CZ448099A3 - Alfal-antitrypsinové preparáty, způsob jejich výroby a jejich použití - Google Patents
Alfal-antitrypsinové preparáty, způsob jejich výroby a jejich použití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ448099A3 CZ448099A3 CZ19994480A CZ448099A CZ448099A3 CZ 448099 A3 CZ448099 A3 CZ 448099A3 CZ 19994480 A CZ19994480 A CZ 19994480A CZ 448099 A CZ448099 A CZ 448099A CZ 448099 A3 CZ448099 A3 CZ 448099A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- preparation
- plasma
- fraction
- preparation according
- adsorption chromatography
- Prior art date
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 title description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 14
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 claims abstract description 13
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 claims abstract description 13
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 25
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 claims description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 10
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 10
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 9
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 8
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 claims description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 8
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 claims description 7
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 claims description 7
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 claims description 6
- CGMRCMMOCQYHAD-UHFFFAOYSA-J dicalcium hydroxide phosphate Chemical compound [OH-].[Ca++].[Ca++].[O-]P([O-])([O-])=O CGMRCMMOCQYHAD-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims description 6
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 6
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 4
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 claims description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 claims description 3
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 claims description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 3
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 claims description 3
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 claims description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 claims description 2
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims description 2
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 claims description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 17
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 14
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 13
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 13
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 11
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 10
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 7
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 6
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 5
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 5
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 4
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 4
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 229940099982 prolastin Drugs 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 2
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 125000001183 hydrocarbyl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000010695 polyglycol Substances 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N serine Chemical compound OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LKDMKWNDBAVNQZ-UHFFFAOYSA-N 4-[[1-[[1-[2-[[1-(4-nitroanilino)-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)NC(C)C(=O)NC(C)C(=O)N1CCCC1C(=O)NC(C(=O)NC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 LKDMKWNDBAVNQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000004173 Cathepsin G Human genes 0.000 description 1
- 108090000617 Cathepsin G Proteins 0.000 description 1
- 206010010144 Completed suicide Diseases 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101000615334 Homo sapiens Antileukoproteinase Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- UEEJHVSXFDXPFK-UHFFFAOYSA-N N-dimethylaminoethanol Chemical compound CN(C)CCO UEEJHVSXFDXPFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012404 Orosomucoid Human genes 0.000 description 1
- 108010061952 Orosomucoid Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 241001522306 Serinus serinus Species 0.000 description 1
- 102000008847 Serpin Human genes 0.000 description 1
- 108050000761 Serpin Proteins 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- KDQPSPMLNJTZAL-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogenphosphate dihydrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O KDQPSPMLNJTZAL-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000001516 effect on protein Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 238000007046 ethoxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- -1 fatty acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 150000002191 fatty alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000013020 final formulation Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 102000051410 human SLPI Human genes 0.000 description 1
- 238000012872 hydroxylapatite chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 description 1
- 229940057838 polyethylene glycol 4000 Drugs 0.000 description 1
- 229920000151 polyglycol Polymers 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229940068965 polysorbates Drugs 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Nativní chromatografický čištěný al-AT-preparát, kteiý má
čistotu alespoň 0,7 PE/mg proteinu a relativní plasma-al-ATaktivitu
alespoň 120 %, přičemž poměr aktivního al-AT
k inaktivnímu ocl-ATje vyšší než v plasmě. Způsob výroby
tohoto preparátu, jakož i použití nosného materiálu, například
anorganického nosného materiálu,jakoje hydroxylapatit, pro
dělení aktivního al-ATod inaktivního al-AT.
Description
Oblast techniky
Vynález se týká αΐ-antitrypsinových preparátů, způsobu jejich výroby a jejich použití.
Dosavadní stav techniky αί-antitrypsin (al-AT) je protein, vyskytující se v plasmě, který je vzhledem ke svým strukturním a funkčním vlastnostem zařazen do skupiny serpinů (Serine protease inhibitors) . Na základě jeho účinku inhibujkícího serinproteasy, je al-AT známý také pod pojmenováním al-proreinase-inhibitor. al-AT je zodpovědný za přibližně 90 % tryptické inhibiční aktivity normální plasmy, takže je často také označován jako hlavní-ptasma-serpin (Major plasma serpin) . Obzvláštním fyziologickým významem je inhibiční aktivita al-AT se zřetelem na elastasu.
al-AT je primárně ochranný protein, kterým mají být buňky chráněné před uvolněnými proteolytickými enzymy. Je syntetisován v játrech a sekretován do plasmy, kde má poločas přibližně 6 dnů. Normální koncentrace al-AT v plasmě činí 1,3 g/1 .
al-AT je relativně malá a polární molekula, která rychle proniká do buněčných tekutin a tam může působit. Lidský al-AT sestává z jednoho jediného polypeptidového © · • ·· ·· ·· • · · · * ·· · • · © © © · • · · ··· ··· • · · © ······· ·« ·· řetězce se 394 zbytky aminokyselin se třemi glykosylačními posicemi na asparaginových zbytcích v posicích 46, 83 a 247 . Zatímco na asparaginu 46 a 247 jsou přítomné jak dvou-, tak také troj-anténní sialysované uhlovodíkové postranní řetězce, je na asparaginu 83 pouze jeden sialysovaný dvouanténní postranní řetězec (Carrell a kol., Nátuře 298 (1982), 329 až 334).
Proteinový řetězec al-AT se vyskytuje v plasmě ve dvou formách, přičemž v jedné formě je odstraněn N-terminální pentapeptid.
Na základě těchto uhlovodíkových postranních řetězců, ale také na základě možného odstranění pentapeptidu, dochází k pravé mikroheterogenitě, která se v jednom a tom samém individuu může také měnit. Vyskytuje se, že ke značným změnám v proporcích těchto isoforem al-AT-molekul dochází během zánětů nebo podávání estrogenů, což pravděpodobně vede zpětně k tomu, že na základě stresových situací se výhodně odbourávají částečně desialysované formy, aby se rychleji opět došlo k normální hladině plasmy (Patterson, Comp. Biochem. Physiol. 100 B (3)(1991), 439 až 454).
Serinproteasy inhibující účinek al-AT je vztahován na formaci stabilních 1 : 1 komplexů mezi al-AT a cílové proteasy. al-AT působí tedy jako jeden druh suicidsubstrátu, se kterým jsou potlačovány další proteasové reakce serinproteas. Účinek al-AT je především inhibován uvolněnými radikály, které rovněž vznikají při zánětech. Fyziologicky slouží tato oxidační labilita pravděpodobně k tomu, že v vezprostředním okolí zánětu je potlačena enzym-inhibující aktivita al-AT , takže proteasy, jako je elastasa a kathepsin G , mohou rozvinout svůj plný účinek při potírání na-
• · © · ·
příklad bakterii, způsobujících zánět.
Oxidační labilita al-AT je však především nevýhodná tam, kde je exponován ctl-AT , popřípadě kapalina, která al-AT obsahuje, jako například v kapalinách respiračního traktu. Tak je elastická tkáň plic chráněna před povrchovými vlivy v podstatě dvěma inhibitory, humáním sekretorickým leukocytovým inhibitorem proteas, který se nachází hlavně v horním respiračním traktu a al-AT , který se nachází převážně ve spodním respiračním traktu. Ačkoliv normálně je přítomno více než dost inhibiční kapacity pro obranu spodního respiračního traktu, může docházet při nadměrné exposici volnými radikály, jako například při silném kouření, k problémům (inhibiční kapacita al-AT je při silném kouření přibližně poloviční).
Prozatím je známo přes 70 kvalitativních a kvantitativních variant lidského al-AT , které se dědí jako autosomální ko-dominantní alely, přičemž se vychází z toho, že přibližně 10 % (!) evropské populace je nosičem patologické varianty al-AT . Také jsou známé al-AT-deficience a jsou relativně široce rozšířené. Nejpozoruhodnější patologická zjištění v souvislosti s variací al-AT-genu jsou relativně brzy počínající degenerativní onemocnění plic, jakož i těžká onemocnění jater. Vedle toho se ve spojitosti s variací al-AT-genu objevují ale také onemocnění ledvin, arthritis a maligní onemocnění. Především při onemocnění plic je jisté, že tato jsou přímo odvozována z úrovně al-AT v plasmě, která kvůli kumulovaným proteolytickým poškozením způsobuje ztrátu elasticity plic. Tak je silný kuřák s homozygotní chybou al-AT dvojnásobně ohrožován a má vysoké rislko rozvinutí emphysemie již ve stáří pod 40 let. Proti nekouřícím homozygotům by měl dobu života zkrácenou o 20
let.
V plasmě se nachází al-AT jak v aktivní formě, tak také v inaktivní formě (viz například Pajdak V. a kol.,
Folia Histochemica et Cytobiologica, Vol. 24 (1986), str.
169 až 172).
Je známá celá řada způsobů výroby al-AT, které zahrnují frakcionované srážení plasmy polyethylenglykolem 4000, ale také zpracování různých frakcí plasmy (Cohn-Fraktion IV-l-precipitát nebo Kistler a Nitschmann-superbatant A nebo A+l) (Feldman a Vinkelman, Blood Separation and Plasma Fractionation (1991), Viley-Liss, lne., str. 341 až 383).
Při dále jdoucím čištění se odpovídající krevní frakce čistí například pomocí DEAE-celulosy (Basis a kol., Vopr. Med. Khim. 33 (1)(1987), 54 až 591) , pomocí materiálů afinitní chromatografie nebo materiálů kationtoměničové chromatografie (EP-0 698 615-A1).
Basis a kol. popisuji způsob čištěni al-AT srážením plasmy síranem amonným a následující chromatografií na DEAE-celulose a chromatografii na hydroxylapatitu. Tento postup ase provádí stále za přítomnosti merkaptoethanolu, který má chránit protein vůči oxidaci síru obsahujících skupin. al-AT se získá pomocí chromatografie na hydroxylapatitu ve dvou frakcích, avšak oba proteiny, al-AT a albumin, se oddělí neúplně.
V průběhu přípravy způsobu podle předloženého vynálezu bylo nyní zjištěno, že se pomocí všech dosavadních způsobů výroby, ovzvláště ale také při způsobu podle Basise a kol.
a podle EP-0 698 625-A1 , nepodařilo úplně oddělit inaktivní al-AT , vyskytující se konstitutivně v plasmě s aktivním al-AT , popřípadě vyrobit preparát za získání aktivního isomeru.
Úkolem předloženého vynálezu tedy je vypracování způsobu, pomocí kterého by bylo možno získat al-AT-preparát, ve kterém by byl poměr aktivního al-AT k inaktivnímu al-AT ve prospěch aktivního al-AT , to znamená pomoci kterého by bylo možno selektivně oddělit inaktivní al-AT od aktivního al-AT .
Dalším úkolem předloženého vynálezu je dát k disposici al-AT-preparát, který by byl zlepšený ve srovnání s dosavadními preparáty.
Podstata vynálezu
Předmětem předloženého vynálezu tedy je preparát na basi nativního, chromatograficky čištěného α-1-antitrypsinu, zlepšený ve srovnání s dosavadními preparáty.
Předmětem předloženého vynálezu tedy je preparát na basi nativního, chromatograficky čištěného al-AT , který má čistotu alespoň jako 0,7 PE/mg proteinu a relativní plasma-al-AT-aktivitu alespoň 120 % .
Relativní plasma-al-AT-aktivita je definována jako pomšr aktivního k inaktivnímu al-AT , přičemž se bere tento poměr v plasmě se 100 % relativní plasma-al-AT-aktivity.
Pro preparáty, dávané k disposici podle předloženého « vynálezu, je tato relativní plasma-al-AT-aktivita výhodně přes 130 % , obzvláště přes 140 % a obzvláště výhodně přes • ·
4 ·
444 444
150 % . Ve zvláštních případech bývá relativní Plasma-al-AT-aktivita tapé přes 160 % . U produktů podle předloženého vynálezu je na základě své čistoty získaný protein přibližně s al-AT-proteinem rovnocenný, takže je možno relativní plasma-al-AT-aktivitu jednoduchým způsobem spočítat .
al-AT se vyskytuje v krvi, popřípadě v séru v určitém podílu vždy také v inaktivní formě, to znamená že nemá žádnou aktivitu inhibující elastasu, je ale ještě imunoreaktivní. Celkové množství aktivního a inaktivního al-AT se může stanovovat pomocí všech běžných metod, například antigen- kvant i fíku j í čími imunologickými metodami, jako je ELISA.
Příčiny výskytu inaktivního al-AT mohou být různé, například může být al-AT inaktivní vzhledem k rozštěpení molekuly nebo na základě poruch v konformaci.
Vzhledem k tomu, že normálně může být v krvi, popřípadě v séru, přítomno až 20 % inaktivního al-AT a tento nemůže být podle dosavadních metod oddělen, představují preparáty podle předloženého vynálezu podstatný pokrok ve srovnání s dosavadními preparáty, ve kterých byl dosud vždy spoluobsažen inaktivní podíl. Jak bylo uvažováno, činí koncentrace al-AT v normální plasmě asi 1,3 g/1 , což dává specifickou aktivitu 0,77 PE/mg (plasmajednotky, stanoveno v elastasovém inhibiěním testu, viz příklad 3) .
al-AT-preparát podle předloženého vynálezu obsahuje výhodně alespoň isomer s hodnotou PI v rozmezí 4,3 až 4,4.
Překvapivě se totiž ukázalo, že přímo na základě to·· · «9 99 ·« • · · · 9 9 9 9 9 • · · 9 · · 9 9·9 9·9 • · · · 9 9 9
999 99 999 9999 99 99 hoto isomeru je aktivita al-AT velmi vysoká. Vzhledem k tomu, že isomer s hodnotou PI v rozmezí 4,3 až 4,4 byl na základě své azidové povahy při způsobu získávání al-AT, popsaném ve stavu techniky, vždy oddělen společně s albuminem od získávané al-AT-frakce, nenacházejí se v žádném al-AT preparátu žádné podíly tohoto isomeru, které by byly hodné zmínky. V souvislosti s uvedeným vynálezem se však ukázala relevance přímo tohoto isomeru se zřetelem na výtěžek aktivity a proto se podle předloženého vynálezu při způsobu výroby používají pouze kroky, které nedovolují oddělení tohoto isomeru od ostatního al-At nebo dovolují jeho oddělení pouze z nepodstatné části, takže větší část tohoto kyselého isomeru zůstává v konečném preparátu.
Rozděleni isomerů výhodného preparátu odpovídá tedy rozdělení nativního proteinu, obzvláště proteinu, který je ziskatelný z plasmy. Obzvláště odpovídá rozdělení isomerů al-AT-preparátu podle předloženého vynálezu při ozřejmění isoelektrickou fokusací (IEF) kvadrupletovému pásovému vzoru.
IEF se provádí obzvláště pomocí gelu Ampholíne PAG plate IEF™ (pH 4,0 až 6,5 nebo pH 4,0 až 5,0) od firmy Pharmacia v souladu s předpisem, udávaným firmou Pharmacia, za použití IEF-markerů firmy Sigma (IEF Mix 3,6 - 6,6).
Isomer s hodnotou pí v rozmezí 4,3 až 4,4 při tom odpovídá nejkyselejšímu pásu. Tento isomer však zcela chybí přímo u čistých, púopřípadě vysoce čistých preparátů al-AT, nebo je v nich obsažen pouze v nepatrné míře pod hranicí důkazu.
Preparát al-AT podle předloženého vynálezu vykazuje • · obzvláště vysokou čistotu, například čistotu vyšší než 0,8 PE/mg , výhodně čistotu vyšší než 0,9 PE/mg , obzvláště výhodně vyšší než 1 PE/mg . Dokonce se ukázalo, že jsou podle předloženého vynálezu dosažitelné čistoty přes 1,1 PE/mg , obzvláště přes 1,2 PE/mg .
Preparát podle předloženého vynálezu obsahuje přitom obvykle méně než 10 % , výhodně méně než 5 % a obzvláště méně než 2 % inaktivního al-AT .
Podle předloženého vynálezu je také možné dát k disposici al-AT-preparár, který je v podstatě prostý inaktivního al-AT .
Poměr akticního al-AT k inaktivnímu al-AT je v preparátu podle předloženého vynálezu zvýšený, obzvláště je vyšší než tento poměr v humání normální plasmě. Je tedy podle předloženého vynálezu možné získat hyperaktivní, popřípadě jako nascentní označovaný al-AT.
Pod pojmem normální plasma se podle předloženého vynálezu rozumí standardisovaná plasma se zřetelem na obsah aktivního al-AT . Standardisace, tedy určení aktivního al-AT , se může provádět pomocí pro to běžných metod. Například se provádí pomoci inhibice aktivity elastasy, popřípadě trypsinu.
Preparát podle předloženého vynálezu má při tom oproti preparátům podle stavu techniky podstatnou výhodu, že preparát, určený obzvláště pro farmaceutickou aplikaci, je nižším obsahem inaktivního al-AT se zřetelem na svoji účinnost podstatně více definovaný než známé preparáty, což má enormní výhodu obzvláště při medicínském použití.
• ·
Výhodně je poskytován k disposici konservujici cti-AT, u kterého může být vyloučeno použití stabilisátorů oxidace, jako je β-merkaptoethanol. Pojem konservovující znamená tedy v rámci předloženého vynálezu, že al-AT je dostatečně stabilní také bez přítomnosti stabilisátorů oxidace, jako je β-merkaptoethanol, což je obzvláště překvapivé vzhledem ke známé velké labilitě al-AT vůči oxidaci.
Při výrobě preparátu podle předloženého vynálezu se může vycházet z krve, plasmy, séra nebo jeho frakcí, ale také z buněčných kultur, obzvláště rekombinantních buněčných kultur, nebo supernatantů buněčných kultur.
Výhodně je obsah monomeru preparátu podle předloženého vynálezu alespoň 95 % , obzvláště alespoň 98 % .
