonucleaae-Aktivitäten) Nucleic. Acids Res», 2, S. 1459 1492 (1975)).

Das Gemisch uturäe mit Phenol und Chloroform extrahiert, auf eine nUA~Konsentration von 1 /Ug/ml verdünnt und der Ligation unterzogen» Nach.der Ligation vmrde die DNA erneut mit Xhol und Hindlll gespalten, um Stamm-Plasmidmoleküle zu entfernen, und in M5219 zur Auswahl in bezug auf Resistenz gegenüber Carbenicillin tranaformiert» Es ^urde ein Transformant gefunden, der keine Hindlll- und keine Xhol-Stella hatte. Dieses Plaamid enthielt eine einzige BcoRI-Stelle und besaß drei Hincll-Steilen (Pig. 4). Diese letztere Eigenschaft bestätigte, daß die P-r -Region noch vorhanden ^ar. Dieses Plasmid \iurde als pPLc23 bezeichnet»

Zur Beurteilung dea Ausmaßes exonucleolytischer Degradation durch das BaI31-Enzym isurde pPLc23-DNA gleichzeitig mit BamHI und Psti gespalten und die Fragmente auf 1,4 %igem Agarosegel gemessen. Im Vergleich mit dem Pstl-BamHI-Fragment von dem Stamm-pPLc2 zeigte das P_stl-BamHI-Fragment von pPLc23 eine Deletion von über 800 Basenpaaren. Kombinierte Digestion mit EcoRI-Patl-HaeII im Vergleich zur EcoRI-PsrfeI-Spaltung bestätigte, daß die Haell-Stelle an der Verbindungsstelle zwischen dem P-r-tragenden Fragment und dem Kanamycinfragment erhalten seblieben war.

3. pPlc236 — Einfügung einer Hindlll-Stelle in pPLc23 Plasmid pPLc23 enthält einzigartige EcoRI- und BamHI-Steilen,

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die etwa 150 Nucleotide unterhalb von dem Pt-Promotor liegen (Fig· 4)~ Sine Hindlll-Inaertionsstelle wurde in pPLc23 durch Ligation des von pPLa832 gewonnenen BamHI-Hindlll-Hindlll-BjmHI-Fragmentes in die BamHI-Stelle von pPLc23 eingefügt» Transformanten wurden in 15219 gewonnen und durch Restriktionsanalyse auf das Vorhandensein einer HindIH-Stelle hin überprüft· Die Struktur eines repräsentativen Glons wurde durch Agarosegel-Slektrophorese des nach der Pstl-EcoRI-, PatI-BamHI oder Patl-Kindlll-Digeation gewonnenen Fragmentes bestätigt» Die nach ;jeder dieser kombinierten Digestionen gewonnenen Fragmente komigrierten im wesentlichen auf einem 1,4 %igen Agarosegel, wodurch gezeigt wurde, daß die jScoRI-, BamHI- und Hindlll-Stellen in der unmittelbaren Nachbarschaft voneinander zu finden sind. Dieses Plasmid wurde ala pPLc236 bezeichnet (Fig. 4).

Der größere Teil von Plasmid pPLc236 stammt von pBr322 von der BamHI-Stelle an Position 377 (J. Sutcliffe, supra) bis mindestens zum Beginn des ß-Lactamaae-Gens bei etwa Position 4160 (J. Sutcliffe, aupra). Der übrige Teil ist zusammengesetzt aus 1) Sequenzen, die von dem Teil des Kanamycin_Gena, das sich zwischen der Xhol-Stelle und einem Haell-Ende dieses Fragmentes befindet, abgeleitet sind; 2) einem Hae_II-BamHI-Fragment, das den Pj-Promotor aus etwa 300 Nucleotiden, der von pPLa832 abgeleitet ist, enthält; 3) einer für BamHI-Hindlll-Eindlll-BamHI-Stellen kodierenden Sequenz«

4. pPLc28 — Deletion von pPLc236

Die beiden benachbarten HindIII-Steilen in pPLc236 überlappt eine Ball-Stelle (in Fig. 4 nicht dargestellt).. Das Plasmid enthält auch eine einzigartige PvuII-Stelle am Basenpaar 2067 dea pBR322-Abschnittes (J. Sutcliffe, supra) (Fig. 4). Die Enzyme Ball und PvuII erzeugen beide glatt abschließende Enden. pPLc236-DHA wurde mit Ball und PvuII gespalten und bei niedriger DNA-Konzentration religiert» In M5219 wurden Trana-

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foirnanten mit Auswahl von Resistenz gegenüber Carbenicillin gewonnen· Die DNA. eines repräsentativen Clons wurde durch Restriktion analysiert. BamHI-Spaltung erzeugte ein einziges Fragment, das auf 1,4 tigern Agarosegel mit dem größeren Teil von pPLc236 nach EamHI-PvuII-Spaltung komigrierte. Kombinierte Digestion mit entweder Patl-EcoRI, Pstl-BamHI oder Pstl-Hindlll erzeugte in jedem Falle zwei Fragmente, von denen das kleinere auf einem 1,4 $igen Agarosegel im wesentlichen mit einem von pPLc236 gewonnenen Pstl-EcoRI-Fragment komigrierte. Dieses Plasmid wurde als pPLc28 bezeichnet (Fig. 4).

pPLc28 kann natürlich wie die anderen im Rahmen der Erfindung beschriebenen Plasmide vielter zur Insertion anderer Restriktionsstellen manipuliert werden. Zum Beispiel wurde ein Fragment, das folgendes enthält; Xba-Restriktionsstelle - SaI-Restriktionsstelle - Xba-Restriktionsstelle - Ps_t-Restriktionsstelle - Xba-Restriktionsstelle in p?Lc28 an der HindIII-Restriktionsstelle eingefügt* Dieses Plasmid wurde als pPLc2819 bezeichnet. Eine andere gleiche Manipulation ergab ein Plasmid, das das an der BamHI-Stelle von pPLc28 eingefügte Fragment Pst-Restriktionsstelle - Sal-Restriktionsstelle - Xba-Restriktionsstelle enthielt» Dieses Plasmid wurde als pPLc2833 bezeichnet.

5. pPLc24 — Insertion der Ribosom—Bindestelle und des Amino-Terminationsteiles von Bakteriophage MS2-Relicaseprotein in pPLc28

Ein EcoRI-BamHI-Fragment von 431 Basenpaaren, das für die Riboaom-Bindestelle und die ersten 98 Aminosäurereste des Bakteriophage MS2-Replicase-Gens kodiert, wurde von Plasmid pMS2-7 gewonnen (R. Devos, u.a«,"Construction And Characterization Of A Plasmid Containing A !early Full-Size DEiA-Copy Of Bacteriophage MS2 RNA¹¹ (Konstruktion und Charakterisierung eines Plasmids, das eine DlfA-Kopie von Bakteriophage MS2-RNA in fast voller Größe enthält), J. Mol. Biolo, 128, S. 595 - 619

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(1979))« Dieses Fragment wurde in Plasmid pPLc28 eingefügt und ersetzte das ursprünglich darin "befindliche EcoRI-BamHI-· Fragment (Pig* 5)· Die Struktur des resultierenden Plasmids, als pPLc24 "bezeichnet, wurde durch Restriktionsanalyse mit EcoRI-BamHI und Größenvergleich der resultierenden Fragmente mit denen, die nach der BcoRI-BamHI-Digestion von pMS2-7 und pPLc28 gewonnen wurden, bestätigt» In pPLc24 läuft die Translation des MS2-Replicaseprotein~Fragraentes kolinear mit der Transcription von dem Py-Promotor und somit unter P-r-Kontrolle*

Biologische Eigenschaften von Wirtszellen, die durch die erfindungsgemäßen Vektoren transformiert wurden

1. Stabilität bei 28 ⁰C

Mit einem der oben beschriebenen Vektoren transformierte Stamme Κ12ΔΗΙ oder M5219 Wurden bei 28 ⁰C auf 20 Generationen in LB-Medium ohne Selektion hinsichtlich antibiotischer Resistenz-Markierungssubstanz vermehrt» Geeignete Verdünnungen der Kulturen wurden dann bei 28 ⁰G entweder in Anwesenheit oder bei Fehlen des erwünschten Antibiotikums vermehrt· In allen Fällen war die Anzahl der gewonnenen Kolonien ungeachtet der Selektion hinsichtlich antibiotischer Resistenz die gleiche, wodurch demonstriert wurde, daß die Vektoren in diesen Wirten bei 28 ⁰C vollkommen stabil waren (siehe Tabelle I, infra).

Alle Vektoren konnten auch in einen für Bakteriophage λ lysogenen Wirtstamm transformiert werden. Derartige Stämme, in denen die Resident-Phage ein Wild-Typ-el-Produkt synthetisiert, waren bei erhöhten Temperaturen (37 ⁰G) lebensfähig. Im Gegensatz dazu konnten nicht-lysogene Wirte nicht mit diesen Vektoren transformiert werden. Stattdessen enthielten die wenigen, aus diesen Experimenten gewonnenen Tranaformanten Vektoren mit Deletionen, die die gesamte oder aen größten Teil der P^-Region entfernten.

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2* Verhalten von Et-Vektoren enthaltenden Zellen nach längerer Induktion bei 42 ⁰C

Die Wirksamkeit der Vermehrung der mit den erfindungsgemäßen Vektoren transformierten Stämme Κ12Δ.ΗΙ und 15219 bei 42 ⁰C wurde entweder mit antibiotischer Selektion oder ohne diese bestimmt»

Vektoren, in denen die Pt in Uhrzeigerorientierung in bezug auf den Ursprung der Replikation (pPLc-Typ) eingefügt iat, verhielten aich ähnlich· Die mit pPLc236 gewonnenen Ergebnisse sind in Tabelle I, infra, wiedergegeben. Der mit pPlc236 transformierte Stamm Κ12ΔΗΙ vermehrte sich bei 42 ⁰C ebenso gut wie bei 28 ⁰C, gleich ob antibiotische Selektion angewandt wurde oder nicht· Der mitpPLc236 transformierte Stamm M5219 vermehrte sich auf nichtselektiven Platten mit einem Wirkungsgrad von 1· Wenn jedoch antibiotische Selektion angewandt wurde, verringerte sich der Wirkungsgrad der Vermehrung wenigstens 1000-fach. Bei 42 ⁰C auf nichtselektiven Platten gewonnene Kolonien wiesen keine Resistenz mehr gegenüber der antibiotischen Markierungssubstanz auf»

Vektoren, in denen der P^ in Gegenzeigerorientierung in bezug auf den Ursprung der Replikation (pPLa-Typ) eingefügt ist, zeigten einen komplizierteren Verlauf der Koloniebildung bei 42 ⁰C. Transformanten vom Stamm M5219 bildeten bei 42 ⁰G selbst in Abwesenheit von antibiotischer Selektion keine Kolonien (der Wirkungsgrad der Vermehrung lag unter 10~^Jj Tabelle I)· Das Verhalten von Transformanten vom Stamm K12£HI hing bei 42 ⁰C von der Beschaffenheit des anwesenden Vektors ab. Während pPLa832 enthaltende Transformanten unweigerlich eine mindestens 1000-fache Verringerung des Vermehrungswirkungsgrades mit und ohne antibiotische Selektion aufwiesen, zeigten zum Beispiel pPla23 oder pPLa2311 enthaltende Transformanten Vermehrungsgrade zwischen 1 bis 10 , häufig mit einer breiten Heterogenität der Koloniegröße·

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Daher verursacht die Expression von pPLa-Typ-Vektoren bei 42 C Interferenz mit dem Wirtsmetaboliamus, wodurch die Zellen nicht in der Lage aind, bei diesen hohen Temperaturen selbst ohne Selektion hinsichtlich des Plasmids zu überleben· Diese Wirkung ist am ausgeprägtesten bei der Verwendung von 15219-Wirten» Umgekehrt stören pPlc-Typ-Vektoren den Metabolismus von Wirtszellen nicht direkt, denn es wurde ein 100 %iges überleben induzierter Zellen bei Fehlen von selektivem Druck beobachtet. Portgesetzte Transcription von dem Ρτ-Promotor gleichzeitig mit der Expression des I-Gens in M5219 kann jedoch zur Inhibition der Vektorreplikation in M5219 Stämmen führen. Das wird durch die Unfähigkeit derartiger Zellen, bei 42 ⁰G auf selektiven Platten zu wachsen, demonstriert·

Tabelle	I	Vektor	28	Vermehrunsswirkungsgrad +	mit Selek tion	ohne Selek tion	1	42 0C	1
		keiner	ohne Selek tion	0C	—	1	1	mit Selek tion	-
		pPia23 pPIa2311	1	1 1	1 zu -ΙΟ"3 1 zu -ΙΟ"3	^10"3	-
Stamm	pPLa832	1 1	1	<10~3	SiO-3	1 zu ^10"3 1 zu -ΙΟ"3	±10-3 210-3
Κ12ΔΗΙ	pPLc236	1	1	1	^10"3	*10"3
	keiner	1	-
	pPLa23	1	1
	pPLa2311 pPLa832	1	1 1
15219	pPLc236	1 1	Λ I
		1

+ Bakterienkulturen wurden bis zur Sättigung in LB-Medium bei 28 C in Abwesenheit von Antibiotikum gezüchtet* Geeignete Verdünnungen wurden entweder mit oder ohne Antibiotikum vermehrt und bei 28 ⁰C oder 42 ⁰C inkubiert. Die Anzahl der gewonnenen Kolonien wurde ermittelt.

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Expression von Genen in den erfind ungs gemäße η Vektoren

1» Allgemeine Verfahrenemeise

Die erfindongagemäßen Vektoren können vorteilhaft für die Erzeugung einer Vielzahl von Polypeptiden und Proteinen verwendet werden, indem MA-Sequenzen, die für die verlangten Polypeptide oder Proteine kodierende Gene aufweisen, in die Vektoren an einer der Endonuclease-Erkennungasteilen neben dem Promotor und Operator eingefügt werden, die entsprechenden Wirte mit diesen, diese eingefügten MA-Sequenzen enthaltenden Vektoren transformiert werden, die Wirte vermehrt werden und die Polypeptid- oder Proteinprodukte gesammelt vierden. Beispiele derartier Polypeptide und Proteine umfassen Leukozyten-Interferon, Insulin, Antigene von Hepatitis, Antigene von Fuß- und Mundkrankheiten, Fibroblaat-Interf eron, Humanviachs turns hormon, Immun-Interferon und eine Vielzahl anderer prokaryotischer, eukaryotischer und Virusenzyme, Hormone, Polypeptide, Antigene und Proteine.

Zur Erläuterung dieser Verfahren -wurden die Synthese spezifischer Gen~Produkte in den erfindungsgemäßen Vektoren durch Impuls-Markierung induzierter Zellen und die Analyse der markierten Proteine durch Polyacrylamid-Elektrophorese verfolgt.

Mit den erfindungsgemäßen Vektoren transformierte Zellen wurden in LB-Medium ohne Antibiotikum bei 28 ⁰C bis zu einer Dichte von 2 χ 10 /ml vermehrt· Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt und in dem Originalvolumen eines aus 19 mM IH₄Cl, 86 mM HaCl, 42 mM ITa₂HPO₄, 1 mM MgSO₄, 0,2 % Glucose, 0,05 % Gasaminosäuren (Difco), 0,01 % Hefeextrakt und SO /Ug/ml L-Tryptophan bestehenden Mediums zur Markierung der Zellen mit c-Aminosäure-Gemisch oder dem obigen Medium resuspendiert, jedoch mit einer Substitution von 5 % Methionin-Sach^eismedium (Difco) für die Casaminosäuren und

35 den Hefeextrakt für die Markierung der Zellen mit S-Methionin.

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Die Inkubation bei 28 C wurde 60 min lang durchgeführt. Die Hälfte der Kultur wurde dann auf 42 ⁰C gebracht· Zu verschiedenen Zeiten nach der Induktion -wurden Aliquoten von den 26 ⁰G und den 42 ⁰G Kulturen mit '^C-Aminosäuregemiach oder mit ^ S-Methionin (Amersham) markiert*

Der Einbau der Markierung wurde durch Phenolextraktion beendet. Die synthetisierten Proteine wurden aua der Phenolschicht durch die Zugabe von 5 Vol. Äthanol ausgefällt und erneut in 1 % SDS, 1 % P -Mercaptoäthanol, 10 % Glycerin, 62,5 mM Tri-HCl (pH-Wert 6,8) gelöst» Proben wurden 5 min lang gekocht, mit 12 000 χ g zentrifugiert und in SDS-enthaltenden Polyacrylamidgelen (10 % bis 15 % Acrylamid) nach der Verfahrensweise von ü· Laemmli, "Cleavage Of Structural Proteins During the Assembly Of The Head Of Bacteriophage T4" (Spaltung von Strukturproteinen während des Aufbaues des Kopfes von Bakteriophage T4), Nature, 227, S. 680 - 682 (1970) der Elektrophorese unterzogen· Nach der Elektrophorese wurden die Gele für die Pluorographie nach der Methode von W. Bonner & R. Laskey, "A PiIm Detection Method Por Tritium-Labelled Proteins And Nucleic Acids In Polyacrylamide Gels ("Pilmnachweiamethode für tritium-markierte Proteine und Nucleinsäuren in Polyacrylamidgelen), Eur. J. Biochem.. 46, S. 83 - 88 (1974) vorbereitet, nur wurde dabei EBrHANCE (NEN) anstelle von PPO-DMSO verwendet.

2. Prokaryotische Gene (a) Das β-Lactamase-Gen

pPLa23 (Pig. 3) enthält das fr -Lactamase-Gen im Orientierungssinne unterhalb von dem P^-Promotor. Daher kann die Erzeugung des durch das (b -Lactamase-Gen kodierten Proteins als Anzeichen für den Wirkungsgrad des Vektors bei der Expression prokaryotischer Gene verfolgt werden·

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Transformanten von Κ12ΔΗΙ und M5219 mit pPIa23 — E. coil Κ12ΔΗΙ (pPLa23) und E. coli M5219 (pPLa23)— wurden wie oben beschrieben hergestellt, und ihre Protein-Synthese wurde verfolgt· Die Ergebnisse aind in Fig. 8 wiedergeben. Daraus iat zu ersehen, daß eine dramatische Steigerung der Synthesegeschwindigkeit zweier Proteine mit scheinbaren relativen MoIekülmaaaen von 27>5K bzw. 3OK kurz nach der Induktion der Transformanten bei 42 ⁰C erfolgt iat. Die Größen dieser verwirklichten Proteine stimmen mit der erwarteten Länge von vollentwickelter /S-Lactamase und ihres Vorläufers überein (J. Sutcliffe, supra). Darüber hinaus lief der induzierten Synthese dieser Proteine eine zunehmende enzymatiache Aktivität von j3-Lactama se parallel, wie nach der Methode von O'Callaghan, u.a., "Uovel Method For Detection Of ß-Lacatamases By Using A Chromogenic Cephalosporin Substrate" (Neuartige Methode zum Nachweis von ß-Lactamase durch Anwendung eines chromogenen Cephalosporin-Subatratea), Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1, S. 283 - 288 (1972) bestimmt wurde, und beide Proteine wurden spezifisch durch Anti- /3-Lactamase-Serum ausgefällt. Als Kontrolle wurde die Proteinsynthese in nicht mit Vektor pPLa23 transformierten Wirten verfolgt. Bei diesen nicht-transformierten Wirten konnte keine Synthese eines der beiden oben beschriebenen Proteine festgestellt werden.

Wie in Fig. 8 gezeigt wird, ist der Gesamtverlauf der Proteinsynthese in diesen Transformanten bei 28 C und 42 C sehr ähnlich. Allerdings scheint die Geschwindigkeit der Synthese einiger Proteine ganz erheblich verändert zu sein, wenn, die Zellen auf 42 ⁰C gebracht werden. Ein ähnliches Verhalten wurde bei nicht mit pPLa23 transformierten Zellen beobachtet. Außerdem wird, wie in Fig. 8 gezeigt wird, die relative Menge des größeren der beiden von ß-Lactamase abhängigen Proteine — des unverarbeiteten Vorläufers für ß-Lactamase — mit der Zeit nach der Induktion größer. Diese Verschiebung zum Aufbau eines Vorläuferproteins kann eine Sättigung der ß-Lactamase-Verarbeitungsmaschinerie der Zelle anzeigen.

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Zar Bestimmung der prozentualen Synthese von ß-Lactamase im Verhältnis zur de novo Geaamtproteinayntheae dea Transformanten wurden die Proteinbänder für die β-Lactamse (27,5K) und ihren Vorläufer (30K) von dem getrockneten Gel abgeachnitten, und ihre Radioaktivität wurde mit der gesamten an das Gel angelegten Radioaktivität verglichen. Diese Ergebnisse sind in Tabelle II wiedergegeben.

Tabelle II Prozentuale Synthese von ß-Lactamase im Verhältnis zur de novo Gesamtproteinsynthese

Minuten nach der Stamm

Induktion bei 42 C Κ12ΔΗΙ 115219

0-TO 8 % 9 %

10-20 9 % 16 %

20-30 10 % 25 %

3O-4O 16 % 24 %

40-50 23 % 30 %

50-60 27 %

60-70 30 %

70-80 33 %

Kontrolle bei 28 ⁰C 5 % 4 %

Wie aus Tabelle II hervorgeht, erreicht die Synthese von β lactamase und ihres Vorläufers einen Maximalwert von etwa 30 % der de novo Gesamtproteinsynthese in beiden Wirtszellenstämmen. Jedoch ist die Kinetik zur Erreichung dieses Wertes bei den beiden Stämmen verschieden — Stamm K12AHI hinkt etwa 20 min hinter Stamm M5219 in der Irreichung des 30 ^-Standes nach. Wenn auch keine Festlegung durch die Theorie beabsichtigt ist, so könnte es doch sein, daß das N-Gen-Produkt, da,-s bei der Induktion von Stamm M5219 mit erzeugt wurde, aber in Stamm Κ12ΔΗΙ fehlt, bestimmte Transcriptions-Verlangsamungssignale

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in den unterhalb des Ρτ-Promotors gelegenen EEiA-Seqaenzen übersehen hat and daher die /3-Lactamase-Synthese in Stamm K5219 beschleunigt·

Um die Geschwindigkeit der Gesamtproteinsynthese in diesen Transformanten zu bestimmen, wurde die in einem bestimmten Zeitraum eingebaute Gesamtradioaktivität bestimmt und mit der in dem 0 bis 10 Minuten-Intervall eingebauten verglichen (d. h. dieses Anfangs int ervall wurde willkürlich mit 100 % als Bezugsgröße gewählt). Die Ergebnisse sind in Tabelle III wiedergegeben·

Tabelle III Geschwindigkeit der Gesamtproteinsynthese

Minuten nach der Stamm

Induktion bei 42 ⁰C Κ12ΔΗΙ M5219

1-10. 100 % 100 %

10-20 104 % 92 %

20-30 134 % 56 %

30-40 113 % 31 %

40-50 120 % 10 fa

50-60 113 % 7 %

60-70 96 % 3 %

70-80 96 % 3 ?6·

150-160 20 %

Wie in Tabelle III gezeigt wird, wird die Gesamtproteinsynthese in E. coli M5219 (pPIa23) nach der Induktion rasch beendet. Dies steht in Einklang mit dem oben beobachteten Unvermögen von M52i9-Transforinanten, 42 ⁰C überleben zu können. Eine ähnliche Inhibition der Proteinsynthese ist in E. coli M5219 (pBR322) nicht zu beobachten. Eine wesentliche Verminderung der Gesamtproteinsynthese ist auch in E. coli

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Κ12ΔΗΙ (pPLa23) nach längerer Inkubation bei 42 C festzustellen. Je ι stehen*

len. Jedoch können diese Zellen Temperaturen von 42 ⁰C über-

(b) Das Tryptophan-Synthetase-A-Gen (i) pPLa23

Ein EcoRI-Fragment (5300 Basenpaare), das das trp A Cistron von Salmonella typhimurium enthielt, wurde von pES9 gewonnen (E* Selker, u.a., "Mitomycin C Induced Expression Of trp A Of Salmonella tryphimurium Inserted Into The Plasmid CoIEl" (Durch Mitomycin C induzierte Expression von in das Plasmid CoIEl eingefügtem trp A von Salmonella tryphimurium), J» Bacteriology« 129, S. 388-394 (1977)) und in pPLa23 an dessen EcoRI-Stelle eingefügt. Zwei repräsentative Plasmide, bei denen dieses Fragment in einer der beiden möglichen Orientierungen in bezug auf die Richtung des P^-Promotors eingefügt wurde, wurden als pPLa23trpA^ und pPLa23trpA₂ bezeichnet.

Induktionsprofile von entweder pPLa23trpA^ oder pPLa23trpAp enthaltendem Stamm K12&HI sind in Pig. 9 gezeigt. Ein Hauptprotein von etwa 25 000 Dalton wurde durch pPLa23trpA* induziert, fehlte aber in induzierten, pPLa23trpA₂ enthaltenden Zellen. Die festgestellte relative Molekülmasse dieses Proteins stimmt mit dem theoretischen Wert (28 500) überein, der von der Nucleotid-Sequenz des S. .typhimurium trp A Gens vorausgesagt wurde (B. Nichols & C. Yanofsky, "nucleotide Sequences Of trp A Of Salmonella tryphimurium And Escherichia colis An Evolutionary Comparison" (Nucleotid-Sequenzen von trp A von Salmonella tryphimurium und Escherichia coli: Ein Entwicklungsvergleich), Proc. Natl. Acad. Sei. USA.« 76, S. 5244 5248 (1979)). Darüber hinaus nahm die Enzymaktivität, die der Anwesenheit eines trp A-Gen-Produktes entspricht, wie nach den Verfahren von 0. Smith & C. Yanofsky "Enzymes Involved In The Biosynthesis Of Tryptophan" (An der Biosynthese von Tryptophan beteiligte Enzyme), Methods.in Enzymology« 5, S. 794 -

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806 (1962) bestimmt wurde, parallel mit der Ansammlung dieses induzierten Proteins zu·

Kack längerer Induktion von pPLa23trpA.. und pPLa23trpA₂ wird ein Protein mit einer annähernden relativen Molekülmasae von 18K synthetisiert (Pig. 9). Die prozentuale Synthese dieses Proteins im Vergleich zur de novo Gesamtpro-teinsynthese des Transformanten ist von der Orientierung des EcoRI trp A Fragmentes in "bezug auf die Richtung der Transcript ion von dem P^- Promotor unabhängig. Daher wird die Synthese dieses Proteins vermutlich durch einen, wahrscheinlich an dem 5300 Basenpaar EcoRI trp A Fragment vorhandenen leicht temperaturabhängig en Bakterienpromotor gesteuert, dessen Codierungskapazität tatsächlich viel größer ist als für trp A gebraucht iiird (E. Selker, supra).

Die prozentuale Synthese von trp A im Vergleich zur de novo Gesamtproteinaynthese wurde im wesentlichen wie oben für β Lactamase beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV wiedergegeben· Die trp A Synthese erreichte mieder einen Maximalwert von etwa 30 % der de novo Gesamtsynthese.

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Tabelle IV Prozentuale Synthese von trp A im Verhältnis zur De Hovo Geaamtprotsinsynthese

Minuten nach der K12dHI Κ12ΔΚΕ

Induktion bei 42 ⁰C pPLa23A₁ pPLa23A₂

0-10 3 % 2 %

30-50 4 % 2 %

60-80 14 % 1 %

90-110 21 % 2 %

120-140 24 % 2 %

150-470 33 % 2 %

Kontrolle bei 28 ⁰C 2 % 3 %

(ii) pPIa2311

Bin mit pPLa23trpA^ identisches, aber auf pPLa2311 basierendes Rekombinant-DiTA-Molekül wurde gleichfalls im wesentlichen wie oben beschrieben hergestellt. Κ12ΔHI-Tranaformanten mit pPLa2311trpA.| verhielten sich ähnlich wie die von pPLa23trpA₁ (mit dem Unterschied, daß bei diesem Versuch der Höchstwert der de novo Gesamtsynthese nach 150 min nur 20 % betrug). Wieder führte eine längere Induktion zu einer reinen Verminderung bei der Geaamtproteinsynthese.

(iii)pPIc23

Das EcoRI-Fragment von pES9 hat ein innerhalb des trp B-Gens gelegenes Ende und enthält eine einzige Sall-Stelle etwa

2500 Basenpaare von der EcoRI-Stelle entfernt (E. Selker. u.a., supra). Da das trp A Gen keine Sall-Stelle enthält (B. Nichols & C. Yanofsky, supra), muß das trp A Gen vollständig in dem Abschnitt des EcoRI-Pragmentes von pES9 liegen, der sich von der ersten EcoRI-Stelle bis zur Sall-Stelle erstreckt. Daher wurde das zuvor hergestellte EcoRI-gragment von pES9 mit Sail digeriert und das resultierende Fragment in pPLc23 als Ersatz

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für daa darin befindliche EcoRI-Sall-Fragment eingefügt (Fig. 4)· Auf der Grundlage der beobachteten Translationarichtung des trp A Gena in pPLa23trpA.j und pPLa23trpA₂ wurde daa auf pPLc23 basierende Rekombinant-BNA-Molekül, daa daa trp A Gen kolinear bei der Tranacription von dem Ργ-Promotor aufweiat, als pPLc23trpiL· bezeichnet.

lach der Induktion (42 ⁰G) von E. coli Κ12Δ.ΗΙ (pPLc23trpA₁) wurde trp A bis zu eihem Höchstwert von etwa 40 % der de novo Geasmtproteinaynthese nach 3-stündiger Induktion synthetisiert. Darüber hinaus wurde dieser hohe Grad der de novo Synthese 2 h lang beibehalten (Pig. 10). Diese Ergebnisse sind in Tabelle V, infra, wiedergegeben. Daher verringert sich die Proteinsynthese der pPLc-Typ-Transformanten im Gegensatz zum Verhalten der pPLa-Typ-Vektoren erst 5 h nach der Induktion.

Tabelle V	0C	% Synthese von	Ausmaß der Ge-
		trp A+	aamtprotein- aynthese
Minuten nach der		11 %	100 % (Bezügswert)
Induktion bei 42		17 %	198 %
30-50		31 %	228 %
60-80		41 %	162 %
120-140		36 %	205 %
180-200	0C	39 %	213 %
240-260		3 %	-
300-320
Kontrolle bei 28
(300 - 320)

+ Im Verhältnis zur de novo Geaamtproteinsynthese

Die tatsächliche Menge von induziertem Protein, das aich in den obigen Transformanten ansammelte, wurde gleichfalls durch atändige Markierung der induzierten Zellen gemessen. E. coli

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Κ12ΔΗΙ (pPLc23trpA-,) wurde bei 28 ⁰C in LB-Medium bis zu einer Dichte von 1 χ 10 Zellen/ml vermehrt» Die Zellen wurden anschließend mit 10 /uCi C-Aminosäuregemisch markiert« Bei einer Dichte der Kultar von 4 ι 10 Zellen/ml wurden die Zellen auf 42 ⁰G gebracht und die Inkubation wurde fortgesetzt* AIa die Kultur Sättigung erreicht hatte (6 h nach der Induktion), wurden die Proteine von den Zellen extrahiert und auf SDS-Polyacrylamid-Gelen getrennt. Es wurde die prozentuale, in das trp A Band eingebaute Radioaktivität bestimmt. Unter den angewandten Bedingungen kann man annehmen, daß die Zellen einheitlich markiert wurden, so daß die in ein Protein eingebaute Radioaktivität die tatsächliche Menge dieses in der Zelle vorhandenen Proteins wiedergibt. Es wurde festgestellt, daß das trp A Protein 10 % des Geaamtzellproteins ausmachte·

Diese Konzentration von 10 % von trp A in den gesamten Zellproteinen von E, coli Κ12ΔΗΙ (pPLc23trpA₁) dient auch dazu, die erheblichen Unterschiede zwischen den ^Pt enthaltenden Vektoren von H· Bernard, u· a., supra, und den erfindungsgemäßen zu demonstrieren» Im Gegensatz zu den durch die erfindungsgemäßen Vektoren erzielten tatsächlichen 10^-Konzentration von trp A berichtet H. Bernard, u.a· nur über eine 6,6-^-Konzentration von trp A — geschätzt auf der Basis enzymatischer trp A Aktivität und einer angenommenen spezifischen Aktivität für das Protein, Es ist gleichfalls zu beachten, daß die von H. Bernard, u· a·, genannte 6,6-^-Konzentration von trp A bei Vektoren festgestellt wurde, die auch ein aktives N-Gen enthielten, so daß die Transcription daher vermutlich in Gegenwart des Anti-Terminations-N-Gen-Produktes stattgefunden hat· Von einer nur 2 % betragenden trp A Konzentration berichtet H. Bernard, u.a,, bei einem Vektor, der kein aktives N-Gen enthielt, Im Gegensatz davon wurde die 10-%-trp a Konzentration, die mit verbesserten erfindungsgemäßen Vektoren festgestellt wurde, in Abwesenheit von H-Gen Produktion ermittelt«, Daher stellen die vorliegenden Vektoren und Verfahren eine bedeutende Verbesserung gegenüber den bisher im Fachgebiet bekannten Vektoren und Verfahren dar»

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(c) Das Bacteriophage MS2 Replicase-Protein-Gen

Plasmid pMS2-7 enthält eine Kopie des Genoma der RUA-Bakteriophage MS2 in fast voller Größe (R. Devos, uua·, supra). Daa Phagen-Replicase-Gen (R) ist in dem EcoRI-Pstl-Fragment enthalten· Dieses Fragment viurde in pPLa2-311 durch einfachen Ersatz dea JcoRI-PjStI-Fragmentes dieaea Vektors eingefügt. Transformanten E. coil K124HI (pPLa2311R.j) warden in bezug auf Sensibilität gegenüber Carbenicillin ausgesondert, da das Gen für Ampicillin-Resistenz in pPLa23HR^ nicht mehr intakt ist. Die Identität des eingefügten Pragmentes wurde durch Koelektrophorese auf Agarosegelen mit den bekannten Fragmenten von pMS72-7 WA ermittelt. In pPLa2311R-j läuft die Transcription des MS2-Replicase-Proteins kolinear mit der Transcription von dem Pj-Promotor*

Induzierte Zellen von S. coli Κ12ΔΗΙ (pPLa2311R-) synthetisieren ein Protein mit einer scheinbaren relativen Molekülmasse von 59K (Fig. 11). Die Größe dieses Proteins entspricht der relativen Molekülmasse von 60692 Dalton, die für die MS2-Replicase von Sequenz-Daten der Virus-RNA berechnet wurde (W. Fiers, u.a·, "Complete nucleotide Sequence Of Bacteriophage MS2 RNA: Primary And Secondary Structure Of The Replicase Gene" (Vollständige Nucleotid-Sequenz von Bakteriophagen MS2 EBiA: Primäre und sekundäre Struktur des Replicase-Gens), Hature, 260, S. 500 - 507 (1976)).

Die Anwesenheit von funktionellem MS2 Repblicase-Protein in den Proteinprodukten von mit pPLa2311R^ transformierten Zellen viurde gleichfalls durch Komplementierungs-Analyse mit MS2 Bernstein-Mutanten nachgewiesen. Diese Analyse bestätigte, daß mit pPla2311R₁ transformierte Zellen ein Produkt erzeugten, das speziell das Produkt einer MS2-Mutante, die eine Lesion in dem Replicase-Gen aufwies, komplementierte, und daß nicht mit pPLa2311R^ transformierte Zellen das Produkt einer

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solchen Mutante nicht komplementierten·

Bei der MS2 Replicase-Proteinsynthese verhielten sich E, coli Κ12ΔΗΙ (ρΡ1α2311Η_η) und E. coli M5219 (pPLa2311R₁) ähnlich — nach 30 min Induktion betrug die prozentuale Synthese von MS2 Replicaae 29 % der de novo Gesamtproteinaynthese, wobei der Wert der Proteinayntheae bei weiterer Induktion achnell abaank (Pig. 11). Da eine solche Abnahme dea Synthesewertes bei der Synthese von f3-Lactamase oder trp A nicht festzustellen war, kann die Verminderung durch eine eigentümliche Eigenschaft der MS2 Replicase hervorgerufen worden sein. Zum Beispiel könnte die beobachtete Tendenz von Phagen-Replicase, sich an ihre eigene mRNA an einer nahe der Mitte dea Cistron gelegenen Stelle zu binden (Meyer, a«a·,. "The Binding Sites Of QßRHA" (Die Bindestellen von QßRUA), Ezperienta, 31. S. 143 ff (1975) die weitere Translation der komplexierten mRNA stören.

3· Eukaryotische Gene

(a) Das Klein-t Antigen von Simian Virus 40 Gen

Sin HindIII-DNA-Fragment, das die vollständige Gcdierungssequenz für das SV40 Klein-t Antigen enthielt (G. Volckaert, u.a·, Nucleotide Sequence Of The Simian Virus 40 Small-t Gen" (Kucleotid-Sequenz des Simian Virus 40 Klein-t Gens) Proc. Natl» Aoad. Sei. U.S.A., 75, S. 2160 - 2164 (1978)) wurde in die Hindlll-Stelle von pBR322 eingefügt (Pig. 12). Die Orientierung des Inserts wurde durch Restriktionsanalyse auf der Grundlage der Anwesenheit einer asymmetrisch gelegenen Taql-Stelle bestimmt. Von diesem Hybrid-DNA-Molekül wurde ein EcpRI-BamHI-Pragment, das das oben genannte Hindlll-Pragment und Teile von pBR322 einschloß, abgeschnitten und in pPLc28 als Ersatz für sein SooRI-BamHI-Fragment so eingesetzt, daß die Translationsrichtung des Klein-t Antigens kolinear mit der Transcription von dem P^-Promotor verläuft (Pig. 12). Das resultierende Rekombinant-DHA-Molekül wurde als pPLc28SV.j.5 bezeichnet.

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Zur Verkürzung dea Abatandes zwischen dem P,-Promotor und dem Initiierungacodon (ATG) dea für Klein-t-Antigen kodierenden Gens nurde pPLc28SV₊5 modifiziert, am daa EcoRI-Hindlll-Pragment zwischen dem Gen und dem P_T-Promotor zu eliminieren. Die-

se Manipulationen sind in den Pig. 12 und 13 dargestellt. Sie umfaßten die Spaltung von pPLc28SV+5 mit CIaI, da3 Zurücknehmen (chewing back) dea 3*-Endes der DUA in zwei getrennten Schritten unter Anwendung der 3^f-Exonuclease-Aktivität von T4 DNA-Polymerase in Gegenwart von GTP bzw· TTP, weitere Behandlung mit ST-Uucleaae, Zugabe von 33c oRI-Linkern zu dem stumpfen Ende, Spaltung des Fragmentes mit ScoEI und Heligation der komplementären Enden.

Die Transformation von B. coli Κ12Δ HI mit diesen modifizierten Hybrid-DETA-Molekülen und die Induktion ergeben die Expression von ziemlich großen Mengen eines Proteins mit einer scheinbaren relativen Molekülmasse von 14K (Fig. 14)· Dieses Protein wurde ohne Induktion nicht erzeugt und auch nicht durch Wirtszellen, die nicht mit SV40 DNA enthaltenden Vektoren transformiert worden waren.

Obwohl authentisches KIein-t-Antigen eine relative Molekülmasse von 19K hat und das in diesen transformierten Zellen erzeugte Protein nur sehr schwach durch Antikörper ausgefällt wurde, die gegen daa Groß-T-Antigen von SV40 eingesetzt wurden, bestätigten zweidimensional Fingerabdrucke (Elektrophorese bei pH-Wert 3,5, gefolgt durch Chromatographie in Butanol/Eaaigaäure/Pyridin/Wasser (15 ί 3 s 10 : 12)) von tryptischen Peptiden, die von diesem Protein und authentischem KIein-t-Antigen abgeleitet wurden, daß die beiden verwandt waren. Wenn das auch nicht als Theorie aufzufassen ist, so könnte es doch sein, daß die sekundäre, an dem Ρχ-Promotor beginnende Struktur der mRUA so beschaffen ist, daß die Initiierung eines internen Initiierungscodona von KIein-t-Antigeη

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gegenüber der Initiierung dea echten Startsignals begünstigt wird· Diaae Hypotheae stimmt auch für die aekundäre Struktur, die unter Anwendung der Verfahrensweise von D. Iserentant & W. Piers, "Secondary Structure Of mB$A And Efficiency Of Translation Initiation" (Sekundäre Struktur von mRNA und Wirkungagrad der Tranalaticnsinitiierung), Gene, 9. S. 1 - 12 (1980) von den Nucleotid-Sequenzen einiger dieaer SV.-enthaltenden Vektoren abgeleitet werden könnte·

Einea der modifizierten pPLc28SV+5 Rekombinant-MA-MoIeküle, daa wie oben hergestellt wurde, verwirklichte geringfügige Mengen einer 17K-Komponente zuaätzlich zu. der 14K-Hauptproteinkomponente. Dieses Molekül wurde ala pPLcSV^.5-37 bezeichnet. Während daa Vorhandenaein des 17K-Proteins nur anfanga mit Hilfe spezieller Immunopräzipitation mit Groß-T-Antiserum nachgewiesen werden konnte, ermöglichte die weitere Modifikation dea Moleküls eine verstärkte Synthese der ^K-Komponente. Diese Modifikation, die aus Spalten von pPLc28SV_t5-37 mit EcoRI, Verlängern der zurückgenommenen 3'-Enden mit DE^-A-PoIymeraae I (K. Backman), u.a., supra) und Religation der stumpfen Enden bestand, könnte die sekundäre Struktur der mRHA verändert haben. Mit pPLc28SV^5-37-9 transformierte Wirte ergaben etwa 4 % ihrer de novo Geaamtproteinayntheae in Form einer 17K Proteinkomponente nach der Induktion. Diese Ergebniase aind in Pig. 14 wiedergegeben. Wie auf Zeile c von Pig. 14 gezeigt wird, wurde die 17K-Komponente mit Serum von einem einen SV40-Tumor aufweisenden Hamater bis zu etwa dem gleichen Ausmaß wie authentisches Klein-t-Antigen, das in mit SY40 infizierten Uierenzellen afrikanischer Grüner Meerkatzen gezüchtet worden war, Lnmuno-ausgefällte

(b) Human-Pibroplaat-Interferon (HPIP)-Gen

Wie in der am 6. Juni 1980 eingereichten Britischen Patentanmeldung 80.18701 beschrieben wird, wurde das für Human-Pibro-

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blast-Interferon kodierende Gen in die Vektoren pPLa8 and pPLc24 ζar Erzeagang von Rekombinant-DNA-Molekülen eingefügt, die in transformierten Wirten nach entsprechender Induktion Proteine mit Antivirus-, physio-chemischer, immunologischer und biologischer Aktivität, die der authentischen Human-Fibroblast-Interferons sehr nahekommt, verwirklichen können*

Cc) Ein BSDV-Antigen-Gen

Wie in der am 15· August 1980 eingereichten Britischen Patentanmeldung 80.26661 beschrieben wird, wurde eine DNA-Sequenz, die für ein die Spezifität von FMDV-Virus-Antigenen aufweisendes Polypeptid kodiert, in den Vektor pPLc24 zur Erzeugung von Rekombinant-DNA-Molekülen eingefügt, die in transformierten Wirten nach entspredhender Induktion Polypeptide mit der Spezifität von MDV-Virus-Antigenen verwirklichen können.

Nach dem hier beschriebenen Verfahren erzeugte Mikroorganismen und Vektoren werden hier durch Kulturen wiedergeben, die in der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, Vereinigte Staaten, am 8. September 1980 hinterlegt und als PL-A bis PL-D identifiziert wurden:

A. E- coil M5219 (pPLa2311)

^B· E, coil' Κ12Δ.ΗΙ (pPLa8)

^σ· E. coli Κ12Δ.ΗΙ (pPLc28)

^D· E» coil M5219 (pPLc24)

Diese Kulturen erhielten die Zugangsnummern ATTC 31694 - 31697.

Außerdem werden nach dem hier beschriebenen Verfahren erzeugte Mikroorgaiismen und Vektoren, die ebenfalls eingefügte DNA-Sequenzen für die Expression darin enthalten, durch in der Kulturensammlung Deutsche Sammlung von Mikroorganismen in Göttingen, West-Deutschland hinterlegte Kulturen vertreten und v»ie folgt identifiziert:

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¹³* Ε» coil Μ5219 (G-pPLa-HFIF-67-12) LDSM 185iJ HFIF-E: E. coli Κ12ΔΗΙ (G-pPLa-HFIF-67-12) [DSM 1852] HFIP-P: E. coli M5219 (G-pPLa-HFIF-67-i2A 19) L^DSM 1853J HFIP-Gs E. coll M5219 (G-pPLc-HFIF-67-8) IjDSM 1854] FMDT-A: E. coli °&(*_rex - pPL-VPl-1) [DSM 1879J FMDV-B: E. coli MFl (λ H cixTcI^-pPL-VPl-l) EdSM 188OJ FMDV-G: E. coli ITFl (λ U"cro"cI_ta-pPL-VPl-5) LDSM 1881T

Die Kultaren HFIF-D bis HFIF-G wurden am 5. Juni 1980 hinterlegt. Die Kulturen FMDV-A bis FMDV-G wurden am 31. Juli 1980 hinterlegt·

Nachdem eine Reihe von erfindungagemäßen Ausführungsformen vorgestellt norden iat, iat klar, daß die grundlegende Konstruktion zur Schaffung anderer Aufführungsformen verändert werden kann, ^obei die erfindungagemäßen Verfahren und erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendet werden» Daher soll der Geltungsbereich der Erfindung durch die beigefügten Ansprüche und nicht durch die oben anhand von Beispielen dargelegten Ausführungsformen festgelegt werden.

Claims (8)

14 469 55 Erfindungsanspruch:

1· Verfahren zur Erzeugung eines verbesserten Cloningvektors, gekennzeichnet dadurch, daß in ein vorhandenes Cloningvehikel mindestens eine DNA-Sequenz eingefügt wird, die mindestens einen von BakteriophageΛ. abgeleiteten und aus P_RO~ oder P, O. bestehenden Promotor oder Operator aufweist, und in dem Cloningvehikel mindestens eine Endonuclease-Erkennungsstelle geschaffen wird, die weniger als etwa 300 Basenpaare von dem aus dem Promotor und Operator bestehenden Abschnitt der DNA-Sequenz entfernt ist·

2· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß jedes in der DNA-Sequenz vorhandene aktive cro-Gen oder aktive N[-Gen inaktiviert wird.

3« Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Erkennungsstelle EcοRI, BaroHI, HindIII, Psti, Xba oder SaI aufweist.

4. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß die Erkennungsstelle weniger als etwa 150 Basenpaare von dem aus dem Prombtor und Operator bestehenden Abschnitt der DAN-Sequenz entfernt ist.

5· Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß in den Vektor eine Ribosom-Bindestelle eingefügt wird.

6. Verfahren nach Punkt 5, gekennzeichnet dadurch, daß-die Ribosora-Bindestelle von Bakteriophage MS2 Replikase abgeleitet ist*

7. Verfahren nach einem der vorstehenden Punkte, gekennzeichnet dadurch, daß in einer der Endonuclease-Erkennungsstellen eine für eukaryothisches, prokaryotisches oder Virusprotein, PoIypeptid, Enzym, Hormon, Antigen oder ein Fragment davon kodierende DNA-Sequenz enthalten ist.

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8. Verfahren- nach Punkt 7, gekennzeichnet dadurch, daß die DNA-Sequenz für Leucozyten-Interferon, Jlbroblast-Interferon, Immun-Intärfe*on, Insulin, Humanwaciistumshoimon, irieüwachstumshoimon oder Antigene von Hepatitis, Maul- und Klauenseuche ode* andere Viren kodiert ist.

Hierzu -/f Seite/z ZeichnungtP/2