DD153999A5 - Verfahren zur herstellung von substanzen mit carcinostatischer und immunstimulierender wirkung - Google Patents
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Abstract
Es werden neue Substanzen mit carcinostatischer und immunostimulierender Wirkung geschaffen. Die neuen Substanzen werden aus einer Kultur oder deren ueberstehender Fluessigkeit erhalten, die durch Kultivieren von Bakterien hergestellt wurde, die zu Fusobacterium gehoeren. Die genannten Substanzen sind zur Behandlung von Krebserkrankungen bei Saeugetieren, einschliesslich des Menschen, brauchbar. Diese Erfindung betrifft derartige Substanzen, ein Verfahren zur Herstellung derselben und carcinostatische Mittel mit einem Gehalt derselben.
Description
Berlin.» den .8.4.1981 Ap G 12
58 040/12
J 4@^ Ap G 12 D/223
Verfahren zur Herstellung earcinostatischer Substanzen Amvsndungsaebiet dar Erfindung.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen Substanzen mit carcinostatischer und die'Immunreaktion stimulierender Wirksamkeit«, Das Verfahren umfaßt die Kultivierung von 7F~Substanz~preduzierenden ßakterieni die zur Gattung Fusobocterium gehören, unter anaeroben Bedingungen und die Isolierung der resultierenden Substanzen von der Kultur oder deren überstehender Flüssig« keit (die genannte neue Substanz wird im folgenden als 15TF-Substanz" bezeichnet)« Man erhält dabei die TF~Sub~ stanzen einschließlich dor im folgenden beschriebenen TF 110, 120, 130 (1316,.132at- 132b, 133a, 133b, 1323, 136), 140 und i5Oe
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
In den letzten Dshren wurden in verstärktem Maße Heilmittel zur Behandlung von Patienten mit verschiedenen Krebstypen eingesetztf die immunologische Funktionen des Wirtes verstärken und einen carcinostatischen Effekt mit Hilfe der immunologischen Funktion erzielen« Unter den Antitumormitteln, die für derartige Heilmittel verwendet wurden, sind bekannte Komponenten, die von Organismen verschiedener Bakterien oder aus Kulturen verschiedener Bakterien erhalten wurden* Es sind darunter auch Polysaccharide^ die aus Fruchtkörporn von Basidiomycetes oder kultivierten Pilzkörpern derselben erhalten wurden«. Dies© Antitumorrnittel
8*4*1981
AP e 12 D/223 453 2 « 58 040/12
sind jedoch bisher nicht befriedigend 9 und zwar hinsichtlich ihrer Wirksamkeit, schädlicher Neboneffekte und hin~ sichtlich des Herstellungsverfahrens«,
Andererseits gibt es Berichte über Organismen und eine überstehende Flüssigkeit, die durch Kultivierung von Bakterien erhalten wurden, die zur Fusobacteriurn-Gattung gehören, wie zum Beispiel Fusobacterium l<031~38, Fuso« bacterium fusifomis tö/«12, Fusobacterium girans 1012 und Fusobacterium nucleatuin 1010 ^Dental Surgery, 2J3* 322-333 (1974.), und 2I1, 534-539 (1972) (japanisch)!. Es wurde bisher jedoch noch keine Untersuchung der Komponenten durchgeführt,'die aus einer Kultur oder deren überstehen" der Flüssigkeit erhalten wurde, welch© durch Kultivierung von Bakterien hergestellt wurde, die zu. Fusobacterium gehören» Es wurden weiterhin auch noch keine pharmakologi sehen Aktivitäten der Komponenten untersucht«
Es ist Ziel der Erfindung, den Stand der Technik durch neue Carcinoistatika zu bereichern,»
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zu schaffen* bei dem ein zu Fusobacterium gehörendes Bakterium unter anaeroben Bedingungen kultiviert wird und neue TF~Substanzen mit carcinostatischen und immunostimulierenden Aktivitäten aus der resultierenden Kultur oder der überstehenden Flüssigkeit derselben.isoliert werden« Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, die genannten
. 8.4.1981
AP C 12 D/223 463. - 3 - 58 040/12
TF~Substanzen zur Verfügung zu stellen« Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, ein carcinostatisches Mittel mit einem Gehalt der genannten TF«Substanzen zu schaffen*
Es wurde die pharraakoXogische Aktivität einer überstehen« den Flüssigkeit untersucht, die durch·Kultivierung von Bakterien* die zu Fusobacterium gehören, und durch Abtrennung des Organismus von der Kultur erhalten wurde* Dabei wurde gefunden, daß eine spezifische? aus der über« stehenden Flüssigkeit erhaltene Komponente eine carcinostatische Aktivität aufweist. Es wurde weiterhin gefun«· deny daß diese Komponente im wesentlichen keine Hemmwirkung auf die Bildung einer Kolonie von Krebszellen be.l einem Kolonie-Schaumbildungsassay-Verfahren aufweist und daß die Komponente nicht dadurch eine carcinostatische Aktivität aufweist, daß sie Krebszellen -abtötet, sondern daß die Komponente eine indirekte carcinostatische Aktivität zeigt, indem sie nämlich die Antitumor-Aktivität des mit dem Medikament behandelten Wirts oder die Immunität des Wirts erhöht und sich auf diese Weise die Hilfe der Immunität zunutze machte
Es wurde weiter gefunden, daß die genannte Komponente eine sehr geringe Toxizität aufweist und auch durch Behandeln der Kultur erhalten werden kann«
Als erfindungsgemäß verwendetes Bakterium kann irgendein TF~>Substanz~produziersnde8 Bakterium e das zu Fusobacterium .gehört, verwendet werden« Beispielsweise wird
2'23 4 63 . ·
Fusobacterium nucleatum vorzugsweise verwendet. Im konkreten Fall wird Fusobacterium nucleatum TF-O31 (FERM 5077; ATCC 31647) oder dergl. verwendet.
Die bakteriologischen Eigenschaften von Fusobacterium nucleatum TF-031 sind wie folgt.
(I) Form
(1) Form der Zellen: spindelförmig (Fig. 1)
(2) Polymorphie der Zellen: fehlt
(3) Beweglichkeit: fehlt
(4) Sporen: fehlen
(5) Gram- Färbung: gramnegativ
(6) Säurebeständigkeit: negativ
(II) Wachstumsbedingungen in einem Kulturmedium
(1) TF»a Agarplatte und geneigtes Kulturmedium äußere Form: rund
Größe: etwa 1 mm Protuberanzi hemisphärische Form
Struktur? tautropfenartig :
Oberflächer glatt Kanten: glatt Farbe: milchig gelblich-weiß Transparenz: opak
(2) TF-a flüssiges Kulturmedium Wachstumsgrad: heftig Trübung: Koagulum Präzipitat: keines
Wachstum an der Oberfläche: keines, kein Wachstum
bis zu einer Tiefe von ca.5 mm . Gas: keines .
(III) Physiologische Eigenschaften
(1) Produktion von Hydrogensulfids +
(2) Reduktion von Nitraten; -
(3) Produktion von Buttersäure: + .
(4) Produktion von Indol: +
(5) Urease; -
(6) Catalase: -
(7) Hydrolyse von Stärke: -
(8) Verhalten gegenüber Sauerstoff; anaerob
(9) Produktion von Ammoniak: +
(10) Produktion von Kohlendioxid: +
(11) Wachstumsbereich: pH 5 bis 8,5» Temperatur 30 bis
450C
(12) Gasbildung aus Sacchariden:
L-Arabinose (-), D-XyIose (-), D-Glucose (-), D-Mannose '(-), D-Fructose (-), D-Galactose (-), Malzzucker (-), Saccharose (-), Trehalose (-), Sorbit (-), Mannit (-), Inosit (-), Glycerin (-) t Stärke (-).
Die neuen TF-Substansen gemäß der vorliegenden Erfindung werden beispielsweise folgendermaßen hergestellt.
Kultur von TF-Substanz liefernden Bakte« rien.die. zum Fusobacterium-.Stamm-gehören.]
hydrophiles organisches Lösungsmittel
Kultur oder ihre 1
lösliche Fraktion
unlösl. Fraktion
Trocknen L·-
TF-1OO - - _
äußere Lösung
£2 TF-TiO
unadToFb ιer te Fraktion
Entsalzen
Trocknen
TF-120 Stehenlassen
Abtrennung
Präzipitat
Pho sphatpuffer (Natriumchlo rid) oder Wasser
Abtrennung
wasserlösliche Fraktion
/15ialyse oder . Ultrafiltration
innere Lösung
Behandlung mit Ionenaustausch,
Eluat
Pho sphatpuffer (Natriumchlorid)
Konzentration
Sntsalzen
Trocknen
TF-130 (TF-1316. 132a, 132b,
133a, 133b, 1323, 136)
Kultur oder ihre überst.Flüssigkeit
wasserlösl. Fraktion" Trocknen
TF-100
Herstellung d. Bariumsalzes
Abtrennung
Bariumsalz Bariumionen1
Lösung
Bariuraent= _fernung_
Abtrennung
Lösung
Dialyse oder Ultrafiltration
Konzentration Fests
töfFl
Trocknen-
TF-140
Yfasserlösliehe Fraktion
Tosliche
Fraktion
Natriumchlorid ent haltende Lösung
hydrophiTes organi-j sches Lösungsmittel
lösliche Fraktior innere Lösung
Trockn.
Behandlung mit ei nem quaternären Ammoniumsalζ
ein quaternärer Ammo· niumltomplex
Dissoziationsverfahren
lösliche Fraktion
Abtrennung
Waschlösungen
TF-11O
Präzipitat
Trocknen
TF»150
223 4 63 ' . ;'". · ;
Das oben erwähnte Herstellungsverfahren wird, im folgenden näher erläutert.
(T) Kultivierung des Bakteriums
Die Kultivierung des zu: Fusobacteriura ' gehörenden Bakteriums wird mittels eines herkömmlichen Verfahrens -zur Kultivierung anaerober Bakterien durchgeführt. Das Heißt, es wird ein Kulturmedium verwendet j das eine Stickstoff« quelle, wie Kalbshirn-Herz-Extrakte, verschiedene Peptone oder dergl.; eine Vitaminquelle, wie Hefeextrakt oder dergl.; ein anorganisches Salz, wie Natriumchlorid oder dergl,; eine Kohlenstoffquelle, wie Glucose, Lactose oder dergl.; ein Reduktionsmittel, wie L-Cystin, Natriumsulfit, Thioglykollat oder dergl., enthält. Das Medium wird auf einen pH von 6 bis 8,5 und vorzugsweise 7,2 bis 8,2 eingestellt und die Bakterien werden dem Kulturmedium einge~ impft. Daraufhin wird eine Kultivierung im Fließgleichgewicht (steady-state-Kultivierung) unter anaeroben Bedingungen bei 35 bis 420C und vorzugsweise bei 36 bis 38°C während 1 bis 5 Tagen und vorzugsweise während 24 bis 72 Stunden durchgeführt.· Es ist insbesondere wünschenswert, das in der Tabelle 1 beschriebene Kulturmedium (im folgen-. den als "TF-KuIturmedium" bezeichnet) zu verwenden. Die Hirn-Herz-Infusion, bei der es sich um einen Kalbshirn-Herz-Extrakt handelt, ist jedoch nicht immer als Kohlen» .stoffquelle notwendig und kann durch eine Herzinfusion ersetzt werden, bei der es sich um einen Kalbsherzextrakt handelt, sowie durch einen Rindfleischextrakt, einen Fischextrakt, durch Maisquellwasser oder dergl. ersetzt werden« Unter den verschiedenen Peptonen sind Proteosepepton und Phytonpepton nicht immer notwendig. Das Trypticasepepton kann durch ein Polypepton ersetzt werden.
Falls Agar nicht verwendet wird, so ist es wünschenswert, eine Kultivierung unter Rühren durchzuführen.
| - 10 - | TF-b | TF-c | |
| Tabelle 1 | 17 | 17 | |
| Bestandteile des Kultur | 3 | 1,5 | |
| mediums (g/l) | TF-a | 5 | 5 |
| Trypticasepepton | 17 | 17,5 | - |
| •Phytonpepton | 3 | - | 25 |
| Proteosepepton | 10 | 3 | 3 · |
| Hirn-Her z-Inf.usionsbruhe | 35 ' | 7,5 | 7»5 |
| Herz-Infusionsbrühe | - . | 6 | 6 |
| Hefeextrakt . · | 3 | 5 | 5 |
| Natriumchlorid | 7,5 | 0,5 | 0,5 |
| Glucose | 6 | 0,1 | 0,1 |
| Lactose | 5 | 0,5 | '. 0,5 |
| L-Cystin | 0,25 | 0 oder 0,7 | 0 oder 0,7 |
| Natriumsulfit | 0,1 | ||
| Thioglykollat | 0,5 | ||
| Agar · 0 | oder 0,7 | ||
(2) Isolierung einer überstehenden Flüssigkeit von der Kultur (Entfernung der Organismen)
Die Organismen v/erden von der oben erhaltenen Kultur abgetrennt, um eine überstehende Flüssigkeit zu erhalten. Die Abtrennung der Organismen kann mittels eines herkömmlichen Verfahrens erfolgen. Beispielsweise kommt ein Zentrifugieren und ein Filtrierverfahren unter Verwendung eines Filtrierhilfsmittels, wie Hyflo Super CeI, in Frage. Unter dem Gesichtspunkt von Verfahrensführung, dem Grad der Abtrennung der Organismen und der Ausbeute an überstehender Flüssigkeit wird insbesondere ein Zentrifugierverfahren bevorzugt. Die Organismen werden vorzugsweise bei dieser Verfahrensstufe entfernt, sie können jedoch auch in einer nachfolgenden Verfahrensstufe (3) entfernt werden.
(3) Isolierung der carcinostatischen Substanz TF-1.00
Der oben erhaltenen, überstehenden Flüssigkeit oder-der Kultur wird ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel zu-
gesetzt, und das dabei gebildete Präzipitat wird aufgefangen. Zu diesem Zeitpunkt ist der pH der überstehenden Flüssigkeit oder der Kultur vorzugsweise auf pH 2 bis 7 eingestellt. Die hydrophilen, organischen Lösungsmittel umfassen z.B. Alkohole, wie Äthanol, Methanol oder dergl., und Ketone, wie Aceton und dergl., wenn auch Alkohole, insbesondere Äthanol, zu den besten Ergebnissen führen. Das hydrophile, organische Lösungsmittel wird in zweckentsprechender V/eise zugesetzt, so daß seine Konzentration 30 bis 70 Vol~# und insbesondere 50 bis 70 Vol-% ausmacht. Nach der Zugabe des hydrophilen, organischen Lösungsmittels wird das resultierende Gemisch bei niedriger Temperatur, vorzugsweise bei etwa 50C, mehrere Stunden bis einige Tage stehengelassen, um die Bildung des Präzipitats zu vervollständigen. Das auf diese Weise gebildete Präzipitat wird mittels herkömmlicher Verfahren, wie mittels Dekantieren, Zentrifugieren, Filtrieren und dergl., abgetrennt.
Anschließend wird Wasser in einer Menge von dem iO- bis 15fachen des oben erhaltenen Präzipitats demselben zugesetzt [das Wasser kann durch einen Phosphatpuffer oder' durch einen Natriumchlorid enthaltenden Phosphatpuffer ersetzt werden, falls beabsichtigt wird, TF-120 oder 130 (1316, 132a, 1?2b, 133a, 133b, 1323 oder 136) zu erhalten, wie im folgenden noch näher beschrieben wird]. Die gebildeten, wasserunlöslichen Materialien werden mittels eines herkömmlichen Verfahrens, wie mittels Zentrifugieren, Filtrieren oder dergl., abgetrennt, worauf die wasserlösliche Fraktion aufgefangen wird. Falls die Kultur verwendet wird, werden die Organismen mittels der oben erwähnten Verfahren entfernt. Die auf diese Weise erhaltene, wasserlösliche Fraktion wird mittels Lyophilisation (Gefriertrocknung) oder dergl. getrocknet. Dabei erhält man eins carcinostatische Substanz TF-100. Das so erhaltene TF-100 hat die in Tabelle-2 aufgeführten Eigenschaften.
(4) Isolierung der carcinostatischen Substanz TF-11O
Die in der obigen Stufe (3) erhaltene,.wasserlösliche Fraktion wird einer Dialyse oder Ultrafiltration unterworfen. Alternativ wird TF-1OO in V/asser aufge3. öst, und zwar in einer. Wassermenge von dem 10- bis 15fachen des TF-100, und die resultierende .Lösung wird der Dialyse oder Ultrafiltration unterworfen. Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht, wie Aminosäuren und anorganische Materialien, werden mittels der oben erwähnten Behandlung entfernt. Die bei der Dialyse oder Ultrafiltration erhaltene, innere Lösung wird aufgefangen und danach getrocknet, wobei man eine carcinostatische Substanz TF-110 erhält. Das auf diese Weise erhaltene TF-110 hat die in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften«
(5) Isolierung der carcinostatischen Substanz TF-120
Die in der obigen Stufe 3 erhaltene, wasserlösliche Fraktion oder gegebenenfalls die innere Lösung, die bei der Durchführung der Dialyse oder Ultrafiltration der wasserlöslichen Fraktion erhalten wurde (die innere Lösung, die in der obigen Stufe (4) erhalten wurde), oder eine Lösung eines Pulvers aus TF-110 in einer geringen Menge Wasser wird mit einem Ionenaustauscher behandelt. Als Ionenaustauscher wird ein schwach basischer Ionenaustauscher oder ein schwach basischer Ionenaustauscher mit Molekularsiebwirkung vorzugsweise verwendet. Beispielsweise ist Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 (Warenzeichen von Pharmacia Co., Ltd.) zur Verwendung geeignet·. Eine mit einem Ionenaustauscher gepackte Säule wird äquilibriert, und zwar beispielsweise mit einem Phosphatpuffer mit einem pH von etwa 8. Daraufhin wird die oben erwähnte Lösung, die behandelt werden soll, durch die .Säulen laufenlassen und die eluierte Lösung wird aufgefangen und anschließend mittels Gefriertrocknung oder dergl. getrocknet. Alternativ
223 463 . .
werden der gleiche Puffer, wie er oben verwendet wurde, und die zu behandelnde Lösung in ein Gefäß gegeben, das einen Ionenaustauscher enthält. OqT Inhalt wird gerührt *und anschließend wird filtriert, woraufhin.das Filtrat getrocknet wird. Auf diese Weise kann eine carcinostatisehe Substanz TF-120 mit den weiter unten beschriebenen Eigenschaften erhalten werden. TF-120 kann auch durch Entsalzen der eluierten Lösung oder des Filtrats, z.B. mittels Dialyse unter Verwendung eines Cellophanrohrs oder dergl.,unter Verwendung von Sephadex G-25 (Warenzeichen von Pharmacia Co., Ltd.) oder mittels Ultrafiltration und anschließendem Trocknen des Filtrats erhalten werden. Das auf diese Weise erhaltene TF-120 hat die in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften.
(6) Isolierung der carcinostatischen Substanz TF-13O
Eine Säule, die die adsorbierten Komponenten enthält, aus denen TF-120 mittels der Behandlung der obigen Stufe (5) entfernt wurde, wird mit einem Phosphatpuffer behandelt, und zwar vorzugsweise einem Phosphatpuffer mit einer. Natriumchloridkonzentration von 0,1 bis 0,6 M und einem ppi von etwa 8 (der Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,1 bis 0,6 M wird im folgenden als "0,1 bis 0,6 M Nati'iumchlorid-Phosphatpuffer" bezeichnet). Alternativ wird die in der obigen Stufe (3) erhaltene, wasserlösliche Fraktion, gegebenenfalls nach Dialyse oder Ultrafiltration, der Behänd!ung mit einem Ionenaustau~ scher unter Verwendung eines 0,1 bis 0,6 M Natriumchlorid-Phosphatpuffers unterworfen. Man erhält auf diese Weise eine Fraktion, die nicht mit einem Phosphatpuffer eluiert wird, der frei von Natriumchlorid ist, aber andererseits mit einem 0,1 bis 0,6 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wird. .
Dieses Verfahren kann entweder in einem Säulensystem oder chargenweise durchgeführt v/erden. Die angestrebte Fraktion, die auf diese Weise erhalten wird und die mit dem Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, wird mittels Gefriertrocknung oder dergl. getrocknet, wobei man eine ' carcinostatische Substanz TF-13O erhält. Das die angestrebte Fraktion enthaltende Eluat, das mit dem zuvor_erwähnten Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, kann entsalzt werden,, und zwar beispielsv/eise mittels Dialyse unter Verwendung eines Cellophanrohrs, durch Molekularsiebung unter Verwendung von Sephadex G~25 oder durch Ultrafiltration, und kann anschließend getrocknet werden.
Der hier verwendete Ausdruck "TF-13O" bezeichnet umfassend alle angestrebten, eluierten Fraktionen, die durch Behandlung der in der obigen »Stufe (3) erhaltenen, wasserlösli» . chen Fraktion oder gegebenenfalls der Komponente der inneren Lösung, die durch Dialyse oder' Ultrafiltration der wasserlöslichen Fraktion erhalten wurde, mit einem Ionenaustauscher erhalten v/erden, und zwar alle solche Fraktionen, die nicht mit einem Phosphatpuffer, der frei von Natriumchlorid ist, eluiert v/erden, aber andererseits mit einem 0,1 bis 0,6 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert werden. TF-130 umfaßt konkret beispielsweise folgende Fraktionen.
(i) Eine Fraktion, die nicht mit einem von Natriumchlorid freien Phosphatpuffer eluiert wurde, jedoch mit einem 0,6 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer bei der oben erwähnten Ionenaustauscherbehandlung eluiert wird (die Fraktion wird als "TF-1316" bezeichnet).
(ii) Eine Fraktion, die nicht mit einem 0,1 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, jedoch mit einem 0,2 M NatriumchlorId--Phosphatpuffer bei der oben
erwähnten Ionenaustauscherbehandlung eluiert wird [die Fraktion wird als *'TF-132a und b" bezeichnet; die TF-132a-Fraktion wird erhalten, indem man einen Ionenaustauscher, der die zuvor erwähnte adsorbierte Komponente enthält, mit einem 0,1 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer·· wäscht, den Ionenaustauscher mit einem 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer behandelt und anschließend die Fraktion auffängt, die mit dem 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wird; die TF-132b-Fraktion wird erhalten, indem man die in der obigen Stufe (3) erhaltene, wasserlösliche Fraktion oder die in der obigen Stufe (4) erhaltene Komponente der inneren Lösung (TF-110) mit einem Ionenaustauscher behandelt].
(iii) Eine Fraktion, die nicht mit einem·0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, jedoch mit einem 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer bei der obigen Ionenaustauscherbehandlung eluiert wird (die Fraktion wird als "TF-133a und b" bezeichnet·; a und b haben jeweils die gleiche Bedeutung,wie im Falle von TF~132a und b definiert).
(iv) Eine Fraktion, die nicht mit einem 0,1 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, jedoch bei der obigen Ionenaustauscherbehandlung mit einem 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wird (die Fraktion wird als "TF-1323" bezeichnet).
(v) Eine Fraktion, die nicht mit einem 0,5 M · Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, jedoch bei der obigen Ionenaustauscherbehandlung mit einem 0,6 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wird (die Fraktion wird als "TF-136" bezeichnet).
Da diese Substanzen TF-1316, 132a, 132b, 133a, 133b, 1323 und 136 in folgender Hinsicht gemeinsame Eigenschaften aufweisen, werden die Substanzen mit den gemeinsamen Eigenschaften als " TF-130" bezeichnet. Das heißt, das
3 4 63
auf die oben erwähnte Weise erhaltene TF-I30 v/eist folgende Eigenschaften auf;
(a) Grauweiß-hollbraunes Pulver.
(b) Es inhibiert das Wachsturas von Ehrlich ascites-Tumor bei Mäusen, Ehrlich festem Tumor und Sarcoma-180 Carcinom und es besitzt eine imraunostimulierende Aktivität. ·
(c) Es ist in Wasser löslich und unlöslich in Methanolr Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthyläther.
(d) Es hat keinen scharfen Schmelzpunkt, beginnt sich bei etwa 1100C zu zersetzen und zersetzt sich bemerkenswert, deutlich über 2000C.
(e) Sein Infrarot·™Absorptionsspektrum, das mittels eines'Verfahrens unter Verwendung von KBr-Tabletten erhalten wurde, zeigt Absorptionsbanden in der Nähe von 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 und 820 cm"1. . .
(f) Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum seiner wäßrigen -Lösung zeigt eine starke Absorption an der Absorptionskante und einen Absorptionspeak in der Nähe von 256-280 nm.
(g) Es zeigt eine positive Molisch-Reaktion, Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktlon, Indol-Chlorv/asserstoffsäure-Reaktion und Lowry-Folin's-Reaktion; seine Ninhydrin-Reaktion ist negativ.
(h) Elementaranalysen-Wertes C 27f5 bis 39,8°/; H 3,2 bis 5*7% N 2,8 bis 6,396.
(i) Sein Saccharidanteil» bestimmt mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens, beträgt etwa 19,0 bis etwa 64,0 Gew.% (ausgedrückt als Glucose), und sein Proteingehalt, bestimmt mittels des Lovrry-Folin-Verfahrens, liegt in der Nähe von 6,0 bis 28,0 Gew.95 (ausgedrückt als Kalbserumalbumin).
223 4β3 ' : . .
Die oben erwähnte Ionenaustauscherbehandlung wird im folgenden noch näher erläutert. Als Ionenaustauscher bei den .folgenden Verfahren wird vorzugsweise ein schwach basischer Ionenaustauscher oder ein schwach basischer Ionenaustauscher mit Molekularsiebwirkung verwendet. Beispielsweise eignet sich das in der obigen Stufe (5) verwendete Diäthylaminoäthyl-Sephadsx A-50, und es kann folgendes Verfahren in einem Chargensystem durchgeführt werden.
(i) ein 0,6 M Natriumchlorid-Phpsphatpuffer, der vorzugsweise einen pH von etwa 8 aufweist, wird durch eine Säule eines die adsorbierten Komponenten enthaltenden Ionenaustauschers,durch den die zu behandelnde Lösung in der obigen Stufe (5) laufenlassen.wurde, hindurchgeleitet und die eluierte Fraktion wird aufgefangen. Die Fraktion wird gegebenenfalls konzentriert und mittels Dialyse, Ultrafiltration oder dergl. entsalzt und anschließend mittels Gefriertrocknung oder dergl. getrocknet, wobei man eine carcinostatische Substanz TF-1316 erhält. Das auf diese Weise erhaltene TF-1316 hat die in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften»
(ii)-1) Ein 0,1 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer, der vorzugsweise einen pH von etwa 8 auf v/eist, wird durch eine Säule eines Ionenaustauschers, enthaltend die nach Durchlaufen der zu behandelnden Lösung in der obigen Stufe (5) adsorbierte Komponente, durchlaufen lassen, um die Säule zu waschen. Daraufhin wird ein 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer, der vorzugsweise einen pH von' etwa 8 aufweist, durch die Säule laufenlassen und die eluierte Fraktion wird aufgefangen, gegebenenfalls konzentriert und mittels Dialyse, Ultrafiltration oder dergl. entsalzt und anschließend mittels Gefriertrocknung oder dergl. getrocknet j wobei man eine carcinostatische Substanz TF-1J'2a erhält. Das auf · diese Weise erhaltene TF-132a hat die in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften.
(ii)~2) Unter Verwendung der in Stufe (3) erhaltenen, wasserlöslichen Fraktion oder der in Stufe (4) erhaltenen, inneren Lösung werden auf die folgende Weise Verfahren zur Isolierung der Fraktion durchgeführt, die nicht mit einem 0,1 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer- eluiert wurde, jedoch mit einem 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer bei der Ionenaustauscherbehandlung eluiert wird. Auf.diese Weise wird TF-132b erhalten. Das heißt, die mit dem Ionenaustauscher bepackte Säule wird mit einem 0,2 bis 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer, der vorzugsweise einen pH von etwa 8 aufweist, äquilibriert. Daraufhin wird der zuvor erwähnte 0,2 bis 0,3 M Natriuinchlorid-Phosphatpuffer der in der obigen Stufe (3) erhaltenen, wasserlöslichen Fraktion oder die durch'Behandeln der wasserlöslichen Fraktion mittels Dialyse oder Ultrafiltration erhaltene Komponente der inneren Lösung durch die Säule laufenlassen und.die eluierte Lösung wird aufgefangen. Gegebenenfalls wird die Säule mit dem erwähnten 0,2 bis 0,3 M . Natriumchlorid-Phosphatpuffer gewaschen und die eluierte Lösung und die V/aschlösungen werden kombiniert. Die Behandlung mit dem Ionenaustauscher kann mehrere Male durchgeführt werden. Anschließend wird eine Lösung, die durch Verdünnen der oben erwähnten, eluierten Lösung mit einem Phosphatpuffer in der V/eise hergestellt wurde, daß die Natriumchloridkonzentration 0,1 M sein kann, durch eine Säule laufenlassen, in der der Ionenaustauscher mit 0,1 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer, der vorzugsweise einen pH von etwa 8 aufweist, äquilibriert wurde. Die Fraktion, die mit dem oben erwähnten 0,1 M Natriumchlorid-Phosphat-.puffer eluiert wurde, wird entfernt und anschließend wird der oben erwähnte 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer durch die Säule geleitet, um ein Eluat zu erhalten. Bei dem konkreten Beispiel der oben erwähnten Behandlung mit dem Ionenaustauscher wird eine Fraktion aufgefangen, die nicht an einem Ionenaustauscher adsorbiert wurde, der mit
dem oben erwähnten 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer äquilibriert wurde-, mit dem oben erwähnten 0,1 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer gewaschen wurde und anschließend mit dem oben erwähnten 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, um ein Eluat zu erhalten. Es kann auch ein Verfahren angewendet werden, bei dem umgekehrt die Fraktion, die auf einem Ionenaustauscher adsorbiert wurde,. der mit dem oben erwähnten 0,1 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer äquilibriert wurde, aufgefangen wird und bei dem anschließend ein Verfahren zur Abtrennung der genannten Fraktion aus einer Fraktion durchgeführt wird, die auf einem Ionenaustauscher adsorbiert wurde , der mit dem oben erwähnten 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer äquilibriert wurde, und wobei eine Fraktion, die mit dem oben erwähnten 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, aufgefangen wird.
Anschließend wird das auf die oben beschriebene Weise erhaltene Eluat gegebenenfalls konzentriert und mittels Dialyse, Ultrafiltration oder dergl. entsalzt und daraufhin mittels Gefriertrocknung oder dergl. getrocknet, um eine carcinostatische Substanz TF-132b zu erhalten. Das auf diese Weise erhaltene TF-132b hat die in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften.
(iii)-i) Die in der obigen Stufe (4) erhaltene Komponente der inneren Lösung wird durch eine Säule aus einem Ionenaustauscher laufenlassen, der mit einem Phosphatpuffer äquilibriert ist, welcher vorzugsweise einen pH von etwa 8 aufweist. Ein 0,2 M'Natriurachlorid-Phosphatpuffer mit einem pH von vorzugsweise etwa 8 wird durch die genannte Säule laufenlassen, um die Säule zu waschen, und anschließend wird 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer mit einem pH von vorzugsweise etwa 8 durch die Säule geleitet. Alternativ wird der oben erwähnte 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer durch die Säule geleitet, die in
der obigen Stufe (ii)-1) behandelt wurde und noch die restliche, adsorbierte Komponente auf v/eist. Die eluierte Fraktion wird aufgefangen, gegebenenfalls konzentriert, mittels Dialyse, Ultrafiltration oder dergl. entsalzt und dann mittels Gefriertrocknung oder dergl. getrocknet, wobei man eine carcinostatische Substanz TF-133a erhält. Die so erhaltene Substanz TF-"T33a besitzt die in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften.
(iii)-2) Die Fraktion, die nicht mit einem 0,2 M " Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, jedoch mit einem 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer bei der lonen™ .austauscher-behandlung eluiert wird, wird auf die folgende Weise aufgefangen, um TF-133b zu erhalten. Dabei.handelt es sich um das gleiche Verfahren wie bei der obigen Stufe (ii)-2). Das heißt, die mit dem Ionenaustauscher bepackte Säule wird mit einem 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer, der vorzugsweise einen pH von etwa 8 aufweist, äquilibriert. Daraufhin wird der oben erwähnte 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer der in der obigen Stufe (3) erhaltenen, wasserlöslichen Fraktion oder es wird die durch Behandeln der wasserlöslichen Fraktion mittels Dialyse oder Ultrafiltration erhaltene Komponente der inneren Lösung durch die Säule laufenlassen und die eluierte Lösung wird aufgefangen. Gegebenenfalls wird die Säule mit dem oben erwähnten 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer gewaschen und die eluierte Lösung und die Waschflüssigkeiten werden kombiniert. Die lonenaustauscherbehandlung kann mehrere Male durchgeführt werden. Danach wird eine Lösung, die in der Weise' durch Verdünnen der zuvor erwähnten eluierten Lösung mit einem Phosphatpuffer hergestellt wurde, daß die Natriumchloridkonzentration 0,2 M betragen kann, durch eine Säule laufenlassen, in der der Ionenaustauscher mit einem Q,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer mit vorzugsweise einem pH von etwa 8 äquilibriert wurde„ Die Fraktion, die mit dem zuvor erwähnten
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0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, wird entfernt, woraufhin der zuvor erwähnte 0,3 M Natriurachlorid-Phosphatpuffer durch die Säule geleitet wird, um ein Eluat zu erhalten. In dem konkreten Beispiel der oben erwähnten Ionenaustauscherbehandlung wird eine Fraktion aufgefangen, die nicht an einem Ionenaustauscher adsorbiert wurde, der mit dem oben erwähnten 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer äquilibriert wurde, an einem Ionenaustauscher adsorbiert wurde, der mit dem zuvor erwähnten 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer äquilibriert wurde, . mit dem zuvor erwähnten 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer gewaschen wurde und anschließend mit dem oben erwähnten 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, um ein Eluat zu erhalten. Es kann auch ein Verfahren angewendet werden, bei dem umgekehrt eine Fraktion aufgefangen wird, die auf einem Ionenaustauscher adsorbiert wurde, der mit dem obengenannten 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer äquilibriert wurde,und bei dem anschließend ein Verfahren zur Abtrennung der genannten Fraktion von einer Fraktion durchgeführt wird, die auf einem Ionenaustauscher adsorbiert wurde, welcher mit dem oben erwähnten 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer äquilibriert wurde, wobei eine Fraktion aufgefangen wird,, die mit dem obengenannten 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde.
Anschließend wird das auf die oben beschriebene Weise erhaltene Eluat gegebenenfalls konzentriert und mittels Dialyse, Ultrafiltration oder dergl. entsalzt und nachfolgend mittels Gefriertrocknung oder dergl, getrocknet, um die angestrebte carcinostatische Substanz TF-133b zu erhalten. Das auf diese Weise erhaltene TF-133b hat die in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften.
(iv) Die in der obigen Stufe (3) erhaltene, wasserlösliche Fraktion oder die in der obigen Stufe (4) erhaltene Komponente der inneren Lösung wird in einen 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer mit einem pH' von vorzugsweise etwa 8 überführt und der auf diese -Weise erhaltene Puffer wird durch eine Ionenaustauschersäule laufenlassen, die zuvor mit einem 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer mit einem pH von vorzugsweise etwa 8 äquilibriert wurde. Die eluierte Lösung wird durch Zugabe eines Fhosphatpuffers in der Weise eingestellt f daß die Natriumchloridkonzentration 0,1 M betragen kann» Anschließend wird die Lösung durch eine lonenaustauschersäule geleitet, die zuvor mit einem 0,1 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer mit· einem pH von vorzugsweise etwa 8 äquilibriert wurde, und anschließend .wird der oben erwähnte 0,3 M Natriumchlorid-Phosphätpuffer durch die genannte Säule geleitet, woraufhin die eluierte Fraktion aufgefangen wird, gegebenenfalls konsntricrtund mittels Dialyse', Ultrafiltration oder dergl. entsalzt wird und anschließend mittels Gefriertrocknung oder dergl. getrocknet wird, um eine carcinostatische Substanz TF-1323 zu erhalten. Das auf diese Weise erhaltene TF-1323 hat die in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften.
(v) Die in der obigen Stufe (4) erhaltene Komponente der inneren Lösung wird durch eine Säule eines Ionenaustauschers laufenlassen, der mit einem Phosphatpuffer mit einem pH von vorzugsweise etwa 8 äquilibriert wurde. Ein 0,5 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer mit einem pH von vorzugsweise etwa 8 wird zum Waschen durch die genannte Säule geleitet und danach wird ein 0,6 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer mit einem pH von vorzugsweise etwa 8 durch die genannte Säule laufenlassen. Alternativ wird der zuvor erwähnte 0,5 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer durch die Säule laufenlassen, die zuvor in der obigen Stufe (ii)-2) behandelt wurde und noch die verbleibende, ab-
sorbierte Komponente umfaßt, woraufhin der zuvor erwähnte 0,6 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer durch die Säule geleitet wird. Die eluierte Fraktion wird aufgefangen, gegebenenfalls konzentriert, mittels Dialyse, Ultrafiltration oder dergl. entsalzt und anschließend mittels Gefriertrocknung oder dergl. getrocknet, um eine carcinostatische Substanz TF-136 zu erhalten. Das auf diese Weise erhaltene TF-136 hat die in Tabelle 2 angegebenen Eigenschaf ten«
(7) Isolierung der carcinostatischen Substanz TF-140
Zur Bildung eines Bariumsalzes werden Bariumionen entwe-. der zu der in den obigen Stufen (1) oder (2) erhaltenen Kultur oder deren überstehender Flüssigkeit oder zu der in der obigen Stufe (3) erhaltenen, wasserlöslichen Fraktion oder zu der durch Auflösen von TF-100 in Wasser erhaltenen Lösung gegeben. Anschließend wird das Präzipitat abgetrennt und danach einem Verfahren zur Entfernung des Bariums unterworfen. Die wasserlösliche Fraktion wird aufgefangen und danach einer Dialyse oder Ultrafiltration unterworfen, um TF-140 zu erhalten. Jm einzelnen wird folgendermaßen vorgegangen: Eine wäßrige Bariumhydroxidlösung, vorzugsweise eine 0,1 bis 0,5 molare wäßrige Bariumhydroxidlüsung, wird zu der in den obigen Stufen (1) oder (2) erhaltenen Kultur oder deren überstehender Flüssigkeit oder zu der in der obigen Stufe (3) erhaltenen, wasserlöslichen Fraktion oder zu einer durch Auflösen· von TF-100 in Wasser erhaltenen, wäßrigen Lösung gegeben, und zwar in einer Menge von etwa dem 10- bis 15fachen der Menge des TF-100. Der pH der resultierenden Mischung wird vorzugsweise auf 10 bis 13 eingestellt, um ein Bariumsalz zu bilden. Durch die Zugabe einer Bariumhydroxidlösung scheidet sich ein Präzipitat ab, und die zugegebene Menge an Bariumionen wird vorzugsweise so eingestellt, daß die
Konzentration der Gesamtmenge der Bariumionen, bezogen auf das Endvolumen.der Mischung, 0,005 bis 0,1 M beträgt. Die auf diese Weise erhaltene Mischung wird filtriert, und es wird ein Verfahren zur Abtrennung des Bariums aus dem erhaltenen Bariumsalz durchgeführt. Das Barium wird vorzugsweise entfernt, indem man das Bariumsalz zu Natriumsulfat, und vorzugsweise einer 5- bis 15%igen wäßrigen Natriumsulfatlösung, gibt, die resultierende Mischung rührt und danach eine Filtration durchführt, um eine Lösung zu erhalten. Der abgetrennte Niederschlag wird mit einer wäßrigen Natriumsulfatlösung wiederholt gewaschen und die Was'chflüssigkeiten v/erden mit der oben erwähnten Lösung kombiniert. Die auf diese Weise erhaltene.Lösung wird einer Dialyse, Ultrafiltration oder dergl. unterworfen,um den Überschuß an Natriumsulfat oder Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen. Die resultierende Lösung wird anschließend mittels Gefriertrocknung oder ' dergl. getrocknet, um eine carcinostatische Substanz TF-140 zu erhalten. Das auf diese Weise erhaltene TF-140 hat die in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften. . -
(8) Isolierung der carcinostatischen Substanz TF-150
Die in der obigen Stufe (3) erhaltene, wasserlösliche Fraktion oder die in der obigen Stufe (4) erhaltene, innere Lösung wird mit einem quaternären Ammoniumsalz behandelt. Das dabei gebildete Präzipitat wird abgetrennt und danach unter Verwendung einer Lösung, enthaltend Natriumchlorid, dissoziiert, woraufhin ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel zu der löslichen Fraktion zugegeben wird. Das auf diese Weise gebildete Präzipitat wird abgetrennt und danach getrocknet, wobei man TF-150 erhält. Als quaternäres Ammoniumsalz, das bei diesem Verfahren eingesetzt werden kann, kommt gewöhnlich irgendein Komplex mit einem Polysaccharid in Frage, Besonders bevorzugte Beispiele derselben umfassen Cetyl-pyridiniumchlorid, Cetyl-
2 3 46:
trimethylammoniumbromid etc.. Die Behandlung mit einem quaternären Ammoniumsalz wird vorzugsweise in Gegenwart eines Puffer, wie eines Boratpuffers oder dergl., durchgeführt. Im folgenden wird die obige Behandlung mit einem quaternären Ammoniumsalz und das Dissoziationsverfahreri • unter Verwendung einer Natriumchlorid enthaltenden Lösung näher erläutert. Beispielsweise wird eine wäßrige Lösung eines quaternären Ammoniumsalzes tropfenweise zu der in der obigen Stufe (3) erhaltenen, wasserlöslichen Fraktion oder zu der in der obigen Stufe 4 erhaltenen, inneren Lösung zugegeben, während der pH schwach basisch gehalten wird. Die resultierende Mischung wird bei 0 bis 500C während 10 Minuten bis mehrere Stunden gerührt, woraufhin das'ausgefallene Präzipitat abgetrennt wird. Das Präzipitat wird mehrere Male mit einer Pufferlösung, vorzugsweise einem 0,1^igen Boratpuffer, enthaltend 0,1 M Natriumchlorid und eine geringe Menge eines quaternären Ammoniumsalzes, gewaschen und danach mit einem Puffer, vorzugsweise einem O,1?oigen Boratpuffer, enthaltend 0,5 M Natriumchlorid und eine geringe Menge eines quaternären Ammoniumsalze-s, dissoziiert, um eine lösliche Fraktion zu erhalten. Nachfolgend wird ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel, vorzugsweise ein Alkohol, nachdem die lösliche Fraktion auf einen pH von vorzugsweise 2 bis 6 eingestellt wurde, der löslichen Fraktion in der Weise zugesetzt, daß deren Endkonzentration 50 bis 90% und vorzugsv/eise 70 bis 9O?6 (nach Volumen) betragen kann. Die auf diese V/eise erhaltene Mischung wird mehrere Stunden bis 90 Stunden bei 0 bis 30°C stehengelassen, woraufhin das" ausgeschiedene Präzipitat abgetrennt wird, um eine carcinostatische Substanz TF-150 zu erhalten. Das auf diese Weise erhaltene TF-150 hat die in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften.
Eigen- Aussehen .schäften
Pharmakologische Wirkung
Löslichkeit
Fraktion
TF-1OO
TF-11O
TF-120 TF-1316
grauweißeshellbraunes Pulver
!I
| TF-132a. | It |
| TF-132b | Il |
| TF-133a | W |
| TF-133b | η |
| TF-1323 | !t |
| TF-136 | ti |
| TF-140 - | ti |
diese Fraktion inhibiert aas Wachstum von Ehrlich ascitas Tumor, Ehrlich festem Tumor bei Mäusen und weist eine immunostimulierende Aktivität auf
diese Fraktion inhibiert das Wachstum von Ehrlich ascites Tumor bei Mäusen und besitzt immunost.Aktivität
diese Fraktion inhibiert das Wachstum von Ehrlich ascitas Tumor, Ehrlich festem Tumor und Sarcoma-180 Carcinom bei Mäusen und besitzt immunostimulierende Aktivität
M St
tt
diese Fraktion inhibiert das Wachstum von Ehrlich ascites Tumor und besitzt immunostimulierende Aktivität.
löslich in Wasserunlöslich in Methanol,Äthanol, Aceton,Benzol,Chloroform, Äthyiacetat und Diäthyläther
I!
I! If
ti ί! tt
n ti
!I
it
Tabelle 2 (Fortsetzung)
Eigenschaften
Zersetzungspunkt
Fraktion
.IR-Absorptionsspektrum (KBr-Verfahren) (cm"1)
TF-1OO
TF-I10 TF-120
TF-1316
TF-130a TF-132b
TF-133a TF-133b TF-I323 TF-136 TF-140
TF-150
Beginn d.Zersetzung dieser Fraktion bei etwa 11O0C und bemerkenswerte Zersetzung über 2000C
!I I!
tt ti
tt ti η das Spektrum weist Absorptionsbanden in d. Nähe von ?60O~32OO, 2960-2930,1670-1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 und 820 cm"1 auf
das Spektrum weist AbsortJtionsbanden in d. Nähe von 3600-3200,2960-2930,1670-1640, 1550,1380-1360,1140-1000 und 820 cm"1 auf
das' Spektrum weist Absorptionsbanden in d. Nähe von 3600-3200,2960-2930,1670-1640, ' 1550,1440-1380,1240,1140-1000,820cm"1 auf J^
Beginn d.Zersetzung dieser Fraktion bei etwa 21O0C,beachtliche Zers.bei etwa 280 C
Beginn d.Zersetzung dieser Fraktion bei etwa 110°C und beachtliche Zers'.über 200 C H It It It It
tt
tt
Tabelle 2 (Fortsetzung)
| ^\Eigensch. | Elementaranalysen- werte | UV-Absorptionsspektra (wäßrige Lösung) | Sephadex | G~50+ |
| Frak^-vT | C(%) H (96) N(%) | A max (ma) | 260 mn | Anthron-H2 3D4 - |
| tion \. | Verfahren 620 nm |
TF-100
TF-110 TF-120
30,6-35,7
4,2-5,2
4,2 5,2
bei der Absorptionskante im Bereich von und im Bereich von 256 V. V..· bis 400,· bis 260 nm
430-530,700-300 und 840-870 ml
35,9-41,0 4,5-5,2 4,2-5,2 35,1-40,2 4,5-5,5 2,0-3,1
TF-1316 30,0-34,0 3,8-4,4 4,9-5,7
TF-132a 34,8-39,8 4,5-5,7 2,8-3,6
TF-132b 35,3-39,5 4,5-5,6 2,8-5,4
TF-133a 28,0-36,6 3,5-5,1 4,5-6,3
TF-133b 31,1-38,5 3,9-5,2 3,4-4,7
TF-1323 29,9-39,4 3,9-5,6 2,8-5,4
TF-136 27,5-32,6 3,2-4,0 5,0-6,1
TF-140 22,0-28,0 3,0-3,5 5,0-6,5
TF-150 31,0-34,0 4,0-4,4 2,8-3,2
bei der Absorptionskante u.i.Bereich von
268-272 nm 256-260 nm 270-280 nm 265-280 nm " " 258-262 nm
am Absorptionsende,eine Schulter i.Ber.v.270-280 nm
bei d.Absorptionskante,eine Schulter i.Ber.v.265-280 nm
bei d.Absorptionskante u.i.Ber.v. 256-260 nm
η it 255-260 nm
255-260 nm
im Bereich von V' Y. bis u.310-430 ml -
Tabelle 2 (Fortsetzung)
ώιgenscn, Frak^
Sephadex G-200"
tion
250 nm Pheno1-H9SO L -Verfahren 490 nm ^ '
Antnron-Ho SO/,-Verfahr en 620 nm
TF-IOO
TF-110 im Bereich von V.V-380 und 600-920.ml
TF-120 im Bereich von V.V-325 und 775-875 ml
TF-1316 im 3ereich von V,V - 160 ml
TF-132a. im Bereich von V.V-340,600-700 und 720-880 ml
TF-132b im Bereich von V.V - 150 ml
TF-133a im Bereich von V.V-300 und 630-940 ml
TF-133b im Bereich von V.V-170 ml TF-1323 ' · im Bereich von V,V-16O ml TF-136 im Bereich von 540-930 ml
TF-140 im Bereich von V.V-300, 500-900 und 900-1000 ml
TF-150 im Bereich von V.V-100 und 100 bis 160 ml im Bereich von V.V-380, .410-520 und 630-760 ml
im Bereich von V.V-360, 360-480 und 510-760 ml
im Bereich von V.V - 160 ml
im Bereich von V.V-340, 340-580 und 720-900 ml
im Bereich von VrV-380,420-520 und.620-760 ml
im Bereich von V, '/-380,420-520 und 620-760 ml
im Bereich von V,V-340 und 340-580 ml '
im Bereich von V. V - 150 ml im Bereich von V1 V-420 ml im Bereich von V. V-420 ml ·
im Bereich von V,V-150 ml
geringe Absorptionsbande
im Bereich von V>V-500. 650-850 und 850-1000 ml
im Bereich von V,/-150 ml
geringe Absorptionsbande
Bemerkung: V.V
Porenvolumen
Tabelle 2 (Fortsetzung)
Eigensch.
Hochleistungs-Flüssigkeits chrpmatograxnis
220 mn 260 mn
TF-100
TF~110 TF-I20
TF-1316
TF«132a· TF-132b TF--133a TF-133b TF-I323 TF-136 TF-140 TF-150
in der Nähe der Lösungsmittelfront, 38-60 und 65 min
in der Nähe der Lösungsmittelfront und 38-60 min
I)
It-
η tt π it π ir
40-60 min
30, 38-60 und 65 min 36-37 tind 48-50 min 38 und 50 min
49-50 min 36 und 48-50 min 28-40 und 42-60 min
40-60 min 32 und 48-50 min in der Nahe der Lösungsinittelfront, 38-60 und 65 min
| in der Nähe | der Lösungs | I |
| mittelfront | und 36-60 min | O |
| t! | 40-60 min | I |
| ti | • 62 und 65 min | |
| H | 32-39 und 45-52 min | |
| 11 | 50-60 und 62 min | |
| St | 38-39 und 52 min | |
| !! | 36 und 50 min | |
| IS | 42-60 min | |
| η η | 40-60 min "XO Λΐν\Α /ιο_ζ(Τ τη-ϊν» | |
Tabelle 2 (Fortsetzung)
| Ninhydrin- reaktion | r | Molisch- . reaktion | Farbreaktion | 4- Indol-HCl- Reaktion | Lowry-Folin- Reaktion | |
| ^\Kigensch. | + | + | Phenol-H2S0^- Anthron-H2S0 Reaktion Reaktion | + | + | |
| FrakXT tion ^s. | - | + | + + | + | + | |
| TF-100 | - | + | • + . . + | + | + | |
| TF-110 | - | + | + + | '+ | • + | |
| TF-120 | - | + | + + | +' | + | |
| TF-1316 | - | + | + + | + | + | |
| TF-132a. | - | + | + + | "+ | + | |
| TF-132b | - | + | + " + | + . | + | |
| TF-133a | - | + . . + | + | + | ||
| TF-133b | - | + | + + | . . + | + | |
| TF-1323 | " + | + + | + | + | ||
| TF-136 | + | + + | + | |||
| TF-140 | + + | |||||
| TF-150 | ||||||
2 (Fortsetzung)
Eigens'ch. Saccharidgehalt^aus- Proteingehalt,ausge-
gedrückt als Glucose, drückt als Kalbsetion \^ bestimmt mittels rumalbumin,bestimmt
Phenol~HoS0/.-Verfahren mittels des Lowry-
| TF-100 | ca. | 40,0 - | ca.46,0 | ca. | 20,0 - | ca. | 23,0 |
| TF-110 | ca. | 30,0 - | ca.69,0 | ca. | 18,0 - | ca. | 22,0 |
| TF-120 | ca. | 56,0 - | ca.73,0 | ca. | 9,0 - | ca. | 13,0 |
| TF-1316 | ca. | 35,0 - | ca.50,0 | ca. | 10,0 - | ca. | 23,0 |
| TF-132a | ca. | 55,0 - | ca.64,0 | ca. | 18,0 - | ca. | 28,0 |
| TF-132b | ca. | 23,6 - | ca.45,5 | ca. | 15,5 - | ca. | 28,0 |
| TF-133a | ca. | 26,0 - | ca.35,0 | ca. | 22,0 - | ca. | 28,0 |
| TF-133b | ca. | 19,0 - | ca.24,5 | ca» | 12,9 - | ca. | 22,9 |
| TF-1323. | ca. | 19,0 - | ca.25,0 | ca. | ii,0 - | ca. | 17,0 |
| TF-136 | ca. | 19,0 - | ca.30,0 | ca. | 6,0 - | ca. | 12,0 |
| TF-140 | ca. | 5,0 - | ca.15,0 | ca. | 23,0 - | ca. | 32,0 |
| TF-150 | ca. | 40,0 - | ca.55,0 | ca. | 7,0 - | ca. | 14,0 |
In Tabelle 2 wurde für das mit "+" gekennzeichnete Sephadex G-50 eine Säule von 50 mm 0 χ 60Ö ram und destilliertes V/asser als Eluierungsmittel verwendet. Für das mit "++" bezeichnete Sephadex G-200 (Warenzeichen von Pharmacia Co., Ltd.) wurde für TF-110, 120, 132a, 133a, 136 und 140 eine Säule von 44 mm 0 χ 500 mm und für TF-1316, 132b, 133b, 1323 und 150 eine Säule von 21 mm 0 χ 400 mm verwendet. Als Eluierungsmittel wurde ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7 bei allen Substanzen verwendet. Um das mit "+++" gekennzeichnete Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm zu erhalten, wurde eine 7,9 mm 0 χ 600 mm χ 2 Säule, beschickt mit TSK-GeI G300 SW (Warenzeichen der Toyo Soda Co., Ltd.), verwendet und die Eluierung wurde bei Zimmertemperatur unter Verwendung eines 0,1 M Phosphatpuffers mit einem pH von 7 als Eluierungsmittel bei einer Durchflußrate von 0,8 ml/min durchgeführt.
Die pharmakologischen Wirkungen der erfindungsgemäßen carcinostatischen Substanzen TF-1OO, TFt-I 10, TF-120, TF-1316, TF-132a, TF-Ί32b, TF-133a, TF,-133b, TF-1323, TF-140 und' TF-15O sollen im folgenden erläutert werden.
(I) Wirkung der TF-Substanzen auf die Zeil-Lebensfähigkeit (Koloniebildungs-Aösay)
Es wird nach dem Verfahren von J.H.Kim et al. [Cancer Res. 2£, 698 (1965)] gearbeitet". HeLa S-3-Zellen werden in Eagle's MEM, versetzt mit 1OJo Kalbsserum,während 3 bis 5"Tagen bei 37°C kultiviert, und zwar in einem CO2-Inkubator. Danach wird die Kultur entnommen. Zu den am Glas anhaftenden Zellen gibt man eine PBS(-)-Lösung (eine wäßrige Lösung von 8$0 g/l Natriumchlorid, 0,2 g/l Kaliumchlorid, 1,15 g/l einbasisches Natriumphosphat und 0,2 g/l zweibasisches Kaliumphosphat), welche 0,01 Gew.% Athylendiamintetraessigsäure und 0,1 Ge\r.% Trypsin enthält. Die Zellen werden von der Glasfläche der Kulturflasche abgelöst und durch Pipettierung zu einzelnen Zellen getrennt. Sodann wird die Anzahl der Zellen mikroskopisch festgestellt. Die Zellsuspension wird mit Eagle's MEM mit einem Gehalt von 20% Kalbsserura verdünnt, so daß pro 1 ml 200 Zellen vorliegen. Petrischalen werden mit 1 ml der Zellsuspension geimpft. Sodann erfolgt eine Kultivierung in einem C02-Inkubator bei 370C während 24 h. Die in dem nachstehenden Beispiel' 1(1) erhaltene Flüssigkeit wird zu der Zellsuspension gegeben, so daß man eine Konzentration von 1/16 bis 1/128 erhält. Zu jeweils 1 ml-Portionen der bei 370C während 24 h kultivierten Zellsuspension gibt man die jeweiligen Testsubstanzen, und in jedem Falle werden die HeLa-Zellen während 7 Tagen kultiviert. Sodann wird das Kulturmedium entfernt. Danach werden die Kulturgefäße mit Hank's Lösung gewaschen. Dann werden die Zellen mit 70 Gew.# Äthanol fixiert und sodann mit 100 Gew.?i Äthanol gewaschen. Nach Entfernung des
Äthanols werden die Zellen mit einer Gimsa-Färbelösung angefärbt. Dann werden die Kolonien gezählt und die Lebensfähigkeit oder Vermehrungsfähigkeit der Zellen wird berechnet.
Die Ergebnisse sind in den Tabellen 3 und 4 zusammengestellt» Die Lebensfähigkeit oder Vermehrungsfähigkeit der Zellen wird nach folgender Gleichung berechnet.
Zahl der Kolonien in der behan-Zellenvermehrungs«· delten Gruppe fähiklt = SKT^FTCte
fähigkelt " -TaEl d*eF Koί^ΙΒΓΘη^ΤτΓΙΓέΤ'"ΰηΈ>e-
handelten Gruppe
Die Vermehrungs- oder Lebensfähigkeit der Zellen wird bei jeder Testsubstanz als Durchschnittswert von fünf Versuchen angegeben.
| Wirkung der überstehenden | Flüssigkeit | "48 Ii | 72 h | auf die Zeliver~ |
| raehrungsfähigkeit | 79,6 | 66,4 | ||
| Verdünnung (ml/ml) | Zellenvermehrungs | 30,0 | 7,9 | fähigkeit {%) . 96 Ja |
| 1/128 · | O | O | 80,4 | |
| 1 /64 | O | O | 5,8 | |
| 1/32 | 100 | 100 | O | |
| 1/16 | O | |||
| Vergleich | 100 |
Wirkung der TF-Substanzen auf die- Zellenvermehrungsfähigkeit
Substanz " Konzentration Vermehrungsfähigkeit der
(yug/ml) Zellen (%)
99,4 97,4 95,9
94,5
• : 88,9 87,3
98,8 91,2 83,3
96,7 97,4 95,9
96,9 95,4 88,8
95,9 96,4 95,4
98,5 98,6 98,6 9.6,8 93,4
| TF-100 | 10 50 100 |
| TF-110 | 10 50 100 |
| TF-120 | 10 50 100 |
| TF-132a | 10 50 100 |
| TF~133a | 10 50 100 |
| TF-136' | 10 50 100 |
| TF-140 | 10 50 100 200 500 |
Man erkennt aus diesen Versuchen, daß die erfindungsgemäßen TF-Substanzen im Vergleich zu der überstehenden Flüssigkeit einen sehr geringen cytotoxischen Effekt auf HeLa-Zellen haben,
(II) Immunostimulierende Wirkung
Vier Mäuse vom ICR-Stamm werden jeweils pro Gruppe verwendet. Jede Testsubstanz wird in 0,2 ml einer physiologischen Salzlösung aufgelöst und dann den Mäusen intraperitoneal verabreicht, 24 h nach der Verabreichung werden 0,2 ml einer Kohlenstoffsuspension in den Schwanz der
Maus intravenös injiziert. Die kohlenstoffsuspension wird hergestellt durch Vermischen von 1 ml Pelikan Zeichentusche 17, Schwarz (Günther Wagner Co., Ltd.) und 2 ml physiologischer Salzlösung, welche 3 Gew.% Gelatine enthält.1, 5, 10 und 15 min nach der Injektion werden 0,'02 ml Blut aus der Augenhöhle entnommen. Hierzu wird eine Hämatokrit-Kaplllare verwendet, welche^mit Heparin beschichtet ist. Danach wird sofort verdünnt und mit 1,6 ml einer 0,1 gew„?oigen wäßrigen Natriumcarbonatlösung härßolysiert. Die Suspension wird sodann bei 675 nm kolorimetriert und· der phagocytotische Index, nämlich der K-Wert, wird nach der Gleichung von Halpern et al. ermittelt. Den Mäusen in der Blindgruppe verabreicht man 0,2 ml einer physiologischen Kochsalzlösung.
log Cn - log C — JL-X.
X-U0
Cq bedeutet den Kohlepulvergehalt im Blut zur Zeit tQ. C bedeutet den Kohlepulvergehalt im Blut zur Zeit t. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 5 bis 7 zusammengestellt.
| Dosis (mg/kg) | TabeljLeJ> | K- | -V/ert | |
| Substanz | 10 50 | Mittlerer | + Ξ | 0,01-45 0,0302 |
| TF-IOO | 5 20 | 0,0851 0,0605 | + Ξ | 0,0213 0,0025 |
| TF-I10 | 5 20 | 0,0901 0,1025 | + Ξ | 0,0152 0,0197 |
| TF-120 | 5 20 | 0,0718 0,0559 | + Ξ | 0,0193 0,0246 |
| TF-1316 | 5 20 | 0,0832 0,1001 | + ΚΕΙ + | 0,0203 0,0296 |
| F-132a | 5 20 | 0,1102 0,0809 | + T- •we» | 0,0057 0,0174 |
| TF-133a | 5 20 ./; | 0,0851 0,0769 | + + | 0,0087 0,0154 - |
| TF-136 | — | 0,0959 0,1027 | + | 0,0024 |
| Vergleich | 0,0300 | |||
| Dosis | Dosis | Tabelle 6 | .+ 0,0051 +0,0031 | + 0,0156 + 0,0139 . + 0,0200 | |
| Substanz | 5 20 | 1 5 20 | + 0,0020 + 0,0075 | + 0,0048 | |
| TF-132b | 5 20 | - | (mg/kg) Mittlerer K-Wert | + 0,0011 + 0,0098 | |
| TF-133b | 5 20 | 0,1190 0,1073 | + 0,0075 + 0,0126 | ||
| TF-150 | 5 20 | 0,0550 0,1099 | + 0,0035 | ||
| TF-1323 | - | 0,1399 0,0577 | |||
| Vergleich | 0,1400 0,0685 | (mg/kg) Mittlerer K-Wert | |||
| 0,0286 | 0,0891 . 0,0946 0,0815 | ||||
| Substanz | Tabelle 7 | 0,0379 | |||
| TF-140 | |||||
| Vergleich | |||||
Man erkennt aus den Tabellen 5 bis 7, daß die mit den erfindungsgemäßen TF-Substanzen behandelten Gruppen eine Aktivierung der retikuloendothelialen Makrophagen im. Vergleich zur Vergleichsgruppen zeigen. Die zelluläre . Immunität der normalen Mäuse wird erhöht.
(III) Carcinostatische Aktivität
(a) Antitumor-Aktivität gegen Ehrlich ascites Tumor
Ehrlich ascites Tumorzellen werden Mäusen vom ICR-Stamm (weiblich, 6 Wochen alt), intraperitoneal verabreicht, und zwar in einer Menge von 1 χ 105 Zellen/Maus. Sodann wird ' die jeweilige Testsubstanz in 0,2 ml einer physiologischen Salzlösung aufgelöst und dann intraperitoneal verabreicht, und zwar einmal pro Tag, wiederholt an 7 Tagen, beginnend mit döm ersten Tag nach der Impfung mit Tumor- zellzn, oder alternativ einmal am Tag, und zwar am ersten Tag sowie am dritten bis siebten Tag. '('ah' insgesamt sechs
Tagen). Im Falle der Testsubstanzen der Tabelle 9 erfolgt die Verabreichung derselben einmal pro Tag, und zwar am ersten Tag und am dritten bis siebten Tag (an insgesamt 6 Tagen) nach der Impfung mit Tumorzellen. Der Vergleichsgruppe werden 0,2 ml einer physiologischen Kochsalzlösung in gleicher Weise verabreicht. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 8 und 9 zusammengestellt.
Anzahl der Uberlebenstage der behan-
Anzahl der Überlebenstage der unbe- v '
handelten Mäuse
Substanz
Dosis(mg/kg χ Anzahl der Verab
Durchschnittliche T/C Überlebenstage {%) ()
'Anzahl der /Anzahl der geüberlebenden/testeten Mäuse
| reichungen) | (Tag) | 8,1 ' | >162 ' 100 | . Mäuse | 13 0 | / | 20 20 | *1 | |
| TP-IOO | 70 χ 7 | >307l ± l8-;6 ± | 10,0 | >142 | 2 | / / | 5 | ||
| 10 χ 6 | >24,0 ± | 2,9 | >193 | 3 | / | 5 | *1 | ||
| TP-110 | 50 χ 6 | >32,5 ± | 1,3 | 100 | 0 | / | 5 | ||
| - | 16,8 ± | 9,3 | 2 | / | 4 | ||||
| 10 χ 5 | >27,5 ± | 9,2 | >153. | 2 | / | 4 | *1 | ||
| TP-120 | 50 χ 6 | >27,3 ± | 2,2 | 100 | 0 | / | 4 | ||
| - | 17,8 ± | 7,8· | >121 | 1 | / | 6 | |||
| • | 1x6 | >20.,8 ± | 4,2 8.8' | 106 . >135 | 0 1 | / | 6 6 | *1 | |
| TP-132a | 5 ,x 6 10 χ 6 | 18,3 ± | 2,2 | 100 | 0 | / / | 6 | ||
| - | 17,2 ± | 7,8 | >164 | 3 | / | 6 | |||
| 1x6 | >28,2 ± | 9,6 6?8 . | >167 >172 | . 4 3 | / | 6 6 | *1 | ||
| TP-133a | 5x6 10 χ 6 | >28,8 ± >2977 ± | 2,2 | 100' | 0 | / / | 6 | ||
| - | 17.,2. ± | / | |||||||
Tabelle 8 (Fortsetzung)
| TF-136 | 1x6 5x6 10 χ 6 | >23^0 ± 6.5 >3O,3 ± 5;6 >25,0 ± 8,2 17,2 ± 2j2 | >176 100 | 1/6 3/6 n 1/6· O" / 6 · |
| TF-1316 | 25 χ 6 100 χ 6 | 22,0 ± 5,2 >32,8 ± 11;2 17,5 ± 1,9 | 127 >187 100 | O / 4 2/4 "*1 Ό / 4 |
| TF-I32b | 5x6 10 χ 6 | >35,0 ± 9,8 18,8 ± 2,2 | >186 >213 100 | .2/5 4/5 *2 0/5 |
| TF-I33b ' | 1x6 5x6. Ίθ χ 6 | >24,0 ± 11,9 >33,2 ± 12;1 >34.8 ± 10,5 18,8 ± 2?2 ' . | >128 >176 >185 . 100 | 1/5 3/5 2/5 ά 0/5 |
| TF-1323 | 1x7 5x7 ". 10 χ 7 | >29,4 ± 10,8 >38>.±3i5 >34,0 ± 11,0 17,0 ± 1,1 | >173 >226 >200 100 | 4/10 .8 / 10 ^2 6 V 10 0/10 |
Λ ' alle überlebenden Mäuse sind frei von Ascites. Sie sind vollständig geheilt Beurteilung am 35. Tag nach der Transplantation der Tumorzellen Beurteilung am 40. Tag nach der Transplantation der Tumorzellen
Substanz Dosis(mg/kg χ AnbUDstanz zahl d9r Verabrei.
,chungen
Durchschnittliche T/C Überlebenstage -{%) (Tag)
Anzahl der Anzahl der geüberlebend ./testeten Mäuse Mäuse (am 35. Tag)
| 0.5 | χ | 6 | >2-3.β | ± 9λ3 | >148 | 2 / | |
| 1 | χ | 6 | >27,0 | ± T,5 | >170 · | 4 / | |
| ΤΡ-140 | 5 | χ | 6 | >31,5 | ± 5,7 | >198 | 9 / |
| 10 | X | 6 | >28,4 | ± 14,8 | >178 | 4 / | |
| - | 15,9 | + 3 4 | 100 | 0 / | |||
| 5 | X | 6 | >30.6 | + ε Ij | >159 | • 3 / | |
| TF-150 | 10 50 | X X | 6 6 | >32?0 >35,Ο | ± 4.;7 ± 0 | >1β8 >·182 | 3 / 5 / |
| - | - | •19,2 | ±15 | 100 | Q / | ||
| ' 5 | |||||||
| ' 10 | |||||||
| / 15 | |||||||
| ' 5 | |||||||
| ' 15 ' | |||||||
| ' 5 | |||||||
| ' 5 - ' 5 | |||||||
| ' 5 | |||||||
alle überlebenden Mäuse, sind frei von Ascites und vollständig geheilt
Man erkennt aus den Tabellen 8 und 9, daß die mit den erfindungsgemäßen TF-Substanzen behandelten Mäuse im Vergleich zu den unbehandelten Mäusen eine, verlängerte Lebensdauer zeigen. *
(b) Antitumor-Aktivitat gegen Ehrlichs festen Tumor
(1) Ehrlich Tumorzellen werden subkutan in die Achselhöhle von Mäusen des ICR-Stamms (weibliche; 6 Wochen alt) transplantiert,und zwar in einer Anzahl von 4 χ 10 Zellen/Maus. Nachfolgend wird die jeweilige Testsubstanz den Mäusen einmal am Tag an insgesamt sieben Tagen wiederholt verabreicht, und zwar beginnend mit dem ersten Tag nach der Transplantation der Tumorzellen, oder alternativ einmal am Tag, und zwar am ersten Tag und am dritten bis siebten Tag (an insgesamt 6 Tagen). Der Vergleichsgruppe werden 0,2 ml einer physiologischen Salzlösung in gleicher Weise verabreicht. Das Gewicht des jeweiligen Tumors wird am 11« oder 14. Tag nach der Transplantation der Tumorzellen bestimmt. Das Gewicht der Tumoren wird ermittelt durch Messung des größten Durchmessers a (mm) und des kleinsten Durchmessers b (mm), und zwar mit Hilfe eines Tastgeräts. Das Gewicht wird nach folgender Gleichung ermittelt: · '
Tumorgewicht = S-^-i- (mg)
Die Ergebnisse sind in Tabelle 10'zusammengestellt. In dieser und in den folgenden Tabellen werden folgende Abkürzungen gewählt:
i.v. = intravenös; i.p. = intraperitoneal;. s.c. " subkutan; i.m. = intramuskulär.
| Verabrei | Tabelle 10 | Dosis | (mg/kg χ | Verab- | X | 6 | Durchschn. | T/C | +1 | |
| Substanz | chungsweg | Anzahl | d. | reichungeri) | X | 6 | Tumorge- | ι θ/, ι I VQ J | ||
| 50 | X | 6 : | wi chj^gj^^^ | |||||||
| i.v. | 100 | - | 1,19 | 21 | ||||||
| TF-100 | i.p. | 100 | X | 6 | 1,97 | 36 | ||||
| S.C. | X | 6 | 1,19 | 21 | ||||||
| .2 | - | 5,54 | 100 | |||||||
| i.p. | 10 | X | 6 | 2,63 | 76 | i-9 | ||||
| TFM 316 | X | 6 | 1,57 | 45 | ||||||
| 1 | X | 6. | 3,44 | 100 | ||||||
| i.v. | 5 | - | 5,61 | 62 | ||||||
| TF-132b | 10 | X | 6 | 4,00 | 44 | +2 | ||||
| X | 6 | 4,32 | 48 | |||||||
| 1 | X | 6 | 9,06 | 100 | ||||||
| ... | i.p. | 5 | - | 6,46 | 71 | O | ||||
| TFM 33b | 10 | X | 7 | 5,40 | 60 | -VeL | ||||
| X | 7 | 4,00 | 44 | |||||||
| . 5 | im | 9,06 | 100 | |||||||
| i.p. | 10 | X | 6 | 3,48 | 42 | |||||
| TFM 323 | X | 6 | 3,17 | 38 | ||||||
| 1 | X | 6 | 8,33 | 100 | ||||||
| i.v. | 5 | - | 5,52 | 97 | Tag nach der Transplantation | |||||
| TFM 36 | 10 | X | 6 | 4,88 | 85 | |||||
| X | 6 | 3,19 | 56 | |||||||
| 1 | X | 6 | 5,69 | 100 | ||||||
| i.v. | 5 | 5,25 | 58 | |||||||
| TF-133b | 10 | 1 . | 3,61 | 40 | ||||||
| 3,30 | 36 | |||||||||
| +1 bestimmt am 1 | 9,06 | 100 | ||||||||
| der.Tumorzellen | I . « | |||||||||
| +2 , ',... | ||||||||||
der Tumorzellen.
(2) Ehrlichs Tumorzellen'werden subkutan in die Achselhöhlen von Mäusen des ICR-Stamms (weiblich; 6 Wochen alt.) in einer Menge von 4 χ. 10 Zellen/Maus transplantiert. Nachfolgend wird die jeweilige Testsubstanz verabreicht. Die Mäuse werden in Gruppen unterteilt. Die Verabreichung erfolgt intravenös, intraperitoneal, subkutan und intramuskulär, und zwar in einer Dosis von 10 mg/kg
oder oder 20 mg/kg einmal am Tag, und zwar am ersten Tag und am dritten bis siebten Tag (an insgesamt 6 Tagen) nach der Transplantation der Tumorzellen. Der Vergleichsgruppe werden 0,2 ml einer physiologischen Salzlösung in gleicher Weise verabreicht. Die Tumorgewichte werden am' 13. Tag nach der Transplantation der Tumorzellen ermittelt, Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 zusammengestellt.
| Dosis (mg/kg) | Tabelle 11 | T/C (%) | |
| Sub- Verabrei stanz chungsweg | 10 | Durchschnittl. Tumorgewicht(g) | 47 100 |
| TF-132a i.v. | 10 20 | 3,83 8,11 | 26 · 26 · |
| TF-133a i.v. | 10 20 | 1,81 1,84 | 40 26 |
| i.p. | 10 20 | 2,82 1,82 | 51 41 |
| S.C. | 10 20 | 3,57 2,86 | 67 46 100 |
| i.m. | 4,65 3,22 6,99 | ||
Man erkennt aus den Tabellen 10 und 11, daß bei Verabreichung der erfindungsgemäßen TF-Substanz ein Tumorwachstumsinhibierungseffekt beobachtet wird.
(c) Antitumor-Aktivität gegen Sarcoma-180 Carcinome
Sarcoma-180 Carcinom wird intraperitoneal transplantiert, und zwar an Mäuse vom ICR-Stamm (weiblich; 6 Wochen alt) in einer Menge von 1 χ 10^ Zellen/Maus. Nachfolgend wird jede Testsubstanz intraperitoneal verabreicht, und zwar in einer Menge von 1 mg/kg, 5 mg/kg oder 10 mg/kg einmal am Tag vom ersten Tag bis zum siebten Tag wiederholt (an insgesamt 7 Tagen), beginnend mit dem Tag der Transplan-
tation der Tumorzellen, oder alternativ einmal pro Tag am ersten Tag und am dritten bis siebten Tag (an insgesamt 6 Tagen). Der Vergleichsgruppe werden 0,2 ml einer physiologischen Kochsalzlösung in gleicher V/eise verabreicht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 zusammengestellt.
Sub- Dosis(mg/kg χ Anstanz · zahl (!.Verabreich.
Durchs chn'. Überlebens- T/C tage (Tag) · (%)
1 Anz.d.über- /Anz.d.ge lebenden Tiere/testeten
| 10 χ 6 | >26.8 t | >11O | 2 / 6 | * | I | |
| TP-132a | 5x6 1x6 | 21,3 | 111 | 1/6 0/6 *! · | CTv I | |
| - | 19; 2 | 100 | 0/6 | |||
| 10 χ 6 | >3O,3 | >158 | 1/6 | |||
| TF-133a | 5x6 1x6 | >27;5 ' >21,5 | >113 | 3 / 6 n . 1/6 | ||
| - | 19.,2 ' | 100 | 0/6 | |||
| 10 χ 6 | >30?2 | >157 | .3/6 | |||
| TP-136a | 5x6 1x6 | . >27j3 >28.0 | >116 | 3 / 6 n .2/6 | ||
| - | 19.^2 | 100 | 0 / 6 | |||
| 10 χ 7 | >12.O ± 0 | >300 | 5/5 ' | |||
| TF-132b | 5x7 | >12.O ± 0 | >300 | 5/5 *2 | ||
| - | 11.0 ± 3.3 | 100 | 0/15 | |||
Tabelle 12 (Fortsetzung)
+1
+2
Beurteilung am 35. Tag nach der Transplantation der Tumorzellen
| 10 | X | 7 | >37 | 7° | ± 0 | >286 | 10 / | *2 | |
| TP-I33b | 5 1 | X X | 7 7 | I^ | ,3 | 1+ 1+ OO | >286 >266 | 10,, / 7 / | |
| - | > 3 4 | ;° | ± 3,3 | 100 | 0 / | ||||
| 5 | X | 7 | >32 | + 0,6 | >255 | . 6 , | *2 | ||
| TF-1323 | 1 | X | 7 | 13 | ± 3,6 | >240 | 5 / | ||
| - | >28 | >6 | ± 3,6 | 100 | 0 / | ||||
| 5 | X | .7 | >30 | V8 | ± 11,5 · | >201 | .5 ./ | *1 | |
| TF-1316 | 1 | X | 7 | ± 9,5 | >2l6 | 4./ | |||
| - | >38 | .3 | ± 2;9 | 100 | 0 / | ||||
| 5 | X | 6 | >24 | »0 | ± 8,9 | >271 | 4 / | *2 | |
| ΤΡ-136 | • 1 | X | 6 | IH | )8 | ± 12,3 | >177 | 1 / | |
| - | ;° | - 2 5 | 100 | 0 / | |||||
| f 10 | |||||||||
| f 10 '. 10 | |||||||||
| ' 15 | |||||||||
| ' 7 | |||||||||
| / 7 | |||||||||
| ' 7 | |||||||||
| ^ 10 | |||||||||
| ^ 10 | |||||||||
| MO | |||||||||
| ': 5 | |||||||||
| ' 5 | |||||||||
| f 5 | |||||||||
Beurteilung am 40. Tag nach der'Transplantation der Tumorzellen Sowohl im Falle +1 als auch im Falle +2 sind die überlebenden Tiere vollständig geheilt.
Man erkennt aus Tabelle 12, daß die mit den erfinduingsgemäßen TF-Substanzen behandelten Tiere im Vergleich zu den Vergleichsgruppen Antitumor-Aktivitäten zeigen.
(d) Antitumor-Aktivitat gegen B-16 Melanome
(1) B-16 Melanom-Tumorzellen werden subkutan in die Achselhöhle von Mäusen des BDF.-Stamms (männliche; 7 Yfochen alt) transplantiert, und zwar in einer Menge von 1 χ 10 Zellen/Maus. Nachfolgend wird die Substanz TF-133a intraperitoneal verabreicht, und zwar in einer Dosis von 5 mg/kg oder 10 mg/kg einmal am Tag, und zwar am ersten Tag und am dritten bis siebten Tag (an insgesamt 6 Tagen), nach der Transplantation der Tumorzellen. In gleicher Weise werden den Vergleichstieren 0,2 ml physiologischer Salzlösung verabreicht. Einer weiteren Gruppe wird 5-FU verabreicht, und zwar in einer Menge von 20 mg/kg. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 zusammengestellt.
Substanz Dosis (mg/kg χ Anz. Durchschn.Tumor- T/C _ der Verabreichungen) ge\^icht (g) (%)
TF-133a 5x6 4,07 70
10 χ 6 2,52 43 "
5-FU ' 20 χ 6 ' ' 4,21 72 Vergleich - . 5,84 100
Man erkennt aus Tabelle 13, daß die mit TF-133a behandel ten Tiere eine offensichtliche Tumo:rwachstums-Inhibierungsaktivität zeigen, und zwar im Vergleich zu denjenigen der Blindgruppe. Die Tiere zeigen bei Behandlung mit 5 mg/kg und 10 mg/kg TF-133a die gleiche oder eine besse re Tumorwachstums-Inhibierungsaktivität als mit 5-FU behandelte Tiere.
~ 49 -
(2) Nach dem in Abschnitt (1). beschriebenen Verfahren werden i5-i6 Melanom-Tumorzellen transplantiert und TF-132a, TF-133a und 5-FU sowie eine physiologische Salzlösung v/erden jeweils verabreicht. Am 21. Tag nach der Transplantation der Tumorzellen werden die Mäuse seziert Und die Metastasen der Melanom-Tumorzellen in den Lungen werden ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 14 aufgeführt.
| Sub- Dosis (mg/kg χ Anz. stanz der Verabreichungen | x. 6 χ 6 | Durchschn.An zahl d.Meta stasen | Prozentuale Me tastasen-Inhi bierung (%) |
| TF-132a 5 10 | χ 6 χ 6 · | 16,0 9,86 | 69 |
| TF-133a 5 10 | χ 6 | . 9,3 6,7 | 70 ·. 78 |
| 5-FU 20 | - | 24,8 | 20 |
| Vergleich | 31,0 | 0 |
Man erkennt aus Tabelle 14, daß bei Verabreichung von TF-132a und TF-133a die Bildung von Metastasen der B-16 Melanom-Tumorzellen in erheblichem Maße inhibiert wird, und zwar im Vergleich zu der mit 5-FU behandelten Gruppe,
(IV) Akute Toxizität
Die ID^Q-Werte bei Mäusen sind in Tabelle 15 zusammengestellt.
' - 50 -
Tabelle 15 Substanz Verabreichungsweg ' LDc0 (mgAg)
500
>250 >1000
> 250 >1000
300 >500
300 >500
300
| TF-100 | i.p. |
| TF-110 | i.v. i.p. |
| TF-120 | i.v. i.p. |
| TF-132a | i.v. i.p. |
| TF-133a | i.v. |
| i.p. | |
| TF-136 | i.v. i.p. |
| TF-132b | i.v. |
| TF-133b | i.v. |
| TF-140 | i.v. |
| TF-150 | i.v. |
| TF-1323 | i.v. |
| TF-1316 | i.v. |
> 100
>200
> 100 >·200 >200 >200
Die obigen pharmakologischen Versuche zeigen, daß die erfindungsgemäßen TF-Substanzen brauchbare carcinostatische Mittel sind. Sie zeigen eine erhebliche Wirksamkeit gegen verschiedene Krebserkrankungen. Sie sind insbesondere wirksam bei festen bzw. soliden Tumoren. Alle TF-Substanzen der vorliegenden Erfindung zeigen ausgezeichnete Effekte. Die Substanzen TF-130, und insbesondere 132a, 132b, 133a, 133b und 1323 sind unter verschiedensten Gesichtspunkten besonders.bevorzugt.
Die erfindungsgemäßen TF-Substanzen können zu verschiedensten pharmazeutischen Mitteln verarbeitet werden, insbesondere zu oral verabreichbaren Mitteln, injizierbaren Mitteln, Suppositorien oder dergl..Bevorzugt sind Injektionsmittel. Falls orale Mittel hergestellt werden, so
können diese verschiedenste Hilfsstoffe enthalten. Sie können in Form-von Kapseln, Tabletten, Pulvern oder Granulatform vorliegen. Wenn. Injektionsmittel hergestellt werden, so kann es sich um solche für subkutane Injektionen, intramuskuläre Injektionen und intravenöse Injektionen handeln. Es kommen Suspensionen oder Lösungen oder auflösbare oder dispergierbare Pulver in Frage. Die Injektionsmittel können ein Lokalanaesthetikum enthalten.
Die Dosis der erfindungsgemäßen TF-Substanzen wird je nach dem Zustand des Patienten ausgewählt. Es ist im allgemeinen erwünscht y bei Erwachsenen eine Dosis von 0,01 bis 50 mg/kg einmal am Tag oder mehrmals am Tag zu verabreichen. Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise subkutan, intramuskulär od-er intravenös oder durch Injektion direkt in die beeinträchtigte Körperregion.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen und anhand von Zeichnungen näher erläutert; es zeigen:
Fig. 1 eine mikroskopische Photographie der Form von Fusobacterium nucleatum TF-031» welche erfindungsgemäß eingesetzt wird;
Fig. 2 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-100;
Fig., 3 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum von TF-100;
Fig. 4 ein Eluierungsmuster, erhalten bei Gelfiltration dieser Substanz mit Sephadex G-50;
Fig. 5 ein Hochle.istungS'-Flüssigkeitschroma.togramm dieser Substanz;
Fig. 6 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-110;
Fig. 7 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;
Fig. 8 ein Elutionsmuster bei Gelfiltration dieser Substanz mit Sephadex G-200;
Fig. 9 ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm dieser Substanz;
Fig. 10 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der cärcinostatischen Substanz TF-120;
Fig. .11' ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz; '
Fig. 12 ein Elutionierungsmuster dieser Substanz bei Gelfiltration an Sephadex G-200;
Fig. 13 ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm dieser Substanz;
Fig. 14 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der cärcinostatischen Substanz TF-1316;
Fig. 15 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;
Fig. 16 ein Elutionsmuster dieser Substanz bei Gelfiltration an Sephadex G-200;
Fig. 17 ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm dieser Substanz;
Flg. 18 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der cärcinostatischen Substanz TF-132a;
Fig. 19 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;
Fig. 20 ein Elutionsmuster bei Gelfiltration dieser Substanz an Sephadex G-200;
Fig. 21 ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm dieser Substanz;
Fig. 22 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatlschen Substanz TF-132b;
Fig. 23 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;
Fig. 2k ein Elutionierungsmuster bei Gelfiltration dieser Substanz an Sephadex G-200;
• . - 53
Fig. 25 ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatograram dieser Substanz;
Fig. 26 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-133a;
Fig. 27 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;
Fig. 28 ein Elutionierungsmuster dieser Substanz bei Gelfiltration an Sephadex G-200;
Fig. 29 ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm dieser Substanz;
Fig. 30 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen. Substanz TF~133b;
Fig.' 31 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;
Fig. 32 ein Elutionierungsmuster dieser Substanz bei Gelfiltration an Sephadex G-200;
Fig. 33 ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromato· gramm dieser Substanz;
Fig. 34 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-.1323;
Fig. 35 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrüm dieser Substanz;
Fig. 36 ein Elutionierungsmuster dieser Substanz bei Gelfiltration an Sephadex G-200;
Fig. ,37 ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm dieser Substanz;
Fig. 38 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-136;
Fig. 39 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;
Fig. 40 ein Elutionierüngsmuster dieser Substanz bei Gelfiltration an Sephadex G-200;
Fig. 41 ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm dieser Substanz;
_ 54 -
Fig. 42 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-140·;
Fig. 43 ein· Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;
Fig. 44 ein Elutionierungsmuster dieser Substanz bei Gelfiltration an Sephadex G-200;
Fig. 45·ein Hochleistungs. -Flüssigkeitschromato gramm dieser Substanz; .
Fig. 46 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-150;
Fig. 47 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz; .
Fig. 48 ein Elutionierungsmuster dieser Substanz bei Gelfiltration an Sephadex G-200; und
Fig. 49 ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm dieser Substanz.
Ausführungsbeispiele Be is ρ i e 1 1
(1) In fünfzehn, jeweils mit einer Schraubkappe ausgerüsteten 2 1 Kulturflaschen v/erden jeweils 2 1 eines Kulturmediums gegeben, das 34 g Trypticasepepton, 6 g Phytonpepton, 20 g Proteosepepton, 70g einer Hirn-Herz-Infusion, 6 g Hefeextrakt, 15 g Natriumchlorid, 12 g Glucose, 10 g Lactose, 0,5 g L-Cystin, 0,2 g Natriumsulfit, 1,0 g Natriumethioglykolat und 1,4 g Agar enthält; das Kulturmedium wird auf einen pH von 7 eingestellt. Das Kulturmedium wird unter 1,2 at Druck 15 min bei 1200C sterilisiert, anschließend 20 min auf einem siedenden Wasserband erwärmt und unmittelbar anschließend mit Wasser gekühlt. Daraufhin wird eine Präkulturlösung von Fusobacterium nucleatum TF-031* die zuvor durch Kultivieren in einem Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung
-•55 -
wie oben hergestellt wurde, dem obigen, wassergekühlten Kulturmedium unter sterilen Bedingungen in einer Menge von 100 ml/Kulturflasche eingeimpft. In einem Inkubator wird während 48 h bei 37°C eine Kultivierung im stabilen Strömungsgleichgewicht durchgeführt. Nach vollständiger Kultivierung wird die Kultur zur Entfernung der Organismen 20 min bei 5°C mit 4000 U/min zentrifugiert. Die Menge der erhaltenen, überstehenden Flüssigkeit beträgt etwa 27 1.
(2) Zu der in der obigen Stufe (1) erhaltenen, überstehenden Flüssigkeit gibt man 40 1 Äthanol unter Rühren bei 5°C. Das resultierende Gemisch wird in einem Kühlraum stehengelassen, bis sich das amorphe Präzipitat vollständig abgesetzt hat. Anschließend wird das Gemisch 15 min bei 50C mit 6000 U/min zentrifugiert. Das Präzipitat wird abgetrennt, mit Äthanol gewaschen und anschließend unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält etwa 60 g rohes Pulver.
(3) 20 g des in der obigen Stufe (2). erhaltenen, rohen Pulvers werden in 120 ml Wasser aufgelöst und die wasserunlöslichen Materialien, die sich zu diesem Zeitpunkt gebildet haben, werden durch Zentrifugieren mit 7500 U/min während 10 min abgetrennt. Anschließend wird die auf diese Weise erhaltene, wasserlösliche Fraktion mit den Waschlösungen kombiniert, die beim zweimaligen Waschen der wasserunlöslichen Materialien mit 60 inl-Portionen Wasser erhalten wurden. Die resultierende Lösung wird unter vermindertem Druck getrocknet, und man erhält 14 g grauweißes-hellbraunes Pulver von TF-100.
B e i s ρ i e 1 2 .
Die in Beispiel 1-(3) beschriebene Lösung, die durch Kombinieren der wasserlöslichen- Fraktion, die keine wasserunlöslichen Materialien enthält, mit den durch Waschen der wasserunlöslichen Materialien erhaltenen Waschlösungen hergestellt wurde, wird einer Ultrafiltration unterworfen, indem man ein hohles Ultrafiltrationssystem vom Fasertyp (Membran Nr. HI-1; hergestellt von Asahi Kasei Kogyo K.K.) einsetzt. Die innere Lösung wird gefriergetrocknet, und man erhält 10 g eines grauweißen-hellbraunen Pulvers von TF-110.
B e i s ρ i e 1 3
10 g des in Beispiel 2 erhaltenen Pulvers werden in einer geringen Menge Wasser aufgelöst, und die resultje rende Lösung wird auf eine Säule gegeben, die mit Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackt ist und mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einem pH von 8 äquilibriert wurde. Die eluierte Lösung wird aufgefangen. Weiterhin werden 2,5 1 des gleichen Phosphatpuffers wie oben, durch die Säule, laufenlassen, und die erhaltene, eluierte Lösung wird .mit der zuvor aufgefangenen, eluierten Lösung kombiniert. Daraufhin wird die resultierende Lösung unter Verwendung eines hohlen Ultrafiltrationssystems vom Fasertyp (Membran Nr. HI-1) entsalzt, unter vermindertem Druck konzentriert und dann gefriergetrocknet, wobei man 470 mg eines grauweißen-hellbraunen Pulvers von TF-120 erhält.
Bei s ρ i e 1 4
2 g des. in Beispiel 1-(2) erhaltenen Pulvers werden in 24 ml Wasser aufgelöst. Die wasserunlöslichen Materialien werden durch Zentrifugieren mit 7500 U/min während 10 min entfernt. Die wasserlösliche Fraktion wird über Nachtgegen destilliertes Wasser bei-50C dialysiert, in-
dem man ein Cellophanrohr verwendet, und die innere Lösung wird unter vermindertem Druck konzentriert. Anschließend wird die konzentrierte Lösung auf eine mit 150 ml Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackte Säule gegeben, die zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einem pH von 8 äquilibriert wurde. Die Säule wird gewaschen, indem man · 600 ml eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einem pH von 8 durchlaufen läßt, woraufhin man einen 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,6 M und einem pH von 8 durch die Säule laufenläßt, um ein Eluat zu erhalten. Das Eluat wird unter vermindertem Druck auf etwa 100 ml konzentriert, gegen destilliertes Wasser bei 50C dialysiert, v;iederum unter vermindertem Druck konzentriert, unter Verwendung einer Sephadex G-25-Säule entsalzt und anschließend gefriergetrocknet. Man erhält 470 mg grauweißes-hellbraunes TF-1316.
Bei spiel 5
Die in Beispiel 1-(3) beschriebene Lösung, die durch Kombinieren der wasserlöslichen Fraktion, welche keine wasserunlöslichen Materialien enthält, und den durch Waschen der wasserunlöslichen Materialien.erhaltenen Waschlösungen hergestellt wurde, wird über Nacht gegen destilliertes Wasser bei 5 C dialysiert, und zwar unter Verwendung eines Cellophanrohrs, und die innere Lösung wird unter vermindertem Druck konzentriert. Die konzentrierte Lösung wird dann auf eine mit 50 g Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackte Säule gegeben, die zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einem pH von 8 äquilibriert wurde. 2 1 eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einem pH von 8 und 2,5 1 eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,1 M und einem pH von 8 werden nacheinander durch die Säule laufenlassen, woraufhin man 2,5 1 eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchlo-
ridkonzentration von 0,2 M und einem pH von 8 durch die Säule laufenläßt, um den an der Säule adsorbierten Wirkstoff zu eluieren. Das erhaltene Eluat \vird unter Verwendung eines hohlen Ultrafiltrationssystems vom Fasertyp (Membran Nr. HI-1) entsalzt und anschließend gefriergetrocknet. Man erhält 6.00 mg eines grauveißen-hellbraunen Pulvers von TF~132a.
Bei s ρ i e 1 6
In 1.,2 1 eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 wer- · den 44,2 g des in Beispiel 1-(2) erhaltenen Pulvers aufgelöst. Die suspendierten, unlöslichen Materialien werden durch Filtration unter Verwendung von Hyflo Super CeI entfernt, und das erhaltene Filtrat wird anschließend auf eine Säule mit einem Durchmesser von 33 cm gegeben, die mit 500 ml Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackt ist und zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 äquilibriert wurde. Die eluierte Lösung wird aufgefangen. Die Säule wird mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0j3 M und einem pH von gewaschen, und die Waschlösungen v/erden mit der oben erwähnten, eluierten Lösung vereinigt. Man erhält 1,67 1 einer Lösung. Die Lösung wird erneut auf eine Säule mit einem Durchmesser von 8 cm gegeben, die mit 400 ml Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackt ist und zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 äquilibriert wurde. Man erhält 1,68 1 einer eluierten Lösung. Die Säule wird mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 gewaschen, wobei man 1,64 1 Waschlösung erhält. Die eluierte Lösung und die Waschlösung werden vereinigt, und es wird
ein 0,025 M' Phosphatpuffer rait einem pH von 8 in der Weise zugegeben, daß 4,98 1 eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,2 M und einem pH von 8 erhalten werden. Die auf diese Weise erhaltene Pufferlösung wird auf eine Säule gegeben, die einen Durchmesser von 8 cm aufweist und mit 500 ml Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackt ist und zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,2 M und einem pH von 8 äquilibriert wurde. Die Säule wird mit 2 1 eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,2 M und einem pH von' 8 gewaschen. Zu 7 1 einer Lösung, die durch Vereinigen der Waschlösungen mit der eluierten Lösung erhalten wurde, gibt man einen 0,025 M Phosphatpuffer mit einem pH von 8 zu, um 14 1 eines 0,025-M Phosphatpuffers mit.einer Natriumchloridkonzentration von 0,1 M und einem pH von 8 zu erhalten. Die auf diese Weise erhaltene, eluierte Lösung wird auf eine Säule mit einem Durchmesser von 8 cm gegeben, die mit 500 ml Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackt ist und zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,1 M und einem pH von 8 äquilibriert wurde. Die eluierte Lösung wird entfernt. Die Säule wird mit 2 1 eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,1 M und einem pH von 8 gewaschen. Anschließend läßt man 2 1 eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,2 M und einem pH von 8 durch die Säule laufen und fängt die eluierte Lösung auf. Die eluierte Lösung wird konzentriert und unter Verwendung eines Ultrafiltrationssystems (verwendetes Filter: Toy.o Ultrafilter UK-10) entsalzt. Die Lösung wird weiter entsalzt,' indem man eine Sephadex G~25-Säule verwendet, und mittels Aktivkohle entfärbt. Anschließend wird die Lösung gefriergetrocknet, und man erhält 880 mg eines grauweißenhellbraunen Pulvers von TF~132b.
Bei s ρ i el 7
10 g des in Beispiel 2 erhaltenen Pulvers werden in einer geringen Menge Wasser aufgelöst, und die resultierende Lösung wird auf eine mit Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackte Säule gegeben, die zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einem pH von 8 äquilibriert wurde. Danach läßt man 5 ml eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer. Natriumchloridkonzentration von 0,2 M und einem pH von 8 durch die Säule laufen, woraufhin 2,5 1 eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 durch die Säule geschickt werden, um den auf der Säule adsorbierten Wirkstoff zu eluieren. Die erhaltene, eluierte Lösung wird unter vermindertem Druck konzentriert. Die konzentrierte Lösung wird unter Verwendung eines Cellophanrohrs entsalzt und unter Verwendung von Sephadex G-25 vollständig entsalzt. Danach wird die.Lösung gefriergetrocknet, und man erhält 600 mg eines grauweißen-hellbraunen Pulvers von TF-133&·
B e i s pie 18 ·
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In 1,2 1 eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 löst man 44,2 g des in Beispiel 1-(2) erhaltenen Pulvers. Die suspendierten, unlöslichen Materialien werden durch Filtration unter Verwendung von Hyflo Super CeI entfernt, und das erhaltene Filtrat wird dann auf eine mit 500 ml Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackte Säule mit einem Durchmesser von 33 cm gegeben, die- zuvor mit einem 0,025M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 äquilibriert wurde. Die eluierte Lösung wird aufgefangen. Die Säule wird mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 gewaschen und die.Waschlösung wird mit der zuvor erwähnten, eluierten Lösung ver-
2 23 463 _
einigt, wobei man 1,67 1 einer Lösung erhält. Die Lösung wird wiederum auf eine mit 40 ml Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackte Säule mit einem Durchmesser von 8 cm gegeben, die zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 äquilibriert wurde. Man erhält 1,68 1 einer eluierten Lösung." Die Säule wird mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M. und. einem pH von 8 gewaschen, wobei man 1,64 1 Waschlösung erhält. Die eluierte Lösung und die Waschlösung werden vereinigt und es wird ein 0,025 M Phosphatpuffer mit einem pH von 8 zugegeben, so daß man 4,98 1 eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,2 M und einem pH von 8 erhält. Die auf diese Weise erhaltene,'eluierte Lösung wird auf eine mit 500 ml Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackte Säule mit einem Durchmesser von 8 cm gegeben, die zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,2 M und einem pH von 8 äquilibriert wurde. Die Säule wird mit 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,2 M und einem pH von 8 gewaschen, woraufhin man 2 1 eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 durch die Säule laufenläßt und dieeluierte Lösung auffängt. Die eluierte Lösung wird konzentriert und unter Verwendung eines Ultrafiltrationssystems (verwendetes Filter: Toyo Ultrafilter UK-10) entsalzt. Die Lösung wird weiter unter Verwendung einer Sephadöx G-25-Säule entsalzt und mittels Aktivkohle entfärbt. Anschließend wird die Lösung gefriergetrocknet, und man erhält 590 mg eines grauweißen-hellbraunen Pulvers von TF-133b.
Beis ρ i el 9
(1) 20 g des -in Beispiel 1-(2) erhaltenen, rohen Pulvers werden in 120 ml Wasser aufgelöst. Die wasserunlöslichen Materialien, die sich zu diesem Zeitpunkt gebildet haben, werden durch Zentrifugieren mit 7500 U/min während 10 min entfernt. Anschließend wird die auf diese Weise erhaltene, wasserlösliche Fraktion und die durch, zweimaliges Waschen der' wasserunlöslichen Materialien mit 60 ml-Portionen Wasser erhaltenen Waschlösungen vereinigt und nachfolgend unter Verwendung eines hohlen Ultrafiltrationssystems vom Fasertyp (Membran Nr. HI-1) einer Ultrafiltration unterworfen. Die innere Lösung wird gefriergetrocknet, und man erhält 10 g eines grauweißenhellbraunen Pulvers. . '
(2) . In 1 1 eines 0,025 Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von werden 25 g des mittels obiger Stufe (1) erhaltenen Pulvers aufgelöst, und die resultierende Lösung wird auf eine mit 500 ml Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackte Säule mit einem Durchmesser von 33 cm gegeben, die zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 äquilibriert wurde. Die Säule wird auf ähnliche Weise mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 gewaschen, und die eluierte Lösung und die Waschlösungen werden vereinigt, wobei man 1,6 1 einer Mischung erhält. Die Mischung wird auf eine mit 400 ml Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackte Säule mit einem Durchmesser von 8 cm gegeben, die auf ähnliche Weise mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 äquilibriert wurde, und man erhält 1,65 1 einer eluierten Lösung. Die eluierte Lösung wird mit 1,7 1 der durch Waschen der Säule mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit ei-
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ner Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 erhaltenen Waschlösung kombiniert, und das resultierende Gemisch wird mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einem pH von 8 in der Weise verdünnt, daß 10,35 1 eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,1 M und einem pH von 8 erhalten werden. ·
Anschließend wird die auf diese Weise erhaltene Pufferlösung auf eine mit 500 ml Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackte Säule mit einem Durchmesser von 8 cm gegeben, die zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,1 M und einem pH von 8 äquilibriert wurde. Die Säule wird mit 2 .1 eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,1 M und einem pH von 8 gewaschen, worauf man 2 1 eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 durch die Säule laufenläßt. Die eluierten Lösungen werden aufgefangen. Die erhaltene, eluierte Lösung wird unter Verwendung eines Ultrafiltrationssystems (verwendetes Filter: Toyo Ultrafilter AK-10) entsalzt und konzentriert, an Sepadex G-25 weiter entsalzt, mittels Aktivkohle entfärbt und danach gefriergetrocknet, und man erhält 1,65 g eines grauweißenhellbraunen Pulvers von TF-1323.
B e i.-fi.JLJLJL-JL IP-
10 g des in Beispiel 2 erhaltenen Pulvers werden in einer geringen Menge Wasser aufgelöst, und die resultierende Lösung wird auf eine mit Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackte Säule gegeben, die zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einem pH von 8 äquilibriert wurde. Danach werden 6 1 eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,5 M und einem pH von 8 durch die Säule laufenlassen, woraufhin man 2,5 1 eines 0,025 M
Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,6 M und einem pH von 8 durch die Säule laufenläßt, um den auf der Säule adsorbierten Wirkstoff zu eluieren. Die erhaltene, durchgelaufene Lösung wird unter Verwendung eines hohlen Ultrafiltrationssystems vom Fasertyp (Membran Nr. HI-1) entsalzt, unter vermindertem Druck konzentriert und anschließend gefriergetrocknet. Man erhält 130 mg eines grauweißen-hellbraunen Pulvers von TF-I36.
15 g des in Beispiel 1-(2)erhaltenenf rohen Pulvers wer-, den in 200 ml Wasser aufgelöst. Die wasserunlöslichen Materialien werden durch Zentrifugieren mit 7500 U/min während 10 min entfernt. Anschließend wird die auf diese Weise erhaltene, wasserlösliche Fraktion durch tropfenweise Zugabe einer 0,2 M wäßrigen Bariumhydroxidlösung auf pH 10 eingestellt. Durch die Zugabe der wäßrigen Bariumhydroxidlösung scheidet sich ein weißes Präzipitat ab. Es werden weiterhin Bariumionen zugesetzt, bis die Gesamtkonzentration der Bariumioiien in dem Endvolumen 0,01 M beträgt. Danach wird die Lösung 30 min gerührt, und das Präzipitat wird durch Filtration isoliert. Das auf diese Weise erhaltene Präzipitat eines Bariurasalzes wird in 10 ml einer 10 gew.^igen wäßrigen Natriumsulfatlösung suspendiert, ausreichend gerührt und danach abfiltriert. Das Filtrat wird aufgefangen. Das Präzipitat wird wiederum suspendiert, gerührt und danach auf die gleiche Weise wie oben filtriert, und zwar einmal mit 10 ml einer 10 gew.^igen wäßrigen Natriumsulfatlösung und zweimal mit 5 ml-Portionen der genannten Lösung. Jedes Filtrat wird aufgefangen. Das zurückbleibende Präzipitat wird weiterhin zweimal mit 10 ml-Portionen Wasser gewaschen und anschließend filtriert, um die Waschlösungen zu isolieren. Das oben erwähnte, aufgefangene Filtrat und die Waschlösungen werden vereinigt, gegen destillier-
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tes Wasser dialysiert, unter vermindertem Druck konzentriert und anschließend gefriergetrocknet. Man erhält 0,45 g eines grauweißen-hellbraunen. Palvers von TF-140.
Beispiel 12 ^
32 g des in Beispiel 1-(2) erhaltenen Pulvers werden in 450 ml Wasser aufgelöst, die suspendierten, unlöslichen Materialien werden durch Filtration unter Verwendung von Hyflo Super CeI entfernt, und das erhaltene FiI-trat wird über Nacht gegen fließendes Wasser Verwendung eines Cellophanrohrs dialysiert. Zu der dialysierten Lösung gibt man tropfenweise 80 ml einer 20%igen (nach Gewicht) wäßrigen Cetylpyridiniumchlorid-Lösung unter Rühren , während man gleichzeitig 200 ml eines 10 gew.^oigen Boratpuffers (pH 9,0) addiert. Das resultierende Gemisch wird 30 min bei Zimmertemperatur gerührt und danach wird das Präzipitat durch Filtration isoliert. Das Präzipitat wird in 150 ml eines 0,1 gew.^igen Boratpuffers (pH 9,0), enthaltend 0,1 M Natriumchlorid und 0,2 Gew.% Cetylpyridiniumchlorid, suspendiert. Die resultierende Suspension wird 30 min gerührt. Anschließend wird das Präzipitat durch Filtration von der Suspension abgetrennt und erneut in 150 ml eines Boratpuffers (pH 9,0) der obigen Zusammensetzung suspendiert. Die auf diese Weise erhaltene Suspension wird 30 min gerührt, woraufhin das Präzipitat durch Filtration isoliert wird. Das isolierte Präzipitat wird in 150 ml eines 0,1 gew.^igen Boratpuffers (pH 9,0), enthaltend 0,5 M Natriumchlorid und 0fZ% Cetylpyridiniumchlorid, suspendiert. Die resultierende Suspension wird gerührt und 30 min dissoziieren lassen. Anschließend wird das Präzipitat von der Suspension durch Filtration abgetrennt, und man erhält eine lösliche Fraktion. Das durch Filtration abgetrennte Präzipitat wird nochmals dem gleichen Dissoziierungsverfahren, wie oben, unterworfen, um eine lösliche Fraktion zu er-
halten. Die beiden löslichen Fraktionen v/erden vereinigt, lind die resultierende, lösliche Fraktion wird mit 1Obiger Chlorwasserstoffsäure auf pH 3-bis 4 eingestellt. Anschließend wird Äthanol in der Weise zugegeben, daß seine Konzentration schließlich 80?ö des Volumens ausmacht. Die resultierende. Lösung wird über Nacht bei 5°C stehengelassen, und das gebildete Präzipitat wird durch Filtration abgetrennt. Man erhält 5,6 g eines grauweißen-hellbraunen Pulvers von TF-150.
Die in den Beispielen 1, 2 und 3 erhaltenen Pulver von TF-100, 110 und 120 werden jeweils in Mengen von 1 mg oder 5 mg in Ampullen abgefüllt. Die Pulver, werden bei der Verwendung in einer sterilisierten physiologischen Salzlösung, einer Lösung, die 0,5^ Lidocain enthält, oder einer ähnlichen "Lösung aufgelöst und anschließend als Injektionsflüssigkeit verwendet«
Herstellungsbeispiel 2
Die in den Beispielen 4, 5 und 6 erha-ltenen Pulver von TF-I316, 132a und 132b werden jeweils in Mengen von 1 mg oder 5 mg in Ampullen abgefüllt. Die Pulver werden bei der Verwendung in einer sterilisierten physiologischen Salzlösung, einer 0,5% Lidocain enthaltenden Lösung oder einer ähnlichen Lösung aufgelöst und danach als Injektionsflüssigkeit verwendet.
Herstellungsbeispiel ^
Das in Beispiel 7 erhaltene Pulver von TF-133a wird in Mengen von 1 mg oder 5 mg in Ampullen abgefüllt. Das Pulver wird bei der Verwendung in einer sterilisierten physiologischen Salzlösung, einer -0,5% Lidocain enthaltenden Lösung oder einer ähnlichen Lösung aufgelöst und als Injektionsflüssigkeit eingesetzt.
Das in Beispiel 8 erhaltene Pulver von, TF-133b wird in Mengen von 1 mg oder 5 mg in Ampullen abgefüllt. Das Pulver wird bei der Verwendung in einer sterilisierten physiologischen Salzlösung, einer 0,5% Lidocain enthaltenden Lösung oder einer ähnlichen Lösung aufgelöst und als Injektionsflüssigkeit verwendet.
Herstellungsbeispiel 5
Das fin Beispiel 9 erhaltene Pulver von TF-1323 wird in Mengen von -1 mg oder 5 mg in Ampullen abgefüllt. Das Pulver wird in einer sterilisierten physiologischen Salzlösung, einer 0,5% Lidocain enthaltenden Lösung oder einer ähnlichen Lösung bei der Verwendung aufgelöst und danach als Injektionsflüssigkeit eingesetzt.
Herstellungsbeispiel 6
Die in den Beispielen 10, 11 und 12 erhaltenen Pulver von TF-136, ΐ40 und 150 werden jeweils in Mengen von 1-mg oder 5 mg in Ampullen abgefüllt. Die Pulver werden bei der Verwendung in einer sterilisierten physiologischen Salzlösung, einer 0,5% Lidocain enthaltenden Lösung oder einer ähnlichen Lösung aufgelöst und anschließend als Injektionsflüssigkeit eingesetzt.
Claims (7)
- 'Erf indungsansp ruch!.♦ Verfahren zur Herstellung von Substanzen mit carcinostatischer und immunostimulierender Wirkung* gekennzeichnet dadurci-u.daß man unter anaeroben Bedingungen zur Gattung Fusobacterium gehörende, TF-Substanz produzierende Bakterien kultiviert und aus der Kultur oder deren überstehender Flüssigkeit die Substanzen isoliert^2* Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man die zur Gattung Fusobacterium gehörenden, TF-Substanz produzierenden Bakterien unter anaeroben Bedingungen kultiviert, der Kultur oder deren überstehender Flüssig·* keit ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel zusetzt und daraufhin die Substanzen mit carcinostatischer und immunostimuUerender Wirkung von dem gebildeten Präzi~ pitat abtrennt«3* Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß man die wasserlösliche Fraktion de© Präzipitats aus dem Präzipitat auszieht und anschließend trocknet«4« Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß man das gebildete Präzipitat isoliert, die wasserlösliche Fraktion des Präzipitats einer Dialyse oder Ultrafiltra- tion unterwirft und die Substanzen mit carcinostatischer und imraunostimulierender Wirkung aus der inneren Lösung isoliert.5# Verfahren nach Punkt 2f gekennzeichnet dadurch, daß man das gebildete Präzipitat isoliert;, die wasserlösliche8.4,1981AP C 12 D/223 463 ~ 69 - 58 040/12Fraktion des Präzipitats gegebenenfalls einer Dialyse oder Ultrafiltration unterwirft und danach mit einem Ionenaustauscher behandelt; und die nichtadsorbierte Fraktion auffängt.
- 6. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß man das gebildete Präzipitat isoliert; die wasserlösliche Fraktion des Präzipitats gegebenenfalls der Dialyse oder Ultrafiltration unterwirft; danach mit einem Ionenaustauscher behandelt; und die Substanzen mit carcinostatischer und immunostimulierender Wirkung au© der adsorbierten Fraktion isoliert.7* Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch, daß man die adsorbierte Fraktion mit einem 0,6 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer behandelt und die eluierte Fraktion auffängt*8, Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch, daß man aus der adsorbierten Fraktion eine Fraktion isoliert, die nicht mit einem 0,1 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, jedoch mit einem 0,2 M Natriumchlorid" Phosphatpuffer eluiert wird,9, Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Fraktion isoliert, die nicht mit einem 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, jedoch mit einem 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wird*10, Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Fraktion isoliert, die nicht mit einem 0,1 M8,4.1981AP C 12 D/223 463 « 70 - 58 040/12Natriumchlorid~Phosphatpuffer eluiert'wurde, jedoch mit einem 0,3 M Natriurnchlorid-Pbosphatpuffer eluiert wird*11· Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch^ daß man eine Fraktion isoliert, die nicht mit einem 0,5 M Natriümchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, jedoch mit einem 0,6 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wird»12* Verfahren nach Punkt 2t gekennzeichnet dadurch, daß man das gebildete Präzipitat isoliert; gegebenenfalls die wasserlösliche Fraktion des Präzipitats der Dialyse oder Ultrafiltration unterwirft.« einen 0,2 bis 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer aus der wasserlöslichen Fraktion des Präzipitats oder einen 0,2 bis 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer aus der durch die Dialyse oder Ultrafiltration erhaltenen, inneren Komponente der Lösung herstellt und dann mit einem Ionenaustauscher behandelt, der mit einem 0,2 bis 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer äquilibriert wurde; eine durch den Ionenaustauscher hindurchgelaufene Fraktion auffängt; diese eluierte Lösung dann in der Weise einstellt, daß ihre Natriumchloridkonzentration etwa 0,1 M beträgt, und sie danach mit einem Ionenaustauscher, der mit einem • 0,1 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer äquilibriert ist, behandelt, um sie daran zu adsorbieren; und nachfolgend eine Fraktion isoliert, die nicht mit einem 0,1 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, jedoch mit einem 0,2 oder 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wird»
- 8.4.1981463 AP C 12 D/223& &Ο **ν - 71 - 58 040/1213* Verfahren nach Punkt 2t gekennzeichnet dadurch, daß man das gebildete Präzipitat isoliert; gegebenenfalls die wasserlösliche Fraktion des Präzipitats der Dialyse oder Ultrafiltration unterwirft, einen 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer aus der wasserlöslichen Fraktion des Präzipitats oder einen 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuff er einer durch die Dialyse oder Ultrafiltration erhaltenen, inneren Komponente der Lösung herstellt und dann mit einem Ionenaustauscher, der mit einem .0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffor äquilibriert ist, behandelt; eine Fraktion, die durch den Ionenaustauscher hindurchgelaufen ist, auffängt; die Natriumchloridkonzentration dieser eluierten Lösung dann auf 0,2 M einstellt und die Lösung daraufhin mit einem Ionenaustauscher, der mit einem 0,2 M Natriumchlorid—Phosphatpuffer äquilibriert ist, behandelt, um sie daran zu adsorbieren; und nachfolgend eine Fraktion-isoliert t die nicht mit einem 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, jedoch mit 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wird»Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man der Kultur oder deren überstehender Flüssigkeit Bariumionen zusetzt, um ©in ßariumsalz zu bilden, oder der Kultur oder deren überstehender Flüssigkeit ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel zusetzt und das gebildete Präzipitat isoliert und dann der wasserlöslichen Fraktion des so isolierten Präzipitats Bariumionen zusetzt, oder einer Lösung eines durch Trocknen der genannten, wasserlöslichen Fraktion des Präzipitats erhaltenen Pulvers.Bariumionen zusetzt, um ein Bariumsalz zu bilden; das gebildete Bariumsalz-8,4β1981AP C 12 D/223 463 - 72 ~ 58 040/12isoliert .und danach einer Behandlung zur Entfernung von Barium unterwirft; und die wasserlösliche Fraktion auffängt und der Dialyse oder Ultrafiltration unterwirft, '15«. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man der Kultur oder deren überstehender Flüssigkeit ein hydrophiles* organisches Lösungsmittel zusetzt; das gebildete Präzipitat isoliert ; die wasserlösliche Fraktion des Präzipitats oder die durch Dialyse oder Ultrafiltration der wasserlöslichen Fraktion erhaltene, innere Komponente der Lösung mit einem quaternären Ammoniumsalz behandelt; das gebildete Präzipitat isoliert und nachfolgend unter Verwendung einer Natriumchlorid enthaltenden Lösung einem Dissoziationsverfahren unterwirft; der erhaltenen, löslichen Fraktion zur Bildung eines Präzipitats ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel zusetzt; und das auf diese Weise gebildete Präzipitßt isoliert.16* Verfahren nach einsm der Punkte 1 bis 15, gekennzeichnet dadurch, daS man für die Kultivierung der Bakterien ein Kulturmedium verwendet, welches Stickstoffquellen, Kohlenstoffquellen, Vitaminquellen, Reduktionsmittel und anorganische Salze enthält, oder ein solches ver-• wendet, das zusätzlich Agar enthält*17© Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 15, gekennzeichnet dadurch, daS das zur Kultivierung der Bakterien verwendete Kulturmedium Trypticasepepton, Phytonpepton, Proteosepepton, eine Hirn-Herz-Infusion (oder Herzinfusion), Hefeextrakt, Natriumchloridf Glucose,, Lactose,
- 8.4.1981.22 3 4 63 AP C 12 D/223 463* 73 - 58 040/12L-Cystin, Natriumsulfit und Thioglykollat umfaßt oder diese und zusätzlich Agar umfaßt*18, Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 15, gekennzeichnet dadurch, daß die-Kultivierung bei 35 bis 42 0C während 1 bis 5 Tagen in einem Kulturmedium durchgeführt wird, da© auf pH 6,0 bis 8*5 eingestellt ist,19» Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 15, gekennzeichnet dadurch, daß die Kultivierung bei 36 bis 38 0C während 1 bis 3 Tagen in einem Kulturmedium durchgeführt wird, das auf pH 7,2 bis 8,2 eingestellt ist.20* Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 15, gekonnzeichnet dadurch, daß es sich bei den zur Gattung Fusobacterium gehörenden Bakterien um Fusobacterium nucleatum handelt.21„ Verfahren nach einem der Punkte 2 bis 15, gekennzeichnet dadurch, daß das hydrophile organische Lösungsmittel, das der Kultur oder deren überstehender Flüssigkeit zugesetzt wird, ein Alkohol ist.
- 22. Verfahren nach einem der Punkte 2 bis 15, gekennzeichnet dadurch, daß das hydrophile organische Lösungsmittel der Kultur oder der überstehenden Flüssigkeit bis zu einer Lösungsraittelkonzentration von 80, vorzugsweise 30 bis 70 Vol.-%, zugesetzt wird«23* Verfahren nach einem der Punkte 6 bis 13, gekennzeichnet dadurch, daß man als Ionenaustauscher einen schwach basischen Ionenaustauscher oder einen schwach basischen Ionenaustauscher mit Molekularsiebwirkung verwendet.8,4„1981AP C 12 D/223 - 74 - 58 040/1224, Verfahren nach Punkt 6» gekennzeichnet1 dadurch, daß man zum Eluieren der auf dam Ionenaustauscher adsorbierten Fraktion einen 0,1 bis 0,6 M Natriumchlorid~Phosphat~ puffer verwendet«25« Verfahren nach einem der Punkte 7 bis 13 oder 24, gekennzeichnet dadurch, daß der pH~Wert des zur Behandlung d®r adsorbierten Fraktion verwendeten Phosphat« puffers rait einem Gehalt an Natriumchlorid etwa 8 beträgt*26» Varfahren nach einem der Punkte 7 bis 13 oder 24,. gekennzeichnet dadurch, daß man die Fraktion, die der Ionenaustouscherbehandlung unterlagen wurde, konzen« triert, entsalzt und trocknet*27* Verfahren nach Punkt 15* gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem quaternären Ammoniumsalz um Cetylpyridiniumchlorid handelt*28* Verfahren nach Punkt 15, gekennzeichnet dadurch, daß man die Behandlung mit dem quaternären Ammoniumsalz in Gegenwart eines Boratpuffers durchführt,29« Verfahren nach Punkt 15, gekennzeichnet dadurch, daß • die Natriumchlorid enthaltende Lösung ein Boratpuffer, enthaltend Natriumchlorid und ein quaternäres Ammoniumsalze ist« '30« Verfahren nach Punkt 65 gekennzeichnet dadurch, daß man Fusobacterium nucleatum einem auf pH 7,2 bis 8,2 eingestellten Kulturmedium einimpft, welches Trypticase~8,4.1981AP C 12 D/223 463 - 75 - 58 040/12pepton, Phytonpepton, Proteosepepton,·©ine Hirn-Herz-Infusion (oder eine Herzinfusion)* Hefeextrakt, Natriumchlorid, Glucose, Lactose, L~Cystin, Natriumsulfit und Thioglykollat umfaßt, oder einem Kulturmedium einimpf t., das außer" diesen zusätzlich Agar umfaßt, und dann unter anaeroben Bedingungen bei 36 bis 38 C während 1 bis 3 Tagen kultiviert; der Kultur oder ihrer überstehenden Flüssigkeit einen Alkohol in einer Konzentration von 50 bis 70 Vol.~% zusetzt; das gebildete Präzipitat isoliert; di© wasserlösliche Fraktion des Präzipitats gegebenenfalls einer Dialyse oder Ultrafiltration unterwirft und dann mit einem schwach basischen Ionenaustauscher oder mit einem schwach basischen Ionenaustauscher mit Molekularsiebwirkung behandelt, um die nichtadsorbierte Fraktion zu entfernen; von der adsorbierten Fraktion eine Fraktion abtrennt, die mit einem 0,1 oder 0,2 Ii Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert'wird; und daraufhin eine Frak*· .tion isoliert, die öit einem 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wird, die Fraktion konzentriert, entsalzt und anschließend trocknet» .
- 31. Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch, daß man Fusobacterium nucleatum einem auf pH 7,2 bis 8,2 eingestellten Kulturmedium einimpft, welches Trypticasepepton, Phytonpepton, Proteosepepton, eine Hirn-Herz-Infusion (oder eine Herzinfusion)', Hefeextrakt, Natriumchlorid, Glucose, Lactose, L-Cystin, Natriumsulfit und Thioglykollat umfaßt, oder einsm Kulturmedium einimpft, das diese und zusätzlich Agar umfaßt, und dann unter anasroben Bedingungen bei 36 bis 38 0C während 1 bis 3 Tagen kultiviert;" der Kultur oder ihrer
- 8.4,1981AP C 12 D/223 ~ 76 - 58 040/12überstehenden Flüssigkeit einen Alkohol in einer Konzentration von 50 bis 70 Vol.-% zugesetzt; das gebildete Präzipitat isoliert; gegebenenfalls die wasserlösliche Fraktion des Präzipitats einer Dialyse oder Ultrafiltration uhterwirf.t und dann einen 0,2 bis 0,3 M Natriumchlorid~Phosphatpuffer der wasserlöslichen Fraktion des Präzipitats oder einen 0,2 bis 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer der bei der Dialyse oder Ultrafiltration erhaltenen s inneren Komponente der Lösung mit einem schwach basischen Ionenaustauscher oder mit einem schwach basischen Ionenaustauscher mit Molekularsieb« wirkung behandelt, der mit einem 0,2 bis 0,3 M Natrium«» chlorid-Phosphatpuffer äquilibriert wurde; die durch den Ionenaustauscher durchgelaufene Fraktion auffängt; diese eluierte Lösung unter Schaffung einer Natriumchloridkonzentration von 0,1 bis 0,2 M einstellt und dann mit einem schwach basischen Ionenaustauscher oder einem schwach basischen Ionenaustauscher mit Molekular-Siebwirkung,, der mit einem 0,1 bis 0,2 M Natriumchlorid« Phosphatpuffer äquilibriert wurde, behandelt, um die eluierte Lösung daran zu adsorbieren; und aus der adsorbierten Fraktion eine Fraktion isoliert, die mit einem 0,2 bis 0,3 M Natriurachlorid-Phosphatpuffer eluiert wird, diese Fraktion konzentriert» entsalzt und danach trocknete32* Verfahren nach einem der Punkte 20, 30.oder 31, gekennzeichnet dadurch, daß das Fusobacterium nucleatum ein Stamm TF-031 ist»Seiten Zeichnung^
Applications Claiming Priority (4)
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|---|---|
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Family Applications (1)
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|---|---|
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-
1980
- 1980-08-22 DD DD22346380A patent/DD153999A5/de not_active IP Right Cessation
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