CZ9903637A3 - Metoda identifikace sloučenin inhibujících nádorový proces a prostředky obsahující tyto sloučeniny - Google Patents

Abstract

Řešení poskytuje farmaceutické prostředky pro léčbu nádoru, skládající se z farmaceuticky přijatelného nosiče a sloučeniny, která byla vybrána na základě stanovení aktivity, inhibující cyklooxygenázu, aktivity, inhibující PDE, aktivity, inhibující růst nádorové buňky a aktivity, inhibující PDEZ. Dále jsou poskytnuty izolovaná fosfodiesteráza, farmaceutické prostředky, obsahující farmaceuticky přijatelný nosič a sloučeninu, vybranou na základě zhodnocení protinádorové aktivity sloučeniny z hlediska jejího vlivu na zvýšení aktivity PKG, na snížení β-kateninu, na fosforylaci β-kateninu. Dále je poskytnut způsob výběru sloučeniny pro léčbu nádoru, způsob identifikace sloučeniny pro léčbu nádoru, způsob testování sloučeniny, účinné při léčbě nádoru.

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká použití jedné nebo více forem fosfodiesterázy typu 2 („PDE2“), fosfodiesterázy typu 5 („PDE5“) a/nebo proteinkinázy G k identifikaci sloučenin, užitečných pro léčbu a prevenci prekancerózních a nádorových procesů u savců, pro farmaceutické prostředky, obsahující tyto sloučeniny a rovněž pro terapeutické metody léčby nádorů pomocí těchto sloučenin.

Dosavadní stav techniky

V současné době zahrnuje nechirurgická léčba maligního nádoru u těch pacientů, jejichž maligní nádor se vyvinul do takového stavu, kdy terapeutické prospěchy chemoterapie/hormonální terapie převažují nad jejich velmi vážnými vedlejšími účinky, aplikaci jednoho nebo více vysoce toxických chemoterapeutik nebo hormonální terapii. Tyto vedlejší účinky jsou dobře známé všem onkologům a liší se lék od léku. Standartní chemoterapeutika jsou však většinou používána pouze po krátká časová období, často se střídá chemoterapie s obdobími bez léčby a tak nedochází k nadměrnému zatížení pacienta vedlejšími účinky léků. Z důvodu rizika změny většinou vylučují vedlejší účinky zahájení chemoterapie u těch pacientů, kteří vykazují prekancerózní procesy nebo vylučují pokračování dlouhodobé chemoterapie nebo hormonální terapie po odstranění zjištěného nádoru s cílem pokusit se předejít jeho opětovnému výskytu.

Přibližně před deseti lety se začaly objevovat náznaky naděje z neočekávaných zdrojů: nesteroidní protizánětlivé léky („NSAID“). Oblast výzkumu karcinomů a prekarcinomů je přeplněna publikacemi, které popisují různé biochemické molekuly, které jsou nadměrně exprimované v nádorové tkáni. To vedlo řadu výzkumných skupin k výzkumu, zdali jsou specifické, nadměrně exprimované molekuly odpovědné za onemocnění a zdali může být nádorový proces zmírněn tím, že jsou tyto nadměrné exprese inhibovány. Například v případě familiární adenomatózní polypózy („FAP“) uvedl v roce 1983 Waddell hypotézu (Waddel, W.R. a kol., „Sulindac for Polyposis of the Colon“, Journal ofSurgical Oncology, 24: 83 až 87,1983), že zatímco prostaglandiny byly v těchto polypech nadměrně exprimovány, nesteroidní protizánětlivé léky („NSAID“) by měly stav onemocnění zmírnit, protože inhibují aktivitu prostaglandinsyntetázy (PGE2). Proto autor aplikoval nesteroidní protizánětlivý lék („NSAID“) sulindak (inhibitor PGE2) několika pacientům s FAP. Waddel zjistil, že polypy ustoupily a po této terapii se neopakovaly. Inhibice PGE2 vzniká v důsledku inhibice cyklooxygenázy (COX) sloučeninami NSAID. Úspěch Wadella se sloučeninou sulindak a vztah PGE2/COX zdánlivě potvrdily úlohu dalších dvou biochemických cílů - PGE2 a COX - v karcinogenezi a následná literarura tyto poznatky ještě posílila.

Náznakem naděje pro pacienty, trpící nádory, byl fakt, že sulindak nepochybně vykazoval mnohem mírnější vedlejší účinky než obvyklá chemoterapeutika nebo hormony a otevíral tak možnost léčby maligního nádoru v počátečních stádiích onemocnění a ve srovnání s obvyklými chemoterapeutiky po delší časová období. Tato naděje však musela být zmírněna nastolením otázky, může-li být sloučenina jako sulindak použita pro léčbu zjištěného maligního nádoru. Tato otázka vznikla v důsledku toho, že Waddell podával sulindak pouze pacientům s prekancerózním stavem, FAP.

Tato naděje byla rovněž zmírněna řadou vedlejších účinků samotných NSAID. Sulindak a ostatní NSAID, jsou-li aplikovány dlouhodobě, zhoršují trávicí trakt, kde PGE2 hraje ochranou úlohu. Dále, jsou-li brány dlouhodobě, vykazují vedlejší účinky, postihující ledviny a interferují s normálním srážením krve. V průběhu své studie Waddell bohužel zjistil, že někteří z jeho pacientů, kterým byl sulindak podáván, přestali lék z důvodů vedlejších účinků brát (viz Waddell, W.R. a kol., „Sulindac for Polyposis of the Colon“, The American Journal of Surgery, 157: 175 až 179, 1989) a většina z nich se proto, aby kontrolovala tvorbu polypů, vrátila k dalším chirurgickým zákrokům. Proto tyto léky nepředstavují pro pacienty s nádory např. pro FAP, pro pacienty s ojediněle se vyskytujícími polypy nebo pro muže po prostatektomii se zvýšenými PSA (zvýšení PSA u těchto mužů naznačuje návrat onemocnění, které nemusí být ještě přítomno jako zjistitelný, viditelný maligní nádor), praktickou dlouhodobou léčbu. Tyto vedlejší účinky také omezují použití NSAID při jakékoliv další indikaci nádorového procesu, vyžadujícího dlouhodobé podávání léků. Někteří vědci předpokládali, že budou používány NSAID, specifické pro COX 2, jako je např. celecoxib. Předpokládá se, že renální a ostatní vedlejší účinky těchto sloučenin však limitují dávkování a délku léčby těmito sloučeninami během dlouhodobých protinádorových indikací. Nedávno publikované údaje dále naznačují, že ktomu, aby bylo dosaženo minimálního účinku na polypy tlustého střeva pouze v předem definovaných oblastech kolorekta, jsou třeba velmi vysoké dávky léků jako je celecoxib. Pro léčbu maligního nádoru tlustého střeva je možná významnější fakt, že určité nádory tlustého střeva (např. HCT-116) neexprimují COX-2 a proto jsou tyto inhibitory proti těmto nádorům ·· φ neúčinné (viz Sheng a kol., „Inhibition of Human Colon Cancer Cell Growth By Selective Inhibition of Cyclooxygenase-2“ J. Clin. Invest., 99(9): 2254 až 2259, 1997).

Současné objevy vzdalují vědce dále od COX/PGE2 cílů, protože tyto cíle nemusí být pro úspěšnou dlouhodobou léčbu pacientů s nádorem primární (nebo možná sekundární). Pamukcu a kol., v U.S. Patentu č, 5401774 odhalil, že sulfonylové sloučeniny, které byly uvedeny jako sloučeniny, které prakticky neinhibují PGE2 a COX (a proto to nejsou NSAID nebo protizánětlivé sloučeniny), neočekávaně inhibovaly růst řady nádorových buněk včetně buněk polypů tlustého střeva. Tyto sulfonylové deriváty byly prokázány jako účinné u modelové karcinogeneze tlustého střeva u potkanů a jedna varianta (nyní označovaná jako exisulind) byla prokázána jako účinná v klinických testech s FAP pacienty. Ještě významnější se ukázal být účinek v prokázaném maligním nádoru: maligním nádoru prostaty, což byli zjištěno při klinické studii, která je uvedena níže. Současný výzkum dále přesvědčivě stanovil, že COX I a/nebo COX II nejsou exprimovány ve všech nádorech, což snížilo naději, že by specifické inhibitory COX I a COX II mohly být široce terapeuticky užitečné při léčbě nádorových procesů (viz Lim a kol., „Sulindac Derivatives Inhibit Growth and Induce Apoptosis in Human Prostatě Cancer Cell Lines“ Biochem. Pharmacology, Vol. 58, str. 1097 až 1107 (1999) v tisku).

Jako u mnoha dalších proteinů, nadměrně exprimovaných v nádorech, nemusí být nadměrná exprese PGE2/COX příčinou některých nádorů, ale spíše důsledkem některých z nich. Spojením těchto zjištění se však objevila otázka, jak sloučeniny jako je exisulind (který je účinný proti nádorům, které exprimují COX tak i proti těm, které neexprimují COX) pracují? Co tyto sloučeniny dělají nádorovým buňkám?

Piazza a kol., (v U.S. Patentové Přihlášce ě. 08/866027 a 09/046739) objevil, že sloučeniny (jako je exisulind) inhibovaly GMP-specifíckou cyklickou fosfodiesterázu (např. PDE5) a že by další podobné sloučeniny mohly být pomocí tohoto enzymu testovány, což by mohlo vést k objevu dalších sloučenin, které by mohly být vyvíjeny a formulovány do protinádorových farmaceutických prostředků.

Tyto farmaceutické prostředky mohou být vysoce protinádorové a prakticky nemusí mít vedlejší účinky, spojené s obvyklými chemoterapeutiky. Rovněž nemusí mít vedlejší účinky, spojené s inhibici COX nebo PGE2, jestliže je třeba se těchto vedlejších účinků vyvarovat. Protinádorové sloučeniny, inhibující cGMP-specifickou PDE, mohou indukovat apoptózu (forma programované smrti buňky) v nádorových buňkách, ale nikoliv v normálních buňkách. Tyto nové sloučeniny proto začínají být označovány jako nová třída protinádorových látek, známých jako selektivní apoptotické protinádorové léky („SAAND“). SAAND tedy byly v rozporu s několika body obvyklé znalosti“ (1) že protinádorové sloučeniny nemohou být účinné bez

současného zabití normálních buněk; (2) že COX jsou odpovědné za nádorové procesy; a (3) že prevence nádorů tlustého střeva pomocí NSAID je zprostředkovávaná inhibici jednoho nebo obou typů COX.

Nový výzkum, uvedený níže, však ukázal, že ne všechny sloučeniny, vykazující klasickou inhibici PDE5, indukují apoptózu v nádorových buňkách. Například dobře známé inhibitory PDE5, zaprinast a sildenafil, sami o sobě neindukují apoptózu nebo neinhibují růst nádorových buněk. Protože však proapoptotické inhibitory PDE5 indukovaly apoptózu selektivně (tzn. pouze v nádorových buňkách nikoliv v normálních) a mohly to tak dělat bez podstatné inhibice COX, je použitelnost PDE5 jako nástroje testování žádoucích protinádorových sloučenin nesporná.

Je však žádoucí přizpůsobit metodu testování PDE5, sloužící k nalezení protinádorových, pro-apoptotických, ale bezpečných sloučenin tak, že mohou být formulovány nové farmaceutické prostředky pro terapeutické použití při léčbě nádorů včetně prekarcinomů a maligních nádorů.

Podstata vynálezu

Během výzkumu, proč některé inhibitory PDE5 sami o sobě indukovaly apoptózu, zatímco jiné ne, jsme objevili formu aktivity GMP-specifické cyklické fosfodiesterázy, která předtím nebyla popsána. Tato nová fosfodiesterázová aktivita nebyla do té doby charakterizována. Bez ohledu na jakoukoliv specifickou teorii, věříme, že tato nová aktivita PDE může být nová konformace PDE2, která v podstatě postrádá cAMP-hydrolytickou aktivitu, tzn. je cGMP-specifická. Klasická PDE2 není cGMP-specifícká (hydrolyzuje také cAMP) a je rovněž zjištěna v nádorových buňkách. Tato nová PDE a PDE2 jsou užitečné při testování žádoucích protinádorových vlastností farmaceutických sloučenin. Stručně, v nádorových buňkách, kde jsou protinádorovými sloučeninami, inhibujícími PDE5, inhibovány aktivity PDE5 a PDE2 (v jejích nových a obvyklých konformacích), dochází k apoptóze. Je-li inhibována pouze PDE5 (ale ne několik forem PDE2), k apoptóze nedochází.

Z nej širšího pohledu má tato nová konformace PDE aktivitu, charakterizovanou:

(a) vyšší specifitou k cGMP než k cAMP;

(b) pozitivním kooperativním kinetickým chováním v přítomnosti cGMP substrátu;

(c) submikromolámí afinitou pro cGMP; a (d) necitlivostí k inkubaci s purifikovanou cGMP-dependentní proteinkinázou « · • · ·» »9»

Ostatní charakteristiky nové PDE zahrnují: má sníženou citlivost k inhibicí zaprinastem a E4021, může být separována od klasické PDE5 aktivity ionexovou chromatografií na anexu, není aktivována systémem vápník/kalmodulin a je necitlivá krolipramu, vinpocetinu a indolidanu.

Další provedení předmětného vynálezu zahrnuje zhodnocení, zdali sloučenina způsobuje v nádorových buňkách zvýšení aktivity cGMP-dependentní proteinkinázy G („PKG“) a/nebo snížení β-kateninu. Bylo zjištěno, že mezi neočekávané charakteristiky sloučenin SAAND patří zvýšení aktivity PKG a snížení β-kateninu v nádorových buňkách, vystavených působení sloučenin SAAND. Věříme, že ke zvýšení aktivity PKG dochází alespoň zčásti v důsledku zvýšení cGMP, způsobeného inhibicí odpovídajících PDE, látkami SAAND, jak je popsáno výše.

Ostatní charakteristiky SAAND jsou (1) inhibice PDE5, oznámené ve výše zmíněném patentu '694, (2) inhibice nové konformace cGMP-specifické PDE, (3) inhibice PDE2; (4) fakt, že SAAND zvyšují intracelulámí cGMP v nádorových buňkách, a (5) fakt, že snižují hladiny cAMP v některých typech nádorových buněk.

Jedno provedení nového způsobu předmětného vynálezu je zhodnocení, zdali sloučenina způsobuje zvýšení aktivity PKG v nádorových buňkách a zdali sloučenina inhibuje PDE5. Další provedení nového způsobu testování předmětného vynálezu je zhodnocení, zdali sloučenina způsobuje zvýšení aktivity PKG v nádorových buňkách a zdali sloučenina inhibuje novou cGMP-specifickou PDE, popsanou výše, a/nebo PDE2. Třetí provedení je zhodnocení, zdali sloučenina způsobuje zvýšení aktivity PKG v nádorových buňkách a zdali sloučenina způsobuje nárůst cGMP v nádorových buňkách a/nebo zdali způsobuje pokles hladin cAMP. Sloučeniny, úspěšně zhodnocené v těchto postupech, lze aplikovat jako SAAND.

Kromě jiného se tento vynález týká nových in vitro a in vivo metod výběru sloučenin, schopných bezpečně léčit nádory a předcházet nádorovým procesům, zejména prekancerózním procesům. Předmětný vynález je konkrétně způsob výběru sloučenin, které mohou být použity pro léčbu a prevenci nádorů včetně prekancerózních procesů. Takto identifikované sloučeniny mohou mít minimální vedlejší účinky, připisovatelné inhibici COX a další nespecifické interakce, spojené s obvyklými chemoterapeutiky. Sledované sloučeniny mohou být testovány tím, že jsou výše popsané nové PDE vystaveny působení sloučenin a jestliže sloučenina tuto novou PDE inhibuje, je dále hodnocena z hlediska jejích protinádorových vlastností (např. pomocí in vitro nebo in vivo modelového testování nebo zkoušek na zvířatech nebo lidech).

Jeden přístup tohoto vynálezu proto zahrnuje způsob testování/výběru pro identifikaci sloučenin, účinných při léčbě nádoru, který zahrnuje zjištění inhibice této nové PDE a/nebo ·

* * · • · · • · ··» ·· ·» 99Λ e·

PDE2 sledovanou sloučeninou a její inhibici COX. Testovací a výběrové metody předmětného vynálezu dále výhodněji zahrnují stanovení, zdali sloučenina inhibuje růst nádorových buněk in vitro nebo in vivo.

Pro vývoj farmaceutických prostředků a terapeutické léčby nádorových procesů mohou být takto uskutečněným výběrem sloučenin identifikovány potenciálně prospěšné a zlepšené sloučeniny pro léčbu nádorových procesů rychleji a s vyšší přesností než bylo možné dříve. Další prospěchy jsou zřejmé z následujícího podrobného popisu.

Předmětný vynález také zahrnuje farmaceutické prostředky, obsahující tyto sloučeniny a terapeutické metody, zahrnující tyto sloučeniny.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 je graf cGMP aktivit cGMP fosfodiesteráz, získaných z nádorových buněk SW480, jak byly změřeny v eluentu po chromatografii na koloně DEAE Trisacryl M.

Obrázek 2 je graf cGMP aktivit znovunanesených cGMP fosfodiesteráz, získaných z nádorových buněk SW480, jak byly změřeny v eluentu po chromatografii na koloně DEAE Trisacryl M.

Obrázek 3 je graf kinetického chování nové PDE předmětného vynálezu.

Obrázek 4 zobrazuje účinek sulfidových a sulfonových derivátů sulindaku (exisulind) na purifikovanou cyklooxygenázovou aktivitu.

Obrázek 5 zobrazuje účinek testovaných sloučenin B a E na inhibici COX.

Obrázek 6 zobrazuje inhibiční účinky sulfidu sulindaku a exisulindu na PDE4 a PDE5, purifikovaných z kultury nádorových buněk.

Obrázek 7 zobrazuje účinky sulfidu sulindaku na hladiny cyklických nukleotidů v buňkách HT-29.

Obrázek 8 zobrazuje fosfodiesterázovou inhibiční aktivitu sloučeniny B.

Obrázek 9 zobrazuje fosfodiesterázovou inhibiční aktivitu sloučeniny E.

Obrázek 10 zobrazuje účinky sulfidu sulindaku a exisulindu na apoptózu a nekrózu buněk

HT-29.

Obrázek 11 zobrazuje účinky sulfidu sulindaku a exisulindu na inhibici růstu buněk HT29 a indukci apoptózy, stanovené na základě fragmentace DNA.

Obrázek 12 zobrazuje vlastnosti, indukující apoptózu, sloučeniny E.

Obrázek 13 zobrazuje vlastnosti, indukující apoptózu, sloučeniny B.

Obrázek 14 zobrazuje účinky sulfidu sulindaku a exisulindu na růst nádorových buněk.

Ί

Obrázek 15 zobrazuje aktivitu, inhibující růst a aktivitu, indukující apoptózu, sulfidu sulindaku a kontroly (DMSO).

Obrázek 16 zobrazuje aktivitu, inhibující růst, sloučeniny E

Obrázek 17 zobrazuje inhibici pre-maligních nádorových poškození v kultuře myšší mléčné žlázy sulindakovými metabolity.

Obrázek 18A je SDS gel proteinů lyzátů buněk SW480 zlyzátů buněk, vystavených působení léku v nepřítomnosti přidaného cGMP. Buňky byly vystaveny po dobu 48 h působení DMSO (0,03 %, dráhy 1 a 2), exisulindu (200, 400 a 600 μΜ; dráhy 3,4,5) a E4021 (0,1, 1 a 10 μΜ; dráhy 6,7,8).

Obrázek 18B je SDS gel (po expozici na film) ze stanovení PKG v lyzátech buněk SW480 z lyzátů buněk, vystavených působení léku v přítomnosti přidaného cGMP. Buňky byly vystaveny po dobu 48 h působení DMSO (0,03 %, dráhy 1 a 2), exisulindu (200, 400 a 600 μΜ; dráhy 3,4,5) a E4021 (0,1, 1 a 10 μΜ; dráhy 6,7,8).

Obrázek 19 je sloupcový graf výsledků Western blotových experimentů, zobrazujících účinek exisulindu na β-katenin a hladiny PKG v nádorových buňkách v porovnání s kontrolou.

Obrázek 20 je graf cGMP aktivit cGMP fosfodiesteráz, získaných z nádorových buněk HTB-26, jak byly stanoveny v eluentu po chromatografii na koloně DEAE-Trisacryl M.

Obrázek 21 je graf cGMP aktivit cGMP fosfodiesteráz, získaných z nádorových buněk HTB-26, jak byly stanoveny v eluentu po chromatografii na koloně DEAE-Trisacryl M s nízkou a vysokou koncentrací substrátu.

Obrázek 22 je graf cGMP aktivit cGMP fosfodiesteráz, získaných z nádorových buněk LnCAP, jak byly stanoveny v eluentu po chromatografii na koloně DEAE-Trisacryl M.

Obrázek 23 je graf cGMP aktivit cGMP fosfodiesteráz, získaných z nádorových buněk LnCAP, jak byly stanoveny v eluentu po chromatografii na koloně DEAE-Trisacryl M s nízkou a vysokou koncentrací substrátu.

Obrázek 24 je sloupcový graf, zobrazující specifitu vazby nekatalytických cGMP vazebných míst PDE5 pro analoga cyklických nukleotidů a vybrané inhibitory PDE5.

Obrázek 25 je graf cGMP aktivit cGMP fosfodiesteráz, získaných z nádorových buněk SW480, jak byly stanoveny v eluentu po chromatografii na koloně DEAE-Trisacryl M použitím etylenglykolu v pufru.

Obrázek 26 je graf cGMP aktivit cGMP fosfodiesteráz, získaných z nádorových buněk SW480, kultivovaných v rotačních kultivačních nádobách, jak byly stanoveny v eluentu po chromatografii na koloně DEAE-Trisacryl M.

Obrázek 27A ukazuje časovou závislost nárůstu množství histonem-spojené fragmentované DNA, v kultuře buněk LNCaP, který následuje po působení 50 μΜ Sloučeninou I.

Obrázek 27B ukazuje průběh působení Sloučeniny I (50 μΜ) na buňky prostaty PrEC, kdy po dobu působení až 4 dny nedochází k ovlivnění fragmentace DNA.

Podrobný popis upřednostňovaných provedení

I. Nová cGMP-specifícká fosfodiesteráza a PDE2 z nádorových buněk

A. Izolace nové konformace PDE

Izolovaná cGMP-specifická fosfodiesteráza (která se jeví jako nová konformace PDE2) byla nejdříve připravena z linie buněk lidského karcinomu, běžně označované jako SW480, dostupné ze sbírky American Tissue Type Collection v Rockville, Maryland, USA. SW480 je linie buněk nádoru lidského tlustého střeva, která pochází z mírně odlišného epiteliálního adenokarcinomu. Jak je diskutováno níže, podobná konformace byla rovněž izolována z nádorů prsu (tzn. linie buněk ΗΤΒ-26) a prostaty (linie buněk LNCAP).

Pod pojmem „izolovaný“ míníme (jak je chápáno v oblasti techniky) nejen izolovaný z nádorových buněk, ale také vytvořený rekombinantními metodami (např. exprimovaný v buněčných liniích bakteriálních nebo jiných ne však lidských hostitelských vektorů). V současnosti však věříme, že je upřednostňovaná izolace z linií lidských nádorových buněk, protože předpokládáme, že takto izolované proteinové cíle mají strukturu (tzn. konformaci nebo topografii), která je podobnější, ne-li stejná, jako jedna zmožných nativních konformaci v nádorové buňce. Tato konformace pomáhá při výběru protinádorových sloučenin, které budou inhibovat cílový enzym(y) in vivo.

Aktivita nové PDE byla nejdříve zjištěna v linii buněk SW480 nádoru tlustého střeva. Pro izolaci nové fosfodiesterázy z SW480 bylo nakultivováno do konfluentního stavu přibližně 400 miliónů buněk SW480 a po dvojím promytí 10 ml vychlazeného PBS byly buňky setřeny z plochy misek pro tkáňové kultury o velikosti 150 cm² a byly odstředěny. Buňky ve formě pelety byly resuspendovány v homogenizačním pufru (20 ml TMPI-EDTA-Triton pH 7,4: 20 mM Tris-HOAc, 5 mM MgAc2, 0,1 mM EDTA, 0,8 % Triton-100, 10 μΜ benzamidin, 10 μΜ TLCK, 2000 U/ml aprotininu, 2 μΜ leupeptin, 2 μΜ pepstatin A) a homogenizovány v ledové lázni (3 krát, 20 s/puls). Homogenizovaný materiál byl odstředěn při 105 000 x g po dobu 60 • 9

9 9 9 <· ·· min. při 4 °C v odstředivce Beckmann L8 a supernatant byl zředěn TMPI-EDTA (60 ml) a aplikován na 10 mililitrovou kolonu DEAE-Trisacryl M, předem ekvilibrovanou TMPI-EDTA pufrem. Kolona s naneseným vzorkem byly promyta 60 ml (TM)-EDTA a aktivity PDE byly eluovány 120 mililitrovým lineárním gradientem NaOAC (0 až 0,5 M) v TM-EDTA, při průtoku 0,95 ml/min., 1,4 ml/frakce. V 80 frakcích, které byly najímány, byla ihned (tzn. během minut) stanovena hydrolýza cGMP. Obrázek 1 ukazuje eluční profil kolony, vykazující dva počáteční vrcholy cGMP PDE aktivity, vrchol A a B, které byly eluovány 40 až 50 mM resp. 70 až 80 mM NaOAC. Jak je vysvětleno níže, vrchol A je PDE5, zatímco vrchol B je nová cGMP-specifická fosfodiesterázová aktivita.

V každé frakci byla stanovena cGMP aktivita PDE a to modifikovanou dvoustupňovou radioizotopovou metodou podle Thomson a kol. (Thomson W.J.o kol., Adv. Cyclic Nukleotide Res. 10: 69 až 92, 1979), která je popsána níže. Reakce probíhala v reakční směsi o objemu 400 pl, která obsahovala Tris-HCl (40 mM; pH 8,0), MgCb (5 mM), 2-merkaptoetanol (4 mM), hovězí sérový albumin (30 pg), cGMP (0,25 μΜ až 5 μΜ) se substrátem, označeným tritiem (200 000 cpm). Inkubační doba byla upravena tak, aby docházelo k hydrolýze menší než 15 %ní. Směs byla inkubována při 30 °C, poté byla reakce zastavena varem po dobu 45 s. Směs byla poté ochlazena, byl přidán hadí jed (50 pg) a směs byla inkubována 10 min. při 30 °C. Pro zastavení reakce byl přidán MeOH (1 ml) a směs byla převedena na anexovou kolonu (Dowex 1-X8, 0,25 ml pryskyřice). K eluentu byl přidán druhý ml MeOH a vzorek byl aplikován na pryskyřici a po přidání 6 ml scintilační kapaliny byla po dobu 1 min. měřena na zařízení Beckmann LS 6500 aktivita tritia.

Aby byly rozděleny cGMP hydrolytické aktivity vrcholu A a B, byly dále frakce 15 až 30 z původních 80 znovu naneseny na kolonu DEAE-Trisacryl M a eluovány lineárním gradientem NaOAC (0 až 0,5 M) v TM-EDTA. U frakcí byla znovu ihned stanovena hydrolýza cGMP (pomocí výše popsaného postupu s 0,2, 2, 5 μΜ substrátem). Výsledky stanovení jsou graficky znázorněny na obr. 2. Jeden postřeh, týkající se vrcholu B, znázorněného na obr. 2, je, že na rozdíl od vrcholu A, vzrůstající koncentrace substrátu cGMP výrazně zvyšovala aktivitu. Zatímco tento fakt jev souladu s tím, že se jedná o PDE2, fakt, že enzym, charakterizovaný na obr. 2, je cGMP-specifický (viz níže) předpokládá, že má ve srovnání s klasickou PDE2, uváděnou v literatuře, novou konformaci. Aktivita vrcholu A ukazuje jasnou saturaci substrátem vysoce afinitních katalytických míst.

« 9 · · ♦ * » ♦ » 9 9 · • 9 9 · » 9 9 · • 9 99

B.Izolace klasické PDE2 z SW480

Byly zjištěny dva postupy, které umožňily izolovat „vrchol B“ z buněk SW480 tak, že enzym měl klasickou PDE2 aktivitu (tzn. nebyl cGMP-specifícký, ale byl stimulovaný cGMP). První postup zahrnuje růst SW480 v rotujících kultivačních lahvích o ploše 850 cm² místo tkáňových kultivačních baněk o ploše 150 cm². SW480 byly pěstovány v rotujících lahvích při rychlosti 0,5 rpm, přičemž každá láhev obsahovala 200 ml RPMI 1640, 2 mM glutamin a 25 mM HEPES. Buňky byly sklizeny následujícím postupem. PBS médium bylo zahříváno alespoň 15 min. na 37 °C. Bylo připraveno 200 ml roztoku, obsahujícího 5 % FBS/kompletní médium RPMI 1640 a bylo přidáno 5 ml glutaminu. Rovněž bylo přidáno 5 ml směsi antibiotikum/antimykotikum.

Do 10 ml roztoku 4X Pancreatinu bylo přidáno 70 ml roztoku PBS. Směs byla ponechána při teplotě místnosti. Médium bylo odstraněno a baňka byla propláchnuta 4 ml PBS, aby bylo jisté, že dno baňky bylo promyto. Roztok byl odstraněn pipetou. Do baňky byly přidány 4 ml zředěného Pancreatinu a baňka byla zatřepána tak, aby bylo roztokem pokryto i její dno. Baňka byla inkubována 8 až 10 min. při 37 °C. Poté bylo rychle pod mikroskopem ověřeno, že všechny buňky mají kulový tvar. Pro lepší oddělení buněk byla baňka několikrát opatrně obrácena na stranu. Do baňky bylo přidáno 10 ml vychlazeného kompletního média a tím byla zastavena proteolýza Pancreatinu. Aby byly buňky shromážděny dohromady byl roztok v baňce míchán rychlým krouživým pohybem. Médium bylo odstraněno pomocí 25 ml pipety a buňky byly v 50 ml odstřeďovacích zkumavkách umístěny do ledu. Zkumavky byly v klinické odstředivce odstředěny 5 min. při 1000 rpm a při 4 °C a buňky byly získány ve formě pelety. Supematant byl vylit a každá peleta byla zmrazená kapalným dusíkem po dobu 15 s. Sklizené buňky mohou být skladovány při -70 °C.

PDE ze sklizených buněk SW480 byly izolovány pomocí FPLC. Pro kontrolu nanášení a eluce vzorku na kolonu DEAE TrisAcryl M o objemu 18 ml bylo použito zařízení Pharmacia AKTA FPLC. Pro chromatografií, jejímž výsledkem byly uvedené eluční profily, bylo použito asi 600 miliónů buněk SW480. Po resuspendaci buněk v homogenizačním pufru (20 ml TMPIEDTA-Triton pH 7,4: 20 mM Tris-HOAc, 5 mM MgAc₂, 0,1 mM EDTA, 0,8 % Triton-100, 10 μΜ benzamidin, 10 μΜ TLCK, 2000 U/ml aprotininu, 2 μΜ leupeptin, 2 μΜ pepstatin A) byly vzorky manuálně homogenizovány. Pufr A obsahoval 8 mM Tris-acetát, 5 mM octan hořečnatý, 0,1 mM EDTA, pH 7,5 a pufr B obsahoval 8 mM Tris-acetát, 5 mM octan hořečnatý, 0,1 mM EDTA, 1 M octan sodný, pH 7,5. Supematanty byly na kolonu naneseny při rychlosti průtoku 1 ml za minutu a kolona byla poté při průtoku 1 ml za minutu promyta 60 ml pufru A. Použitý

gradient byl O až 15 % pufr B v 60 ml, 15 až 50 % pufr B v 60 ml a 50 až 100 % pufr B v 16 ml. Během gradientově eluce byly sbírány frakce po 1,5 ml.

Získaný eluční profil byl podobný (obr. 26) jako profil, získaný výše pro novou PDE aktivitu (viz např. obr. 1) až na to, že vrchol B, izolovaný tímto postupem, vykazoval cAMP hydrolytickou aktivitu při koncentraci substrátu 0,25 μΜ a která by mohla být 2 až 3 násobně aktivována 5 μΜ cGMP.

Druhý postup izolace klasické PDE2 z buněk SW480 zahrnoval chromatografii na koloně DEAE, ale nikoliv v uspořádání FPLC (viz sekce IA) a s takovou úpravou, že pufry obsahovaly 30 % etylenglykol, 10 mM TLCK a 3,6 mM β-merkaptoetanol. Přídavek těchto činidel do pufrů způsobil změnu v elučním profilu (viz obr. 25), kdy došlo k posunu z oblasti nízké koncentrace octanu sodného do oblasti vysoké koncentrace octanu sodného a to tak, že vrchol A se posunul z koncentrace octanu sodného 40 mM na koncentraci 150 mM, vrchol B z koncentrace 75 mM na koncentraci 280 mM a vrchol C z koncentrace 200 mM na koncentraci 500 mM (viz obr. 25). Vrchol B na obr. 25 byl stanovován s 2 μΜ substrátem cAMP a vykazoval 2 násobnou aktivaci roztokem 5 μΜ cGMP (viz obr. -Y). Selektivní inhibitor PDE2, EHNA, inhiboval PDE aktivitu v tomto vrcholu B s 2 μΜ cGMP s hodnotou IC50 1,6 μΜ a PDE aktivitu vrcholu B s 2,0 μΜ cAMP s hodnotou IC50 3,8 μΜ (a hodnotou IC50 2,5 μΜ po přídavku 10 μΜ rolipramu).

C. cGMP-specifita PDE z vrcholu A a nové aktivity z vrcholu B

U každé frakce po chromatografii na koloně DEAE ze sekce IA byla rovněž stanovena cGMP-hydrolytická aktivita (0,25 μΜ cGMP) v přítomnosti nebo nepřítomnosti Ca⁺⁺ nebo Ca⁺⁺CaM a/nebo EGTA a cAMP-hydrolytická aktivita (0,25 μΜ cAMP) v přítomnosti nebo nepřítomnosti 5 μΜ cGMP. Ani PDE vrcholu A ani vrcholu B (frakce 5 až 22; viz obr. 1) významně nehydrolyzovaly cAMP, což znamená, že žádná z nich nevykazovala aktivitu jako klasická rodina PDE, hydrolyzujících cAMP (tzn. PDE 1,2,3).

Ca⁺⁺ (s nebo bez kalmodulinu) nedokázal aktivovat cAMP ani cGMP hydrolytickou aktivitu vrcholu A i B a cGMP nedokázal aktivovat nebo inhibovat hydrolýzu cAMP. Tyto výsledky stanovily, že vrcholy A a B tvoří cGMP-specifické PDE, ale nikoliv klasické nebo dosud známé PDE1, PDE2, PDE3 nebo PDE4.

V případě nové PDE vrcholu B, jak je diskutováno níže, cyklický GMP aktivoval cGMP hydrolytickou aktivitu enzymu, ale neaktivoval žádnou cAMP hydrolytickou aktivitu (na rozdíl od vrcholu B z výše uvedené sekce IB). To ukázalo, že nová PDE vrcholu B - nová fosfodiesteráza předmětného vynálezu - buď nevykazuje hydrolýzu cAMP, stimulovanou cGMP * * 9 9 9 9 ··« 9 9 «·· 9 · 9 9 9 9 9 („cGS“) nebo nepatří do klasické nebo dosud známé rodiny PDE2 aktivit, jelikož známé izoformy PDE2 hydrolyzují jak cGMP tak i cAMP.

D. Vrchol A je klasická PDE5, ale nový vrchol B - nová cGMP-specifická PDE - nikoliv

Aby byla charakterizována jakákoliv izoforma PDE, bylo stanoveno kinetické chování a substrátová specifita.

Vrchol A vykazoval typické „PDE5“ charakteristiky. Například K_m enzymu pro cGMP byla 1,07 μΜ a V_max byla 0,16 nmol/min/mg. Dále, jak je diskutováno níže, zaprinast (IC50-1,37 μΜ), E4021 (ICso=3 nM) a sildenafil inhibovaly aktivitu vrcholu A. Zaprinast dále vykazoval inhibici cGMP hydrolytické aktivity vrcholu A, což je v souladu s výsledky, uvedenými v literatuře.

PDE vrcholu B ze sekce IA vykazovala oproti PDE vrcholu A značně odlišné kinetické vlastnosti. Například při použití výnosu podle Eadie-Hofstee pro vrchol A, poskytovala data pro hydrolýzu cGMP jednoduchou čáru, která se vzrůstající koncentrací substrátu klesala, což naznačovalo kinetické chování podle Michaelise-Mentenové. Při použití výnosů podle EadieHotfstee vykazoval vrchol B v nepřítomnosti cAMP novou vlastnost hydrolýzy cGMP s rostoucí koncentrací substrátu cGMP měla křivka klesající charakter (zdánlivá K_m=8,4) a poté vzrůstající charakter (K_m<l) (viz obr. 3). Toto určilo submikromolámí afinitu vrcholu B pro cGMP (tzn. kde K_m < 1).

Zvýšená cGMP hydrolytická aktivita v přítomnosti vzrůstajících koncentrací substrátu cGMP byla v souladu s kinetickými studiemi (tzn. obr. 3) a pozitivně-kooperativním kinetickým chováním v přítomnosti substrátu cGMP. Toto bylo objeveno na základě porovnání 0,25 μΜ, 2 μΜ a 5 μΜ koncentrací cGMP v přítomnosti PDE vrcholu B po druhé separaci na DEAE. Toto bylo provedeno proto, aby byla vyloučena cAMP hydrolýza a aby byl vyloučen tento nový enzym, předtím identifikovaný jako PDE5. V případě PDE vrcholu B způsobily vyšší koncentrace cGMP nepoměrně vyšší hydrolýzu cGMP, což je ukázáno na obr. 2.

Tato pozorování naznačila, že vazba cGMP na enzym vrcholu B způsobuje v enzymu konformační změny. Toto sice potvrzuje výhodu použití nativního enzymu z nádorových buněk, ale tento vynález není omezen pouze na nativní formu enzymu, mající výše uvedené charakteristiky.

♦'· 9 • Β · · » · · ·· ·«» «> «·

Ε. Necitlivost PDE vrcholu Β k Zaprinastu a Sildenafilu ve srovnání s vrcholem A a jejich účinky na další inhibitory PDE

Odlišné inhibitory PDE byly studovány pomocí dvanácti různých koncentrací léku v rozmezí od 0,01 μΜ do 100 μΜ a pomocí 0,25 μΜ substrátu ³H-cGMP. Hodnoty IC50 byly vypočítány ze sigmoidních křivek s různou směrnicí, které byly získány pomocí Prism 2,01 (GrapgPad). Výsledky jsou ukázány vtab. 1. Zatímco sloučeniny E4021 a zaprinast inhibovaly vrchol A, jsou hodnoty IC50 (s vysokými afinitami), spočítané pro novou aktivitu PDE vrcholu B (sekce IA), významně zvýšené (>50 krát). Toto potvrzuje, že vrchol Aje PDE5. Tato data dále ukazují, že aktivita nové PDE předmětného vynálezu je necitlivá vůči zaprinastu a E4021, což je důležité pro praktické účely.

Tabulka 1

Porovnání inhibitorů PDE pro vrchol A a vrchol B ze sekce IA (cGMP hydrolýza)

Sloučenina	Rodiny inhibitorů PDE	IC5O IC50 vrchol A (μΜ) vrchol Β (μΜ)	Poměr (IC50 vrchol A/vrchol B
E4021		5	0,003	8,4	0,0004
Zaprinast		5	1,4	>30	<0,05
Sloučenina E		5 a další	0,38	0,37	1,0
Sulfid sulindaku	5 a další	50	50	1,0
Vinpocetin		1	>100	>100
EHNA		2,5	>100	3,7
Indolidan		3	31	>100	<0,31
Rolipram		4	>100	>100
Sildenafil		5	0,0003	>10	<0,00003

V kontrastu s tím je skutečnost, že sulfid sulindaku a Sloučenina E kompetitivně inhibovaly se stejným účinkem fosfodiesterázy vrcholu A i B (IC5o=O,38 μΜ pro PDE vrcholu A; 0,37 μΜ pro PDE vrcholu B).

Pro léčbu nádorů a pro výběr užitečných sloučenin pro tuto léčbu má význam fakt, že vrchol B (nebo jeho forma) je necitlivý vůči zaprinastu, zatímco vrcholy A i B jsou citlivé vůči sulfidu sulindaku a Sloučenině E. Testovali jsme zaprinast, E4021 a sildenafil abychom zjistili,

4 *·· *· ** ♦·♦ ** *· indukuje-li apoptózu nebo inhibuje-li růst nádorových buněk a to stejné jsme zjišťovali pro Sloučeninu E. Jak bude vysvětleno níže, zaprinast sám o sobě neměl významné vlastnosti z hlediska indukce apoptózy nebo inhibice růstu, zatímco sulfid sulindaku a Sloučenina E ano. Jinými slovy schopnost sloučeniny inhibovat PDE vrcholu A i B souvisí s její schopností indukovat apoptózu v nádorových buňkách, zatímco, jestliže sloučenina (např. zaprinast) je specifická pouze k PDE vrcholu A, nebude tato sloučenina sama o sobě indukovat apoptózu.

F. Necitlivost nové PDE vrcholu B k inkubaci s cGMP-dependentní proteinkinázou G

Další rozdíly mezi PDE vrcholu A a novou PDE vrcholu B (sekce IA) byly pozorovány v jejich odpovídajících cGMP-hydrolytických aktivitách v přítomnosti různých koncentrací cGMP-dependentní proteinkinázy G (která fosforyluje typickou PDE5). Frakce vrcholů A i B ze sekce IA byly inkubovány s různými koncentracemi proteinkinázy G při 30 °C 30 min. Po pokusu o fosforylaci byla stanovena hydrolýza cGMP obou vrcholů. Vrchol A, v souladu s publikovanými informacemi o PDE5, vykazoval jako odpověď na inkubaci s proteinkinázou G zvýšenou hydrolýzu cGMP, což naznačuje, že vrchol A byl fosforylován. Vrchol B však zůstal nezměněn (tzn. nebyl fosforylován a nereagoval na inkubaci s cGMP-dependentní proteinkinázou G). Tato data se shodují s údaji pro vrchol A, což je izoforma, shodující se se známou rodinou PDE5 a vrchol B ze sekce IA je aktivita nové cGMP-specifické PDE.

G. Nový vrchol B v linii nádorových buněk prostaty a prsu

Nový vrchol B byl izolován ze dvou dalších linií nádorových buněk, linie nádorových buněk prsu, HTB-26 a linie buněk nádoru prostaty, LnCAP, podobným postupem jako byl použit pro jeho izolaci z SW480, která je uvedena výše. Protokol byl modifikován v několika směrech. Pro ještě vyšší reprodukovatelnost při srovnávání odlišných buněčných linií, bylo pro kontrolu nanášení vzorku a jeho eluce z kolony DEAE TrisAcryl M o objemu 18 ml, použito zařízení Pharmacia AKTA FPLC. Pro získání referenčního vrcholu B, byly SW480 aplikovány stejným postupem několikrát. Pro eluční profily bylo použito 200 až 400 miliónů buněk SW480. Pro eluční profil bylo použito 70 miliónů buněk LnCAP (viz obr. 22 a 23) a v jiném experimentu bylo použito 32 miliónů buněk HTB-26 (viz obr. 20 a 21). Po resuspendaci buněk v homogenizačním pufru byly vzorky manuálně homogenizovány. Pufr A obsahoval 8 mM TRIS-acetát, 5 mM octan hořečnatý, 0,1 mM EDTA, pH 7,5 a pufr B obsahoval 8 mM TRISacetát, 5 mM octan hořečnatý, 0,1 mM EDTA, 1 M octan sodný, pH 7,5. Supematanty byly na *» · • « · · ♦ t <

» f · ·· » « 9 · » #· ··»

9 9 » 9 9

9 9

9 9

9 kolonu aplikovány při průtoku 1 ml/min. a poté byla kolona promyta 60 ml pufru A při průtoku 1 ml/min. Použitý gradient byl 0 až 15 % pufr B v 60 ml, 60 ml 15 až 50 % pufr B a 50 až 100 % pufr B v 16 ml. Během gradientu byly sbírány frakce po 1,5 ml. Vrcholy, odpovídající cGMP PDE aktivitě, byly eluovány okolo frakce 65, což odpovídalo koncentraci octanu sodného 400 mM (viz obr. 20 až 23). Tato aktivita byla stanovena při koncentraci cGMP 0,25 μΜ (což naznačuje submikromolární afinitu k cGMP).

Rolipram, PDE4-specifický lék, inhiboval většinu cAMP aktivity PDE (tzn. cAMP aktivita byla důsledkem PDE4), což naznačuje, že cGMP aktivity vrcholů B byly více specifické pro cGMP než pro cAMP. Všechny tři vrcholy B (od SW480, HTB-26 a LnCAP) nevykazovaly stimulaci systémem Ca/kalmodulin a byly rezistentní ke 100 nM E4021, specifickému inhibitoru PDE5 jako je zaprinast (viz obr. 20 a 22). Vrcholy B rovněž vykazovaly velký nárůst aktivity v případě, že byla koncentrace substrátu cGMP zvýšena z 0,25 μΜ na 5 μΜ (naznačuje pozitivně-kooperativní kinetiku) (viz obr. 21 a 23). Tyto tři vrcholy rovněž vykazovaly podobnou inhibici níže uvedenými exisulindem a Sloučeninou I.

II. Začlenění proteinkinázy G a β-kateninu - obecně

Aby bylo zjištěno, jaký účinek, jestliže nějaký má, má protinádorový cGMP-specifický inhibitor PDE, jako je exisulind, na cGMP-dependentní proteinkinázu G („PKG“) v nádorových buňkách, obsahujících buď defekt genu pro adenomatózní póly pózu střeva („APC gen“) nebo defekt v genu, který kóduje β-katenin, byla provedena řada experimentů. Jak je vysvětleno níže, tento inhibitor způsobuje zvýšení aktivity PKG v těchto nádorových buňkách. K tomuto zvýšení aktivity nedochází pouze v důsledku zvýšené aktivace PKG v buňkách, obsahujících oba defekty, ale také v důsledku zvýšené exprese PKG v buňkách, obsahujících defekt APC. Dále, je-li PKG z nádorových buněk s oběma defekty imunoprecipitována, sráží se s β-kateninem.

β-katenin byl prokázán v řadě různých maligních nádorů, tím, že vědci zjistili vysoké hladiny β-kateninu u pacientů s nádorem, obsahujícím mutace genu APC, potlačující nádor. U lidí s mutacemi tohoto genu se od narození často objeví ve výstelce tlustého střeva tisíce malých nádorů. Jestliže APC gen pracuje správně, kóduje normální APC protein, o kterém se předpokládá, že se váže na β-katenin a reguluje ho. Objev, že PKG je v nádorových buňkách, obsahujících buď defekt APC genu nebo β-kateninu, vázána na β-katenin ve skutečnosti prokazuje, že PKG je začleněna do jedné z hlavních buněčných cest, která vede k malignímu nádoru. Dále, vzhledem ke vztahu mezi cGMP-specifickou inhibicí a zvýšením PKG během φ φ φ φ · • · · « φ · ♦ φ • · * * φ • · · Φ· φφφ * · « • · φ • φ « φφφ φ • · φ · léčby SAAND látkami existuje souvislost mezi cGMP a PKG/p-katenin/APC defektem v těchto buňkách.

Existence tohoto spojení je dále podpořena pozorováním, že β-katenin sám o sobě je snížen v případě, že jsou nádorové buňky, obsahující defekt APC nebo defekt β-kateninu, vystaveny působení látek SAAND. Toto snížení β-kateninu je iniciováno samotnou PKG. PKG fosforyluje β-katenin - což je další nové pozorování, spojené s tímto vynálezem. Fosforylace βkateninu umožňuje degradaci β-kateninu ubiquitin-proteazomálním systémem.

Fosforylace β-kateninu enzymem PKG je v nádorových buňkách důležitá, protože vylučuje účinek mutací APC a β-kateninu. Mutovaný APC protein záporně ovlivňuje vazbu βkateninu, vázaného na mutantní APC protein a tato změna ve vazbě byla zamýšlena pro prevenci fosforylace β-kateninu GSK-3b kinázou. V případě mutantního β-kateninu umožňuje zvýšení aktivity PKG rovněž fosforylaci mutantního β-kateninu. V nádorových buňkách, obsahujících oba typy mutace, se při zvýšení aktivity PKG v nádoru počítá s inhibicí cGMP-PDE a fosforylaci β-kateninu (vedoucí k jeho degradaci).

Ve stručnosti, tato zjištění nevedou pouze k novým farmaceutickým testovacím metodám identifikace dalších sloučenin typu SAAND, ale také podporují úlohu inhibice cGMP-specifické PDE v terapeutických přístupech k nádorovým procesům. Pomocí tohoto pozorování může být rovněž vysvětlen neočekávaně široký rozsah inhibičního působení SAAND sloučenin na nádorové procesy, protože, jak je vysvětleno níže, mohou být léčeny jak nádory s APC defektem tak i bez něj.

III. Testování farmaceutických prostředků pomocí PDE

A. Obecně

Pro identifikaci sloučenin, které mohou být použity pro léčbu nebo prevenci nádorů a které nejsou charakterizované řadou vedlejších účinků jsou užitečné nová PDE předmětného vynálezu a PDE2 s PDE5 nebo bez ní.

Maligní nádor a prekarcinom mohou být považovány za onemocnění, které zahrnuje neregulovaný buněčný růst. Buněčný růst se skládá z řady odlišných faktorů. Jeden faktor je, jak rychle se buňky množí a další je, jak rychle buňky umírají. Ke smrti buňky může dojít buď nekrózou nebo apoptózou, což závisí na vnějších podmínkách. Buněčná diferenciace je další faktor, který ovlivňuje kinetiku růstu nádoru. Pro nalezení významného cíle pro farmaceutickou terapii je důležité rozhodnutí, který z mnoha aspektů buněčného růstu je sloučeninou ovlivňován.

• · • * · « * *· ♦♦ • · · ♦ · « * · « · « • 9 9 9 9 9

9 9 9 9

.......

Při výběru sloučeniny, které inhibují růst a mají proapoptotickou aktivitu, mohou být testovací stanovení, založená na této technologii, kombinována, s jinými postupy.

Tento vynález je výsledkem několika důležitých objevů. Za prvé autoři vynálezu zjistili, že žádoucí inhibitory růstu nádorových buněk indukují apoptotickou smrt nezralých buněk maligního nádoru (viz Piazza, G.A., a kol., Cancer Research, 55(14), 3110 až 3116, 1995). Za druhé několik autorů vynálezu neočekávaně objevilo sloučeniny, které selektivně indukují apoptózu bez současné inhibice COX a také inhibují PDE5. Konkrétně a v kontrastu s významnými vědeckým studiemi sloučeniny, žádoucí pro léčbu nádorových stavů, inhibují PDE5 (EC 3.1.4.17). PDE5 je jedna z alespoň deseti genových rodin fosfodiesteráz. PDE5 a nová PDE předmětného vynálezu jsou jedinečné vtom, že selektivně degradují cyklický GMP a nedegradují cAMP, zatímco ostatní rodiny PDE selektivně degradují/hydrolyzují cAMP a nikoliv cGMP nebo degradují neselektivně jak cGMP tak i cAMP. Žádoucí sloučeniny, používané pro léčbu nádorových procesů, výhodněji téměř neinhibují neselektivní nebo cAMP degradující fosfodiesterázové typy.

B. Testování COX

Upřednostňované provedení předmětného vynálezu zahrnuje stanovení cyklooxygenázové inhibiční aktivity dané sloučeniny a rovněž stanovení její inhibiční aktivity cGMP-specifické PDE. U testovaných sloučenin jsou hodnoceny jejich schopnosti léčit bud’ přímo nebo nepřímo nádorové procesy a to porovnáváním jejich aktivit proti známým sloučeninám, užitečným pro léčbu nádorových procesů. Standartní sloučenina, o které je známo, že je účinná při léčbě nádorových procesů aniž by způsobovala podráždění žaludku, je 5-fluoro2- metyl-l-(p-metylsulfonylbenzyliden)-3-indenyloctová kyselina („exisulind“). Další skupinu sloučenin, užitečných pro srovnatelné účely, tvoří ty, o nichž je známo, že inhibují COX, jako je indomethacin a sulfidové metabolity sulindaku: 5-fluoro-2-metyl-l-(p-metylsulfmylbenzyliden)3- indenyloctová kyselina („sulfid sulindaku“). Mezi ostatní užitečné sloučeniny patří ty, o kterých je známo, že inhibují cGMP-specifické PDE, jako je l-(3-chloroanilino)-4-fenylftalazin („MY5445“).

Zde používaný termín „prekancerózní procesy“ zahrnuje syndromy, které jsou reprezentovány abnormálními nádorovými změnami tkáně včetně dysplastických. Jako příklady lze uvést dysplastické růsty v tkáních tlustého střeva, prsu, prostaty nebo plic nebo stavy jako je syndrom dysplastických névů, syndromy polypózy, polypy tlustého střeva, prekancerózní poškození cervixu (tzn. cervikální dysplazie), jícnu, plic, dysplazie prostaty, intraneoplazie ···« φ φ ·Φ φφφφ • · ♦ φφφ φφφφ • ♦ φφφ Φ φ φφ φφ φ • ♦ · φ φ · φφφφ

..............

prostaty, prsu a/nebo kůže a s tím spojené stavy (např. aktinická keratóza), zatímco procesy jsou nebo nejsou klinicky identifikovatelné.

Zde používaný termín „karcinom“ nebo „maligní nádor“ označuje poškození, která jsou maligní. Příklady zahrnují maligní melanomy, maligní nádor prsu, prostaty a tlustého střeva. Termíny „nádorový proces“ a „nádory“, jak jsou zde používány, označují jak maligní tak i prekancerózní procesy.

Zde používaná zkratka PG znamená prostaglandin; PS znamená prostaglandinsyntetáza; PGE2 znamená prostaglandin E2; PDE znamená fosfodiesteráza; COX znamená cyklooxygenáza; cyklický nukleotid, RIA znamená radioimunometoda.

Inhibice COX sloučeninou může být stanovena dvěma způsoby. Jeden postup zahrnuje měření vylučování PGE2 neporušenými buňkami HL-60, které následuje po vystavení buněk působení testované sloučeniny. Jiný postup zahrnuje měření aktivity purifíko váných cyklooxygenáz (COX) v přítomnosti testované sloučeniny. Oba postupy zahrnují protokoly, dříve popsané v literatuře, ale upřednostňované protokoly jsou uvedeny níže.

Sloučeniny mohou být hodnoceny podle toho, zdali inhibují produkci prostaglandinu E2 („PGE2“). Toto lze zjistit měřením PGE2 pomocí soupravy pro enzymové imunostanovení (EIA) PGE2 jako je např. komerčně dostupná souprava od firmy Amersham, Arlington Heights, IL USA. Vhodné buňky jsou ty, které produkují velké množství PG jako jsou např. buňky HL-60. Buňky HL-60 jsou lidské promyelocyty, které jsou pomocí DMSO rozdělovány do zralých granulocytů (viz Collins, S.J., Ruscetti, F.W., Gallagher, R.E. a Gallo, R.C., „Normál Functional Characteristics of Cultured Human Promyelocytic Leukemia Cells (HL-60) After Induction of Differentiation By Dimethylsulfoxid“ J. Exp. Med., 149: 969 až 974, 1979). Tyto diferenciované buňky produkují PGE2 po stimulaci kalciovým ionoforem, A23187 (viz Kargman, S., Prášit, P. a Evans, J.F.„ Translocation of HL-60 Cell 5-Lipoxygenase“, J. Biol. Chem., 266: 23745 až 23752, 1991). HL-60 jsou dostupné z ATCC (ATCC:CCL240). Mohou být kultivovány v atmosféře 5 % CO2 při 37 °C v médiu RPMI 1640, které je obohaceno 20 % tepelně inaktivovaným zárodečným hovězím sérem, 50 U/ml penicilinu a roztokem streptomycinu o koncentraci 50 pg/ml. Pro indukci myeloidní diferenciace jsou buňky vystaveny působení roztoku 1,3 %ního DMSO po dobu 9 dnů, poté jsou promyty a resuspendovány ve fyziologickém roztoku, pufrovaném fosfátem (Dulbecco) tak, že koncentrace buněk je 3 χ 10⁶ buněk/ml.

Diferenciované buňky HL-60 (3 χ 10⁶ buněk/ml) jsou inkubovány 15 min. při 37 °C v přítomnosti požadovaných koncentrací testovaných sloučenin. Buňky jsou poté stimulovány

pomocí A23187 (5 χ ΙΟ'⁶ Μ) 15 min.. PGE₂, vylučovaný do média, je měřen postupem, popsaným výše.

Jak je naznačeno výše, druhý postup stanovení inhibice COX sledovanou sloučeninou se skládá z měření aktivity COX v přítomnosti testované sloučeniny. V literatuře byly uvedeny dvě odlišné formy cyklooxygenázy (COX-I a COX-2), které regulují syntézu prostaglandinů. COX-2 reprezentuje indukovatelnou formu COX, zatímco COX-I je konstitutivní forma. Aktivita COX-I může být měřena metodou, kterou popsal Mitchell a kol. („Selectivity of Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs as Inhibitors of Constitutive and Inducible Cyclooxygenase, “ Proč. Nati. Acad. Sci. USA., 90:11693 až 11697, která je zde začleněna jako odkaz), která používá COX-I, purifikovanou z beranního semenného váčku, což popsali Boopathy a Balasubramanian, „Purification And Characterization of Sheep Platelet Cyclooxygenase“ (Biochem. J., 239:371 až 377, 1988, který je zde začleněn jako odkaz). Aktivita COX-2 může být měřena pomocí COX-2, purifikované z ovčí placenty, což popsal Mitchell a kol., 1993.

Cyklooxygenázová inhibiční aktivita léku může být stanovena postupy, které jsou známé vdané oblasti techniky. Například Boopathy a Balasubramanian, 1988, popsali postup, ve kterém je prostaglandin H syntetáza 1 (Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan) inkubována při 37 °C 20 min. s 100 μΜ kyselinou arachidonovou (Sigma Chemical Co.), kofaktory (jako je 1,0 mM glutathion, 1,0 mM hydrochinon, 0,625 μΜ hemoglobin a 1,25 mM CaCl₂ v 100 mM TrisHC1, pH 7,4) a testovaným lékem. Po inkubaci může být reakce zastavena trichloroctovou kyselinou. Po zastavení reakce přídavkem kyseliny thiobarbiturové a malonaldehydu může být měřena enzymová aktivita spektrofotometricky při 530 nm.

Sloučenina, která vykazuje nižší COX-I nebo COX-2 inhibiční aktivitu oproti jejím vyšším kombinovaným inhibičním aktivitám PDE5/nová PDE/PDE2, může být žádoucí sloučenina.

Množství COX inhibice je určeno porovnáním aktivity cyklooxygenázy v přítomnosti a nepřítomnosti testované sloučeniny. Zbytková (tzn. menší než asi 25 %) nebo žádná COX inhibiční aktivita při koncentraci přibližně 100 μΜ je náznakem toho, že by u sloučeniny měla být dále hodnocena její použitelnost přo léčbu nádorových procesů.

C. Stanovení fosfodiesterázové inhibiční aktivity

U sloučenin může být testován jejich inhibiční účinek na aktivitu nové fosfodiesterázy tohoto vynálezu pomocí buď enzymu, izolovaného výše popsaným postupem, rekombinantní verze nebo pomocí nové PDE a/nebo PDE2 spolu sPDE5. Hladiny cyklických nukleotidů

• · · · · · · ·· ··. ·· ·· v celých buňkách jsou měřeny metodou RIA a srovnávány s hladinami v neošetřených buňkách nebo buňkách, ošetřených zaprinastem.

Fosfodiesterázová aktivita může být stanovena postupy, známými v oblasti techniky, jako ,,,7, je např. metoda s použitím radioaktivního H cyklického GMP (cGMP)(cyklický 3',5'guanosinmonofosfát) jako substrátu pro enzym PDE. (Thomson, W.J., Teraski, W.L., Epstein, P.M., Strada, S.J., Advances in Cyclic Nucleotide Research, 10:69 až 92, 1979, který je začleněn jako odkaz). Ve stručnosti, roztok substrátu H-cGMP o definované specifické aktivitě (0,2 μΜ; 100 000 cpm; obsahující 40 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM MgCl₂ a 1 mg/ml BSA) je smíchán s testovaným lékem v celkovém objemu 400 μΐ. Směs je inkubována 10 min. při 30°C s izolovanou PDE předmětného vynálezu. Reakce je zastavena např. varem reakční směsi po dobu 75 s. Po ochlazení v ledu je přidáno 100 μΐ roztoku hadího jedu o koncentraci 0,5 mg/ml (jed O. Hannah, dostupný ze Sigmy) a směs je inkubována 10 min. při 30 °C. Tato reakce je poté zastavena přídavkem alkoholu např. 1 ml 100 %ního metanolu. Stanovované vzorky jsou aplikovány na kolonu Dowex 1-X8 o objemu 1 ml a kolona je promyta 1 ml 100 % metanolu. Množství radioaktivity je v objemu, který odpovídá mrtvému objemu kolony a v eluátu, změřeno scintilačním přístrojem. Stupeň inhibice fosfodiesterázy je vypočten z množství radioaktivity v reakcích, ve kterých byl přítomen lék a porovnáním získaných výsledků s kontrolním vzorkem (reakční směs bez testované sloučeniny, ale s roztokem léku).

Schopnost žádoucích sloučenin inhibovat fosfodiesterázy předmětného vynálezu se projevuje jako zvýšení cGMP v nádorových buňkách, vystavených působení testované sloučeniny. Množství aktivity PDE může být stanoveno měřením množství cyklického GMP v extraktu ošetřených buněk a to použitím radioimunoanalýzy (RIA). V tomto postupu byly buňky HT-29 nebo SW480 rozetřeny na misky a pěstovány do konfluentní fáze. Jak bylo naznačeno výše obsahovaly buňky SW-480 jak PDE5 tak i novou PDE předmětného vynálezu, takže je-li aktivita PDE zvýšena, je současně měřena kombinovaná cGMP hydrolytická aktivita. Testovaná sloučenina o koncentracích přibližně 200 μΜ až asi 200 pM je poté inkubována s buněčnou kulturou. Po asi 24 až 48 h je médium od buněk odděleno a buňky jsou rozpuštěny. Reakce je zastavena přídavkem roztoku 0,2 N HC1/50 % MeOH. Je odebrán vzorek pro stanovení proteinů. Cyklický GMP je z kyselino/alkoholového extraktu buněk purifíkován ionexovou chromatografií na anexu jako je kolona Dowex. cGMP je vysušen, acetylován podle publikovaného postupu jako např. pomocí roztoku acetanhydridu v trietylaminu (Steiner, A.L., Parker, C.W., Kipnis, D.M., J. Biol. Chem., 247(4): 1106 až 1113, 1971, který je zde začleněn jako odkaz). Acetylovaný cGMP je kvantifikován radioimunoanalýzou (Harper, J., Brooker,G., Advances in Nucleotide Research, W:1 až 33, 1979, zde začleněný jako odkaz). Iodované ligandy (metylester tyrosinu) derivatizováného cyklického GMP jsou v přítomnosti antiséra a vhodných pufrů inkubovány se standardy nebo neznámými vzorky. Antisérum může být připraveno řízenými technikami pomocí systému cyklický nukleotid-hapten. Antisérum je z ovce, které byly aplikovány konjugáty sukcinyl-cGMP-albumin a je zředěno 1/20 000. Interpolace dávek a odchylka od křivek standardů jsou aplikovány tak, jak bylo popsáno předtím (Seibert, A.F., Thompson, W.J., Taylor, A., Wilbourn, W.H., Barnard, J. a Haynes, J., J. Applied Physiol., 72:389 až 395, 1992, zde začleněný jako odkaz).

Kultivační média mohou být okyselena, zmrazená (-70 °C) a může v nich být analyzován obsah cGMP a cAMP.

Kromě zjištěných zvýšení obsahu množství cGMP v nádorových buňkách, ke kterým dochází v důsledku působení žádoucích sloučenin, bylo rovněž pozorováno snížení obsahu cAMP. Bylo pozorováno, že konkrétně požadovaná sloučenina (tzn. ta, která selektivně indukuje apoptózu pouze v nádorových buňkách, ale téměř nikoliv v normálních buňkách) má stejný časový průběh jako inhibice cGMP-specifické PDE jakožto počáteční akce, ke které dochází během několika minut při zvýšeném obsahu cGMP. Za druhé, působení žádoucí protinádorové sloučeniny na nádorové buňky vede během 24 h ke snížení obsahu cAMP. Intracelulámí cíle pro působení léků jsou studovány dále, ale současné údaje podporují myšlenku, že počáteční zvýšení obsahu cGMP a následný pokles cAMP předcházejí apoptóze v nádorových buňkách, vystavených žádoucím sloučeninám.

Změna poměru dvou cyklických nukleotidů může být přesnější prostředek pro stanovení žádoucí cGMP-specifické fosfodiesterázové inhibiční aktivity testovaných sloučenin spíše než pouze měření absolutní hodnoty cGMP, inhibice cGMP specifické fosfodiesterázy nebo pro stanovení pouze hladiny hydrolýzy cGMP. V nádorových buňkách, které nebyly ošetřeny protinádorovými sloučeninami, je poměr cGMP/cAMP v rozmezí 0,03 až 0,05 (tzn. 300 až 500 fmol/mg proteinu pro cGMP ku 6000 až 8000 fmol/mg proteinu pro cAMP). Po vystavení buněk působení žádoucích protinádorových sloučenin se poměr několikanásobně zvýší (výhodně alespoň 3 násobné zvýšení) což je výsledek počátečního zvýšení cyklického GMP a pozdějšího snížení cyklického AMP.

Bylo pozorováno, že konkrétně žádoucí sloučeniny dosahují počátečního zvýšení obsahu cGMP v ošetřených nádorových buňkách na hladinu cGMP vyšší než asi 500 fmol/mg proteinu. Dále konkrétně žádoucí sloučenina způsobuje pozdější snížení obsahu cAMP v ošetřených nádorových buňkách na hladinu cAMP menší než asi 4000 fmol/mg proteinu.

Ke stanovení obsahu cyklického AMP byly použity radioimunoanalýzy, podobné těm, které byly výše popsány pro cGMP. Stručně, cyklické nukleotidy jsou z kyselino/alkoholových • ·· «φ • 4 9 Φ φ φ • Φ Φ 4 9

9 9 4 4 4

4 9 4 9

94494 44

9 4

4 · extraktů buněk puntíkovány ionexovou chromatografií na anexu, jsou vysušeny, acetylovány podle publikovaných postupů a kvantifikovány radioimunoanalýzou. Jodované ligandy derivatizovaného cyklického AMP a cyklický GMP jsou v přítomnosti specifického antiséra a vhodných pufrů inkubovány se standardy nebo neznámými vzorky.

Obsah cyklického nukleotidu může být ověřen tím, že bude stanovena změna nebo akumulace cyklických nukleotidů v neporušených buňkách. Pro měření cAMP neporušené buňky je používán podle publikovaného postupu předem označený ³H-adenin (Whalin, M.E., Garrett Jr,. R.L., Thompon, W.J., a Strada,S.J. „Correlation of cell-free brain cyclic nucleotide phosphodiesterase activities to cyclic AMP decay in intact brain slices“ Sec. Mess. and Phos. Protein Research, 12:311 až 325, 1989, který je zde začleněn jako odkaz). Tímto postupem je měřena přeměna značeného ATP na cyklický AMP a v závislosti na specifickém protokolu může být daný postup použit pro odhadnutí aktivit adenylátcyklázy nebo cyklické nukleotidové fosfodiesterázy v neporušených buňkách. Akumulace cyklického GMP byla velmi nízká a proto, ji nebylo možno použít pro studium neporušených předem označených buněk podle publikovaných postupů (Reynolds, P.E., Strada, S.J., a Thompson, W.J. „Cyclic GMP Accumulation In Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Measured By Intact Cell Prelabeling,“ Life Sci., 60:909 až 918, 1997, který je zde začleněn jako odkaz).

Účinek sloučeniny na inhibiční aktivitu PDE může být stanoven rovněž ve vzorku tkáně. Od subjektů, které byly vystaveny působení testovací sloučeniny, jsou odebírány tkáňové biopsie u lidí nebo tkáně z anestezováných zvířat. Vzorek tkáně je homogenizován v 500 μΐ 6 % TCA. Známé množství homogenátu je odebráno pro stanovení proteinů. Zbývající homogenát je ponechán 20 min. v ledu, aby došlo k vysrážení proteinů. Dále je homogenát odstředěn 30 min. při 15 000 g a při 4 °C. Je tak získán supematant a peleta. Supematant je 4 krát promyt 5 objemy vody, saturované dietyléterem. Vrchní éterová vrstva je po každém promytí odstraněna. Vodný éterový extrakt je vysušen. Vysušený vzorek může být zmrazen pro další použití nebo může být použit bezprostředně. Vysušený extrakt je rozpuštěn v 500 μΐ pufru pro stanovení. Množství cGMP-specifické inhibice je stanoveno měřením množství cyklických nukleotidů metodou RIA, která je popsána výše.

Množství inhibice je stanoveno na základě porovnání aktivity nové PDE (nebo PDE2) v přítomnosti a nepřítomnosti sloučeniny. Inhibice aktivity nové PDE (nebo PDE2) je náznakem toho, že sloučenina je užitečná pro léčbu nádorových procesů. Významná inhibiční aktivita, vyšší než aktivita exisulindu, výhodněji vyšší než 50 % při koncentraci 10 μΜ nebo nižší, je náznakem toho, že by sloučenina mohla být dále hodnocena z hlediska jejích protinádorových

4 · ·· »«

44

4 4 4

4 4 4

4 4 4

4 4 4

44 vlastností. Výhodněji by měla být hodnota IC50 inhibice nové PDE pro sloučeninu, u které je zvažováno další použití, nižší než 50 μΜ.

D. Stanovení, zdali sloučenina zabraňuje růstu nádorových buněk

V alternativním provedení zahrnuje způsob předmětného vynálezu další stanovení toho, zdali sloučenina zabraňuje růstu nádorových buněk.

Ve vzorku mohou být podle testované tkáně použity různé linie buněk. Například mezi tyto buněčné linie patří: SW-480 - adenokarcinom tlustého střeva; HT-29 - adenokarcinom tlustého střeva, A-427 -adenokarcinom plic; MCF-7 - adenokarcinom prsu a UACC-375 melanomová linie; a DUI45- karcinom prostaty. Údaje o cytotoxicitě, získané použitím těchto buněčných linií, indikují inhibiční účinek nádorových poškození. Tyto buněčné linie jsou dobře charakterizované a jsou používány v United States National Cancer Institute v testovacím programu pro nové léky proti rakovině.

Schopnost sloučenin inhibovat růst nádorových buněk může být měřen pomocí linie buněk HT-29 karcinomu lidského tlustého střeva, získané zATCC. Buňky HT-29 byly již charakterizovány jakožto důležitý model kultury buněk karcinomu tlustého střeva (Fogh, J., a Trempe, G. In: Human Tumor Cells in Vitro, J. Fogh (eds.), Plenární přednáška, New York, str. 115 až 159, 1975). Buňky HT-29 jsou udržovány ve vlhčené atmosféře 95 % vzduchu a 5 % CO2, při 37 °C, v RPMI médiu, které je obohaceno 5 % zárodečným telecím sérem (Gemini Bioproducts, lne., Carlsbad, CA), 2 mM glutaminem a 1 % roztokem antibiotikum/antimykotikum. Stručně, buňky HT-29 jsou rozděleny do mikrotitračních destiček s 96 jamkami tak, že na každou jamku připadá 500 buněk a destičky jsou inkubovány 24 h při 37 °C. Poté je přidána sloučenina. Každé stanovení počtu buněk je prováděno 6 krát. Po 6 dnech jsou buňky fixovány takovým přídavkem vychlazené trichloroctové kyseliny, že konečná koncentrace je 10 % a obsah proteinů je měřen kolorimetrickou metodou pro stanovení proteinů s použitím sulforhodaminu B (SRB), která je popsána v literatuře autory Skehan, P., Storeng, R., Scudiero, D., Monks, A., McMahon, J., Vistica, D., Warren, J.T., Bokesch, H., Kenney, S., a Boyd, M.R. „New Colorimetric Assay For Anticancer-Drug Screening,“ J. Natí Cancer Inst. 82:1107 až 1112,1990, který je zde začleněn jako odkaz.

Kromě SRB stanovení je dostupná řada dalších způsobů stanovení inhibice růstu, které mohou nahradit SRB stanovení. Tyto postupy zahrnují počítání živých buněk po fixování roztokem trypan blue, značení buněk, schopných syntézy DNA, BrdU nebo radioznačeným thymidinem, fixování živých buněk neutrální červení nebo fixování živých buněk MTT.

·· ·» φ · · · • · · · • · · · · • · · · • ·» ·· ·· ·· · · • * · • · · · • · ·

Významná inhibice růstu nádorových buněk tj. vyšší než 50 % při dávkách 100 μΜ nebo nižších je dalším náznakem toho, že sloučenina je užitečná pro léčbu nádorů. Výhodněji je stanovena hodnota IC50, která je použita pro srovnávání. Tato hodnota je koncentrace léku, která je potřebná pro 50 % inhibici růstu nádorových buněk ve srovnání s kontrolou. Pro sloučeninu, u které je dále zvažováno použití pro léčbu nádorových procesů, by měla být hodnota IC50 výhodněji nižší než 100 μΜ.

E. Stanovení, zdali sloučenina indukuje apoptózu

Ve druhém alternativním provedení testovací postup předmětného vynálezu dále zahrnuje stanovení, zdali sloučenina indukuje apoptózu v kulturách nádorových buněk.

Za pomoci morfologických a biochemických kritérií mohou být popsány dvě odlišné formy buněčné smrti: nekróza a apoptóza. Nekróza je doprovázena zvýšenou propustností plazmatické membrány; buňky botnají a plazmatická membrána je během několika minut porušena. Apoptóza je charakterizována tvorbou puchýřků na membráně, kondenzací cytoplazmy a aktivací endogenních endonukleáz.

Apoptóza se přirozeně vyskytuje během přeměny normální tkáně a během embryonálního vývoje orgánů a končetin. Apoptóza je také indukována cytotoxickými T-lymfocyty a přirozenými zabíječi buněk, ionizující radiací a spolehlivými chemoterapeutickými léky. Předpokládá se, že nevhodná regulace apoptózy hraje důležitou roli v řadě patologických stavů včetně karcinomu, AIDS, Alzheimerovy choroby apod. U sloučenin může být testována indukce apoptózy pomocí kultur nádorových buněk, uchovávaných za podmínek, které jsou popsány výše. Působení testovaných sloučenin na buňky zahrnuje buď pre-konfluentní nebo postkonfluentní kultury a působení po dobu 2 až 7 dnů při různých koncentracích. Apoptotické buňky jsou měřeny v napadených i „plovoucích“ částech kultur. Po odstřeďovacím promývacím kroku (10 min., 2000 rpm) jsou obě části shromážděny odstraněním supematantu, trypsinací napadených buněk a spojením obou preparátů. Protokol pro léčbu nádorových buněk pomocí sulindaku a podobných sloučenin, s cílem získat významný stupeň apoptózy, byl popsán v literatuře, (viz Piazza, G.A., a kol, Cancer Research, 55:3110 až 3116, 1995, který je zde začleněn jako odkaz). Nové významné znaky zahrnují sbírání plovoucích i napadených buněk, určení takové optimální doby působení a takového dávkování, aby byla pozorována apoptóza a identifikaci podmínek, optimálních pro buněčné kultury.

Po působení sloučenin na kultury může být stanovena apoptóza a nekróza pomocí fluorescenčního mikroskopu po předcházejícím označení akridinovou oranží a ethidium

bromidem. Metodu měření počtu apoptotických buněk již popsali Duke a Cohen, „Morphological And Biochemical Assays Of Apoptosis,“ Current Protocols In Immunology, Coligan a kol., eds., 3.17.1 až 3.17.16 (1992, začleněno jako odkaz).

Plovoucí a napadené buňky mohou být například sbírány trypsinací a trojnásobným promy tím PBS. Alikvotní podíly buněk mohou být odstředěny. Peleta může být poté resuspendována v médiu a ve směsi barviček, obsahující akridinovou oranž a ethidium bromid, která je připravena v pufru a jemně míchána. Směs může být poté umístěna na podložní sklíčko a mohou být určeny hlavní morfologické znaky apoptózy.

Apoptóza může být také kvantifikována měřením nárůstu fragmentace DNA v buňkách, na které bylo působeno testovanými sloučeninami. Pro kvantitativní in vitro stanovení cytoplazmatických histonem-spojených fragmentů DNA (mono a oligonukleozómy) je dostupná komerční fotometrická EIA (Cell Death Detection ELISA^okys, Kat. č. 1774425, Boehringer Mannheim). Toto stanovení je založeno na principu sendvičové enzymoimunoanalýzy s použitím myšších monoklonálních protilátek proti DNA a histonům.To umožňuje specifické stanovení mono- a oligonukleozómů v cytoplazmatické frakci buněčných lyzátů.

Kromě stanovení apoptózy pomocí soupravy lze apoptózu měřit následujícím způsobem. Vzorek (lyzát buněk) je umístěn do mikrotitrační destičky, potažené streptavidinem („MTP“). Dále je přidána směs konjugátů protilátky proti histon-biotin a proti DNA s peroxidázou a jsou inkubovány 2 h. Během inkubace se protilátka proti histonu váže na histonovou složku nukleozómů a současně fixuje imunokomplex na streptavidinem potaženou MTP prostřednictvím její biotinylace. Peroxidázou značená protilátka proti DNA reaguje s DNA složkou nukleozómů. Po odstranění nenavázaných protilátek v promývacím kroku, je množství nukleozómů kvantifikováno pomocí peroxidázy, zadržené v imunokomplexu. Peroxidáza je stanovena fotometricky s ABTS7 (2,2'-Azido-[3-etylbenzthiazolin-sulfonát]) jako substrátem.

Například buňky SW-480 adenokarcinomu tlustého střeva byly rozděleny do mikrotitrační destičky MTP s 96 jamkami tak, že hustota buněk byla 10 000 buněk/jamku. Buňky byly poté vystaveny působení testované sloučeniny a ponechány inkubovat 48 h při 37 °C. Po inkubaci byla MTP odstředěna a supernatant byl odstraněn. Peleta buněk v každé jamce byla resuspendovávána v pufru pro lýzi po dobu 30 min.. Lyzáty byly odstředěny a alikvoty supernatantu (tzn. cytoplazmatické frakce) byly převedeny do MTP, potažené streptavidinem. Je třeba dbát na to, aby lyžované pelety (tzn. buněčná jádra, obsahující vysokomolekulární nefragmentovanou DNA) nebyly v MTP míchány. Poté byly vzorky analyzovány.

• ♦ * · • · · · · « · • « · · · · • 9 · · · · · • · · · · · • · · · · · ·

Násobek stimulace (FS=OD_max/OD_veh), jakožto indikátor apoptotické odezvy, je stanovován při daných koncentracích pro každou testovanou sloučeninu. Hodnoty EC50 mohou být rovněž stanoveny zhodnocením řady koncentrací testované sloučeniny.

Statisticky významné zvýšení apoptózy (tzn. vyšší než dvounásobná stimulace při koncentraci 100 μΜ) je dalším náznakem toho, že sloučenina je užitečná pro léčbu nádorů. Výhodněji by měla být hodnota EC50 pro apoptotickou aktivitu pro sloučeninu, u které je dále zvažováno použití při léčbě nádorových onemocnění, nižší než 100 μΜ. EC₅o je zde definována jako koncentrace, která způsobuje 50 % indukci apoptózy v porovnání s léčbou vehikulem.

F. Modelové testy orgánové kultury mléčné žlázy

U testovaných sloučenin, identifikovaných výše uvedenými postupy, může být testována protinádorová aktivita na základě jejich schopnosti inhibovat průběh prenádorových procesů v systému orgánové kultury mléčné žlázy. Tuto techniku s použitím orgánové kultury mléčné žlázy myši úspěšně použili další vědci pro studium účinků známých protinádorových činidel jako jsou určité NSAID, retinoidy, tamoxifen, selen a určité přirozené produkty a lze ji použít pro ověřování správnosti testovacích metod předmětného vynálezu.

Například, samice myši BALB/c může být léčena kombinací estradiolu a progesteronu, které jsou podávány denně, aby byla u žlázy vyvolána odezva na hormony in vitro. Zvířata jsou usmrcena a hrudní mléčné žlázy jsou asepticky vyříznuty a inkubovány 10 dní v růstovém médiu, které je obohaceno insulinem, prolaktinem, hydrokortizonem a aldosteronem. Aby došlo k indukci tvorby premaligních procesů, je do média přidán DMBA (7,12dimetylbenz(a)antracen). Zcela vyvinuté žlázy jsou poté zbaveny prolaktinu, hydrokortizonu a aldosteronu, které vznikají při regresi žláz, ale ne při premaligních procesech.

Testovaná sloučenina je rozpuštěna v DMSO a přidávána do kultury. Na konci období kultury jsou žlázy fixovány v 10 % formalinu, fixovány salum karminem a umístěny na skleněná sklíčka. Výskyt vzniku poškození mléčné žlázy je poměr poškozených mléčných žláz a žláz bez poškození. Výskyt postižení mléčné žlázy ve žlázách, které byly pod vlivem testované sloučeniny, je porovnán s těmi, které sloučeninou ošetřeny nebyly.

Plocha, kterou zaujímají poškození mléčné žlázy může být kvantifikována promítnutím obrazu žlázy do digitální formy. Plocha, odpovídající žláze, je vyhledána v digitálním obraze a považována za 100 %. V digitalizovaném obraze je také nastíněn počítačově kvantifikovaný prostor, který zaujímá každá struktura bez regrese.

• *

Příklady provedení vynálezu

Experimentální výsledky

V různých protokolech byla u řady sloučenin testována možnost využití při léčbě nádorů. Výsledky těchto testů jsou uvedeny níže. Testované sloučeniny jsou dále označené následujícím pí směnným kódem:

A. rac-threo-(E)-1 -(N,N'-dietylaminoetanethio)-1 -(butan-1 ',4 '-olido)-[3 ',4': 1,2]-6-fluoro-2metyl-3-(p-metylsulfonylbenzyliden)-indan;

B. (Z)-5-fluoro-2-metyl-l-(3,4,5-trimetoxybenzyliden)-3-octová kyselina;

C. (Z)-5-fluoro-2-metyl-l-(p-chlorobenzyliden)-3-octová kyselina;

D. rac-(E)-1 -(butan-1',4'-olido)-[3 ',4': 1,2]-6-fluoro-2-metyl-3-(p-metylsulfonylbenzyliden)-1Sindanyl-N-acetylcystein;

E. (Z)-5-fluoro-2-metyl-l-(3,4,5-trimetoxybenzyliden)-3-indenylacetamid, N-benzyl;

F. (Z)-5-fluoro-2-metyl-l-(p-metylsulfonylbenzyliden)-3-indenylacetamid,

N,N'-dicyklohexyl;

G. ribo-(E)-1 -triazolo-[2',3': Γ ',3 ]-1 -(butan-1 ',4 '-olido)-[3 ',4': 1,2]-6-fluoro-2-metyl-3-(pmetylsulfonylbenzyliden)-indan;

H. rac-(E)-l-(butan-1 ',4'-olido)-[3',4':l,2]-6-fluoro-2-metyl-3-(p-metylsulfonylbenzyliden)-lSindanyl-glutathion).

Příklad 1 - stanovení inhibice COX

U referenčních a testovaných sloučenin byla analyzována jejich COX inhibiční aktivita v souladu s protokolem na stanovení COX. Obr. 4 ukazuje účinek různých koncentrací sulfidu sulindaku nebo exisulindu na aktivitu purifikované cyklooxygenázy (Typ 1). Aktivita

··· ·· ·> ··· ·· ·« cyklooxygenázy byla stanovena použitím purifikované cyklooxygenázy z beranních semenných váčků, jak bylo popsáno dříve (Mitchell a kol.) Hodnota IC₅₀, spočítaná pro sulfid sulindaku, byla asi 1,76 μΜ, zatímco pro exisulind byla vyšší než 10 000 μΜ. Tato data ukazují, že sulfid sulindaku je, na rozdíl od exisulindu, inhibitor COX-1. Podobná data byla získána pro izoenzym COX-2 (Thompson a kol., Journal of the National Cancer Institute, 87: 1259 až 1260, 1995).

Obrázek 5 ukazuje účinek testovaných sloučenin B a E na inhibicí COX. Aktivita COX byla stanovena stejně jako v případě sloučenin, ukázaných na obr. 4. Data ukazují, že ani testovaná sloučenina B ani E významně neinhibují COX-1.

Tabulka 2

Cyklooxygenázová inhibiční aktivita u řady sloučenin

Referenční sloučeniny	% inhibice při koncentraci 100 μΜ
Indomethacin	95
MY5445	94
Sulfid sulindaku	97
Exisulind	<25
Testované sloučeniny	% inhibice při koncentraci 100 μΜ
A	<25
B	<25
C	87
D	<25
E	<25

V souladu s protokolem, viz výše, byla u sloučenin A až E hodnocena COX inhibiční aktivita, což je uvedeno v tab. 2. Sloučenina C při dávce 100 μΜ inhibovala COX více než z 25 % a proto nebyla pro další testování vybrána.

Příklad 2- stanovení inhibice cGMP PDE

U referenčních a testovaných sloučenin byla analyzována jejich inhibiční aktivita cGMP PDE v souladu s protokolem na stanovení, který byl uveden výše. Obr. 6 ukazuje účinek různých koncentrací sulfidu sulindaku a exisulindu na aktivitu PDE4 nebo cGMP PDE, purifikované • · • φ φ · * φφφ · · · · • φ φ φφ φ · · φ · φφ φφφ φ φ φφ φφ φ z kultury buněk HT-29 nádoru lidského tlustého střeva, které byly popsány dříve (W.J.Thompson a kol.). Hodnota IC50 sulfidu sulindaku pro inhibici PDE4 byla 41 μΜ, a pro inhibici cGMP PDE byla 17 μΜ. Hodnota IC50 exisulindu pro inhibici PDE4 byla 181 μΜ, a pro inhibici cGMP PDE byla 56 μΜ. Tato data ukazují, že sulfid sulindaku i exisulind inhibují fosfodiesterázovou aktivitu. Obě sloučeniny vykazovaly vyšší selektivitu pro cGMP PDE izoenzymovou formu než pro PDE4 izoformu.

Obr. 7 ukazuje účinek sulfidu sulindaku na produkci cGMP nebo cAMP, který byl v souladu s popsaným stanovením stanoven v kultuře buněk HT-29. Buňky HT-29 byly vystaveny působení sulfidu sulindaku po dobu 30 min. a vhodnou radioimunometodou byl měřen cGMP nebo cAMP. Jak naznačují výsledky sulfid sulindaku zvyšuje hladiny cGMP o více než 50 % s hodnotou EC50 7,3 μΜ (obr. 7A). Hladiny cAMP nebyly vlivem sloučeniny změněny, ačkoliv známý inhibitor PDE4, rolipram, cAMP zvyšoval (obr. 7B). Data demonstrují farmakologický význam inhibování cGMP PDE ve vztahu k PDE4.

Obr. 8 ukazuje účinek naznačené dávky testované sloučeniny B na izoenzymy fosfodiesterázy cGMP PDE nebo PDE4. Vypočítaná hodnota IC50 byla 18 μΜ pro cGMP PDE a 58 μΜ pro PDE4.

Obr. 9 ukazuje účinek naznačené dávky testované sloučeniny E na PDE4 nebo cGMP PDE. Vypočítaná hodnota IC50 byla 0,08 μΜ pro cGMP PDE a vyšší než 25 μΜ pro PDE4.

Tabulka 3

Inhibiční aktivita cGMP PDE, zjišťovaná u řady sloučenin

Referenční sloučeniny	% inhibice při koncentraci 10 μΜ
Indomethacin	34
MY5445	86
Sulfid sulindaku	97
Exisulind	39
Testované sloučeniny	% inhibice při koncentraci 10 μΜ
A	<25
B	<25
C	<25
D	36
E	75

U sloučenin, uvedených v tab. 3, byla hodnocena inhibiční aktivita PDE podle výše uvedeného protokolu. Ze sloučenin, které neinhibovaly COX, bylo pouze u sloučeniny E zjištěno, že při koncentraci 10 μΜ způsobuje vyšší než 50 % inhibici. Jak je uvedeno na obr. 8, sloučenina B vykazuje vyšší než 50 % inhibici při koncentraci 20 μΜ. Z tohoto důvodu mohou být v závislosti na hladině dávky, použité v jednodávkovém testu, zachyceny takové sloučeniny, které mohou být aktivní při trochu vyšších dávkách. Použitá dávka je individuální a může být snížena v případě, že jsou zjištěny určité hladiny sloučeniny, při kterých je sloučenina aktivní. Tím lze identifikovat ještě účinější sloučeniny.

Příklad 3 - stanovení apoptózy

U referenčních a testovaných sloučenin byla stanovena inhibiční aktivita nové PDE v souladu s protokoly pro stanovení. V souladu s těmito protokoly ukazuje obr. 10 účinek sulfidu sulindaku a exisulindu na apoptotickou a nekrotickou smrt buněk. Buňky HT-29 byly vystaveny po dobu 6 dnů působení naznačených dávek sulindaku nebo exisulindu. Apoptotická a nekrotická smrt buněk byla stanovena nejdříve (Duke a Cohen, V: Current Protocols in Immunology, 3.17.1 až 3.17.16, New York, John Wiley and Sons, 1992). Data ukazují, že jak sulfid sulindaku tak i exisulind jsou schopny způsobit apoptotickou smrt buňky, aniž by indukovaly nekrózu. Všechna data byla získána ze stejného experimentu.

Obrázek 11 ukazuje účinek sulfidu sulindaku a exisulindu na inhibici růstu nádoru a indukci apoptózy, což bylo stanoveno fragmentací DNA. Horní obrázek (1 IA) je inhibice růstu (otevřené symboly, levá osa) a fragmentace DNA (uzavřené symboly, pravá osa) exisulindem. Spodní obrázek (11B) je inhibice růstu (otevřené symboly) a fragmentace DNA (uzavřené symboly) sulfidem sulindaku. Inhibice růstu byla stanovena pomocí SRB po 6 dnech působení. Fragmentace DNA byla stanovena po 48 h působení. Všechna data byla získána ze stejného experimentu.

Obrázek 12 ukazuje vlastnosti sloučeniny E, které indukují apoptózu. Buňky HT-29 adenokarcinomu tlustého střeva byly ošetřeny naznačenou koncentrací sloučeniny E po dobu 48 h a poté byla metodou fragmentace DNA stanovena apoptóza. Vypočítaná hodnota EC50 byla 0,05 μΜ.

Obrázek 13 ukazuje vlastnosti sloučeniny B, které indukují apoptózu. Buňky HT-29 adenokarcinomu tlustého střeva byly ošetřeny naznačenou koncentrací sloučeniny B po dobu 48 h a metodou fragmentace DNA byla stanovena apoptóza. Vypočítaná hodnota EC50 byla 175 μΜ.

·» • ό · · · ··» * « ♦ · • · « « · · · · · · 1 · · · · ♦ · · · «· · ··· « » · « * · · «·· ·· ·· ·«· ·· ··

Tabulka 4

Aktivita, indukující apoptózu, řady sloučenin

Referenční sloučeniny	násobek indukce při koncentraci 100 μΜ
Indomethacin	<2,0
MY5445	4,7
Sulfid sulindaku	7,9
Exisulind	<2,0
E4021	<2,0
Zaprinast	<2,0
Sildenafil	<2,0
EHNA	<2,0
Testované sloučeniny	násobek indukce při koncentraci 100 μΜ
A	<2,0
B	3.4
C	5,6
D	<2,0
E	4,6

V souladu s protokolem, který se týká násobné indukce, byla u sloučenin A až E testována aktivita, indukující apoptózu, která je uvedena v tab. 4. Sloučeniny B, C a E vykazují při dávce 100 μΜ významnou více než dvojnásobnou aktivitu, indukující apoptózu. Z těchto tří látek pouze sloučenina B při daných dávkách neinhibovala COX, ale inhibovala cGMPspecifickou PDE.

U řady inhibitorů fosfodiesterázy byla stanovena aktivita, indukující apoptózu. Data jsou uvedena v tab. 5, viz níže. Buňky HT-29 byly pod vlivem různých inhibitorů fosfodiesterázy po dobu 6 dnů. Poté byla v souladu s popsaným postupem, po označení akridinovou oranží a ethidium bromidem, morfologicky stanovena apoptóza a nekróza. Data ukazují, že nová cGMPspecifická PDE je užitečná pro testování sloučenin, které indukují apoptózu buněk HT-29.

.:

• • · φ · · · · · · · φφφ «φ «φ «φ» «· φφ

Tabulka 5

Data ο indukci apoptózy u inhibitorů PDE

Inhibitor	oznámená selektivita	% apoptózy	% nekrózy
Vehikulum		8	6
8-metoxy-IBMX	PDE1	2	1
Milrinon	PDE3	18	0
RO-20-1724	PDE4	11	2
MY5445	PDE5	80	5
IBMX	neselektivní	4	13

Příklad 4 - stanovení inhibice růstu

U referečních a testovaných sloučenin byla analyzována jejich PDE5 inhibični aktivita v souladu s protokolem na její stanovení. Obrázek 14 ukazuje inhibični účinek různých koncentrací sulfidu sulindaku a exisulindu na růst buněk HT-29. Buňky HT-29 byly po dobu 6 dnů vystaveny působení různých dávek exisulindu (trojúhelníky) nebo sulfidu sulindaku (čtverce). Počet buněk byl měřen metodou, používající sulforhodaminu (SRB metoda), která již byla popsána (Piazza a kol., Cancer Research, 55:3110 až 3116, 1995). Hodnota IC50 pro sulfid sulindaku byla přibližně 45 μΜ a pro exisulind 200 μΜ. Data ukazují, že jak sulfid sulindaku tak exisulind jsou schopny inhibovat růst nádorových buněk.

Obrázek 15 ukazuje aktivitu, inhibující růst a aktivitu, indukující apoptózu, pro sulfid sulindaku. Časový průběh experimentuje ukázán pro buňky HT-29, ošetřené vehikulem, 0,1 % DMSO (otevřené symboly) nebo sulfidem sulindaku o koncentraci 120 μΜ (uzavřené symboly). Inhibice růstu (15A nahoře) byla měřena počítáním živých buněk po fixování roztokem trypanové modři. Apoptóza (15B dole) byla zjištěna morfologickým stanovením po fixování roztokem akridinové oranži a ethidium bromidu, jak bylo popsáno výše (Duke a Cohen, v: Current Protokols in Immunology, 3.17.1 až 3.17.16, New York, John Wiley and Sons, 1992). Data ukazují, že sulfid sulindaku je schopen inhibovat růst nádorových buněk a že účinek je spojen se zvýšením apoptózy. Všechna data jsou ze stejného experimentu.

Obrázek 16 ukazuje inhibični aktivitu růstu testované sloučeniny E. Buňky HT-29 adenokarcinomu tlustého střeva byly po dobu 6 dnů vystaveny působení naznačené koncentrace sloučeniny E a počet buněk byl stanovena SRB metodou. Vypočítaná hodnota IC50 byla 0,04 μΜ.

Tabulka 6

Aktivita, indukující růst, zjištěná pro řadu sloučenin

Referenční sloučeniny	% inhibice při koncentraci 100 μΜ
Indomethacin	75
MY5445	88
Sulfid sulindaku	88
Exisulind	<50
E4021	<50
Sildenafil	<50
Zaprinast	<50
Testované sloučeniny	% inhibice koncentraci při 100 μΜ
A	68
B	77
C	80
D	78
E	62
V souladu s výše uvedeným testovacím protokolem byla u sloučenin A až E testována
inhibiční aktivita růstu, výsledky jsou uvedeny všechny testované sloučeniny aktivitu.	vtab. 6. Při jedné dávce 100 μΜ vykazovaly
U řady fosfodiesterázových inhibitorů byla stanovena jejich inhibiční aktivita na růst
buněk. Data jsou uvedena vtab. 7. Buňky HT-29 byly vystaveny působení různých inhibitorů fosfodiesterázy po dobu 6 dnů. Růst buněk byl stanoven popsanou SRB metodou. Níže uvedená data spolu sdaty, která jsou uvedena výše, ukazují, že inhibitory nové PDE účinně inhibovaly
růst nádorových buněk.
Tabulka 7
Data, udávající inhibici růstu buněk, kterou vykazují inhibitory PDE
Inhibitor oznámená selektivita	inhibice růstu (IC50, μΜ)
8-metoxy-IBMX PDE1	>200 μΜ

• · » · · 9-9 • · · 9 ·· · » · • 9 9 · · · • · · « · · » * · · ·· · · ·Λ

Tabulka 7-pokračování

Inhibitor	oznáméná selektivita	inhibice růstu (IC50, μΜ)
Milrinon	i PDE3	>200 μΜ
RO-20-1724	PDE4	>200 μΜ
MY5445	5 PDE5	5 μΜ
IBMX	neselektivní	>100 μΜ
Zaprinast	PDE5	>100 μΜ
Sildenafil	PDE5	>100 μΜ
E4021	PDE5	>100 μΜ

Aby byla ukázána efektivnost této metody testování různých forem nádorových procesů, byly sloučeniny testovány na řadě buněčných linií. Byly stanoveny účinky sulfidu sulindaku a exisulindu na různé buněčné linie. Data jsou uvedena v tab. 8. Hodnoty IC₅₀ byly stanoveny SRB metodou. Data ukazují širokou účinnost těchto sloučenin, jejichž dávky jsou srovnatelné, na široké pole nádorových procesů. Proto sloučeniny, takto identifikované a vybrané v předmětném vynálezu, by měly být užitečné pro léčbu mnohačetných forem nádorů.

Tabulka 8

Data o inhibici růstu pro různé linie buněk

Typ buňky/ Tkáňová specifita	IC50 (μΜ)
sulfid sulindaku	exisulind	Sloučenina E*
HT-29, tlusté střevo	60	120	0,10
HCT116, tlusté střevo	45	90
MCF7/S, prs	30	90
UACC375, melanom	50	100
A-427, plíce	90	130
Bronchiální epiteliální buňky	30	90
NRK, ledvina (ne ras-transformované) 50	180
KNRK, ledvina (ras-transformované) 60	240
PC3 Karcinom lidské prostaty		82	0,90

Tabulka 8-pokračování

Typ buňky/ Tkáňová specifita	IC50 (μΜ)
sulfid sulindaku	exisulind	Sloučenina E*
Colo205			1,62
DU-145			0,10
HCT-15			0,60
MDA-MB-231			0,08
MDA-MB-435			0,04

*Stanoveno metodou s použitím neutrální červeně, jak popsal Šchmid a kol., v Proč. AACR Vol

39, str. 195 (1998).

Příklad 5 - Aktivita v modelové orgánové kultuře mléčné žlázy

Obr. 17 ukazuje inhibici premaligních procesů v orgánové kultuře mléčné žlázy, způsobených metabolity sulindaku. Experiment s orgánovou kulturou mléčné žlázy byl proveden podle dříve popsaného postupu (Mehta a Moon, Cancer Research, 46: 5832 až 5835, 1986). Výsledky ukazují, že sulindak a exisulind účinně inhibují tvorbu premaligních poškození, zatímco sulfid sulindaku byl inaktivní. Data podporují hypotézu, že inhibice cyklooxygenázy není pro protinádorové vlastnosti žádoucích sloučenin nezbytná.

Analýza

Pro výběr sloučenin pro léčbu nádorových procesů poskytuje tento vynález princip srovnávání experimentálních dat testovaných sloučenin. V rámci tohoto předmětného vynálezu mohou být testované sloučeniny zařazeny podle svého potenciálního použití pro léčbu nádorů u lidí. Tyto sloučeniny, mající požadované účinky, mohou být vybrány pro další testování a následné využití u lidí.

V níže uvedené v tab. 9 jsou uvedeny údaje o kvalitě různých testovaných sloučenin spolu s několika protokoly. Data ukazují, že exisulind, sloučenina B a sloučenina E vykazují takovou aktivitu, jaká je potřebná pro splnění testu, skládajícího se ze 4 bodů: neinhibují COX, účinně inhibují cGMP-specifickou PDE, inhibují růst a indukují apoptózu. Aktivita těchto • ·· ·· · · · 9 9 • 9 9 9 9 · · 9 ♦ 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 ··

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 ·

9 9 · · « · · · ·

999 9 9 99 9 99 99 99 sloučenin v orgánové kultuře mléčné žlázy potvrzuje účinnost vynálezu. Na základě zhodnocení kvality testovacích protokolů byla Sloučenina E zařazena jako nejlepší, potom následovala Sloučenina B a exisulind.

Tabulka 9

Profil aktivit různých sloučenin

Sloučenina	Inhibice COX	Inhibice PDE	Inhibice	Orgánová kultura mléčné žlázy
růstu	Apoptóza
Exisulind	-	++	++	++	+++
Sulfid sulindaku	++++	+++	+++	+++	-
MY5445	++++	+++	+++	+++	+
A	-	-	+++	++	++
B	-	+++	+++	+++	++
D	-	-	++	-	-
E	-	++++	++++	++++	++++
F	-	-	++	+	-
G	-	-	+++		+++
H			++

Vysvětlivky k tab. 9: Aktivita sloučenin, založená na zhodnocení řady experimentů včetně testů maximální aktivity a síly.

- neaktivní + málo aktivní ++ středně aktivní +++ silně aktivní ++++ vysoce aktivní

Odhaleno bylo také nové stanovení aktivity PKG, které je použité v testovacích metodách předmětného vynálezu, ale které má rovněž obecnější účinnost při stanovení aktivity PKG za jiným účelem (např. pro studium úlohy PKG v normální funkci buněk). Pro vysvětlení, toto je užitečné při popisu stanovení PKG před tím, než je vysvětleno, jak může být aktivita PKG • 9

užitečná při hodnocení léků, kdy je zjišťováno, zdali může být sloučenina užitečná při léčbě nádorů.

Nové stanovení PKG

Nové stanovení PKG předmětného vynálezu zahrnuje vazbu na pevnou fázi s aminokyselinovými sekvencemi, z nichž každá obsahuje alespoň vazebnou doménu pro cGMP a fosforylační místo fosfodiesterázy typu 5 („PDE5“). Tato sekvence je známá a popsaná v literatuře. Výhodněji neobsahuje vázaná PDE5 sekvence katalytickou doménu PDE5, jak je popsáno níže. Jedna cesta jak navázat PDE5 sekvence na pevnou fázi je exprimovat tyto sekvence jako fúzní protein, obsahující PDE5 sekvence a jeden člen aminokyselinového vazebného páru a chemicky připojit druhý člen tohoto aminokyselinového vazebného páru na pevnou fázi (např. kuličky). Vazebný pár, který může být použit, je glutathion S-transferáza („GST“), který je exprimován jako fúzní protein s PDE5 sekvencí a glutathion („GSH“), který je kovalentně vázán na pevnou fázi. V tomto případě může být fúzní protein PDE5 sekvence/GST vázán na pevnou fázi tím, že je roztok, obsahující fúzní protein, protlačen přes pevnou fázi, což je popsáno níže.

RT-PCR metoda je používána pro získání cGB domény PDE5 s přímými a protisměrnými primery, navrženými ze sekvence cDNA hovězí PDE5A (McAllister-Lucas L.M. a kol., J. Biol. Chem. 268, 22863 až 22873, 1993) a pro výběr mezi rodinami PDE 1 až 10. Pro buňky HT-29 jsou používány 5'-3'Inc. soupravy pro celkovou RNA a purifíkace mRNA na koloně oligo(dT). Pro syntézu fragmentu o velikosti 1484 bp, kódujícího fosforylační místo a cGMP vazebná místa lidské PDE5A s nízkou i vysokou afinitou (203 až 1686 bp, cGB-PDE5), jsou používány přímý primer (GAA-TTC-TGT-TAG-AAA-AGC-CAC-CAG-AGA-AAT-G, 203 až 227) a protisměrný primer (CTC-GAG-CTC-TCT-TGT-TTC-TTC-CTC-TGC-TG, 1664 až 1686). Syntetizovaný nukleotidový fragment cGB-PDE5 kóduje 494 aminokyselin s 97 % podobností s hovězí PDE5A. Fragment je poté klonován ve fúzním vektoru pGEX-5X-3 glutathion-S-transferáza (GST) (Pharmacia Biotech.) s tac promotorem a EcoRI a Xhol restrikčními místy. Fúzní vektor je poté transfektován v bakterii E. coli BL21 (DE3) (Invitrogen). Transfektovaná bakterie BL21 je pěstována do logaritmické fáze a poté je jako induktor přidán IPTG. Indukce probíhá při 20 °C po dobu 24 h. Bakterie jsou sklizeny a lyžovány. Rozpustný buněčný lyzát je inkubován s konjugátem Sepharose 4B a GSH (GSHSepharose 4B). Fúzní protein GST-cGB-PDE5 se může vázat na kuličky GSH-Sepharosy, zatímco ostatní proteiny jsou z kuliček vymyty přebytkem vychlazeného PBS.

·· ·* ► · · · » · · * » 9 9 9

I · «

Exprimovaný fúzní protein GST-cGB-PDE5 je znázorněn na 7,5 % polyakrylamidovém gelu po SDS elektroforéze jako protein o velikosti 85 kD. Je charakterizován tím, že váže cGMP a je fosforylován proteinkinázou G a A. Má dvě vazebná místa pro cGMP a K_d je 1,6 ± 0,2 μΜ, což je blízko hodnotě Ka = 1,3 μΜ pro nativní hovězí PDE5. GST-cGB-PDE5 na kuličkách Sepharosy, konjugované GSH, může být in vitro fosforylován cGMP-dependentní proteinkinázou a cAMP-dependentní proteinkinázou A. K_m fosforylace GST-cGB-PDE5 enzymem PKG je 2,7 μΜ a V_max je 2,8 μΜ, zatímco K_m fosforylace BPDEtidu je 68 μΜ. Fosforylace enzymem PKG ukazuje, že poměr mezi začleněným molekulovým fosfátem a GSTcGB-PDE5je 1 ku 1.

Při stanovení kapalného vzorku, ve kterém se předpokládá PKG, pomocí PDE5, vázané na pevné fázi, jsou vzorek a pevná fáze smíchány s fosforylačním pufrem, obsahujícím ³²Ρ-γATP. Roztok je inkubován 30 min. při 30 °C, aby bylo dosaženo fosforylace PDE5 sekvence enzymem PKG a tím bylo zjištěno, zdali je PKG přítomna. Pevná fáze je poté od roztoku oddělena (např. odstředěním nebo filtrací) a promyta fyziologickým roztokem, pufrovaným fosfátem („PBS“), aby byl odstraněn jakýkoliv zbývající roztok a jakýkoliv nezreagovaný ³²Ρ-γATP.

U pevné fáze může být poté přímo testováno (např. kapalným scintilačním zařízením), zdali je P začleněn. Je-li tomu tak, pak to znamená, že vzorek obsahoval PKG, protože PKG fosforyluje PDE5. Jestliže je PDE5 vázána prostřednictvím fúzního proteinu, jak je popsáno výše, pak může být fúzní protein, obsahující PDE5, eluován zpěvné fáze SDS pufrem a poté může být v eluentu stanoven obsah ³²P. To je konkrétně výhodné v případě, že je zde možnost, že jsou přítomny další proteiny. Eluent pak může být zpracován (např. gelovou separací) s cílem separovat od sebe různé proteiny tak, že u frakce, obsahující fúzní protein, může být stanoven začleněný P. Fosforylovaný fúzní protein může být eluován z pevné fáze SDS pufrem a dále opět rozpuštěn při elektroforéze. Proběhne-li separace v gelu, mohou být proteiny obarveny, aby byla(y) vidět pozice proteinů a může být měřena ³²P fosforylace PDE5 podílu fuzního proteinu, ke které dochází vlivem PKG, a to expozicí gelu na film. Jestliže je ³²P na filmu viditelný, znamená to, že v původním vzorku, který obsahoval PKG, byla přítomna PKG, která fosforylovala PDE5 podíl fúzního proteinu, eluovaného z pevné fáze.

Při stanovení může být do pufru pro stanovení přidán přebytek (např. 100 x více) inhibitoru proteinkinázy (,,PKP‘), který specificky a silně inhibuje proteinkinázu A („PKA“) a neinhibuje PKG. Inhibovat PKA je žádoucí, protože PKA může přispívat k fosforylaci substrátu

PKG (např. PDE5). Přídavkem PKI je jakýkoliv příspěvek PKA k fosforylaci eliminován a detekovaná fosforylace je pouze v důsledku samotné PKG.

• · » · · ··· •99 9 9 99· 9 9

Souprava, která může být použita pro stanovení v předmětném vynálezu, obsahuje následující, předem připravené reaktanty, distribuované v oddělených nádobách:

1. pufr pro lýzi buněk: 50 mM Tris-HCl, 1 % NP-40, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM

NA3VO4, 1 mM NaF, 500 μΜ IBMX, proteinázové inhibitory.

2. Substrát proteinkinázy G na bázi pevné fáze: rekombinantní GST-cGB-PDE5, vázaný na

Sepharose 4B (50 % suspenze).

3. 2x fosforylaění pufr: ³²Ρ-γ-ΑΤΡ (3000 mCi/mmol, 5—10 pCi/stanovení), 10 mM KH₂PO₄, mM K2HPO4, 200 μΜ ATP, 5 mM MgCl₂.

4. Inhibitor PKA proteinkinázy I

V soupravě mohou být také poskytnuty nádoby na jedno použití a příslušenství, ve kterých se provádějí výše uvedené reakce.

Na základě výše uvedených poznatků bude odborník v oblasti analytiky snadno předvídat různé cesty, jak adaptovat popsané stanovení. Krátce, použitím alespoň podílu PDE5 (nebo jakéhokoliv jiného proteinu, který může být selektivně fosforylován PKG) může být zjištěna přítomnost a relativní množství (ve srovnání s kontrolou) PKG a to hodnocením fosforylace proteinu, který lze fosforylovat, pomocí značeného fosforylačního činidla.

SAAND zvyšují aktivitu PKG v nádorových buňkách

Použitím výše uvedených stanovení PKG byly provedeny následující experimenty, jejichž cílem bylo stanovit, zdali sloučeniny SAAND zvyšují aktivitu PKG buď proto, že zvyšují expresi PKG nebo proto, že zvyšují hladiny cGMP (nebo obou) v nádorových buňkách, které byly vystaveny působení SAAND.

Postupy testování

Z hlediska účinku na PKG v nádorových buňkách byly hodnoceny dva odlišné typy inhibitorů PDE. SAAND-exisulind, byl hodnocen proto, že je protinádorový. Také u klasického inhibitoru PDE5, který nepatří mezi látky SAAND, E4021, bylo zjišťováno, dochází-li ke zvýšení PKG pouze v důsledku klasické inhibice PDE5, nebo je-li zvýšení PKG součástí proapoptotického účinku látek SAAND, který zahrnuje inhibici PDE5 a inhibice nové PDE, odhalené v US Patentové přihlášce č. 09/173375 autorů Liu a kol, podané 15. října 1998.

φφ

Φ φ φ · * φ • Φφ · φ ·φφ

9 9 99 9

9 9 9 9 9 9 φ 9 9 9 9

999 9 9 99 ♦«· • Φ Φ Φ

9 9 9

9 9 9

9 9 ♦

99

Pro testování účinku inhibice cGMP-specifické PDE na nádory, obsahující mutaci APC, byly použity buňky SW480 maligního nádoru tlustého střeva. SW480 jsou známé jako buňky, které obsahují mutaci APC. Na každou z 8 misek bylo dáno asi 5 miliónů buněk SW480 v RPMI s 5 % sérem.

- 10 cm misky - 30 μΐ kontrolního vehikula DMSO (bez léku),

- 10 cm misky - 200 μΜ, 400 μΜ, 600 μΜ exisulind v DMSO a

- 10 cm misky - E4021; Ο,ΙμΜ, 1 μΜ a 10 μΜ v DMSO.

Misky byly inkubovány 48 h při 37 °C v 5 % CO₂.

Kapalná média byla z misek odsáta (buňky se sami o sobě držely na misce). Přichycené buňky byly promyty v každé misce studeným PBS a do každé misky bylo přidáno 200 μΐ pufru pro lýzi buněk (tzn. 50 mM Tris-HCl, 1 % NP-40, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM Na₂VO4, mM NaF, 500 μΜ IBMX s proteinázovými inhibitory). Bezprostředně po přidání pufru pro lýzi buněk byly lyžované buňky z každé misky setřeny. Lyzát buněk z každé misky byl převeden do mikrozkumavky, které byly inkubovány 15 min. při 4 °C. Během této doby byly zkumavky mírně míchány, aby došlo k úplné lýzi buněk. Po ukončení lýze byly zkumavky odstředěny (14 000 rpm) po dobu 15 min.. Supernatant z každé zkumavky byl převeden do nové mikrozkumavky.

V každé zkumavce byl stanoven obsah proteinů, protože v případě, že lék inhibuje růst buněk, bude celkové množství proteinů vyšší v kontrole než ve vzorcích, ošetřených lékem. Jestliže je lék účinný, měl by být ve skutečnosti celkový obsah proteinů ve vzorcích, vystavených působení léku, samozřejmě stejný jako u kontroly. Ve výše uvedené situaci bylo třeba mikrozkumavky s kontrolou a E4021 naředit tak, aby byly standardizovány se vzorky, ošetřenými vysokými dávkami exisulindu (skupina s nižšími dávkami exisulindu musí být standardizována na nejvyšší dávky exisulindu). Po změření obsahu proteinů musí být koncentrace celkových proteinů u různých vzorků standardizována (např. naředěním).

Pro každou koncentraci léku a kontrolu byly provedeny 2 stanovení PKG, jedno s přídavkem cGMP a jedno bez přídavku cGMP, což je detailněji popsáno níže. Důvodem, proč byla prováděna tato 2 různá stanovení PKG, je fakt, že cGMP specificky aktivuje PKG. Je-li aktivita PKG stanovena pomocí nového stanovení PKG předmětného vynálezu, nelze zjistit, je-li zvýšení aktivity PKG důsledkem zvýšeného cGMP v buňkách (což může být způsobeno inhibici cGMP-specifické PDE) nebo, je-li hladina aktivity PKG důsledkem zvýšené exprese proteinu PKG. Stanovením aktivity PKG ve vzorku s přídavkem a bez přídavku cGMP lze zjistit, zdali je aktivita PKG zvýšena, a zdali to je důsledkem zvýšené exprese PKG. Jestliže tedy protinádorový lék zvyšuje ve srovnání s kontrolou aktivitu PKG, je možno odhadnout, jedná-li se o zvýšení, • * • *

·· ·· * »» ♦ φ · « * < # · · >

φ φ φ * • · φ φ indukované lékem, v důsledku zvýšené exprese proteinu PKG (oproti aktivaci) ve vzorku, který byl ošetřen lékem, jestliže (1) vzorek, ošetřený lékem, s extra cGMP vykazuje vyšší aktivitu PKG ve srovnání s kontrolním vzorkem s extra cGMP a (2) vzorek, ošetřený lékem, bez extra cGMP vykazuje vyšší aktivitu PKG ve srovnání s kontrolou.

Po připravení paralelních vzorků s přídavkem a bez přídavku cGMP bylo ke 20 μΐ suspenze substrátu na bázi pevné fáze PDE5/GST, který byl popsán výše, přidáno 50 μΐ každého buněčného lyzátu. U každého kontrolního vzorku a vzorku hodnoceného buněčného lyzátu s lékem je reakce odstartována přídavkem fosforylačního pufru, obsahujícího roztok 10 pCi ³²Pγ-ΑΤΡ (200 μΜ ΑΤΡ, 4,5 mM MgCh; 5 mM KH2PO4; 5 mM K2HPO4;), do každé směsi. Výsledné směsi jsou inkubovány 30 min. při 30°C. Směsi jsou poté odstředěny, aby byla odstraněna pevná fáze a supernatant není dále používán. Pevná fáze v každé zkumavce byla promyta 700 μΐ vychlazeného PBS. K pevné fázi byl přidán vzorkový pufr podle Laemmli (30 μΐ) (Bio-Rad). Směsy byly povařeny 5 min. a naneseny na 7,5 % SDS polyakrylamidový gel. Elektroforéza probíhala 1 h. při 150 V. Získané proužky byly fixovány roztokem commassie blue, čímž byly vizualizovány, a tím bylo zjištěno, jsou-li přítomny proužky o velikosti 85 kD, které odpovídají GST-PDE5 fúznímu proteinu. Gel je vysušen a položen na film, který v případě, že je PDE5 fosforylována, ukáže odpovídající tmavou vazbu. Tmavost každé vazby odpovídá stupni fosforylace.

Jak je ukázáno na obr. 18A a 18B, SAAND exisulind způsobuje v závislosti na dávkách zvýšení aktivity PKG v obou vzorcích tj. s přidaným cGMP a bez přidaného cGMP oproti kontrolním vzorkům s bez extra cGMP. Toto potvrzuje i tmavší vzhled vazeb o velikosti 85 kD v každém, lékem ošetřeném vzorku. Dále, vzorky SW480, na které bylo působeno exisulindem, mají vyšší fosfory lační aktivitu PKG tehdy, byl-li do stanovení přidán cGMP ve srovnání se vzorky, ošetřenými samotným exisulindem (tzn. bez přídavku cGMP). Zvýšení aktivity PKG ve vzorcích, ošetřených lékem, tedy není pouze důsledkem aktivace PKG zvýšením buněčného cGMP, když SAAND inhibuje cGMP-specifickou PDE, ale zvýšení aktivity PKG v nádoru s mutací APC je také důsledkem zvýšené exprese PKG.

Také fakt, že vzorky SW480, ošetřené E4021, nevykazují v porovnání s kontrolou aktivaci PKG (viz obr. 18A a 18B), ukazuje, že zvýšená aktivace PKG, způsobená SAAND, v nádorových procesech, obsahujících mutaci APC, není pouze důsledkem inhibice klasické PDE5.

Jako analytická technika pro hodnocení aktivace PKG může být místo expozice na film, což bylo popsáno výše, použit postup, kdy je u vazby z SDS gelu o velikosti 85 kD určen stupeň ·♦ • ·

♦ 9 9 9 • 9 9 9

9 9 9

9 9 9

99 fosfory láce a to tak, že proužek je z gelu vyříznut a ³²P, začleněný ve vyříznuté vazbě, může být zjištěn v scintilačním (beta) zařízení v ³²P okně.

Pro testování účinku inhibice cGMP-specifické PDE v nádorech s mutací β-kateninu, byly použity buňky HCT116 maligního nádoru tlustého střeva. O HCT116 je známo, že obsahují mutaci β-kateninu, ale neobsahují mutaci APC.

Pro růst buněk HCT116 je použit stejný postup jako v případě SW480, který byl popsán výše. V tomto experimentu byly použity pouze exisulind a kontroly. Buňky, ošetřené exisulindem, produkují PKG, která byla fosforylována do vyššího stupně než odpovídající kontroly, což naznačuje, že v buňkách, ošetřených lékem, dochází k aktivaci PKG, která je nezávislá na mutaci APC.

Pro účely předmětného vynálezu uvádíme v nárocích termín „snížený β-katenin“ a míníme tím přirozený β-katenin a/nebo mutantní formu tohoto proteinu.

Potvrzení zvýšené exprese PKG a snížení β-kateninu v buňkách SW480 Western blotem

Jak je znázorněno výše, SAAND způsobují zvýšení exprese PKG a zvýšení hladiny cGMP, přičemž obojí vede ke zvýšení aktivity PKG v nádorových buňkách, ošetřených SAAND. Tato zvýšená exprese proteinu PKG byla dále ověřena relativně kvantitativní metodou - Western blotem, který je popsán níže.

Buňky SW480, ošetřené exisulindem, byly nejdříve z mikrozkumavek vypláchnuty ledovým PBS. Buňky byly za mírného míchání lyžovány 15 min. v modifikovaném RIPA pufru. Buněčný lyzát byl odstředěn v chlazené místnosti. Supematanty byly ihned po odstředění převedeny do nových mikrozkumavek. Ve vzorcích byla stanovena koncentrace proteinů pomocí činidla BioRad DC Protein Assay (Temecula, CA). Vzorky byly standardizovány na koncentraci proteinů, viz výše.

pg každého vzorku bylo naneseno na 10 % SDS gel. Byla provedena SDS elektorforéza a poté byly proteiny převedeny na nitrocelulózovou membránu. Blotovaná nitrocelulózová membrána byla za stálého míchání 1 h při teplotě místnosti blokována v čerstvě připraveném TBST, který obsahuje 5 % netučné sušené mléko.

Primární kozlí protilátka proti PKG je naředěna na požadovanou koncentraci/ředění čerstvým roztokem TBST/5 % netučné sušené mléko. Nitrocelulózová membrána je umístěna do roztoku primární protilátky a za stálého míchání inkubována 1 h při teplotě místnosti. Nitrocelulózová membrána je poté promyta 3x10 min. novým roztokem TBST. Nitrocelulózová membrána je za stálého míchání inkubována 1 h při teplotě místnosti v roztoku, obsahujícím

44 *« 4 ·· *·

4 4 · 4 · · · · 4 · 4

444 44 4 4444

444 4 · 9 9 9 9 ·

4 4 4 4 4 4 4 4 4

444 44 4· 444 99 44 sekundární králičí protilátku proti kozlí protilátce, konjugovanou s POD. Nitrocelulózová membrána je poté promyta 3 x 10 min. novým roztokem TBST. Detekce je provedena pomocí substrátu pro POD BM blue (Boehringer Mannheim).

Jak je graficky znázorněno na obr. 19, exisulind způsobuje pokles β-kateninu a zvýšení PKG, jejichž data byla získána western blotem. Buňky SW480 byly vystaveny působení exisulindu nebo vehikula (0,1 % DMFO) po dobu 48 h. 50 pg každého buněčného lyzátu bylo naneseno na 10 % SDS gel a blotováno na nitrocelulózovou membránu, membrána byla inkubována s králičí protilátkou proti β-kateninu a králičí protilátkou proti PKG.

SAAND snižují hladiny β-kateninu v nádorových buňkách

Toto zjištění bylo učiněno při kultivování buněk SW480 s 200, 400 nebo 600 μΜ exisulindem nebo vehikulem (0,1 % DMSO). Buňky byly sklizeny 48 h po přídavku testované látky a byl proveden imunoblot. Imunoreaktivní protein může být detekován Western blotem. Analýza Western blotem ukázala, že exprese β-kateninu byla v případě buněk, ošetřených exisulindem, oproti kontrole snížena o 50 %. Tyto výsledky naznačují, že obsah β-kateninu je působením SAAND látek snížen. Výše získané výsledky, které uvádějí, že aktivita PKG se zvyšuje s tímto působením a spolu s výsledky, níže uvedenými, které udávají, že β-katenin je fosfory lován PKG, naznačují, že snížení β-kateninu v nádorových buňkách je iniciováno aktivací PKG. Použití aktivity PKG v nádorech je proto užitečné jako prostředek při výběru protinádorových sloučenin.

Fosforylace β-kateninu enzymem PKG

PKG fosforyluje β-katenin in vitro. Experimentálně toto bylo stanoveno imunoprecipitací komplexu z buněk SW480 (neošetřených žádným lékem), který obsahuje β-katenin. Precipitace byla provedena způsobem, který je popsán níže pod pojmem „β-kateninová imunoprecipitace“. Imunoprecipitovaný komplex, který je stále zachycen na pevné fázi (např. kuličkách), je smíchán s ³²Ρ-γ-ΑΤΡ a čistou PKG (100 U). Jsou připraveny rovněž odpovídající kontroly bez PKG.

Protein je z pevné fáze uvolňován SDS pufrem a směs, obsahující protein je podrobena SDS elektroforéze v 7,5 % gelu. Při elektroforéze dochází k odstranění přebytečného ³²Ρ-γ-ΑΤΡ ze směsi. Proto je jakékoliv ³²Ρ-γ-ΑΤΡ, detekované v proužku β-kateninu o velikosti 93 kD, důsledkem fosforylace β-kateninu. Jakékoliv zvýšení Ρ-γ-ΑΤΡ, detekované v proužku β44

kateninu o velikosti 93 kD, ošetřeného extra PKG ve srovnání s kontrolou, která neobsahuje extra PKG, je důsledkem fosforylace β-kateninu v proužku, ošetřeném extra PKG.

Z výsledků, které jsme získali, bylo patrné zvýšení fosforylace u proužku, ošetřeného PKG, oproti kontrole, která vykazovala minimální, téměř nedetekovatelnou fosforylaci. Tento výsledek naznačuje, že β-katenin může být fosforylován PKG.

Fosforylace mutantního β-kateninu PKG

Stejný postup jako je popsán v bezprostředně předcházející sekci, byl proveden s buňkami HCT116, které neobsahují mutaci APC, ale mutaci β-kateninu. Výsledky těchto experimentů naznačují, že rovněž mutantní β-katenin je fosforylován PKG.

Pro účely tohoto předmětného vynálezu uvádíme fosforylaci β-kateninu v nárocích jako fosforylaci přirozeného typu a/nebo mutantních forem tohoto proteinu.

β-katenin precipituje s PKG

Supernatanty buněčných lyzátů buněk SW480 i HCT116 byly připraveny stejnou cestou jako při western blotových experimentech. Buněčný lyzát je nejdříve vy čeřen přídavkem 150 μΐ suspenze kuliček (50 %) protein A Sepharosy na 500 pg buněčného lyzátu a inkubován 10 min. při 4 °C na třebačce pro zkumavky. Kuličky byly odstraněny odstředěním při 14 000 x g, 10 min.. Supernatanty byly převedeny do nové zkumavky pro odstředění. K 500 pg buněčného lyzátu bylo přidáno 10 pg králičí polyklonální protilátky proti β-kateninu (Upstate Biotechnology, Lake Placid, New York). Směs buněčný lyzát/protilátka byla jemně míchána 2 h při 4 °C. K zachycení imunokomplexu došlo po přidání 150 μΐ suspenze kuliček protein A Sepharose (75 μΐ připravených kuliček) a jemném míchání směsi přes noc při 4 °C. Sepharosové kuličky byly shromážděny pulsním odstředěním (5 s v mikroodstředivce při 14 000 rpm). Supernatantová frakce byla odstraněna a kuličky byly promyty 3 x 800 μΐ ledového PBS pufru. Sepharosové kuličky byly resuspendovány v 150 μΐ vzorkového pufru a jemně míchány. Aby došlo k disociaci imunokomplexu z kuliček, byly kuličky Sepharosy 5 min povařeny. Kuličky byly odstředěny a supernatant byl podroben SDS elektroforéze.

Supernatanty byly podrobeny Western blotu a membrána byla poté inkubována s králičí protilátkou proti β-kateninu. Poté byla membrána promyta 3 x 10 min. TBST, aby byla odstraněna přebytečná protilátka proti β-kateninu. Byla přidána kozlí protilátka proti králičí • ·· ·· · ·· 99 • · · · · · · · · ·· · • · · · ♦ · ··«·

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 99 99 999 99 99 protilátce konjugovaná s křenovou peroxidázou, následovala inkubace 1 h při teplotě místnosti. Po ukončení může být přítomnost β-kateninu vizualizována pomocí substrátu HRPO. V tomto experimentu byl β-katenin zřetelně vizualizován.

Pro detekci PKG na stejné membráně byl nejdříve z membrány odstraněn konjugát protilátky proti β-kateninu pomocí 62 mM Tris-HCl pufru (pH 7,6) s 2 % SDS a 100 μΜ 2βmerkaptoetanolem ve vodní lázni o teplotě 55 °C po dobu 0,5 h. Čistá membrána byla poté 1 h při teplotě místnosti a za stálého mírného míchání blokována v roztoku TBST s 5 % odtučněným sušeným mlékem. Blokovaná čistá membrána byla poté inkubována s králičí polyklonální protilátkou proti PKG (Calbiochem, LaJolla, CA), která je dále detekována pomocí konjugátu sekundární kozlí protilátky proti králičí protilátce a HRPO. Přítomnost PKG na blotované membráně je vizualizována se substrátem HRPO. V tomto experimentu byla PKG vizualizována. Na základě toho, že na membráně jsou pouze proteiny, které imuniprecipitovaly s β-kateninem v buněčných supernatantech, tento výsledek jasně stanovuje, že PKG byla v buněčných supernatantech fyzikálně spojena s proteinových komplexem, obsahujícím β-katenin.

Stejná membrána po Western blotu byla také inkubována s protilátkou proti GSK3- β, aby se zjistilo, zdali koprecipituje s β-kateninem. V tomto experimentu jsme na membráně rovněž detekovali GSK3^, což naznačuje, že GSKJ-β precipituje s GSKJ-β a PKG, z čehož lze usuzovat, že tyto tři proteiny mohou být částí stejného komplexu. Protože GSKS-β a forma βkateninu tvoří v normálních buňkách část APC komplexu, může být PKG částí stejného komplexu a může být jako součást tohoto komplexu začleněna do fosforylace β-kateninu.

Protinádorové farmaceutické prostředky, obsahující inhibitory cGMP PDE

Jak bylo vysvětleno výše, exisulind je sloučenina, která vykazuje žádoucí protinádorové vlastnosti. Jeho účinnost a použití jako protinádorové látky byla objevena ještě předtím, než bylo pochopeno, že sloučenina pracuje tak, že v nádorových buňkách inhibuje aktivitu cGMPspecifické PDE.

Během klinických zkoušek u pacientů s nádory bylo kromě jiného ověřeno, že postup při výběru, uvedený v předmětném vynálezu, může být použit pro výběr sloučenin pro léčbu lidí. Po zjištění skutečnosti, že exisulind měl protinádorové vlastnosti (in vitro} a protože měl profil žádoucí sloučeniny, splňující výběrová kritéria předmětného vynálezu, bylo na základě úspěšnosti sloučeniny ve dvou klinických zkouškách u lidí stanoveno, že pomocí kritérií tohoto vynálezu mohou být vybrány další sloučeniny.

Jak je naznačeno výše, řada nádorů nese mutaci APC. Kromě jiného byly při klinických zkouškách u pacientů s nádorem, nesoucím mutaci APC, ověřeny postupy výběru, uvedené v předmětném vynálezu.

Mutace APC byla prvně objevena u pacientů s dědičným nádorem, adenomatózní polypózou střeva („APC“). APC onemocnění je charakterizováno výskytem stovek až tisíců polypů v tlustém střevu během druhého desetiletí života a běžná léčba znamená chirurgické odstranění tlustého střeva před 20 rokem života.

První klinická zkouška zahrnovala pacienty sAPC. V této studii měl/měla každý pacient/pacientka odebráno tlusté střevo kromě malé části střeva, přilehlé k rektu (kde je připojeno tenké střevo), aby byla ochráněna rektální funkce. U takového pacienta se však běžně tvoří polypy ve zbývající malé části tlustého střeva, které potřebují periodické odstraňování (např. elektrokauterizací).

Zkouška, ve které byl vybrán exisulind, byla preventivní zkouška, navržená pro zhodnocení protinádorových charakteristik léku a to srovnáním míry kumulace nových polypů, tvořených během 12 měsíců u skupin, jimž byl lék podáván a u skupin bez léčení. V úvahu přicházeli pacienti, kteří tvořili mezi 9 až 44 polypy za rok. Na počátku studie, na konci 6 měsíce a na konci 12 měsíce byly pacientům odstraněny všechny polypy. Studie byla provedena se 34 pacienty. Na základě stanoveného počtu polypů, tvořených během 1 roku u pacientů s APC, kteří produkovali 9 až 44 polypů za rok, byl z hlediska poklesu rychlosti tvorby polypů exisulind klinicky a statisticky značně lepší než placebo.

Na základě průměrného počtu polypů, produkovaných během prvních šesti měsíců studie, byla u pacientů, ošetřených exisulindem, zjištěna přibližně jedna třetina počtu polypů v porovnání s pacienty, léčenými placebem (průměrné hodnoty 9 polypů/rok a 26 polypů/rok; p= 0,013). Na základě průměrného počtu polypů, vytvořených během celých 12 měsíců studie, produkovali pacienti, léčení exisulindem, přibližně polovinu počtu polypů oproti pacientům, léčených placebem (průměrné hodnoty 18 polypů/rok a 38 polypů/rok; p= 0,020).

Zvláštní klinická zkouška byla rovněž provedena s pacienty mužského pohlaví, kteří měli karcinom prostaty, v důsledku čehož jim byly prostaty odstraněny. Studie byla prováděna u pacientů s detekovatelnými hladinami PSA (specifický antigen prostaty), které byly po radikální prostatektomii zvýšeny, což naznačuje opětovný výskyt karcinomu prostaty.

U 96 pacientů bylo provedeno hodnocení karcinomu prostaty: byly provedeny dvojnásobně-slepé, placebem-kontrolované a multicentrické zkoušky, kdy byl pacientům podáván exisulind v dávkách 500 mg/den. Níže uvedená data ukazují statisticky významnou odlišnost v hladinách PSA mezi skupinou, které byl podáván exisulind a skupinou, které bylo

9 podáváno placebo. Hladiny PSA u skupiny, ošetřené exisulindem, byly ve srovnání s hladinami PSA u neošetřené skupiny významně sníženy. Ačkoliv zvýšená hladina PSA není sama o sobě onemocnění, je v oblasti medicíny velmi sledována jakožto náhradní ukazatel, indikující přítomnost opětovného výskytu karcinomu prostaty u těchto mužů.

Kromě hodnocení, založeného na rozdílech v hladinách PSA mezi skupinami, ošetřenými exisulindem a neošetřenými skupinami, které byly hodnoceny jako celek, zahrnovaly průběžné analýzy také analýzy podskupin. V této studii byli pacienti rozděleni do skupin s vysokým, středním a malým rizikem ve smyslu rizika vývoje jejich metastatického onemocnění. Toto rozdělení bylo provedeno pomocí metodologie, publikované v Journal of the American Medical Association (JAMA 5. května 1999, str. 1591 až 1597). K určení, kteří studovaní pacienti patří do které skupiny, posloužily vědcům v případě, že nevěděli, zdali byl pacientům podáván lék nebo placebo, lékařské anamnézy; studovaní pacienti byli podle výše uvedené publikované metodologie přiřazeni do odpovídající rizikové skupiny. Ve skupinách se středním a vysokým rizikem ukázaly statistické analýzy statisticky významné rozdíly v hladinách PSA mezi pacienty, léčenými exisulindem a pacienty, léčenými placebem.

Data ze studie prostaty jsou následující:

Tabulka 10

Účinek exisulindu na hladinu PSA u mužů po prostatektomii se stoupající PSA

Skupina	Placebo	Exisulind	„p“ hodnota
Celkově	4,49	2,85	0,0004
S velkým rizikem	4,98	2,91	0,0002
Se středním rizikem	6,24	2,95	0,0053

V těchto exisulindových zkouškách a několika dalších, zahrnujících lék v dalších indikacích, byla monitorováním nepříznivých případů (AE), klinickými laboratorními testy (hematologie, chemie séra a analýza moči), pomocí životních znaků (krevní tlak, puls, dýchání, teplota a hmotnost), fyzickými testy a horní endoskopií hodnocena bezpečnost látky.

Z hlediska bezpečnosti nebyly v klinických testech, které byly provedeny s exisulindem pro více než 400 pacientů, zjištěny žádné významné nedostatky. Exisulind nezpůsoboval jakékoliv krevní diskrázie, zvracení v důsledku dávkování nebo neurologickou či renální toxicitu, které jsou spojeny s běžnými chemoterapeutiky. Také nezpůsoboval jakékoliv klinicky významné změny v životních znacích. V párovaných biopsiích polypu a normálních tkáních tlustého střeva u APC pacientů, bylo zjištěno, že exisulind zvyšoval rychlost apoptózy v polypu,

*· · • · »· • t · • · · • » · • Φ »·· ♦ · »· • · 9 9 • · · t • · · · ale nikoliv v normálních tkáních tlustého střeva, což naznačuje minimální účinky exisulindu na normální tkáně.

Při dávkách vyšších než je maximální tolerovaná dávka (MTD = 600 mg u pacientů se subtotální kolonektomií, 400 mg u pacientů s intaktním tlustým střevem; 350 mg u dětských pacientů) byly zjištěny pouze nepříznivé účinky, související s dávkováním, které se projevily ve formě zvýšení jaterních testů (LFT), které bylo pozorováno brzo během léčby. Podle zkušeností bylo zvýšení LFT reversibilní a nevyskytovalo se v případě, že byla dávka snížena. Ostání příhody (např. příležitostná bolest břicha) měly většinou krátké trvání, byly slabé až střední intenzity a nevyžadovaly přerušení léčby nebo snížení dávky exisulindu.

V krátkosti, tyto zkoušky prokázaly, že podávání exisulindu je účinná, dobře snášená dlouhodobá terapie pro klinické řízení nádorových procesů. Tyto výsledky ukazují, že výběr další sloučeniny, která inhibuje aktivitu cGMP-specifické PDE (stejně jako splňuje další výběrová kritéria předmětného vynálezu) může vyústit v terapeuticky účinný lék, in vivo.

Druhým lékem je látka, u které bylo zjištěno, že inhibuje cGMP a která byla rovněž objevena předtím, než byl znám mechanismus jejího účinku a předtím, než bylo známo, že splňuje výběrová kritéria tohoto vynálezu. Jedná se o (Z)-5-fluoro-2-metyl-(4-pyridyliden)-3-(Nbenzyl)indenylacetamid hydrochlorid (Sloučenina I). V hodnoceních in vitro a in vivo byla Sloučenina I ukázána jako protinádorový lék s aktivitami proti širokému spektru nádorů. Je rovněž bezpečná pro studie na zvířatech a pro studii u lidí, která využívá jedinou zvyšující se dávku.

Každý odborník v dané oblasti techniky z níže uvedených dat pozná, že Sloučenina I může být bezpečně podávána zvířatům v dávkách, daleko za toierovatelnými (a v řadě případů toxickými) dávkami běžných chemoterapeutik nebo protinádorových NSAID. Např. při studiu akutní toxicity u potkanů, kdy byla Sloučenina I podávána v jednotlivých orálních dávkách (v 0,5 % karboxymetylcelulózovém vehikulu) 2000 mg/kg nebo vyšších, nebyly pozorovány žádné příznaky toxicity. Při dávce 4000 mg/kg byly přírůstky tělesné hmotnosti mírně snížené. Jednotlivá dávka 1000 mg/kg, podávaná intraperitoneálně, vedla ke snížení přírůstku tělesné hmotnosti a při pitvě některých zvířat z této skupiny byly pozorovány mesenterické adheze.

U skupiny, složené ze dvou fen a dvou psů, nevedla aplikace dávky 1000 mg/kg Sloučeniny I ve formě kapsulí k žádným projevům toxicity. Vzhledem k povaze kapsulí se Sloučeninou I, vyžadovala tato dávka podání alespoň 13 kapsulí každému zvířeti, což bylo považováno za maximální počet, aniž by byla zvířata podrobena stresu. Proto bylo těmto psům podáváno 7 po sobě jdoucích dávek po 1000 mg/kg/den. Během podávání dávek nebyly pozorovány žádné očividné příznaky spojené s účinkem léku.

·· • 9 • · • · · • · · ··· ·· ·· • · • 9 • · 9 • 9 ·· • 99 99

9 9 9 9

9 9 9 9 • · · 9 9 9

9 9 9 9

999 99 99

Při jedné dávce není sloučenina I akutně toxická. Na základě výsledků těchto studií byla považována orální LD50 Sloučeniny I za vyšší než 1000 mg/kg u psů a 4000 mg/kg u potkanů a intraperitoneální LD50 u potkanů byla považována za vyšší než 1000 mg/kg.

Při studii, kdy byly potkanům podávány dávky v rozmezí sedmi dnů a kdy byla sloučenina hodnocena při aplikaci dávek 0, 50, 500 nebo 2000 mg/kg/den, nedošlo při dávce 50 mg/kg/den ke vzniku pozorovatelných projevů toxicity. U samic potkana byly při dávce 500 mg/kg/den účinky, spojené s podáváním sloučeniny, omezeny na zvýšení absolutních a relativních hmotností jater. Při dávce 2000 mg/kg/den zahrnovaly účinky dýchací a/nebo abnormální respirační šelesty, snížené přírůstky hmotnosti a sníženou spotřebu potravy v případě samců potkana a zvýšené hmotnosti jater u samic potkana. Při jakýchkoliv dávkách nebyly pozorovány žádné hematologické nebo chemické změny krve ani žádné mikroskopické patologické změny.

U potkana byla také provedena 28 denní studie při dávkách 0, 50, 500 a 2000 mg/kg/den. Nebyla zde zjištěna žádná abnormální klinická pozorování, přisuzovaná CP-461 a nijak zvláštní nebyly ani změny tělesné hmotnosti, oftalmoskopické testy, hematologické a chemické hodnoty krve a testy moče. Při nekropsii nebyly zjištěny žádné makroskopické změny tkáně. Údaje o hmotnosti orgánu ukázaly statisticky významné zvýšení hmotnosti jater u skupiny, které bylo podáváno 2000 mg/kg/den a statisticky významné zvýšení hmotnosti štítné žlázy u skupiny, které byla podávána dávka 2000 mg/kg/den. Mírné zvýšení při nižších dávkách nebylo statisticky významné. Histopatologické hodnocení tkání naznačilo přítomnost stop hypertrofie folikulárních buněk, zvýšený počet mitotických obrazů (naznačující možnou buněčnou proliferaci) ve štítné žláze a mírnou centrilobulární hypertrofii vjátrech. Tyto změny byly obecně omezeny na malý počet zvířat při dávce 2000 mg/kg/den, ačkoliv jedna samice měla při dávce 500 mg/kg/den zvýšené mitotické obrazy ve štítné žláze. Nálezy vjátrech mohou naznačovat velmi mírnou stimulaci mikrozomálních enzymů, vedoucí ke zvýšenému metabolismu thyroidních hormonů, které naopak vedou ke stimulaci štítné žlázy. Odborník v dané oblasti techniky tedy pozná, že tyto účinky jsou ve srovnání s účinky, očekávanými při podobných dávkách obvyklých chemoterapeutik nebo NSAID, extrémně malé.

Pro další stanovení bezpečnostního profilu Sloučeniny I byla provedena studie s cílem zhodnotit, zdali byla apoptóza buněk nádoru prostaty, indukovaná Sloučeninou I, srovnatelná sjejími účinky na epiteliální buňky prostaty, odvozené od normální tkáně. Buňky nádoru prostaty, sensitivní k androgenu, LNCaP (z ATCC (Rockville, MD)) byly rozmnožovány za standardních podmínek použitím média RPMI 160, obsahujícího 5 % FCS a 2 mM glutamin. Primární kultury epiteliálních buněk prostaty (PrEC), odvozené od normální prostaty (od

Clonetics lne. (San Diego, CA)) rostly za stejných podmínek jako linie nádorových buněk s výjimkou toho, že bylo použito médium bez séra, optimalizované pro růst těchto kultur (Clonetics lne.). Pro experimenty byly dány buňky LNCaP nebo PrEC do mikrotitrační destičky s 96 jamkami tak, aby hustota buněk byla 10 000 buněk na jamku. Po 24 h byly buňky vystaveny působení buď vehikula (0,1 % DMSO) nebo 50 μΜ Sloučenině I (volná báze), rozpuštěné v DMSO. Po různých dobách působení léku (4, 24, 48, 72 nebo 99 h) byly buňky lyžovány a byla u nich měřena histony-spojená DNA, jakožto indikátoru apoptotické smrti buňky (viz Piazza a kol., Cancer Research 57: 2452 až 2459, 1977).

Obr. 27 ukazuje časově závislé zvýšení množství fragmentované, histony-spojené DNA v buněčných kulturách LNCaP, ke kterému dochází v důsledku působení 50 μΜ Sloučeniny I (volné báze). Významný nárůst fragmentované DNA byl detekován po 24 h působení a indukce byla udržena po dobu až 4 denního kontinuálního působení. Naopak až 4 denní působení Sloučeniny I (50 μΜ) na PrEC buňky („normální“ prostaty) neovlivňovalo fragmentaci DNA. Tyto výsledky ukazuji selektivní indukci apoptózy v nádorových buňkách na rozdíl od normálních buněk. Toto je v kontrastu s běžnými chemoterapeutiky, které indukují apoptózu nebo nekrózu v rychle rostoucích normálních a nádorových buňkách stejně.

Na závěr, lze říci, že pro vykazování protinádorových účinků v jediné klinické zkoušce se stupňujícími se dávkami, prováděné u lidí jsou nezbytní pacienti, bezpečnostní studie u lidí, během které je lék podáván orálně, Sloučenina I, která produkuje nevýznamné vedlejší účinky při jakékoliv dávce včetně dávek, převyšujících předpokládané hladiny.

Jak je naznačeno výše, Sloučenina I také vykazuje silné protinádorové vlastnosti. Hodnota IC50 inhibice růstu, získaná pro Sloučeninu I, byla v případě linie buněk SW-480 0,7 μΜ. Tento výsledek byl potvrzen zhodnocením Sloučeniny I u hlodavců použitím ložisek aberantních krypt („ACF“) jako indikátoru karcinogeneze (viz Bird, Cancer Letí. 37: 147 až 151, 1987). Tento model hlodavců s karcinogenezí, indukovanou azoxymetanem („AOM“) byl použit pro určení účinků Sloučeniny I (volné báze a soli) na vývoj maligního nádoru tlustého střeva in vivo. ACF jsou prekurzory nádorů tlustého střeva a inhibice ACF je faktor, předpovídající chemopreventivní účinost.

V experimentu s potkany bylo dosaženo iniciace ACF dvěma po sobě jdoucími týdeními aplikacemi karcinogenu. Sloučenina I byla podávána jeden týden před zahájením ACF a po dobu experimentu. ACF byly zaznamenány po 5 týdnech působení. Sloučenina I byla podávána samcům potkana Fisher 344 orálně jako součást potravy. Denní spotřeba potravin (mg/kg tělesné hmotnosti) se během studie lišila a proto, aby byl poskytnut základ pro porovnávání jednotlivých dávek, byla dávka Sloučeniny I vyjádřena v gramech na kg potravy. K určení, zdali měla • ·

Sloučenina I nepříznivý účinek na růst a/nebo stravování, byla během experimentu stanovována tělesná hmotnost. Experimentální skupiny měly menší přírůstek hmotnosti než kontroly, což bylo indikátorem biodostupnosti. Rozdíly v hmotnosti však byly menší než 10 % a proto se u nich nepředpokládalo, že by ovlivňovaly tvorbu ACF.

Volná báze Sloučeniny I inhibovala tvorbu ACF, což bylo změřeno snížením krypt v tlustém střevu. Data jsou shrnuta v tab. 11. Kromě skupiny, které byly aplikovány nízké dávky (pouze 0,5 g/kg potravy), byly rozdíly mezi skupinou, které byla látka podávána a kontrolní skupinou podstatné a v případě skupiny s dávkou 1,0 a 2,0 g/kg potravy dokonce statisticky významné.

Tabulka 11

Inhibice ložisek aberantích krypt Sloučeninou I

Dávka sloučeniny	n	průměrACF/tlusté střevo	% kontroly	p (t-test)
(g/kg potravy)		(+SO)		vs.Kontrola
Kontrola	10	149 ±9	-
0,5	7	149 ± 14	100	0,992
1	10	111 ±9	75	0,008
1,5	10	132 ±4	89	0,101
2,0	10	107 ± 15	72	0,029

Sloučenina I rovněž zpětně splnila výběrová kritéria předmětného vynálezu a byla jednou ze sloučenin, použitých pro určení správnosti výběrových kritérií. Například použitím protokolů, které byly popsány výše, má Sloučenina I hodnotu IC50 cGMP-specifické PDE 0,68 μΜ, přičemž byla použita cGMP-specifická PDE z extraktů buněk HT29. Sloučenina I inhibovala COX I (při 100 μΜ) méně než z 25 %.

Protože Sloučenina I je pro-apoptotická, byla hodnota EC50 fragmentace DNA 15 μΜ. Procenta apoptózy buněk SW-480 pro Sloučeninu I jsou při různých koncentracích léku ukázána v tab. 12.

Tabulka 12

Morfologicky stanovená indukce apoptózy buněk HT-29 z buněk SW-480 adenokarcinomu tlustého střeva Sloučeninou I

Působení	Dávka	% apoptózy
Vehikulum (0,1 % DMSO)	-	1
Sloučenina I	0,35 μΜ	16
Sloučenina I	0,7 μΜ	27
Sloučenina I	1,5 μΜ	88

Aktivita Sloučeniny 1 není omezena pouze na aktivitu proti liniím buněk karcinomu tlustého střeva nebo na modely karcinomu tlustého střeva u zvířat. Sloučenina I má široký rozsah protinádorových účinků na různé linie nádorových buněk. Různé typy buněčných linií lidského karcinomu byly rozmnožovány za sterilních podmínek v médiu RPMI 1640 s 10 % zárodečným hovězím sérem, 2 mM L-glutaminem a uhličitanem sodným. Aby byly stanoveny inhibiční účinky Sloučeniny I na růst buněk, byly buňky rozděleny do mikrotitrační destičky s 96 jamkami tak, že hustota buněk byla 1000 buněk na jamku. 24 hodin po umístění buněk byly k buňkám dávkovány různé koncentrace volné báze Sloučeniny I, rozpuštěné v DMSO (konečná koncentrace 0,1 %). Účinek léku na růst nádorových buněk byl zjištěn na základě stanovení cy to toxicity pomocí neutrální červeně, které následovalo po 5 dnech nepřetržitého působení. Neutrální červeň je barvička, která selektivně barví živé buňky tím, že je přenášena ATPdependentním transportním mechanismem.

Jak je shrnuto v tab.13, vykazuje Sloučenina I (volná báze) silnou inhibiční aktivitu růstu, v případě, že je hodnocena pro řadu linií lidských buněk, odvozených od různých tkání. Sloučenina I vykazuje srovnatelné inhibiční účinky na růst bez ohledu na histogenezi tumoru, od kterého byly buněčné linie odvozeny. Hodnota GI50 (koncentrace léku, která způsobuje ve srovnání s kontrolním vehikulem 50 % inhibici růstu), vypočítaná pro všechny buněčné linie byla 1-2 μΜ.

Kromě dat, uvedených níže v tabulce, jsme získali srovnatelnou citlivost ke Sloučenině I (HC1 soli) u linie buněk lidské leukémie (CCRF-CEM, K562 a Molt-4), linie buněk myelomu (RPMI8226), linie buněk nádoru pankreasu (PAN-1) a linie buněk nádoru vaječníku (OVCAR3).

Tabulka 13

Inhibice růstu různých linií buněk lidského nádoru Sloučeninou I

Buněčná linie	Původ nádoru	GI5o μΜ	GI90 μΜ
Colo 205	Tlusté střevo	1,6	2,4
HCT-15	Tlusté střevo	1,7	3,0
HT-29	Tlusté střevo	2,1	8,0
SW-620	Tlusté střevo	1,7	2,5
DU145	Prostata	1,6	2,8
PC-3	Prostata	1,7	82,5
NCI-H23	Plíce	1,7	2,5
NCI-H322M	Plíce	2,1	13,2
NCI-H460	Plíce	1,9	30,0
NCI-H82	Plíce	1,7	5,8
MDA-MB-231	Prs	1,8	77,6
MDA-MB-435	Prs	1,6	2,3
UISO-BCA-1	Prs	1,5	4,7
Molt-4*	Leukémie	1,6	nestanoveno
CCRF-CEM*	Leukémie	1,4	nestanoveno
K-562*	Leukémie	1,8	nestanoveno
RPMI-8226*	Myelom	1,2	nestanoveno
OVCAR*	Vaječník	1,2	nestanoveno
PANC-1*	Pankreas	2,2	nestanoveno

* kromě případů, označených hvězdičkou, u kterých bylo testování provedeno s HCl solí, bylo testování provedeno s volnou bází sloučeniny.

Vzhledem k charakteristikám, týkajících se bezpečnosti látky pro lidi a zvířata a vzhledem k velmi širokého účinku Sloučeniny I na zvířata a buněčné kultury, je jasné, že sloučeniny, splňující výběrová kritéria předmětného vynálezu (včetně inhibice cGMP-specifické PDE), mohou být užitečná protinádorová terapeutika.

Pro identifikaci strukturálně doplňkových sloučenin, inhibujících cGMP-specifickou PDE, které mohou být terapeuticky účinné coby protinádorové látky, má odborník v dané oblasti techniky řadu užitečných modelových sloučenin, zde odhalených (stejně tak jako jejich analoga, začleněné v odkazech), které mohou být použity jako základ pro počítačové modelování • · ·<··« ···« • · ♦ · f ··*« • ··· · to * · · · « » <· · » « · · · · • ® » · · · ·· · · «· doplňkových sloučenin se stejnou konformací, ale které jsou odlišné chemicky. Například software, který je prodáván firmou Molecular Simulations lne. jako WebLab® ViewerPro^1M obsahuje molekulární vizualizaci a schopnosti chemické komunikace. Tento software zahrnuje funkčnost včetně 3D vizualizace známých aktivních sloučenin, čímž je možno uvést v platnost správnost načrtnuté nebo importované chemické struktury. Software dále umožňuje, aby byly struktury seřazeny podle znaků, definovaných uživatelem. Rovněž mohou být měřeny vzdálenosti, úhly nebo dihedrály.

Protože struktury dalších aktivních sloučenin byly odhaleny výše, lze použít s pomocí tohoto softwaru k identifikaci nové doplňkové sloučeniny, která poté může být testována a vybírána podle výběrových kritérií předmětného vynálezu, skupinovou analýzu a výběrové techniky, založené na dvojrozměrné a trojrozměrné podobnosti. Tyto softwarové metody vycházejí z toho, že sloučeniny, které vypadají podobně nebo mají podobné vlastnosti, mají větší předpoklady mít podobnou aktivitu, což může být potvrzeno pomocí výběrového kritéria předmětného vynálezu.

Mimoto, jestliže jsou tyto doplňkové sloučeniny počítačově modelovány, mnoho těchto sloučenin a jejich variant může být syntetizováno pomocí známých kombinatorických chemických technik, které jsou běžně používány odborníky ve farmaceutickém průmyslu. Jako příklady několika firem, které nabízejí kombinatorické chemické služby mohou být uvedeny např. New Chemical Entities, lne. of Bothell Washington, Protogene Laboratories, inc., of Palo Alto, California, Axys, Inc. of South San Francisco, California, Nanosyn, Inc. of Tuscon, Arizona, Trega, Inc. of San Diego, California a RBI, Inc. of Natick, Mass. Existuje však řada dalších firem. Mnoho velkých farmaceutických firem má podobné, ne-li lepší, vlastní možnosti. Krátce, odborník v daném stavu techniky může poměrně snadno připravit pro testování mnoho sloučenin, z nichž pak vybere sloučeniny, slibné pro léčbu nádorových procesů, které mají znaky sloučenin, které byly odhaleny zde. Předmětem zájmu je při identifikaci sloučenin, které mohou být testovány a poté vybrány pomocí kriteria tohoto vynálezu, sledování vazby vybraných protinádorových sloučenin na protein PDE5. Postupem, uvedeným níže, bylo zjištěno, že výhodnější žádoucí sloučeniny, které splňují výběrové kritérium tohoto předmětného vynálezu, se vážou na cGMP katalytickou oblast PDE5.

Pro toto stanovení byla použita sekvence PDE5, která nezahrnuje katalytickou doménu.

Jedna cesta, jak produkovat tuto sekvenci je exprimovat tuto sekvenci jako fúzní protein, výhodněji s glutathion S-transferázou („GST“), a to proto, aby byla znatelná.

RT-PCR metoda, je používána ke získání cGB domény PDE5 s přímými a obrácenými primery, odvozenými od sekvence cDNA hovězí PDE5A (McAllister-Lucas L.M. a kol., J. Biol.

Chem. 268, 22863 až 22873, 1993) a při výběru mezi rodinami PDE 1 až 10. Pro buňky HT-29 jsou používány 5'- 3', lne. soupravy pro stanovení celkové RNA, po čemž následuje purifikace mRNA na koloně oligo (dT). Pro syntézu fragmentu o velikosti 1484 bp, kódujícího fosforylační místo a cGMP vazebná místa s nízkou i vysokou afinitou lidské PDE5A (203 až 1686 bp, cGBPDE5) jsou používány přímý primer (GAA-TTC-TGT-TAG-AAA-AGC-CAC-CAG-AGAAAT-G, 203 až 227) a protisměrný primer (CTC-GAG-CTC-TCT-TGT-TTC-TTC-CTC-TGCTG, 1664 až 1686). Syntetizovaný nukleotidový fragment cGB-PDE5 kóduje 494 aminokyselin s 97 % podobností s hovězí PDE5A. Fragment je poté klonován v pGEX-5X-3glutathion-Stransferázovém (GST) fúzním vektoru (Pharmacia Biotech) stač promotorem a restrikčními místy EcoRI a Xhol. Fúzní vektor je poté transfektován do bakterie E. coli BL21 (DE3) (Invitrogen). Transfektovaná bakterie BL21 je kultivována do logaritmické fáze a poté je přidán IPTG jako induktor. Indukce probíhá při 20 °C 24 h. Poté jsou bakterie sklizeny a lyžovány. Rozpustný buněčný lyzát je inkubován s konjugátem Sepharose 4B a GSH (GSH-Sepharose 4B). GST-cGB-PDE5 fúzní protein se může vázat na kuličky GSH-Sepharosy a ostatní proteiny jsou vymyty z kuliček přebytkem vychlazeného PBS.

Exprimovaný GST-cGB-PDE5 fúzní protein je při elektroforéze v 7,5 % polyakrylamidovém SDS gelu znázorněn jako protein o velikosti 85 kD. Je charakterizován tím, že váže cGMP a může být fosforylován proteinkinázou G a A. Má dvě cGMP vazebná místa a Kd je 1,6 ±0,2 μΜ, což je blízko hodnotě Kd = 1,3 μΜ pro nativní hovězí PDE5. GST-cGBPDE5 na kuličkách Sepharosy, konjugované s GSH, může být in vitro fosforylován cGMPdependentní proteinkinázou a cAMP-dependentní proteinkinázou A. K_m fosforylace GST-cGBPDE5 enzymem PKG je 2,7 μΜ a V_max je 2,8 μΜ, zatímco K_m fosforylace BPDEtidu je 68 μΜ. Při fosforylaci enzymem PKG je poměr molekulárního fosfátu, začleněný do GST-cGB-PDE5 proteinu a proteinu jedna ku jedné.

Vazba cGMP na sledované sloučeniny (Francis S.H. a kol., J. Biol. Chem. 255, 620 až 626, 1980) byla stanovena v celkovém objemu 100 μΐ, kde byly 5 mM fosfátový sodný pufr (pH=6,8), 1 mM EDTA, 0,25 mg/ml BSA, ³H-cGMP (2 μΜ, NEN) a fúzní protein GST-cGBPDE5 (30 pg/stanovení). Každá testovaná sloučenina je přidána ve stejnou dobu jako substrát ³H-cGMP a směs je inkubována 1 h při 22 °C. Poté je směs převedena do zařízení Brandel MB24 s GF/B filtrem, následuje 2 násobné promytí 10 ml vychlazeného 5 mM draselného pufru (pH 6,8). Membrány jsou poté vyříznuty, přeneseny do scintilačních lahviček („vialek“) a do každé lahvičky je přidán 1 ml vody a 6 ml scintilační kapalné směsi Ready Safe™. Lahvičky jsou umístěny do scintilačního zařízení Beckman LS6500.

• * ·

Pro výpočty byly povalením vazebného proteinu po dobu 5 min. připraveny slepé vzorky, přičemž výsledky byly oproti nepovařenému proteinu menší než 1 %.

Rovněž byly kalibrovány zhášení membránou filtru nebo ostatními zbytky.

Pro testování, zdali se mohou kompetitivně vázat na cGMP vazebná místa proteinu GSTcGB-PDE5, byly vybrány inhibitory PDE5, sulfid, exisulind, Sloučenina B, Sloučenina E, E4021 a zaprinast a analoga cyklických nukleotidů, cAMP, cyklický IMP, 8-bromo-cGMP, cyklický UMP, cyklický CMP, 8-bromo-cAMP, 2'-O-butyl-cGMP a 2'-O-butyl-cAMP. Výsledky byly ukázány na obr. 24. cGMP specificky váže protein GST-cGB-PDE5. Cyklický AMP, cUMP, cCMP, 8-bromo-cAMP, 2'-O-butyl-cAMP a 2'-O-butyl-cGMP nesoutěží o možnost vazby s cGMP. Cyklický IMP a 8-bromo-cGMP mohou při vysokých koncentracích (100 μΜ) částečně soutěžit s cGMP (2 μΜ). Žádný z inhibitorů PDE5 nevykazoval při vázání proteinu GST-cGBPDE5 jakoukoliv kompetici s cGMP. Proto se nevážou na cGMP vazebná místa PDE5.

Sloučenina E se však kompetitivně (s cGMP) vázala na PDE5 (tzn. vrchol A). (Sloučenina E se také kompetitivně (s cGMP) váže na PDE vrchol B). Protože se Sloučenina E neváže na cGMP-vazebné místo PDE5, existuje zde kompetitivní vazba mezi Sloučeninou E a cGMP, kdy se žádoucí sloučeniny jako je Sloučenina E vážou na cGMP katalytické místo PDE5. Tato informace, kterou může odborník v dané oblasti techniky snadno získat (pomocí běžných experimentů pro kompetitivní vazbu), však může usnadnit modelování dalších sloučenin. Pomocí chemických struktur žádoucích sloučenin, uvedených zde, a pomocí informací o cGMP vazebném místě, může odborník modelovat, identifikovat a vybírat (pomocí výběrových kriterií předmětného vynálezu) další sloučeniny pro jejich použití jako terapeutik.

Sloučeniny, vybrané v souladu s metodologií předmětného vynálezu, mohou být formulovány do farmaceutických prostředků. Běžně je termín „farmaceutický prostředek” chápán jako sloučenina (např. jako pevná látka, uvedená výše) a farmaceuticky přijatelný nosič, který je podáván pacientovi formou orální aplikace v pevné nebo kapalné formě, formou IV nebo IP aplikace v kapalné formě, formou lokální aplikace ve formě masti nebo formou rektální nebo lokální aplikace ve formě čípku. Nejvíce preferované jsou nosiče pro orální aplikaci. Jak je v dané oblasti dobře známo, farmaceuticky přijatelné nosiče pro farmaceutické prostředky pro orální aplikaci jsou kapsule, tablety, pilulky, prášek, pastilky a granule. V těchto pevných formách dávek může nosič obsahovat alespoň jedno inertní ředidlo jako je sacharóza, laktóza nebo škrob. Tyto nosiče také mohou obsahovat, stejně jako v normální praxi, další přídavné látky např. lubrikační činidla jako je stearát hořečnatý. V případě kapsulí, tablet, pastilek a pilulek mohou nosiče rovněž obsahovat pufrující činidla. Nosiče jako jsou tablety, pilulky a granule mohou být připraveny potažením povrchů tablet, pilulek nebo granulí filmem. Příležitostně může • · •

• · být filmem potažena sloučenina, která je pak slisována do tablety, pilulky nebo granule a tableta, pilulka nebo granule použita pro aplikaci pacientovi. Upřednostňovaná potažení zahrnují taková, která se rozpouští nebo rozkládají vlivem pH tlustého střeva jako jsou shellak nebo Eudraget S.

Farmaceuticky přijatelné nosiče pro farmaceutické prostředky zahrnují kapalné formy dávek pro orální aplikaci např. farmaceuticky přijatelné emulze, roztoky, suspenze, sirupy a elixíry, obsahující inertní ředidla, jako je voda, která jsou běžně používána v dané oblasti. Kromě těchto inertních ředidel mohu prostředky také obsahovat adjuvants jako jsou zvlhčující činidla, emulzifikační a suspenzační činidla a sladidla, barviva a parfémy.

Farmaceuticky přijatelné nosiče pro farmaceutické prostředky pro IV nebo IP aplikaci zahrnují běžné farmaceutické fyziologické roztoky.

Farmaceuticky přijatelné nosiče pro farmaceutické prostředky pro lokální podávání zahrnují DMSO, alkohol nebo propylenglykol apod., které mohou být použity v kombinaci s náplastí nebo jiným materiálem, který zadržuje kapalinu, a který je třeba proto, aby udržel lék na daném místě na kůži tak, aby nebyl vysušen.

Farmaceuticky přijatelné nosiče pro farmaceutické prostředky pro rektální aplikaci jsou výhodněji čípky, které mohou kromě sloučenin předmětného vynálezu obsahovat masťové základy jako je kokosové máslo, čípkový vosk nebo gel.

Farmaceuticky přijatelný nosič a sloučeniny předmětného vynálezu jsou formulovány do farmaceutických prostředků v jednotlivých dávkovačích formách, které jsou aplikovány pacientovi. Hladina účinné složky (tzn. sloučeniny, vybrané v souladu s tímto vynálezem) v dávce se může lišit, tzn. dávka musí to obsahovat takové množství účinné složky, které bude v souladu s žádoucí metodou aplikace (např. orální nebo rektální) efektivní pro dosažení aktivity, eliminující nádor. Vybraná hladina dávky závisí na původu podávané aktivní sloučeniny (např. na její IC50, která může být snadno zjištěna), na způsobu podání, na žádoucí délce léčby a na dalších faktorech. Je-li to žádoucí, může být jednotková dávka taková, že denní požadavek aktivní sloučeniny je v jedné dávce nebo je rozdělen mezi více dávek, např. dvě až čtyři za den. Pro IV aplikaci může být zjištěna počáteční dávka na základě dávky, která je potřeba k dosažení IC50 co se týká obsahu plazmy průměrného dospělého muže (tzn. asi 4 litry). Počáteční dávky aktivní sloučeniny, vybrané v souladu s předmětným vynálezem, se mohou pohybovat v rozsahu 0,5 až 600 mg.

Farmaceutické prostředky předmětného vynálezu jsou výhodněji baleny do nádob (např. box, láhev nebo obojí) s vhodným tištěným materiálem (např. uvnitř balení), obsahující indikace, návod pro použití apod.

• 9 • · «·* · · « · ·· · ·'· · * · · · 9 9 · ··· «· ·· ··* ·· «*

Na základě výše uvedených návodů je možná řada modifikací a variací předmětného vynálezu. Předmětný vynález tedy může být v rámci připojených nároků praktikován jinak, než jak je zde specificky popsáno.

Claims (14)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Farmaceutický prostředek pro léčbu nádorového procesu, vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič a sloučeninu, která byla vybrána na základě:

   stanovení aktivity sloučeniny, inhibující cyklooxygenázu (COX); stanovení aktivity sloučeniny, inhibující PDE, kde PDE je charakterizována:

   (a) vyšší specifítou k cGMP než k cAMP;

   (b) pozitivním kooperativním kinetickým chováním v přítomnosti substrátu cGMP;

   (c) submikromolární afinitou pro cGMP; a (d) necitlivostí k inkubaci s purifikovanou cGMP-dependentní proteinkinázou; a výběru takové sloučeniny pro léčbu nádorů, která vykazuje nižší inhibiční aktivitu vůči COX než vůči zmíněné PDE aktivitě.
2. 2. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se dále tím, že zmíněná sloučenina je pro léčbu nádorů vybírána na základě stanovení, zdali inhibuje růst nádorové buňky v kultuře nádorových buněk; a na základě výběru sloučeniny, která inhibuje růst nádorové buňky.
3. 3. Farmaceutický prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že inhibice růstu je zjištěna hodnocením, indukuje-li sloučenina apoptózu.
4. 4. Farmaceutický prostředek pro léčbu nádoru, vyznačující se tím, že zahrnuje farmaceuticky přijatelný nosič a sloučeninu, vybranou na základě stanovení aktivity sloučeniny, inhibující růst nádorové buňky;

   stanovení aktivity sloučeniny, inhibující PDE, přičemž PDE je charaterizována:

   (a) vyšší specifítou k cGMP než k cAMP;

   (b) pozitivním kooperativním kinetickým chováním v přítomnosti substrátu cGMP;

   (c) submikromolární afinitou pro cGMP; a (d) necitlivostí k inkubaci s purifikovanou cGMP-dependentní proteinkinázou; a (e) výběrem sloučeniny, která vykazuje aktivitu, inhibující růst nádorové buňky a aktivitu, inhibující zmíněnou PDE
5. 5. Farmaceutický prostředek podle nároku 4, vyznačující se tím, že dále obsahuje stanovení, zdali sloučenina indukuje apoptózu v nádorových buňkách; a výběr sloučeniny, která indukuje apoptózu.
6. 6. Farmaceutický prostředek podle nároku 5, vyznačující se tím, že dále zahrnuje stanovení, zdali sloučenina vykazuje aktivitu, inhibující COX; a výběr sloučeniny s nižší aktivitou, inhibující COX ve srovnání s aktivitou sloučeniny, inhibující zmíněnou PDE.

   9 9 9 • 9 9 • 9 · 9 • · » • 9 9 9

   9 9 · »

   9 9 9 9 • 9 9 9 • «9
7. 7. Farmaceutický prostředek pro léčbu nádoru, vyznačující se tím, že zahrnuje farmaceuticky přijatelný nosič a sloučeninu, vybranou na základě stanovení aktivity sloučeniny, inhibující PDE, kde PDE je charakterizována :

   (a) vyšší specifitou k cGMP než k cAMP;

   (b) pozitivním kooperativním kinetickým chováním v přítomnosti substrátu cGMP;

   (c) submikromolámí afinitou pro cGMP; a (d) necitlivostí k inkubaci s purifikovanou cGMP-dependentní proteinkinázou; a (e) výběrem sloučeniny s touto inhibiční aktivitou.
8. 8. Farmaceutický prostředek podle nároku 7, vyznačující se tím, že sloučenina je dále vybrána na základě stanovení, zdali sloučenina indukuje apoptózu v nádorové buňce a na základě výběru sloučeniny s aktivitou, která indukuje apoptózu.
9. 9. Farmaceutický prostředek pro léčbu nádoru, vyznačující se tím, že zahrnuje farmaceuticky přijatelný nosič a sloučeninu, vybranou na základě:

   stanovení aktivity sloučeniny, inhibující cyklooxygenázu (COX); stanovení aktivity sloučeniny, inhibující PDE2; a výběru sloučeniny pro léčbu nádoru, která má nižší aktivitu, inhibující COX než je aktivita, inhibující zmíněnou PDE.
10. 10. Farmaceutický prostředek podle nároku 9, vyznačující se dále tím, že zmíněná sloučenina je vybrána na základě stanovení, zdali sloučenina inhibuje růst nádorové buňky v kultuře nádorových buněk; a na základě výběru takové sloučeniny pro léčbu nádoru, která vykazuje inhibici růstu nádorové buňky.
11. 11. Farmaceutický prostředek podle nároku 10, vyznačující se tím, že inhibice růstu je zjištěna hodnocením, indukuj e-li sloučenina apoptózu.
12. 12. Farmaceutický prostředek pro léčbu nádoru, vyznačující se tím, že zahrnuje farmaceuticky přijatelný nosič a sloučeninu, vybranou na základě:

    stanovení aktivity sloučeniny, inhibující růst nádorové buňky; stanovení aktivity sloučeniny, inhibující PDE2, a výběru sloučeniny, která vykazuje aktivitu, inhibující růst nádorové buňky a aktivitu, inhibující zmíněnou PDE
13. 13. Farmaceutický prostředek podle nároku 12, vyznačující se tím, že dále zahrnuje stanovení, zdali sloučenina indukuje apoptózu v nádorových buňkách; a výběr sloučeniny, která indukuje apoptózu.
14. 14. Farmaceutický prostředek podle nároku 13, vyznačující se tím, že dále zahrnuje:

    • * * *.

    22.

    23.

    24.

    stanovení, zdali sloučenina vykazuje aktivitu, inhibující COX; a výběr sloučeniny s aktivitou, inhibující COX, která je nižší ve srovnání s aktivitou, inhibující zmíněnou PDE. Farmaceutický prostředek pro léčbu nádoru, vyznačující se tím, že zahrnuje farmaceuticky přijatelný nosič a sloučeninu, vybranou na základě stanovení aktivity, inhibující PDE2 a na základě výběru sloučeniny s touto inhibiční aktivitou.

    Farmaceutický prostředek podle nároku 15, vyznačující se dále tím, že sloučenina je vybrána na základě stanovení, zdali indukuje apoptózu v nádorové buňce a na základě výběru sloučeniny s aktivitou, která indukuje apoptózu.

    Způsob výběru sloučeniny pro léčbu nádoru, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    stanovení aktivity sloučeniny, inhibující cyklooxygenázu (COX);

    stanovení aktivity sloučeniny, inhibující PDE2; a výběr sloučeniny pro léčbu nádoru, která má aktivitu, inhibující COX nižší než aktivitu, inhibující zmíněnou PDE.

    Způsob podle nároku 17, vyznačující se dále tím, že zmíněná sloučenina je vybrána na základě stanovení, zdali sloučenina inhibuje růst nádorové buňky v kultuře nádorových buněk; a na základě výběru sloučeniny pro léčbu nádoru, která inhibuje růst nádorové buňky. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že inhibice růstu je zjištěna hodnocením, indukuj e-li sloučenina apoptózu.

    Způsob výběru sloučeniny pro léčbu nádoru, vyznačující se tím, že zahrnuje stanovení aktivity sloučeniny, inhibující růst nádorové buňky;

    stanovení aktivity sloučeniny, inhibující PDE2, a výběr sloučeniny, která vykazuje aktivitu, inhibující růst nádorové buňky a aktivitu, inhibující zmíněnou PDE.

    Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že dále zahrnuje stanovení, zdali sloučenina indukuje apoptózu v nádorových buňkách; a výběr sloučeniny, která indukuje apoptózu. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že dále zahrnuje: stanovení, zdali sloučenina vykazuje aktivitu, inhibující COX; a výběr sloučeniny s aktivitou, inhibující COX, která je nižší ve srovnání s aktivitou sloučeniny, inhibující zmíněnou PDE.

    Způsob výběru sloučeniny pro léčbu nádoru, vyznačující se tím, že zahrnuje stanovení aktivity sloučeniny, inhibující PDE2 a výběr sloučeniny s touto inhibiční aktivitou. Farmaceutický prostředek podle nároku 23, vyznačující se tím, že sloučenina je dále vybrána na základě stanovení, zdali sloučenina indukuje apoptózu v nádorové buňce a na základě výběru sloučeniny s aktivitou, která indukuje apoptózu.

    • «

    9 9

    9 9

    9 9

    25. Způsob identifikace sloučeniny pro léčbu nádoru, vyznačující se tím, že zahrnuje stanovení aktivity sloučeniny, inhibující cyklooxygenázu (COX); a stanovení aktivity sloučeniny, inhibující PDE, kde PDE je charakterizována:

    (a) vyšší specifitou k cGMP než k cAMP;

    (b) pozitivním kooperativním kinetickým chováním v přítomnosti substrátu cGMP;

    (c) submikromolámí afinitou pro cGMP; a (d) necitlivostí k inkubaci s purifikovanou cGMP-dependentní proteinkinázou; výběr sloučeniny, která má aktivitu, inhibující COX nižší než je aktivita, inhibující zmíněnou PDE

    26. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že dále zahrnuje stanovení, zdali sloučenina inhibuje růst nádorové buňky v kultuře; a výběr sloučeniny pro léčbu nádoru, která inhibuje růst nádorové buňky.

    27. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že dále zahrnuje:

    (a) stanovení, zdali sloučenina indukuje apoptózu nádorové buňky; a (b) výběr sloučeniny pro léčbu nádoru, která indukuje apoptózu.

    28. Způsob výběru sloučeniny pro léčbu nádoru, vyznačující se tím, že zahrnuje stanovení aktivity, inhibující růst sloučeniny; stanovení aktivity sloučeniny, inhibující PDE, kde PDE je charakterizována:

    (a) vyšší specifitou k cGMP než k cAMP;

    (b) pozitivním kooperativním kinetickým chováním v přítomnosti substrátu cGMP;

    (c) submikromolámí afinitou pro cGMP; a (d) necitlivostí k inkubaci s purifikovanou cGMP-dependentní proteinkinázou; a výběr sloučeniny, která vykazuje tuto aktivitu, inhibující růst a aktivitu, inhibující zmíněnou PDE.

    29. Způsob testování sloučeniny, účinné pro léčbu nádoru, vyznačující se tím, že zahrnuje stanovení PDE inhibiční aktivity testované sloučeniny, kde PDE je charakterizována:

    (a) vyšší specifitou k cGMP než k cAMP;

    (b) pozitivním kooperativním kinetickým chováním v přítomnosti substrátu cGMP;

    (c) submikromolámí afinitou pro cGMP; a (d) necitlivostí k inkubaci s purifikovanou cGMP-dependentní proteinkinázou; a výběr sloučeniny s touto inhibiční aktivitou.

    30. Způsob podle nároku 29, vyznačující se tím, že zahrnuje stanovení, zdali sloučenina indukuje apoptózu v buňce a další výběr sloučeniny s aktivitou, která indukuje apoptózu.

    99 99

    9 « • · • 9

    9 «

    9 9 9

    99 ···

    31. Způsob podle nároku 29, vyznačující se tím, že dále zahrnuje stanovení, zdali vybraná sloučenina inhibuje syntézu prostaglandinů a dále výběr sloučeniny s malou aktivitou, inhibující prostaglandinovou syntézu.

    32. Způsob podle nároku 29, vyznačující se tím, že aktivita zmíněné PDE je zjištěna pomocí izolace cGMP-specifických PDE aktivit z linie nádorových buněk, obsahujících PDE5 a zmíněnou novou PDE, pomocí inhibice aktivity PDE5 vystavením zmíněného izolátu PDE působení inhibitoru PDE5 při koncentraci, která neinhibuje novou PDE a pomocí stanovení inhibiční aktivity testované sloučeniny vůči zbývající cGMP aktivitě, čímž může být stanovena inhibiční aktivita testované sloučeniny vůči nové PDE.

    33. Izolovaná fosfodiesteráza, vyznačující se tím, zeje charakterizována:

    (a) vyšší specifítou k cGMP než k cAMP;

    (b) pozitivním kooperativním kinetickým chováním v přítomnosti substrátu cGMP;

    (c) submikromolární afinitou pro cGMP; a (d) necitlivostí k inkubaci s purifikovanou cGMP-dependentní proteinkinázou.

    34. Izolovaná fosfodiesteráza podle nároku 33, vyznačující se tím, že je dále charakterizována sníženou citlivostí k inhibici zaprinastem a E4021.

    35. Izolovaná fosfodiesteráza podle nároku 33, vyznačující se tím, že je dále charakterizována tím, že může být separována od klasické PDE5 aktivity aniontovou výměnnou chromatografií.

    36. Izolovaná fosfodiesteráza podle nároku 35, vyznačující se tím, že je dále charakterizována tím, že není téměř vůbec aktivována systémem vápník/kalmodulin.

    37. Izolovaná fosfodiesteráza podle nároku 36, vyznačující se tím, že je dále charakterizována tím, že je necitlivá k rolipramu, vinpocetinu a indolidanu.

    38. Farmaceutický prostředek pro léčbu nádoru, vyznačující se tím, že zahrnuje farmaceuticky přijatelný nosič a sloučeninu, vybranou na základě:

    zhodnocení protinádorové aktivity sloučeniny proti nádoru, který má být léčen; zhodnocení, zvyšuje-li sloučenina aktivitu PKG v nádoru, který má být léčen; a výběru sloučeniny, která vykazuje protinádorovou aktivitu a má schopnost způsobovat zvýšení PKG v léčeném nádoru.

    39. Farmaceutický prostředek podle nároku 38, vyznačující se tím, že zmíněná sloučenina je dále vybrána na základě hodnocení, zdali sloučenina inhibuje PDE5 a na základě výběru sloučeniny, která inhibuje PDE5.

    • · • · • * · « v · 9 · >

    • · · · ·· ·· • · 9 9

    9 » • *

    40. Farmaceutický prostředek podle nároku 38, vyznačující se tím, že zmíněná sloučenina je dále vybrána na základě hodnocení, zdali sloučenina snižuje β-katenin v nádoru, který má být léčen a na základě výběru sloučeniny, která snižuje β-katenin.

    41. Farmaceutický prostředek podle nároku 38, vyznačující se tím, že zmíněná sloučenina je dále vybrána na základě hodnocení, zdali sloučenina inhibuje cGMP-specifickou fosfodiesterázu („PDE“) a na základě výběru sloučeniny, která inhibuje zmíněnou PDE.

    42. Farmaceutický prostředek podle nároku 38, vyznačující se tím, že zmíněná sloučenina je dále vybrána na základě hodnocení, zdali sloučenina zvyšuje expresi PKG a na základě výběru sloučeniny, jestliže zvyšuje expresi PKG.

    43. Farmaceutický prostředek podle nároku 38, vyznačující se tím, že zmíněná sloučenina je dále vybrána na základě hodnocení, zdali sloučenina zvyšuje aktivaci PKG a na základě výběru sloučeniny, jestliže zvyšuje aktivaci PKG.

    44. Farmaceutický prostředek podle nároku 38, vyznačující se tím, že zmíněná sloučenina je dále vybrána na základě hodnocení, zdali sloučenina inhibuje PDE2 a na základě výběru sloučeniny, která inhibuje PDE2.

    45. Farmaceutický prostředek pro léčbu nádoru, vyznačující se tím, že zahrnuje farmaceuticky přijatelný nosič a sloučeninu, vybranou na základě:

    hodnocení, zdali sloučenina zvyšuje aktivitu PKG v neporušené nádorové buňce nádoru, který má být léčen;

    hodnocení, zdali sloučenina snižuje β-katenin v nádorových buňkách;

    výběru sloučeniny, která způsobuje zvýšení aktivity PKG v neporušené nádorové buňce a způsobuje pokles β-kateninu v nádoru, který má být léčen.

    46. Farmaceutický prostředek pro léčbu nádoru, vyznačující se tím, že zahrnuje farmaceuticky přijatelný nosič a sloučeninu, vybranou na základě výběru sloučeniny, která zvyšuje aktivitu PKG v nádoru; a zhodnocení inhibiční aktivity sloučeniny na růst nádoru, kde sloučenina, která zvyšuje aktivitu PKG a má aktivitu, inhibující růst nádoru, má schopnost inhibovat nádorový proces, aniž by inhibovala růst normálních buněk.

    47. Farmaceutický prostředek pro léčbu nádoru, vyznačující se tím, že zahrnuje farmaceuticky přijatelný nosič a sloučeninu, vybranou na základě stanovení aktivity sloučeniny, inhibující cyklooxygenázu (COX) a stanovení, zdali sloučenina zvyšuje aktivitu PKG v nádorových buňkách; a výběr sloučeniny pro léčbu nádoru s nižší aktivitou, inhibující COX než je její schopnost zvyšovat aktivitu PKG.

    48. Farmaceutický prostředek pro léčbu nádoru, vyznačující se tím, že zahrnuje farmaceuticky přijatelný nosič a sloučeninu, vybranou na základě stanovení aktivity sloučeniny, inhibující

    4 ·

    4 4

    4 4 4 4

    4 4 4 4

    4 4 4 4 4

    4 4 4 4

    44 44 růst buněk; stanovení, zdali sloučenina zvyšuje aktivitu PKG v nádorových buňkách; a výběr sloučeniny, která vykazuje aktivitu, inhibující růst nádorové buňky a zvyšuje aktivitu PKG v nádorových buňkách.

    49. Farmaceutický prostředek pro léčbu nádoru, vyznačující se tím, že zahrnuje farmaceuticky přijatelný nosič a sloučeninu, vybranou na základě zhodnocení, zdali PKG způsobuje fosforylaci β-kateninu v nádoru, který je léčen a výběr sloučeniny, která způsobuje fosforylaci β-kateninu jako sloučeniny pro léčbu nádoru, který má být léčen.

    50. Způsob výběru sloučeniny pro léčbu nádoru, který má být léčen, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    (a) hodnoceni protinádorové aktivity sloučeniny na nádor, který má být léčen;

    (b) hodnocení, zdali sloučenina zvyšuje aktivitu PKG v nádoru, který má být léčen; a (c) výběr sloučeniny, která vykazuje protinádorovou aktivitu a je schopna způsobovat zvýšení aktivity PKG v nádoru, který má být léčen.

    51. Způsob podle nároku 50, vyznačující se tím, že dále zahrnuje hodnocení, zdali sloučenina inhibuje PDE5 a výběr sloučeniny, která inhibuje PDE5.

    52. Způsob podle nároku 50, vyznačující se tím, že dále zahrnuje hodnocení, zdali sloučenina snižuje β-katenin v nádoru, který má být léčen a výběr sloučeniny, která takto snižuje βkatenin.

    53. Způsob podle nároku 50, vyznačující se tím, že dále zahrnuje hodnocení, zdali sloučenina inhibuje cGMP-specifickou fosfodiesterázu („PDE“) a výběr sloučeniny, která inhibuje zmíněnou PDE.

    54. Způsob podle nároku 50, vyznačující se tím, že dále zahrnuje hodnocení, zdali sloučenina zvyšuje expresi PKG a výběr sloučeniny, jestliže zvyšuje expresi PKG.

    55. Způsob podle nároku 50, vyznačující se tím, že dále zahrnuje hodnocení, zdali sloučenina zvyšuje aktivaci PKG a výběr sloučeniny, jestliže zvyšuje aktivaci PKG.

    56. Způsob podle nároku 50, vyznačující se tím, že dále zahrnuje hodnocení, zdali sloučenina inhibuje PDE2 a výběr sloučeniny, která inhibuje PDE2.

    57. Způsob výběru sloučeniny pro léčbu nádoru, který má být léčen, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    (a) hodnocení, zdali sloučenina zvyšuje aktivitu PKG v neporušené nádorové buňce nádoru, který má být léčen;

    (b) hodnocení, zdali sloučenina snižuje β-katenin v nádorových buňkách; a (c) výběr sloučeniny, která způsobuje zvýšení aktivity PKG v neporušené nádorové buňce a způsobuje snížení β-kateninu v nádoru, který má být léčen.

    • · • · · · • · · « • · · · · • · · « ·· ··

    58. Způsob identifikace sloučeniny, účinné pro léčbu nádoru, vyznačující se tím, že zahrnuje: výběr sloučeniny, která zvyšuje aktivitu PKG v nádoru; a hodnocení aktivity sloučeniny, inhibující růst nádoru, kdy sloučenina, která zvyšuje aktivitu PKG a má aktivitu, inhibující růst nádoru, má schopnost inhibovat nádorový proces aniž by inhibovala růst normálních buněk.

    59. Způsob identifikace sloučeniny, účinné pro léčbu nádoru, vyznačující se tím, že zahrnuje: stanovení aktivity sloučeniny, inhibující cyklooxygenázu (COX); a stanovení, zdali sloučenina zvyšuje aktivitu PKG v nádorových buňkách;

    nízká aktivita, inhibující COX a zvýšení aktivity PKG naznačuje, že sloučenina je účinná pro léčbu nádoru.

    60. Způsob výběru sloučeniny pro léčbu nádoru, vyznačující se tím, že zahrnuje stanovení aktivity sloučeniny, inhibující růst nádorové buňky;

    stanovení, zdali sloučenina zvyšuje aktivitu PKG v nádorových buňkách; a výběr sloučeniny, která vykazuje aktivitu, inhibující růst nádorové buňky a zvyšuje aktivitu

    PKG v nádorových buňkách.

    61. Způsob výběru sloučeniny pro léčbu nádoru, který má být léčen, vyznačující se tím, že zahrnuje hodnocení, zdali PKG způsobuje fosforylaci β-kateninu v nádoru, který má být léčen a výběr sloučeniny, která způsobuje, že PKG fosforyluje β-katenin, jakožto sloučeniny pro léčbu nádoru, který má být léčen.