Výhodná forma provedení preparátu podle předloženého vynálezu spočívá v tom, že je preparát zlepšen nejen se zřetelem na obsah aktivního al-AT , ale také se vyskytuje ve vyšší čistotě, například alespoň 90 % (mg/mg proteinu).
Předmětem předloženého vynálezu je také farmaceutický přípravek, obsahující al-AT-preparát podle předloženého vynálezu, popřípadě s farmaceuticky přijatelnými pomocnými substancemi, jako jsou pufry, stabilisátory, adjuvanty, antioxidanty, solemi nebo excipienty.
Vzhledem k tomu, že uvedené preparáty se mají používat hlavně ve farmaceutické oblasti, spočívá výhodná forma provedení v tom, že je preparát zpracován k inaktivaci popřípadě přítomných patogenů. Výhodně se preparát podle předloženého vynálezu dává k disposici ve formě stabilní pro • · • · *« • » · • · »« » »4 ·· • <· · · ··« ·*· • · f ♦ ♦ skladování, obzvláště jako lyofilisát nebo jako (hluboce zmrazený) roztok, zvláště jako roztok, který je vhodný pro íntravenosní aplikací, jako aerosol nebo jako sprej. Preparát se může vyskytovat také asociovaný s liposomy, popřípadě fosfolipidy nebo jinými mikro- nebo nanopartikulárními formami, což je výhodné pro určité aplikační formy.
Předmětem předloženého vynálezu je rovněž způsob výroby al-AT-preparátu podle předloženého vynálezu čištěním frakce, obsahující al-AT , která je výhodně získatelná z humáního plasmapoolu pomocí adsorpční chromatografie tak, že se al-AT adsorbuje, popřípadě se oddělí insktivní al-AT a aktivní al-AT se získá v jedné frakci elucí.
Pod pojmem adsorpční chromatografie se podle předloženého vynálezu rozumí taková chromatografie, při které se al-AT adsorbuje (váže) na chromatografický materiál. Nakonec se může elucí získat požadovaná frakce.
Pro adsorpční chromatografii se může použít například anorganický chromatografický materiál, jako je hydroxylapatit, výhodně keramický hydroxylapatit. Adsorpční chromatograf ie se může ale také provádět na aniontoměniči, výhodně za přítomnosti detergentu.
Jako aniontoměniče se výhodně použijí materiály na basi uhlohydrátů nebo vinylpolymerů, které se osvědčily v laboratorních podmínkách a při průmyslovém použití, obzvláště komerčně dostupné produkty, jako je například DEAE-SephacelR, DEAE-SephadexR, DEAE-SepharoseR CL6B,
DEAE-SepharoseR Fast Flow, QAS-SephadexR, Q-SepharoseR Fast η n
Flow, Q-Sepharose Big Beats , Q-Sepharose High Performance (firmy Pharmacia); DEAE-Trisacryl, DEAE-SpherodexR, Q-Hy• · · ·
per-D^ (firmy Sepracor); DEAE-Toyopearl^, QAE-Toyopearl^, Toyopearl Super-Q^ (firmy Tosohaas); Fractogel^-EMDT, -TMAE nebo jiné Fractogelové materiály, Licrospher 1000 TMAE^, Lisrospher 1000 DEAE^ a Licrospher 4000 DMAE& (firmy Merck); Macroprep DEAE^, Macroprep (firmy BioRad); Protein PAK DEAE^ (firmy Vaters) , přičemž výhodné je zpracováni pomoci silného aniontoměniče, například Q-sepharosy. Přesné podmínky, při kterých probíhá získávání aktivního al-AT , mohou kolísat vždy podle materiálu iontoměniče; tyto jsou ale pro odborníky pro odpovídající materiály známé a je možno je lehce a bez velkých nákladů zjistit, popřípadě optimalisovat.
Výhodně se výchozí materiál při, popřípadě před adsorpční chromatografií neinkubuje nebo se inkubuje pouze po velmi krátkou dobu (například několik málo minut). Adsorpční chromatografie, popřípadě získání al-AT , se provádí obzvláště za takových podmínek, aby isomer s hodnotou pl mezi 4,30 a 4,40 , obzvláště mezi 4,34 a 4,39 zůstával v jímaných frakcích a obzvláště výhodně tak, aby spektrum aktivních isomerů zůstávalo zachováno také během, popřípadě po čištění, popřípadě zpracování. Tyto podmínky jsou pro odborníky lehce optimalisovatelné vyzkoušením různých elučních pufrů pro odpovídající použité adsorpční materiály, neboř isomer s hodnotou pl v rozmezí 4,3 a 4,4 , popřípadě frakce, ve které je tento isomer obsažený, je lehce delektovatelná pomocí IEF . Při tom se musí dbát obzvláště na to, aby se tento kyselý isomer neoddělil s albuminem. Toto je však pro odborníky bez problému možné, například zkoušením eluovaných frakcí pomocí gelové elektroforesy, popřípadě IEF (a detekcí kyselého al-AT a albuminu).
Při další výhodné formě provedení se neprovádí chro- 12 ·· · · · · matografie na kationtoměniči, obzvláště se neprovádí žádná chromatografie na kationtoměniči při nízké hodnotě pH .
pod pojmem detergent (tensid) se obvykle rozumí povrchově aktivní organická látka, obzvláště organické syntetické produkty. Podle předloženého vynálezu se výhodně používají neionogenní detergenty, jako jsou polyethery, obzvláště alkyl-, fenol- a polyglykolethery, produkty ethoxylace mastných kyselin, amidů mastných kyselin, mastných aminů, mastných alkoholů a aminoxidů, estery mastných kyselin a polyalkoholů a cukrové estery. Detergent (tensid) nepůsobí obzvláště na proteiny denaturačně. Obzvláště výhodné jsou pro účely předloženého vynálezu tensidy ze skupiny polysorbátů (například tveen) a tensidy ze skupiny Tritonu^.
Adsorpční chromatografií se může při způsobu podle předloženého vynálezu předřadit nebo zařadit při výhodné formě provedení další zpracování, jako je například srážení, filtrace, gelová filtrace, zpracování s anorganickým nosným materiálem nebo chromatografické čištění. Jako výhodný anorganický nosný materiál se při tom osvědčil hydroxylapatit, přičemž obzvláště výhodný je zde keramický hydroxylapatit. Při další výhodné formě provedení se adsorpční chromatograf ie na aniontoměniči, výhodně za přítomnosti detergentu, kombinuje s adsorpcí na hydroxylapatitu.
V průběhu prací na předloženém vynálezu se překvapivě ukázalo, že za zvláštních okolností je možné také zpracováním s anorganickými materiály, jako je hydroxylapatit, dosáhnout dělení aktivního al-AT od inaktivního al-AT. Tento efekt nastupuje obzvláště tehdy, když je již al-AT v podstatě oddělený od albuminu.
• ·
» · · · «· · ···
Proto je také zpracování předčištěných al-AT-preparátů s anorganickými nosnými materiály, obzvláště s hydroxylapatitem vhodné pro výrobu preparátů podle předloženého vynálezu. Výhodně se z výchozího materiálu již předem z vysokého procenta odstraní. Oddělení aktivního al-AT se provádí výhodně frakcionovanou elucí. Zpracování s hydroxylapatitem představuje výhodně terminální čistící krok.
Překvapivě se ukázalo, že ačkoliv je al-AT jak známo extrémně labilní vůči oxidaci, může se způsob podle předloženého vynálezu provádět také bez použití β-merkaptoethanolu nebo jiných inhibitorů oxidace, které je třeba specielně při výrobě farmaceutických preparátů vyloučit.
Způsob podle předloženého vynálezu se tedy výhodně provádí za nepřítomnosti β-merkaptoethanolu nebo jiných stabilisátorů vůči oxidaci, to znamená, že se nepoužívá žádný pufr, který by takovýto stabilisátor obsahoval.
Výhodný výchozí materiál pochází výhodně z plasmapoolu, obzvláště takového, který se získává od dárců krve s al-AT normální hladinou. Pro způsob podle předloženého vynálezu se používá výhodně plasma nebo frakce plasmy, obzvláště o albumin ochuzená výchozí frakce, výhodně Cohn V-sraženina, odpovídající v podstatě Cohn IV A-frakci (podle Cohn, Review 28 (1941), 395 až 417). Při další výhodné formě provedení se vychází z předčištěné frakce, například z komerčně dostupného preparátu, jako je Prolastin.
Při způsobu podle předloženého vynálezu se také výhodně provádí krok pro inaktivaci, popřípadě odstranění
popřípadě přítomných patogenů. Toto zpracování k inaktivaci a/nebo odstranění se výhodně zajišťuje zpracováním tensidy a/nebo teplem, například tepelným zpracováním v pevném stavu, obzvláště zpracováním parou podle EP-0 159 311, EP-0 519 901 nebo EP-0 674 531 , ale také zpracováním organickými rozpouštědly a/nebo detergenty, například podle EP-0 131 740 a EP-0 050 061.
Další zpracování pro inaktivaci virů, popřípadě patogenů, zahrnuje také zpracování chemickými nebo chemicko-fyzikálními metodami, například chaotropními látkami podle VO 94/13329 nebo DE-44 34 538 , nebo fotoinaktivaci.
Ozařování nebo nanofiltrace představuje výhodné fyzikální postupy pro odstaňování virů v rámci předloženého vynálezu .
Způsob podle předloženého vynálezu se výhodně koncipuje tak, aby při tom bylo možné také získávání jiných proteinů, obzvláště získávání transferrinu, albuminu, orosomucoidu a apolipoproteinu, které se potom mohou získávat v další frakci chromatografického zpracování podle předloženého vynálezu. Přesné podmínky může odborník při znalosti předloženého vynálezu pro každý chromatografický materiál lehce zjistit, popřípadě optimalisovat.
Hodnota pH je při provádění způsobu podle předloženého vynálezu, obzvláště při eluci, výhodně v rozmezí 5,5 až 8,0 , obzvláště 6,5 až 6,8 . Ukázalo se také, že při provádění způsobu podle předloženého vynálezu je vhodné použití pufru s iontovou silou odpovídající 10 mM fosfátu.
Podle dalšího aspektu se týká předložený vynález použití nosného materiálu pro dělení inaktivního cel-AT od aktivního cel-AT . Jako pevný nosný materiál pro adsorpci a dělení se výhodně používá anorganický nosný materiál, jako je hydroxylapatit, nebo aniontoměnič za přítomnosti detergentu, obzvláště Q-Sepharosa za přítomnosti Tveenu při další výhodné formě provedení.
Vynález je blíže objasněn pomocí následujících příkladů provedení, na které však není nijak omezen.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Čištění cel-AT z Cohn V-staženiny (v současné době podle názoru přihlašovatele nej lepší cesta pro provedení vynálezu)
Cohn V-staženina se mícháním suspenduje s trojnásobnou hmotností A-pufru (1,2 g/1 dihydrátu hydrogenfosforečnanu sodného = 6,74 mM, 10 g/1 chloridu sodného = 171 mM, pH 7,0 , upraveno 96% kyselinou octovou) po dobu 4 až 6 hodin při teplotě 4 °C . Potom se cel-AT z této zakalené suspense přes noc vysráží při konečné koncentraci ethylalkoholu 17,5 % při teplotě 6 °C .
Odstředěná sraženina se míchá se 24-násobnou hmotností 10 mmol Tris-HCl, pH 10,4 (upraveno 6 M hydroxidem sodným) po dobu 30 minut při teplotě místnosti a potom 90 minut při teplotě 40 °C , potom se hodnota pH upraví na 6,5 a vyčiří se pomocí filtru CUNO 50SA . Do filtrátu se přidá 15 % v/v Tweenu 80 a míchá se po dobu 2 hodin při teplotě 26 °C .
·· ·· • 9 · • · 9 ··* ···
Získaný roztok se nanese na chromatografický sloupec, naplněný Q-Sepharosou^ Fast Flow (Pharmacia) a ekvilibrovaný 25 mM natriumfosfátového pufru, pH 6,5 , aby to odpovídalo 10 mg proteinu na 1 ml gelu (asi dva objemy sloupce) a promyje se 2,5 objemy sloupce 25 mM natriumfosfátového pufru, pH 6,5 (eluuje při tom z větší části Tween^ 80) a potom 3 objemy sloupce 60 mM chloridu sodného ve 25 mM natriumfosfátového pufru, pH 6,5 (eluuje transferrin).
Elucl 3 objemy sloupce 100 mM chloridu sodného ve 25 ml natriumfosfátového pufru, pH 6,5, se získá frakce, obsahující al-AT s asi 0,40 až 0,60 plasmajednotkami (PE) al-AT na jeden mg Proteinu, přičemž aktivita se zjišťuje inhibicí elastasy podle příkladu 3 (1 PE al-AT odpovídá asi
1,3 mg čistého al-AT) .
Pomoci 3 objemů sloupce 125 mM chloridu sodného ve 25 mM natriumfosfátového pufru, pH 6,5 , se může potom eluovat hlavně sérový albumin a další plasmové proteiny a pomocí 1 až 2 M chloridu sodného ve 25 mM natriumfosfátového pufru, pH 6,5 , inaktivní al-AT (prakticky žádná inhibice elastasy, ale imunoreaktivní al-AT) a zbytkové nečistoty.
Frakce obsahující al-AT se asi třicetkrát zkoncentruje pomocí ultrafiltrační membrány (vylučovací hranice 30000 Dalton) a diafiltruje se s 0,15 g/1 Na^-citrátu x 2 H20 = 0,5 mM .
Získaná diafiltrát se potom lyofilisuje. Lyofilisovaný prášek se upraví na zbytkový obsah vody 7,5 ± 0,5 % a podrobí se S-TIM 4-zpracováni podle EP-0 159 311 (10 hodin • · · ·
• · · · · • · · · · « « ······ • · ·· ·· ·· při teplotě 60 °C a 1 hodinu při teplotě 80 °C).
Zpracovaný prášek se rozpust! v 10 mM natriumfosfátového pufru, pH 6,8 , na asi 10 mg/ml proteinu a nanese se na chromatografický sloupec, naplněný keramickým hydroxylapatitem (Macropep Typ I, zrnitost 80 μιη, Bio-Rad) a ekvilibrovaný 10 mM natriumfosfátového pufru, pH 6,8 , aby to odpovídalo 10 mg proteinu na jeden ml lože sloupce (asi 1 objem sloupce).
Elucí 5 objemy sloupce 40 mM natriumfosfátového pufru, pH 6,8 , se získá frakce, obsahující al-AT s asi 0,90 až 1,05 plasmajednotkami (PE) al-AT na jedem mg proteinu .
Třemi objemy sloupce 100 mM natriumfosfátového pufru, pH 6,8 , je možno potom ještě eluovat hlavně inaktivní al-AT , sérový albumin a další plasmové proteiny a pomocí 500 mM natriumfosfátového pufru, pH 6,8 , zbytkové nečistoty.
Ukázalo se, že pomocí tohoto způsobu čištění je možno získat al-AT s vysokou specifickou aktivitou 1,0 PE/mg (což odpovídá 130 % relativní plasma-al-AT-aktivity) . Výsledek je znázorněn v následující tabulce 1 .
• 9
Tabulka 1
Spec. aktivita PE/mg | čištění | celk. výtěžek/ % plasmy | |
Plasma | 0,014 | 1,0 | 100 |
po hydoxyapatitu | 1,0 | 70,0 | 14 |
Na farmaceutickém trhu se nacházející al-AT-produkt Prolastin (firma Cutter) je podle údajů výrobce čistá ze 45 až 80 % a má modle inhibičniho testu elastasy specifickou aktivitu 0,60 PE/mg (což odpovídá 78 % relativní plasma-al-AT-aktivity) .
Příklad 2
Čištění al-AT (Serva) pomocí keramického hydroxyapatitu al-AT od Serva , který s ninimálně 95% čistotou (podle údajů výrobce stanovoenou pomocí SDS-gelu) má dosud nejvyšší naměřenou specifickou aktivitui al-AT 0,81 PE/mg , se dále zpracovává rovněž přes keramický hydroxyapatit. Spojené frakce dávají specifickou aktivitu 0,92 PE/mg (což odpovídá asi 120 % relativní plasma-al-AT-aktivity). V redukovaném SDS-Excelgelu je vidět se stříbrným zbarvením proteinů jednoznačné oddělení od inaktivního al-AT a jiných znečisťujících proteinů.
• · • ·· ·· ·· ··· · · · · · • β · · · · • · · ·♦· ··· • · · · ··· ···· ·· ··
Příklad 3
Předpis pro měření inhibice elastasy
Test se provádí podle předpisu J. Bietha, B. Spiesse a C.G. Vermutha (1974), The synthesis and analytical use of a highly sensitive and conventient substráte of elastase, Biochem. Med. 11(4), 350-357, popř. J. Travis a D. Johnson (1981), Human alphal-proteinase Inhibitor, Methods of Enzymology 80, 754-765 .
Tris : Tris+:
Elastasa
Substrát
0,2 M Tris-HCl, pH 8,0.
Tris s 0,1 % humáního sérového albuminu (HSA),smíseno krátce před použitím.
6% elastasa (z vepřového pankreatu, Boehringer Mannheim) se zředí 1 : 1000, sterilně se přefiltruje a zmrazí se při teplotě -20 °C .
22,5 mg sukcinyl-(alanin)^-p-nitroanilidu (Bachem Feinchemikalien AG, CH) se rozpustí v 5 ml dimethylformamidu a uschová se při teplotě 4 °C.
Vzorky se zředí Tris+ až na odpovídající koncentrace.
pg elastasy se zředí 275 pl Tris+ (ve vodní lázni temperováno na teplotu 25 °C) a se 100 μΐ vzorku se inkubuje po dobu 3 minut při teplotě 25 °C . Potom se substrát zředí 1 : 10 Tris+ , 200 μΐ tohoto se přimísí ke vsázce a ihned se měří přírůstek extinkce při 405 nm a 25 °C po dobu 5 minut. Jako slepý pokus inhibice se přimísí ke vsázce 100 μΐ Tris+ .
Slepý pokus dává u výše uvedené vsázky 0,05 až 0,06 • · ··· • · ··· ·· • ·· dA/min . Jako standardní křivka slouží zřeďovací řada 1 : 100 až 1 : 400 referenční plasmy (Immuno AG, 1A3E). Prolastin (Cutter) se z předběžného zředění 1 : 50 (v alikvotu při teplotě -20 °C zmraženo) zředí pomocí Tris+ : 80 (zředění 1 : 4000) a spolu se měří při každé měřící sérii se zředěním 1 : 150 referenční plasmy. Při příliš velké odchylce vůči standardní přímce by se měla tato serie měření vypustit nebo považovat výsledky pouze jako přibližné řídící hodnoty.
Inhibice se vypočítá podle rovnice :
% — (1 - (dA/min)vzorek/(dA/min)siep pOk ) · Ιθθ ·
Inhibice vzorků má ležet v oblasti 20 až 50 % inhibice a přepočte se potom pomocí standardní přímky na plasmajednotky.
Příklad 4
Charakterisace různých al-AT-produktů pomocí inhibice elastasy a IEF
Údaje jsou uvedené v následující tabulce 2 .
• ·· • · · ♦ • · · • · · • · · ··· ·· ·· ·· ·· • · · · · · • · · · · • · ··· ··· • · · • ···· ·· ··
'>Ί £
rH (D
4-) | |||
Η | '>1 | 0 | |
τί | β | ΰ | |
•Η | '>1 | ε | 'fd |
> | ΰ | 0 | 4J |
ε | 4J | Ή | |
0 | 0 | Ή | >υ |
Η | 4J | 0 | |
0 | Ή | a | a |
Λ | QJ | 0) | |
ω | Λ | £ | β |
< ά χ.
+ + ' β • ·· • · · · » · ·
9 · · • · ·
999 99 #« ·* 99 • « · 9 9 · © · 9 9 · • 9 999 999
9 ·
9 9 9 9 99 99 py 4?·?<?- ^fe
Claims (32)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Nativní, chromatografíčky čištěný al-AT-preparát, vyznačující se tím, že má čistotu alespoň 0,7 PE/mg proteinu a relativní plasma-al-AT-aktivitu alespoň 120 % .
- 2. Preparát podle nároku 1 , vyznačující se tím, že se vyskytuje jako farmaceutický preparát.
- 3. Preparát podle nároku 1 nebo 2 , vyznačující se tím, že je čištěn z plasmna-poolu.
- 4. Preparát podle některého z nároků 1 až 3 , vyznačující se tím, že má čistotu více něž 0,9 PE/mg , výhodně více než 1,0 PE/mg , obzvláště více než1,1 PE/mg a obzvláště výhodně více než 1,2 PE/mg .
- 5. Preparát podle některého z nároků 1 až 4 , vyznačující se tím, že obsahuje alespoň isomer s hodnotou Pl v rozmezí 4,3 až 4,4 .
- 6. Preparát podle některého z nároků 1 až 5 , vyznačující se tím, že podíl inaktivního al-AT je nižší než 10 % , výhodně nižší než 5 % , obzvláště nižší než 2 % .
- 7. Preparát podle některého z nároků 1 až 6 , vyznačujíc! se tím, že je prostý inaktiv23 • · · ního al-AT .
- 8. Preparát podle některého z nároků 1 až 7 , vyznačující se tím, že al-AT je konservuj ící .
- 9. Preparát podle některého z nároků 1 až 8 , vyznačující se tím, že rozdělení isomerů al-AT odpovídá nativnímu proteinu, obzvláště kvadruplettpásovému vzoru, zřetelnému při isoelektrické fokusaci.
- 10. Preparát podle některého z nároků 1 až 9 , vyznačující se tím, že j e zpracován pro inaktivaci popřípadě přítomných patogenů.
- 11. Preparát podle některého z nároků 1 až 10 , vyznačující se tím, že se vyskytuje ve formě stabilní při skladování, výhodně jako lyofilisát nebo jako roztok, obzvláště jako roztok vhodný pro intravenosní aplikaci, jako aerosol nebo jako sprej.
- 12. Preparát podle některého z nároků 1 až 11 , vyznačující se tím, že se vyskytuje asociovaný s liposomy, fosfolipidy, popřípadě s jinými mikropartikulárními nebo nanopartikulárními formami.
- 13. Způsob výroby preparátu podle nároku 1 čištěním frakce, obsahující al-AT , získatelné pomocí adsorpčni chromatograf ie tak, že se al-AT adsorbuje a aktivní al-AT se získává eluci v jedné frakci.
- 14. Způsob podle nároku 13 , vyznačuj ící t í m , že se jako výchozí- 24 materiál použije plasma nebo frakce plasmy, obzvláště frakce ochuzená o albumin, výhodně Cohn V-sraženina.
- 15. Způsob podle nároku 13 nebo 14 , vyznačujíc! se tím, že se vychází z předčištěné frakce.
- 16. Způsob podle některého z nároků 13 až 15 , vyznačující se tím, že se pro adsorpční chromatografii použije anorganický chromatografický materiál , výhodně hydroxylapatit, obzvláště výhodně keramický hydroxylapatit.
- 17. Způsob podle některého z nároků 13 až 16 , vyznačující se tím, že se pro adsorpční chromatografii použije aniontoměnič, výhodně za přítomnosti detergentu.
- 18. Způsob podle některého z nároků 13 až 16 , vyznačující se tím, že aniontoměničem je Q-sepharosa.
- 19. Způsob podle některého z nároků 13 až 18 , vyznačující se tím, že se adsorpční chromatograf ie provádí za použití pufru, který je prostý merkaptoethanolu.
- 20. Způsob podle některého z nároků 13 až 19 , vyznačující se tím, že pufr, používaný pro eluci, má hodnotu pH v rozmezí 5,5 až 8,0 , výhodně okolo6,5 až 6,8 .
- 21.Způsob podle některého z nároků 13 až 16 a 20 , • 9 vyznačující se tím, že pufr, používaný při eluci, obsahuje sůl s iontovou silou odpovídající 60 mM, výhodně 40 mM fosfátu.
- 22. Způsob podle některého z nároků 13 až 15 a 17 až 20 , vyznačující se tím, že pufr, používaný při eluci, obsahuje sůl s iontovou silou odpovídající 50 až 130 mM chloridu sodného.
- 23. Způsob podle některého z nároků 13 až 22 , vyznačující se tím, že se provádí další krok, zvolený ze skupiny zahrnující srážení, filtraci, gelovou filtraci, zpracování s anorganickým nosným materiálem a chromatografické čištění.
- 24. Způsob podle některého z nároků 13 až 22 , vyznačující se tím, že se kombinuje adsorpční chromatografie na aniontoměniči, výhodně za přítomnosti detergentu, s adsorpcí na hydroxylapatitu.
- 25. Způsob podle některého z nároků 13 až 22 , vyznačující se tím, že se provádí jediná adsorpční chromatografie.
- 26. Způsob podle nároku 25 , vyznačující se tím, že je zařazen další čistící krok, který neobsahuje adsorpční chromatografií.
- 27. Způsob podle některého z nároků 13 až 26 , vyznačující se tím, že v další frakci je získáván protein, zvolený ze skupiny zahrnující transferrin, albumin, orosomukosid a apolipoprotein.* ; í9 9 999 9 9 99 999 9 • · • · · *·
- 28. Způsob podle některého z nároků 13 až 27 , vyznačující se tím, že se provádí krok pro inaktivaci popřípadě přítomných patogenů.
- 29. Způsob podle některého z nároků 13 až 28 , vyznačující se tím, že se jako inaktivace provádí zpracování s detergentem, rozpouštědlem a/nebo za tepla.
- 30. Způsob podle některého z nároků 13 až 29 , vyznačující se tím, že se eluce provádí tak, že frakce obsahující al-AT , obsahuje také isomer s hodnotou PI v rozmezí 4,3 až 4,4 .
- 31. Použití nosného materiálu pro dělení aktivního al-AT od inaktivního al-AT .
- 32. Použití podle nároku 31 , vyznačující se tím, že nosný materiál je anorganický nosný materiál, výhodně hydroxylapatit, obzvláště výhodně keramický hydroxylapatit.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CZ19994480A CZ448099A3 (cs) | 1998-05-20 | 1998-05-20 | Alfal-antitrypsinové preparáty, způsob jejich výroby a jejich použití |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CZ19994480A CZ448099A3 (cs) | 1998-05-20 | 1998-05-20 | Alfal-antitrypsinové preparáty, způsob jejich výroby a jejich použití |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ448099A3 true CZ448099A3 (cs) | 2000-06-14 |
Family
ID=5468124
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ19994480A CZ448099A3 (cs) | 1998-05-20 | 1998-05-20 | Alfal-antitrypsinové preparáty, způsob jejich výroby a jejich použití |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CZ (1) | CZ448099A3 (cs) |
-
1998
- 1998-05-20 CZ CZ19994480A patent/CZ448099A3/cs unknown
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU729389B2 (en) | Alpha 1-antitrypsin preparation as well as a method for producing the same | |
Smith et al. | Platelet coagulation factor XIa-inhibitor, a form of Alzheimer amyloid precursor protein | |
DK166587B1 (da) | Blodkoagulationshaemmende proteiner, fremgangsmaade til deres fremstilling samt deres anvendelse | |
IE861902L (en) | Polypeptides with blood-coagulation inhibiting action | |
US4485100A (en) | Elastase inhibitors, a process for their preparation and medicaments containing these inhibitors | |
US6284874B1 (en) | Process for separating α1-proteinase inhibitor from cohn fraction IV1 and IV4 paste | |
CA2489773A1 (en) | Process for separating alpha-1-proteinase inhibitor from cohn fraction iv1 + iv4 paste | |
Atmani et al. | Identification of Uronic‐Acid‐Rich Protein as Urinary Bikunin, the Light Chain of Inter‐α‐Inhibitor | |
WO1994012637A2 (en) | Novel human amyloid protein precursor homologue and kunitz-type inhibitors | |
CA2174231C (fr) | Procede de preparation d'un concentre d'inter-alpha-trypsine inhibiteur a usage therapeutique et concentre obtenu | |
US6451978B2 (en) | Purification of antithrombin-III-α and β | |
CZ448099A3 (cs) | Alfal-antitrypsinové preparáty, způsob jejich výroby a jejich použití | |
KR20060118486A (ko) | 인자 xi의 치료적 사용 | |
CA2154231C (fr) | Procede de preparation d'un concentre d'inhibiteur de la c1-esterase (c1-inh), et concentre obtenu, a usage therapeutique | |
EP1726649A2 (en) | Peptide fragment having cytotoxicity-inhibitory activity and screening method for peptide fragment having said cytotoxicity-inhibitory activity | |
ES2361492T3 (es) | Procedimiento para la purificación de antitrombina-iii. | |
MXPA99011354A (es) | Preparacion de alfa 1-antitripsina y procedimiento para su obtencion | |
RU2488403C1 (ru) | Способ получения особо чистого препарата ферроксидазы церулоплазмина и/или фактора свертывания крови протромбина. аффинный неомициновый сорбент для их получения | |
Glaser | Can alpha-1-protease inhibitor be used in replacement therapy? | |
JPH1080281A (ja) | 新規蛋白質及びその製造方法 | |
CA2328605A1 (en) | Protein z-dependent protease inhibitor | |
CN119013036A (zh) | 制备白蛋白制剂的方法 | |
Tschesche et al. | FUNCTION AND STRUCTURE OF HUMAN PLASMA α1-ANTITRYPSIN | |
Tschesche et al. | FUNCTION AND STRUCTURE OF HUMAN PLASMA¤ ₁-ANTITRYPSIN | |
JPH059200A (ja) | ヒト尿性トリプシンインヒビターの製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |