[go: up one dir, main page]

CZ448099A3 - Alfal-antitrypsinové preparáty, způsob jejich výroby a jejich použití - Google Patents

Alfal-antitrypsinové preparáty, způsob jejich výroby a jejich použití Download PDF

Info

Publication number
CZ448099A3
CZ448099A3 CZ19994480A CZ448099A CZ448099A3 CZ 448099 A3 CZ448099 A3 CZ 448099A3 CZ 19994480 A CZ19994480 A CZ 19994480A CZ 448099 A CZ448099 A CZ 448099A CZ 448099 A3 CZ448099 A3 CZ 448099A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
preparation
plasma
fraction
preparation according
adsorption chromatography
Prior art date
Application number
CZ19994480A
Other languages
English (en)
Inventor
Erwin Mattes
Peter H. Matthiessen
Original Assignee
Baxter Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Baxter Aktiengesellschaft filed Critical Baxter Aktiengesellschaft
Priority to CZ19994480A priority Critical patent/CZ448099A3/cs
Publication of CZ448099A3 publication Critical patent/CZ448099A3/cs

Links

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Nativní chromatografický čištěný al-AT-preparát, kteiý má čistotu alespoň 0,7 PE/mg proteinu a relativní plasma-al-ATaktivitu alespoň 120 %, přičemž poměr aktivního al-AT k inaktivnímu ocl-ATje vyšší než v plasmě. Způsob výroby tohoto preparátu, jakož i použití nosného materiálu, například anorganického nosného materiálu,jakoje hydroxylapatit, pro dělení aktivního al-ATod inaktivního al-AT.

Description

Oblast techniky
Vynález se týká αΐ-antitrypsinových preparátů, způsobu jejich výroby a jejich použití.
Dosavadní stav techniky αί-antitrypsin (al-AT) je protein, vyskytující se v plasmě, který je vzhledem ke svým strukturním a funkčním vlastnostem zařazen do skupiny serpinů (Serine protease inhibitors) . Na základě jeho účinku inhibujkícího serinproteasy, je al-AT známý také pod pojmenováním al-proreinase-inhibitor. al-AT je zodpovědný za přibližně 90 % tryptické inhibiční aktivity normální plasmy, takže je často také označován jako hlavní-ptasma-serpin (Major plasma serpin) . Obzvláštním fyziologickým významem je inhibiční aktivita al-AT se zřetelem na elastasu.
al-AT je primárně ochranný protein, kterým mají být buňky chráněné před uvolněnými proteolytickými enzymy. Je syntetisován v játrech a sekretován do plasmy, kde má poločas přibližně 6 dnů. Normální koncentrace al-AT v plasmě činí 1,3 g/1 .
al-AT je relativně malá a polární molekula, která rychle proniká do buněčných tekutin a tam může působit. Lidský al-AT sestává z jednoho jediného polypeptidového © · • ·· ·· ·· • · · · * ·· · • · © © © · • · · ··· ··· • · · © ······· ·« ·· řetězce se 394 zbytky aminokyselin se třemi glykosylačními posicemi na asparaginových zbytcích v posicích 46, 83 a 247 . Zatímco na asparaginu 46 a 247 jsou přítomné jak dvou-, tak také troj-anténní sialysované uhlovodíkové postranní řetězce, je na asparaginu 83 pouze jeden sialysovaný dvouanténní postranní řetězec (Carrell a kol., Nátuře 298 (1982), 329 až 334).
Proteinový řetězec al-AT se vyskytuje v plasmě ve dvou formách, přičemž v jedné formě je odstraněn N-terminální pentapeptid.
Na základě těchto uhlovodíkových postranních řetězců, ale také na základě možného odstranění pentapeptidu, dochází k pravé mikroheterogenitě, která se v jednom a tom samém individuu může také měnit. Vyskytuje se, že ke značným změnám v proporcích těchto isoforem al-AT-molekul dochází během zánětů nebo podávání estrogenů, což pravděpodobně vede zpětně k tomu, že na základě stresových situací se výhodně odbourávají částečně desialysované formy, aby se rychleji opět došlo k normální hladině plasmy (Patterson, Comp. Biochem. Physiol. 100 B (3)(1991), 439 až 454).
Serinproteasy inhibující účinek al-AT je vztahován na formaci stabilních 1 : 1 komplexů mezi al-AT a cílové proteasy. al-AT působí tedy jako jeden druh suicidsubstrátu, se kterým jsou potlačovány další proteasové reakce serinproteas. Účinek al-AT je především inhibován uvolněnými radikály, které rovněž vznikají při zánětech. Fyziologicky slouží tato oxidační labilita pravděpodobně k tomu, že v vezprostředním okolí zánětu je potlačena enzym-inhibující aktivita al-AT , takže proteasy, jako je elastasa a kathepsin G , mohou rozvinout svůj plný účinek při potírání na-
• · © · ·
příklad bakterii, způsobujících zánět.
Oxidační labilita al-AT je však především nevýhodná tam, kde je exponován ctl-AT , popřípadě kapalina, která al-AT obsahuje, jako například v kapalinách respiračního traktu. Tak je elastická tkáň plic chráněna před povrchovými vlivy v podstatě dvěma inhibitory, humáním sekretorickým leukocytovým inhibitorem proteas, který se nachází hlavně v horním respiračním traktu a al-AT , který se nachází převážně ve spodním respiračním traktu. Ačkoliv normálně je přítomno více než dost inhibiční kapacity pro obranu spodního respiračního traktu, může docházet při nadměrné exposici volnými radikály, jako například při silném kouření, k problémům (inhibiční kapacita al-AT je při silném kouření přibližně poloviční).
Prozatím je známo přes 70 kvalitativních a kvantitativních variant lidského al-AT , které se dědí jako autosomální ko-dominantní alely, přičemž se vychází z toho, že přibližně 10 % (!) evropské populace je nosičem patologické varianty al-AT . Také jsou známé al-AT-deficience a jsou relativně široce rozšířené. Nejpozoruhodnější patologická zjištění v souvislosti s variací al-AT-genu jsou relativně brzy počínající degenerativní onemocnění plic, jakož i těžká onemocnění jater. Vedle toho se ve spojitosti s variací al-AT-genu objevují ale také onemocnění ledvin, arthritis a maligní onemocnění. Především při onemocnění plic je jisté, že tato jsou přímo odvozována z úrovně al-AT v plasmě, která kvůli kumulovaným proteolytickým poškozením způsobuje ztrátu elasticity plic. Tak je silný kuřák s homozygotní chybou al-AT dvojnásobně ohrožován a má vysoké rislko rozvinutí emphysemie již ve stáří pod 40 let. Proti nekouřícím homozygotům by měl dobu života zkrácenou o 20
let.
V plasmě se nachází al-AT jak v aktivní formě, tak také v inaktivní formě (viz například Pajdak V. a kol.,
Folia Histochemica et Cytobiologica, Vol. 24 (1986), str.
169 až 172).
Je známá celá řada způsobů výroby al-AT, které zahrnují frakcionované srážení plasmy polyethylenglykolem 4000, ale také zpracování různých frakcí plasmy (Cohn-Fraktion IV-l-precipitát nebo Kistler a Nitschmann-superbatant A nebo A+l) (Feldman a Vinkelman, Blood Separation and Plasma Fractionation (1991), Viley-Liss, lne., str. 341 až 383).
Při dále jdoucím čištění se odpovídající krevní frakce čistí například pomocí DEAE-celulosy (Basis a kol., Vopr. Med. Khim. 33 (1)(1987), 54 až 591) , pomocí materiálů afinitní chromatografie nebo materiálů kationtoměničové chromatografie (EP-0 698 615-A1).
Basis a kol. popisuji způsob čištěni al-AT srážením plasmy síranem amonným a následující chromatografií na DEAE-celulose a chromatografii na hydroxylapatitu. Tento postup ase provádí stále za přítomnosti merkaptoethanolu, který má chránit protein vůči oxidaci síru obsahujících skupin. al-AT se získá pomocí chromatografie na hydroxylapatitu ve dvou frakcích, avšak oba proteiny, al-AT a albumin, se oddělí neúplně.
V průběhu přípravy způsobu podle předloženého vynálezu bylo nyní zjištěno, že se pomocí všech dosavadních způsobů výroby, ovzvláště ale také při způsobu podle Basise a kol.
a podle EP-0 698 625-A1 , nepodařilo úplně oddělit inaktivní al-AT , vyskytující se konstitutivně v plasmě s aktivním al-AT , popřípadě vyrobit preparát za získání aktivního isomeru.
Úkolem předloženého vynálezu tedy je vypracování způsobu, pomocí kterého by bylo možno získat al-AT-preparát, ve kterém by byl poměr aktivního al-AT k inaktivnímu al-AT ve prospěch aktivního al-AT , to znamená pomoci kterého by bylo možno selektivně oddělit inaktivní al-AT od aktivního al-AT .
Dalším úkolem předloženého vynálezu je dát k disposici al-AT-preparát, který by byl zlepšený ve srovnání s dosavadními preparáty.
Podstata vynálezu
Předmětem předloženého vynálezu tedy je preparát na basi nativního, chromatograficky čištěného α-1-antitrypsinu, zlepšený ve srovnání s dosavadními preparáty.
Předmětem předloženého vynálezu tedy je preparát na basi nativního, chromatograficky čištěného al-AT , který má čistotu alespoň jako 0,7 PE/mg proteinu a relativní plasma-al-AT-aktivitu alespoň 120 % .
Relativní plasma-al-AT-aktivita je definována jako pomšr aktivního k inaktivnímu al-AT , přičemž se bere tento poměr v plasmě se 100 % relativní plasma-al-AT-aktivity.
Pro preparáty, dávané k disposici podle předloženého « vynálezu, je tato relativní plasma-al-AT-aktivita výhodně přes 130 % , obzvláště přes 140 % a obzvláště výhodně přes • ·
4 ·
444 444
150 % . Ve zvláštních případech bývá relativní Plasma-al-AT-aktivita tapé přes 160 % . U produktů podle předloženého vynálezu je na základě své čistoty získaný protein přibližně s al-AT-proteinem rovnocenný, takže je možno relativní plasma-al-AT-aktivitu jednoduchým způsobem spočítat .
al-AT se vyskytuje v krvi, popřípadě v séru v určitém podílu vždy také v inaktivní formě, to znamená že nemá žádnou aktivitu inhibující elastasu, je ale ještě imunoreaktivní. Celkové množství aktivního a inaktivního al-AT se může stanovovat pomocí všech běžných metod, například antigen- kvant i fíku j í čími imunologickými metodami, jako je ELISA.
Příčiny výskytu inaktivního al-AT mohou být různé, například může být al-AT inaktivní vzhledem k rozštěpení molekuly nebo na základě poruch v konformaci.
Vzhledem k tomu, že normálně může být v krvi, popřípadě v séru, přítomno až 20 % inaktivního al-AT a tento nemůže být podle dosavadních metod oddělen, představují preparáty podle předloženého vynálezu podstatný pokrok ve srovnání s dosavadními preparáty, ve kterých byl dosud vždy spoluobsažen inaktivní podíl. Jak bylo uvažováno, činí koncentrace al-AT v normální plasmě asi 1,3 g/1 , což dává specifickou aktivitu 0,77 PE/mg (plasmajednotky, stanoveno v elastasovém inhibiěním testu, viz příklad 3) .
al-AT-preparát podle předloženého vynálezu obsahuje výhodně alespoň isomer s hodnotou PI v rozmezí 4,3 až 4,4.
Překvapivě se totiž ukázalo, že přímo na základě to·· · «9 99 ·« • · · · 9 9 9 9 9 • · · 9 · · 9 9·9 9·9 • · · · 9 9 9
999 99 999 9999 99 99 hoto isomeru je aktivita al-AT velmi vysoká. Vzhledem k tomu, že isomer s hodnotou PI v rozmezí 4,3 až 4,4 byl na základě své azidové povahy při způsobu získávání al-AT, popsaném ve stavu techniky, vždy oddělen společně s albuminem od získávané al-AT-frakce, nenacházejí se v žádném al-AT preparátu žádné podíly tohoto isomeru, které by byly hodné zmínky. V souvislosti s uvedeným vynálezem se však ukázala relevance přímo tohoto isomeru se zřetelem na výtěžek aktivity a proto se podle předloženého vynálezu při způsobu výroby používají pouze kroky, které nedovolují oddělení tohoto isomeru od ostatního al-At nebo dovolují jeho oddělení pouze z nepodstatné části, takže větší část tohoto kyselého isomeru zůstává v konečném preparátu.
Rozděleni isomerů výhodného preparátu odpovídá tedy rozdělení nativního proteinu, obzvláště proteinu, který je ziskatelný z plasmy. Obzvláště odpovídá rozdělení isomerů al-AT-preparátu podle předloženého vynálezu při ozřejmění isoelektrickou fokusací (IEF) kvadrupletovému pásovému vzoru.
IEF se provádí obzvláště pomocí gelu Ampholíne PAG plate IEF™ (pH 4,0 až 6,5 nebo pH 4,0 až 5,0) od firmy Pharmacia v souladu s předpisem, udávaným firmou Pharmacia, za použití IEF-markerů firmy Sigma (IEF Mix 3,6 - 6,6).
Isomer s hodnotou pí v rozmezí 4,3 až 4,4 při tom odpovídá nejkyselejšímu pásu. Tento isomer však zcela chybí přímo u čistých, púopřípadě vysoce čistých preparátů al-AT, nebo je v nich obsažen pouze v nepatrné míře pod hranicí důkazu.
Preparát al-AT podle předloženého vynálezu vykazuje • · obzvláště vysokou čistotu, například čistotu vyšší než 0,8 PE/mg , výhodně čistotu vyšší než 0,9 PE/mg , obzvláště výhodně vyšší než 1 PE/mg . Dokonce se ukázalo, že jsou podle předloženého vynálezu dosažitelné čistoty přes 1,1 PE/mg , obzvláště přes 1,2 PE/mg .
Preparát podle předloženého vynálezu obsahuje přitom obvykle méně než 10 % , výhodně méně než 5 % a obzvláště méně než 2 % inaktivního al-AT .
Podle předloženého vynálezu je také možné dát k disposici al-AT-preparár, který je v podstatě prostý inaktivního al-AT .
Poměr akticního al-AT k inaktivnímu al-AT je v preparátu podle předloženého vynálezu zvýšený, obzvláště je vyšší než tento poměr v humání normální plasmě. Je tedy podle předloženého vynálezu možné získat hyperaktivní, popřípadě jako nascentní označovaný al-AT.
Pod pojmem normální plasma se podle předloženého vynálezu rozumí standardisovaná plasma se zřetelem na obsah aktivního al-AT . Standardisace, tedy určení aktivního al-AT , se může provádět pomocí pro to běžných metod. Například se provádí pomoci inhibice aktivity elastasy, popřípadě trypsinu.
Preparát podle předloženého vynálezu má při tom oproti preparátům podle stavu techniky podstatnou výhodu, že preparát, určený obzvláště pro farmaceutickou aplikaci, je nižším obsahem inaktivního al-AT se zřetelem na svoji účinnost podstatně více definovaný než známé preparáty, což má enormní výhodu obzvláště při medicínském použití.
• ·
Výhodně je poskytován k disposici konservujici cti-AT, u kterého může být vyloučeno použití stabilisátorů oxidace, jako je β-merkaptoethanol. Pojem konservovující znamená tedy v rámci předloženého vynálezu, že al-AT je dostatečně stabilní také bez přítomnosti stabilisátorů oxidace, jako je β-merkaptoethanol, což je obzvláště překvapivé vzhledem ke známé velké labilitě al-AT vůči oxidaci.
Při výrobě preparátu podle předloženého vynálezu se může vycházet z krve, plasmy, séra nebo jeho frakcí, ale také z buněčných kultur, obzvláště rekombinantních buněčných kultur, nebo supernatantů buněčných kultur.
Výhodně je obsah monomeru preparátu podle předloženého vynálezu alespoň 95 % , obzvláště alespoň 98 % .
Výhodná forma provedení preparátu podle předloženého vynálezu spočívá v tom, že je preparát zlepšen nejen se zřetelem na obsah aktivního al-AT , ale také se vyskytuje ve vyšší čistotě, například alespoň 90 % (mg/mg proteinu).
Předmětem předloženého vynálezu je také farmaceutický přípravek, obsahující al-AT-preparát podle předloženého vynálezu, popřípadě s farmaceuticky přijatelnými pomocnými substancemi, jako jsou pufry, stabilisátory, adjuvanty, antioxidanty, solemi nebo excipienty.
Vzhledem k tomu, že uvedené preparáty se mají používat hlavně ve farmaceutické oblasti, spočívá výhodná forma provedení v tom, že je preparát zpracován k inaktivaci popřípadě přítomných patogenů. Výhodně se preparát podle předloženého vynálezu dává k disposici ve formě stabilní pro • · • · *« • » · • · »« » »4 ·· • <· · · ··« ·*· • · f ♦ ♦ skladování, obzvláště jako lyofilisát nebo jako (hluboce zmrazený) roztok, zvláště jako roztok, který je vhodný pro íntravenosní aplikací, jako aerosol nebo jako sprej. Preparát se může vyskytovat také asociovaný s liposomy, popřípadě fosfolipidy nebo jinými mikro- nebo nanopartikulárními formami, což je výhodné pro určité aplikační formy.
Předmětem předloženého vynálezu je rovněž způsob výroby al-AT-preparátu podle předloženého vynálezu čištěním frakce, obsahující al-AT , která je výhodně získatelná z humáního plasmapoolu pomocí adsorpční chromatografie tak, že se al-AT adsorbuje, popřípadě se oddělí insktivní al-AT a aktivní al-AT se získá v jedné frakci elucí.
Pod pojmem adsorpční chromatografie se podle předloženého vynálezu rozumí taková chromatografie, při které se al-AT adsorbuje (váže) na chromatografický materiál. Nakonec se může elucí získat požadovaná frakce.
Pro adsorpční chromatografii se může použít například anorganický chromatografický materiál, jako je hydroxylapatit, výhodně keramický hydroxylapatit. Adsorpční chromatograf ie se může ale také provádět na aniontoměniči, výhodně za přítomnosti detergentu.
Jako aniontoměniče se výhodně použijí materiály na basi uhlohydrátů nebo vinylpolymerů, které se osvědčily v laboratorních podmínkách a při průmyslovém použití, obzvláště komerčně dostupné produkty, jako je například DEAE-SephacelR, DEAE-SephadexR, DEAE-SepharoseR CL6B,
DEAE-SepharoseR Fast Flow, QAS-SephadexR, Q-SepharoseR Fast η n
Flow, Q-Sepharose Big Beats , Q-Sepharose High Performance (firmy Pharmacia); DEAE-Trisacryl, DEAE-SpherodexR, Q-Hy• · · ·
per-D^ (firmy Sepracor); DEAE-Toyopearl^, QAE-Toyopearl^, Toyopearl Super-Q^ (firmy Tosohaas); Fractogel^-EMDT, -TMAE nebo jiné Fractogelové materiály, Licrospher 1000 TMAE^, Lisrospher 1000 DEAE^ a Licrospher 4000 DMAE& (firmy Merck); Macroprep DEAE^, Macroprep (firmy BioRad); Protein PAK DEAE^ (firmy Vaters) , přičemž výhodné je zpracováni pomoci silného aniontoměniče, například Q-sepharosy. Přesné podmínky, při kterých probíhá získávání aktivního al-AT , mohou kolísat vždy podle materiálu iontoměniče; tyto jsou ale pro odborníky pro odpovídající materiály známé a je možno je lehce a bez velkých nákladů zjistit, popřípadě optimalisovat.
Výhodně se výchozí materiál při, popřípadě před adsorpční chromatografií neinkubuje nebo se inkubuje pouze po velmi krátkou dobu (například několik málo minut). Adsorpční chromatografie, popřípadě získání al-AT , se provádí obzvláště za takových podmínek, aby isomer s hodnotou pl mezi 4,30 a 4,40 , obzvláště mezi 4,34 a 4,39 zůstával v jímaných frakcích a obzvláště výhodně tak, aby spektrum aktivních isomerů zůstávalo zachováno také během, popřípadě po čištění, popřípadě zpracování. Tyto podmínky jsou pro odborníky lehce optimalisovatelné vyzkoušením různých elučních pufrů pro odpovídající použité adsorpční materiály, neboř isomer s hodnotou pl v rozmezí 4,3 a 4,4 , popřípadě frakce, ve které je tento isomer obsažený, je lehce delektovatelná pomocí IEF . Při tom se musí dbát obzvláště na to, aby se tento kyselý isomer neoddělil s albuminem. Toto je však pro odborníky bez problému možné, například zkoušením eluovaných frakcí pomocí gelové elektroforesy, popřípadě IEF (a detekcí kyselého al-AT a albuminu).
Při další výhodné formě provedení se neprovádí chro- 12 ·· · · · · matografie na kationtoměniči, obzvláště se neprovádí žádná chromatografie na kationtoměniči při nízké hodnotě pH .
pod pojmem detergent (tensid) se obvykle rozumí povrchově aktivní organická látka, obzvláště organické syntetické produkty. Podle předloženého vynálezu se výhodně používají neionogenní detergenty, jako jsou polyethery, obzvláště alkyl-, fenol- a polyglykolethery, produkty ethoxylace mastných kyselin, amidů mastných kyselin, mastných aminů, mastných alkoholů a aminoxidů, estery mastných kyselin a polyalkoholů a cukrové estery. Detergent (tensid) nepůsobí obzvláště na proteiny denaturačně. Obzvláště výhodné jsou pro účely předloženého vynálezu tensidy ze skupiny polysorbátů (například tveen) a tensidy ze skupiny Tritonu^.
Adsorpční chromatografií se může při způsobu podle předloženého vynálezu předřadit nebo zařadit při výhodné formě provedení další zpracování, jako je například srážení, filtrace, gelová filtrace, zpracování s anorganickým nosným materiálem nebo chromatografické čištění. Jako výhodný anorganický nosný materiál se při tom osvědčil hydroxylapatit, přičemž obzvláště výhodný je zde keramický hydroxylapatit. Při další výhodné formě provedení se adsorpční chromatograf ie na aniontoměniči, výhodně za přítomnosti detergentu, kombinuje s adsorpcí na hydroxylapatitu.
V průběhu prací na předloženém vynálezu se překvapivě ukázalo, že za zvláštních okolností je možné také zpracováním s anorganickými materiály, jako je hydroxylapatit, dosáhnout dělení aktivního al-AT od inaktivního al-AT. Tento efekt nastupuje obzvláště tehdy, když je již al-AT v podstatě oddělený od albuminu.
• ·
» · · · «· · ···
Proto je také zpracování předčištěných al-AT-preparátů s anorganickými nosnými materiály, obzvláště s hydroxylapatitem vhodné pro výrobu preparátů podle předloženého vynálezu. Výhodně se z výchozího materiálu již předem z vysokého procenta odstraní. Oddělení aktivního al-AT se provádí výhodně frakcionovanou elucí. Zpracování s hydroxylapatitem představuje výhodně terminální čistící krok.
Překvapivě se ukázalo, že ačkoliv je al-AT jak známo extrémně labilní vůči oxidaci, může se způsob podle předloženého vynálezu provádět také bez použití β-merkaptoethanolu nebo jiných inhibitorů oxidace, které je třeba specielně při výrobě farmaceutických preparátů vyloučit.
Způsob podle předloženého vynálezu se tedy výhodně provádí za nepřítomnosti β-merkaptoethanolu nebo jiných stabilisátorů vůči oxidaci, to znamená, že se nepoužívá žádný pufr, který by takovýto stabilisátor obsahoval.
Výhodný výchozí materiál pochází výhodně z plasmapoolu, obzvláště takového, který se získává od dárců krve s al-AT normální hladinou. Pro způsob podle předloženého vynálezu se používá výhodně plasma nebo frakce plasmy, obzvláště o albumin ochuzená výchozí frakce, výhodně Cohn V-sraženina, odpovídající v podstatě Cohn IV A-frakci (podle Cohn, Review 28 (1941), 395 až 417). Při další výhodné formě provedení se vychází z předčištěné frakce, například z komerčně dostupného preparátu, jako je Prolastin.
Při způsobu podle předloženého vynálezu se také výhodně provádí krok pro inaktivaci, popřípadě odstranění
popřípadě přítomných patogenů. Toto zpracování k inaktivaci a/nebo odstranění se výhodně zajišťuje zpracováním tensidy a/nebo teplem, například tepelným zpracováním v pevném stavu, obzvláště zpracováním parou podle EP-0 159 311, EP-0 519 901 nebo EP-0 674 531 , ale také zpracováním organickými rozpouštědly a/nebo detergenty, například podle EP-0 131 740 a EP-0 050 061.
Další zpracování pro inaktivaci virů, popřípadě patogenů, zahrnuje také zpracování chemickými nebo chemicko-fyzikálními metodami, například chaotropními látkami podle VO 94/13329 nebo DE-44 34 538 , nebo fotoinaktivaci.
Ozařování nebo nanofiltrace představuje výhodné fyzikální postupy pro odstaňování virů v rámci předloženého vynálezu .
Způsob podle předloženého vynálezu se výhodně koncipuje tak, aby při tom bylo možné také získávání jiných proteinů, obzvláště získávání transferrinu, albuminu, orosomucoidu a apolipoproteinu, které se potom mohou získávat v další frakci chromatografického zpracování podle předloženého vynálezu. Přesné podmínky může odborník při znalosti předloženého vynálezu pro každý chromatografický materiál lehce zjistit, popřípadě optimalisovat.
Hodnota pH je při provádění způsobu podle předloženého vynálezu, obzvláště při eluci, výhodně v rozmezí 5,5 až 8,0 , obzvláště 6,5 až 6,8 . Ukázalo se také, že při provádění způsobu podle předloženého vynálezu je vhodné použití pufru s iontovou silou odpovídající 10 mM fosfátu.
Podle dalšího aspektu se týká předložený vynález použití nosného materiálu pro dělení inaktivního cel-AT od aktivního cel-AT . Jako pevný nosný materiál pro adsorpci a dělení se výhodně používá anorganický nosný materiál, jako je hydroxylapatit, nebo aniontoměnič za přítomnosti detergentu, obzvláště Q-Sepharosa za přítomnosti Tveenu při další výhodné formě provedení.
Vynález je blíže objasněn pomocí následujících příkladů provedení, na které však není nijak omezen.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Čištění cel-AT z Cohn V-staženiny (v současné době podle názoru přihlašovatele nej lepší cesta pro provedení vynálezu)
Cohn V-staženina se mícháním suspenduje s trojnásobnou hmotností A-pufru (1,2 g/1 dihydrátu hydrogenfosforečnanu sodného = 6,74 mM, 10 g/1 chloridu sodného = 171 mM, pH 7,0 , upraveno 96% kyselinou octovou) po dobu 4 až 6 hodin při teplotě 4 °C . Potom se cel-AT z této zakalené suspense přes noc vysráží při konečné koncentraci ethylalkoholu 17,5 % při teplotě 6 °C .
Odstředěná sraženina se míchá se 24-násobnou hmotností 10 mmol Tris-HCl, pH 10,4 (upraveno 6 M hydroxidem sodným) po dobu 30 minut při teplotě místnosti a potom 90 minut při teplotě 40 °C , potom se hodnota pH upraví na 6,5 a vyčiří se pomocí filtru CUNO 50SA . Do filtrátu se přidá 15 % v/v Tweenu 80 a míchá se po dobu 2 hodin při teplotě 26 °C .
·· ·· • 9 · • · 9 ··* ···
Získaný roztok se nanese na chromatografický sloupec, naplněný Q-Sepharosou^ Fast Flow (Pharmacia) a ekvilibrovaný 25 mM natriumfosfátového pufru, pH 6,5 , aby to odpovídalo 10 mg proteinu na 1 ml gelu (asi dva objemy sloupce) a promyje se 2,5 objemy sloupce 25 mM natriumfosfátového pufru, pH 6,5 (eluuje při tom z větší části Tween^ 80) a potom 3 objemy sloupce 60 mM chloridu sodného ve 25 mM natriumfosfátového pufru, pH 6,5 (eluuje transferrin).
Elucl 3 objemy sloupce 100 mM chloridu sodného ve 25 ml natriumfosfátového pufru, pH 6,5, se získá frakce, obsahující al-AT s asi 0,40 až 0,60 plasmajednotkami (PE) al-AT na jeden mg Proteinu, přičemž aktivita se zjišťuje inhibicí elastasy podle příkladu 3 (1 PE al-AT odpovídá asi
1,3 mg čistého al-AT) .
Pomoci 3 objemů sloupce 125 mM chloridu sodného ve 25 mM natriumfosfátového pufru, pH 6,5 , se může potom eluovat hlavně sérový albumin a další plasmové proteiny a pomocí 1 až 2 M chloridu sodného ve 25 mM natriumfosfátového pufru, pH 6,5 , inaktivní al-AT (prakticky žádná inhibice elastasy, ale imunoreaktivní al-AT) a zbytkové nečistoty.
Frakce obsahující al-AT se asi třicetkrát zkoncentruje pomocí ultrafiltrační membrány (vylučovací hranice 30000 Dalton) a diafiltruje se s 0,15 g/1 Na^-citrátu x 2 H20 = 0,5 mM .
Získaná diafiltrát se potom lyofilisuje. Lyofilisovaný prášek se upraví na zbytkový obsah vody 7,5 ± 0,5 % a podrobí se S-TIM 4-zpracováni podle EP-0 159 311 (10 hodin • · · ·
• · · · · • · · · · « « ······ • · ·· ·· ·· při teplotě 60 °C a 1 hodinu při teplotě 80 °C).
Zpracovaný prášek se rozpust! v 10 mM natriumfosfátového pufru, pH 6,8 , na asi 10 mg/ml proteinu a nanese se na chromatografický sloupec, naplněný keramickým hydroxylapatitem (Macropep Typ I, zrnitost 80 μιη, Bio-Rad) a ekvilibrovaný 10 mM natriumfosfátového pufru, pH 6,8 , aby to odpovídalo 10 mg proteinu na jeden ml lože sloupce (asi 1 objem sloupce).
Elucí 5 objemy sloupce 40 mM natriumfosfátového pufru, pH 6,8 , se získá frakce, obsahující al-AT s asi 0,90 až 1,05 plasmajednotkami (PE) al-AT na jedem mg proteinu .
Třemi objemy sloupce 100 mM natriumfosfátového pufru, pH 6,8 , je možno potom ještě eluovat hlavně inaktivní al-AT , sérový albumin a další plasmové proteiny a pomocí 500 mM natriumfosfátového pufru, pH 6,8 , zbytkové nečistoty.
Ukázalo se, že pomocí tohoto způsobu čištění je možno získat al-AT s vysokou specifickou aktivitou 1,0 PE/mg (což odpovídá 130 % relativní plasma-al-AT-aktivity) . Výsledek je znázorněn v následující tabulce 1 .
• 9
Tabulka 1
Spec. aktivita PE/mg čištění celk. výtěžek/ % plasmy
Plasma 0,014 1,0 100
po hydoxyapatitu 1,0 70,0 14
Na farmaceutickém trhu se nacházející al-AT-produkt Prolastin (firma Cutter) je podle údajů výrobce čistá ze 45 až 80 % a má modle inhibičniho testu elastasy specifickou aktivitu 0,60 PE/mg (což odpovídá 78 % relativní plasma-al-AT-aktivity) .
Příklad 2
Čištění al-AT (Serva) pomocí keramického hydroxyapatitu al-AT od Serva , který s ninimálně 95% čistotou (podle údajů výrobce stanovoenou pomocí SDS-gelu) má dosud nejvyšší naměřenou specifickou aktivitui al-AT 0,81 PE/mg , se dále zpracovává rovněž přes keramický hydroxyapatit. Spojené frakce dávají specifickou aktivitu 0,92 PE/mg (což odpovídá asi 120 % relativní plasma-al-AT-aktivity). V redukovaném SDS-Excelgelu je vidět se stříbrným zbarvením proteinů jednoznačné oddělení od inaktivního al-AT a jiných znečisťujících proteinů.
• · • ·· ·· ·· ··· · · · · · • β · · · · • · · ·♦· ··· • · · · ··· ···· ·· ··
Příklad 3
Předpis pro měření inhibice elastasy
Test se provádí podle předpisu J. Bietha, B. Spiesse a C.G. Vermutha (1974), The synthesis and analytical use of a highly sensitive and conventient substráte of elastase, Biochem. Med. 11(4), 350-357, popř. J. Travis a D. Johnson (1981), Human alphal-proteinase Inhibitor, Methods of Enzymology 80, 754-765 .
Tris : Tris+:
Elastasa
Substrát
0,2 M Tris-HCl, pH 8,0.
Tris s 0,1 % humáního sérového albuminu (HSA),smíseno krátce před použitím.
6% elastasa (z vepřového pankreatu, Boehringer Mannheim) se zředí 1 : 1000, sterilně se přefiltruje a zmrazí se při teplotě -20 °C .
22,5 mg sukcinyl-(alanin)^-p-nitroanilidu (Bachem Feinchemikalien AG, CH) se rozpustí v 5 ml dimethylformamidu a uschová se při teplotě 4 °C.
Vzorky se zředí Tris+ až na odpovídající koncentrace.
pg elastasy se zředí 275 pl Tris+ (ve vodní lázni temperováno na teplotu 25 °C) a se 100 μΐ vzorku se inkubuje po dobu 3 minut při teplotě 25 °C . Potom se substrát zředí 1 : 10 Tris+ , 200 μΐ tohoto se přimísí ke vsázce a ihned se měří přírůstek extinkce při 405 nm a 25 °C po dobu 5 minut. Jako slepý pokus inhibice se přimísí ke vsázce 100 μΐ Tris+ .
Slepý pokus dává u výše uvedené vsázky 0,05 až 0,06 • · ··· • · ··· ·· • ·· dA/min . Jako standardní křivka slouží zřeďovací řada 1 : 100 až 1 : 400 referenční plasmy (Immuno AG, 1A3E). Prolastin (Cutter) se z předběžného zředění 1 : 50 (v alikvotu při teplotě -20 °C zmraženo) zředí pomocí Tris+ : 80 (zředění 1 : 4000) a spolu se měří při každé měřící sérii se zředěním 1 : 150 referenční plasmy. Při příliš velké odchylce vůči standardní přímce by se měla tato serie měření vypustit nebo považovat výsledky pouze jako přibližné řídící hodnoty.
Inhibice se vypočítá podle rovnice :
% — (1 - (dA/min)vzorek/(dA/min)siep pOk ) · Ιθθ ·
Inhibice vzorků má ležet v oblasti 20 až 50 % inhibice a přepočte se potom pomocí standardní přímky na plasmajednotky.
Příklad 4
Charakterisace různých al-AT-produktů pomocí inhibice elastasy a IEF
Údaje jsou uvedené v následující tabulce 2 .
• ·· • · · ♦ • · · • · · • · · ··· ·· ·· ·· ·· • · · · · · • · · · · • · ··· ··· • · · • ···· ·· ··
'>Ί £
rH (D
4-)
Η '>1 0
τί β ΰ
•Η '>1 ε 'fd
> ΰ 0 4J
ε 4J Ή
0 0 Ή
Η 4J 0
0 Ή a a
Λ QJ 0)
ω Λ £ β
< ά χ.
+ + ' β • ·· • · · · » · ·
9 · · • · ·
999 99 #« ·* 99 • « · 9 9 · © · 9 9 · • 9 999 999
9 ·
9 9 9 9 99 99 py 4?·?<?- ^fe

Claims (32)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Nativní, chromatografíčky čištěný al-AT-preparát, vyznačující se tím, že má čistotu alespoň 0,7 PE/mg proteinu a relativní plasma-al-AT-aktivitu alespoň 120 % .
  2. 2. Preparát podle nároku 1 , vyznačující se tím, že se vyskytuje jako farmaceutický preparát.
  3. 3. Preparát podle nároku 1 nebo 2 , vyznačující se tím, že je čištěn z plasmna-poolu.
  4. 4. Preparát podle některého z nároků 1 až 3 , vyznačující se tím, že má čistotu více něž 0,9 PE/mg , výhodně více než 1,0 PE/mg , obzvláště více než
    1,1 PE/mg a obzvláště výhodně více než 1,2 PE/mg .
  5. 5. Preparát podle některého z nároků 1 až 4 , vyznačující se tím, že obsahuje alespoň isomer s hodnotou Pl v rozmezí 4,3 až 4,4 .
  6. 6. Preparát podle některého z nároků 1 až 5 , vyznačující se tím, že podíl inaktivního al-AT je nižší než 10 % , výhodně nižší než 5 % , obzvláště nižší než 2 % .
  7. 7. Preparát podle některého z nároků 1 až 6 , vyznačujíc! se tím, že je prostý inaktiv23 • · · ního al-AT .
  8. 8. Preparát podle některého z nároků 1 až 7 , vyznačující se tím, že al-AT je konservuj ící .
  9. 9. Preparát podle některého z nároků 1 až 8 , vyznačující se tím, že rozdělení isomerů al-AT odpovídá nativnímu proteinu, obzvláště kvadruplettpásovému vzoru, zřetelnému při isoelektrické fokusaci.
  10. 10. Preparát podle některého z nároků 1 až 9 , vyznačující se tím, že j e zpracován pro inaktivaci popřípadě přítomných patogenů.
  11. 11. Preparát podle některého z nároků 1 až 10 , vyznačující se tím, že se vyskytuje ve formě stabilní při skladování, výhodně jako lyofilisát nebo jako roztok, obzvláště jako roztok vhodný pro intravenosní aplikaci, jako aerosol nebo jako sprej.
  12. 12. Preparát podle některého z nároků 1 až 11 , vyznačující se tím, že se vyskytuje asociovaný s liposomy, fosfolipidy, popřípadě s jinými mikropartikulárními nebo nanopartikulárními formami.
  13. 13. Způsob výroby preparátu podle nároku 1 čištěním frakce, obsahující al-AT , získatelné pomocí adsorpčni chromatograf ie tak, že se al-AT adsorbuje a aktivní al-AT se získává eluci v jedné frakci.
  14. 14. Způsob podle nároku 13 , vyznačuj ící t í m , že se jako výchozí
    - 24 materiál použije plasma nebo frakce plasmy, obzvláště frakce ochuzená o albumin, výhodně Cohn V-sraženina.
  15. 15. Způsob podle nároku 13 nebo 14 , vyznačujíc! se tím, že se vychází z předčištěné frakce.
  16. 16. Způsob podle některého z nároků 13 až 15 , vyznačující se tím, že se pro adsorpční chromatografii použije anorganický chromatografický materiál , výhodně hydroxylapatit, obzvláště výhodně keramický hydroxylapatit.
  17. 17. Způsob podle některého z nároků 13 až 16 , vyznačující se tím, že se pro adsorpční chromatografii použije aniontoměnič, výhodně za přítomnosti detergentu.
  18. 18. Způsob podle některého z nároků 13 až 16 , vyznačující se tím, že aniontoměničem je Q-sepharosa.
  19. 19. Způsob podle některého z nároků 13 až 18 , vyznačující se tím, že se adsorpční chromatograf ie provádí za použití pufru, který je prostý merkaptoethanolu.
  20. 20. Způsob podle některého z nároků 13 až 19 , vyznačující se tím, že pufr, používaný pro eluci, má hodnotu pH v rozmezí 5,5 až 8,0 , výhodně okolo
    6,5 až 6,8 .
  21. 21.
    Způsob podle některého z nároků 13 až 16 a 20 , • 9 vyznačující se tím, že pufr, používaný při eluci, obsahuje sůl s iontovou silou odpovídající 60 mM, výhodně 40 mM fosfátu.
  22. 22. Způsob podle některého z nároků 13 až 15 a 17 až 20 , vyznačující se tím, že pufr, používaný při eluci, obsahuje sůl s iontovou silou odpovídající 50 až 130 mM chloridu sodného.
  23. 23. Způsob podle některého z nároků 13 až 22 , vyznačující se tím, že se provádí další krok, zvolený ze skupiny zahrnující srážení, filtraci, gelovou filtraci, zpracování s anorganickým nosným materiálem a chromatografické čištění.
  24. 24. Způsob podle některého z nároků 13 až 22 , vyznačující se tím, že se kombinuje adsorpční chromatografie na aniontoměniči, výhodně za přítomnosti detergentu, s adsorpcí na hydroxylapatitu.
  25. 25. Způsob podle některého z nároků 13 až 22 , vyznačující se tím, že se provádí jediná adsorpční chromatografie.
  26. 26. Způsob podle nároku 25 , vyznačující se tím, že je zařazen další čistící krok, který neobsahuje adsorpční chromatografií.
  27. 27. Způsob podle některého z nároků 13 až 26 , vyznačující se tím, že v další frakci je získáván protein, zvolený ze skupiny zahrnující transferrin, albumin, orosomukosid a apolipoprotein.
    * ; í
    9 9 99
    9 9 9 99 99
    9 9 • · • · · *·
  28. 28. Způsob podle některého z nároků 13 až 27 , vyznačující se tím, že se provádí krok pro inaktivaci popřípadě přítomných patogenů.
  29. 29. Způsob podle některého z nároků 13 až 28 , vyznačující se tím, že se jako inaktivace provádí zpracování s detergentem, rozpouštědlem a/nebo za tepla.
  30. 30. Způsob podle některého z nároků 13 až 29 , vyznačující se tím, že se eluce provádí tak, že frakce obsahující al-AT , obsahuje také isomer s hodnotou PI v rozmezí 4,3 až 4,4 .
  31. 31. Použití nosného materiálu pro dělení aktivního al-AT od inaktivního al-AT .
  32. 32. Použití podle nároku 31 , vyznačující se tím, že nosný materiál je anorganický nosný materiál, výhodně hydroxylapatit, obzvláště výhodně keramický hydroxylapatit.
CZ19994480A 1998-05-20 1998-05-20 Alfal-antitrypsinové preparáty, způsob jejich výroby a jejich použití CZ448099A3 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ19994480A CZ448099A3 (cs) 1998-05-20 1998-05-20 Alfal-antitrypsinové preparáty, způsob jejich výroby a jejich použití

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ19994480A CZ448099A3 (cs) 1998-05-20 1998-05-20 Alfal-antitrypsinové preparáty, způsob jejich výroby a jejich použití

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ448099A3 true CZ448099A3 (cs) 2000-06-14

Family

ID=5468124

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19994480A CZ448099A3 (cs) 1998-05-20 1998-05-20 Alfal-antitrypsinové preparáty, způsob jejich výroby a jejich použití

Country Status (1)

Country Link
CZ (1) CZ448099A3 (cs)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU729389B2 (en) Alpha 1-antitrypsin preparation as well as a method for producing the same
Smith et al. Platelet coagulation factor XIa-inhibitor, a form of Alzheimer amyloid precursor protein
DK166587B1 (da) Blodkoagulationshaemmende proteiner, fremgangsmaade til deres fremstilling samt deres anvendelse
IE861902L (en) Polypeptides with blood-coagulation inhibiting action
US4485100A (en) Elastase inhibitors, a process for their preparation and medicaments containing these inhibitors
US6284874B1 (en) Process for separating α1-proteinase inhibitor from cohn fraction IV1 and IV4 paste
CA2489773A1 (en) Process for separating alpha-1-proteinase inhibitor from cohn fraction iv1 + iv4 paste
Atmani et al. Identification of Uronic‐Acid‐Rich Protein as Urinary Bikunin, the Light Chain of Inter‐α‐Inhibitor
WO1994012637A2 (en) Novel human amyloid protein precursor homologue and kunitz-type inhibitors
CA2174231C (fr) Procede de preparation d&#39;un concentre d&#39;inter-alpha-trypsine inhibiteur a usage therapeutique et concentre obtenu
US6451978B2 (en) Purification of antithrombin-III-α and β
CZ448099A3 (cs) Alfal-antitrypsinové preparáty, způsob jejich výroby a jejich použití
KR20060118486A (ko) 인자 xi의 치료적 사용
CA2154231C (fr) Procede de preparation d&#39;un concentre d&#39;inhibiteur de la c1-esterase (c1-inh), et concentre obtenu, a usage therapeutique
EP1726649A2 (en) Peptide fragment having cytotoxicity-inhibitory activity and screening method for peptide fragment having said cytotoxicity-inhibitory activity
ES2361492T3 (es) Procedimiento para la purificación de antitrombina-iii.
MXPA99011354A (es) Preparacion de alfa 1-antitripsina y procedimiento para su obtencion
RU2488403C1 (ru) Способ получения особо чистого препарата ферроксидазы церулоплазмина и/или фактора свертывания крови протромбина. аффинный неомициновый сорбент для их получения
Glaser Can alpha-1-protease inhibitor be used in replacement therapy?
JPH1080281A (ja) 新規蛋白質及びその製造方法
CA2328605A1 (en) Protein z-dependent protease inhibitor
CN119013036A (zh) 制备白蛋白制剂的方法
Tschesche et al. FUNCTION AND STRUCTURE OF HUMAN PLASMA α1-ANTITRYPSIN
Tschesche et al. FUNCTION AND STRUCTURE OF HUMAN PLASMA¤ ₁-ANTITRYPSIN
JPH059200A (ja) ヒト尿性トリプシンインヒビターの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic