CZ422299A3

CZ422299A3 - Method of reinforcing natural cytoplasmic mammal sterility and for renewal of mammal fertility as well as its use when preparing hybrid plants

Info

Publication number: CZ422299A3
Application number: CZ19994222A
Authority: CZ
Inventors: Gregory G. Brown
Original assignee: Mcgill University
Priority date: 1998-05-26
Filing date: 1998-05-26
Publication date: 2000-03-15

Abstract

Způsoby pro posílení přirozené cytoplasmatické samčí sterility a pro obnovení samčí fertility ajejich použití při přípravě hybridních plodin. Je také popsán způsob pro obnovení samčí fertility u rostlin s cytoplasmatickou samčí sterilitou, který obsahuje kroky, a) vložení genového konstruktu, který se skládá v podstatě ze sekvence kódující mitochondriální transitní peptid tušovaný před a v rámečku s editovanou formou normálního mitochondriálního genu, kterýje transkribován současně s neobvyklýmmitochondriálním genemspojenýms CMS, dojádra rostlinné buňky; b) selekci rostlinných buněk, které získaly genový konstrukt v kroku a); a c) indukci regenerace selektovaných roslinných buněk za zisku zralé rostliny.Methods for enhancing natural cytoplasmic male sterility and for restoring male fertility and their use in preparation hybrid crops. Also disclosed is a method for recovering a male fertility in plants with cytoplasmic male sterility comprising the steps of: a) introducing a gene construct which is it consists essentially of a mitochondrial coding sequence transit peptide suspected before and in the frame with the edited in the form of a normal mitochondrial gene that is transcribed simultaneously with unusualmitochondrial CMS-linked genes, plant cell cadaver; b) selection plant cells that received the gene construct in step a); and c) inducing regeneration of the selected plant cells after profit mature plant.

Description

Způsob pro posílení přirozené cytoplasmatické samčí sterility a pro obnovení samčí fertility a jeho použití při přípravě hybridních plodinMethod for enhancing natural cytoplasmic male sterility and restoring male fertility and its use in the preparation of hybrid crops

Oblast technikyTechnical field

Předkládaný vynález se týká způsobů pro posílení přirozené cytoplasmatické samčí sterility a pro obnovení samčí fertility a jejich použití při přípravě hybridních plodin.The present invention relates to methods for enhancing natural cytoplasmic male sterility and restoring male fertility and their use in the preparation of hybrid crops.

Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

U mnoha rostlin mají hybridy, vytvořené křížením dvou nebo více kmenů, vyšší výnos než rodičovské kmeny. Například, u řepky (Brassica napus, campestris), kanadské nejvýznamnější plodiny, mohou mít manuálně připravené hybridy až o 50% vyšší výnos než původní rodičovské linie. Tento fenomen, nazývaný hybridní posílení, byl úspěšně použit u kukuřice (Zea mays). Hybridní kukuřice tvoří přibližně 90% severoamerických plodin.In many plants, hybrids produced by crossing two or more strains have a higher yield than the parent strains. For example, rape (Brassica napus, campestris), Canada's most important crop, can produce manually prepared hybrids up to 50% higher than the original parent lines. This phenomenon, called hybrid enhancement, has been successfully used in maize (Zea mays). Hybrid maize accounts for approximately 90% of North American crops.

Pro komerční výrobu hybridních semen je nutno zabránit samooplození semen hybridních rostlin. Toto je relativně snadné u kukuřice, protože samčí nebo pyl-produkující orgány (tyčinky) jsou umístěny v jiných částech rostliny než samičí, nebo semena obsahující orgány (pestíky) a tyčinky, které dohromady tvoří takzvané střapce, mohou být manuálně snadno odstraněny z mnoha rostlin použitých při výrobě semen.For the commercial production of hybrid seeds, the self-fertilization of seeds of hybrid plants must be avoided. This is relatively easy for maize, since male or pollen-producing organs (sticks) are located in parts of the plant other than female, or seeds containing organs (pistils) and sticks that together form so-called tassels can be easily removed from many plants manually used in seed production.

Naopak, u většiny jiných druhů rostlin, jako je řepka, jsou tyčinky a pestíky přítomny ve stejné struktuře rostliny a proto není manuální odstranění samčích orgánů možné. Proto je při produkci semen pro přípravu hybridů těchto rostlin.nutno použít alternativních způsobů pro kontrolu opylení. Přehled technik vyvinutých pro tento účel je uveden v The PBI ·· 4444 rt ·· • · · · • « · · • ··· ·»· • · 44 44Conversely, in most other plant species, such as rapeseed, sticks and pistils are present in the same plant structure and therefore manual removal of male organs is not possible. Therefore, in the production of seeds for the preparation of hybrids of these plants, alternative pollination control methods need to be used. An overview of the techniques developed for this purpose is given in The PBI 4444 rt 44 44 rt 44 44 rt

Bulletin, článku od Arnisona, P. (Arnison, P. et al., The PBI Bulletin, January 1997, 1-11).Bulletin, Article by Arnison, P. (Arnison, P. et al., The PBI Bulletin, January 1997, 1-11).

Jedním alternativním způsobem je použití chemikálií, takzvaných gametocidů, které specificky usmrcují pyl. Tyto chemikálie jsou obyčejně nákladné a často jsou pouze částečně účinné. Pro většinu plodin, zejména pro ty, které - jako řepka - kvetou po prodloužené období, není tento typ kontroly opylení finančně výhodný. Téměř všechny systémy pro výrobu hybridních semen jsou proto založeny na genetické kontrole opylení. Existují tři kategorie genetických mechanismů pro kontrolu opylení: samo-inkompatibilita, techniky molekulové hybridizace a cytoplasmatická samčí sterilita.One alternative way is to use chemicals, so-called gametocides, that specifically kill pollen. These chemicals are usually expensive and often only partially effective. This type of pollination control is not financially beneficial for most crops, especially for those that - like rape - bloom for an extended period. Thus, almost all hybrid seed production systems are based on genetic pollination control. There are three categories of genetic mechanisms for pollination control: self-incompatibility, molecular hybridization techniques, and cytoplasmic male sterility.

Samo-inkompatibilita (SI) je důsledkem schopnosti některých rostlin odmítat svůj vlastní pyl. Rostliny exprimující SI mohou být použity jako samičí linie při výrobě hybridů, ale - protože obyčejně takové rostliny odmítají svůj vlastní pyl - je obvykle obtížné a finančně nevýhodné propagovat nebo udržovat takové linie. Kromě toho, samoinkompatibilita neexistuje u většiny druhů rostlin. Nejnověji použitými jsou techniky molekulové hybridizace. Tyto techniky jsou založeny na geneticky vyvolané samčí sterilitě, která je způsobena expresí toxických proteinů v buňkách vyrábějících pyl. Takové vložené geny pro toxiny působí jako dominantní geny samčí sterility a mohou být použity pro přípravu samičích linií pro výrobu hybridních semen. Stejně jako u SI není propagace takových samičích linií jednoduchá a dochází při ní ke ztrátám rostlinného materiálu. Tyto nedostatky takových technik jsou dosud nevyřešené a v současnosti byly tyto techniky použity pro přípravu pouze několika hybridních variet a tyto variety nejsou pěstovány ve významném rozsahu.Self-incompatibility (SI) is due to the ability of some plants to reject their own pollen. SI-expressing plants can be used as female lines in the production of hybrids, but - usually because such plants reject their own pollen - it is usually difficult and financially disadvantageous to promote or maintain such lines. In addition, self-incompatibility does not exist in most plant species. The most recently used are molecular hybridization techniques. These techniques are based on genetically induced male sterility, which is caused by the expression of toxic proteins in pollen producing cells. Such inserted toxin genes act as dominant male sterility genes and can be used to prepare female hybrid seed production lines. As with SI, propagation of such female lines is not easy and leads to loss of plant material. These drawbacks of such techniques are still unresolved, and currently these techniques have been used to prepare only a few hybrid varieties and these varieties are not grown to a significant extent.

• · · · · ·• · · · · ·

Cytoplasmatická samčí sterilita (CMS) je nejrozšířenější a klasický ne-Mendelovský znak. CMS rostliny nejsou schopny samooplození a proto pokud je CMS linie pěstována spolu se samčí fertilní linií, jsou všechna semena tvořená na sterilních rostlinách hybridy dvou rodičovských rostlin. Oproti většině znaků je CMS přenášena po matce, t.j. je přenášena na potomstvo pouze semenem. Tato vlastnost je důsledkem skutečnosti, že gen nebo geny, které určují CMS, jsou umístěny na mitochondriální DNA (mtDNA); oproti většině genů, které jsou přítomny v jaderné DNA, jsou geny v mtDNA přenášeny u většiny rostlinných druhů pouze samičím způsobem. V důsledku této vlastnosti samičího přenosu je možná snadná propagace CMS linií, oplozením samčí fertilní linie udržovací linií. , která je totožná s CMS linií v jaderných genech, ale která má samčí fertilitu, jelikož neobsahuje mtDNA způsobující CMS. Opět, v důsledku mateřského přenosu CMS budou hybridní linie připravené za použití samičích CMS linií také mít samčí sterilitu, protože budou obsahovat mtDNA způsobující samčí sterilitu. Toto je problémem u semenných rostlin jako je kukuřice nebo řepka, které vyžadují tvorbu pylu pro tvorbu semen, která jsou sklízeným produktem. Naštěstí byly u mnoha druhů rostlin objeveny specifické dominantní jaderné geny, které byly nazvány geny obnovující fertilitu (Rf), které potlačují fenotyp samčí sterility a obnovují fertilitu u Fl hybridů. Složky CMS systému proto jsou: CMS linie, které obsahují cytoplasmu se samčí sterilitou (S) (nebo mtDNA) a které jsou homozygotní pro recesivní nebo udržovací alelu genu obnovujícího fertilitu; udržovací linie, která obsahuje fertilní nebo normální mtDNA (F), ale je ísogenní s CMS linií v jaderných genetických lokusech; a linie s obnovenou fertilitou, která obvykle obsahuje mtDNA samčí sterility, ale která je homozygotní pro • · · · ·· A · · · · · • · · · · · < · · ······Cytoplasmic male sterility (CMS) is the most widespread and classical non-Mendelian trait. CMS plants are not capable of self-fertilization and therefore, if the CMS line is grown together with the male fertile line, all seeds formed on sterile plants are hybrids of the two parent plants. Unlike most features, the CMS is transmitted by the mother, i.e. it is transmitted to the offspring only by seed. This property is due to the fact that the gene or genes that determine CMS are located on mitochondrial DNA (mtDNA); In contrast to most genes that are present in nuclear DNA, the genes in mtDNA are only transmitted in a female manner in most plant species. As a result of this female transmission property, easy propagation of the CMS lines is possible by fertilizing the male fertile line with the maintenance line. , which is identical to the CMS line in nuclear genes, but which has male fertility as it does not contain CMS-causing mtDNA. Again, due to maternal CMS transmission, hybrid lines prepared using female CMS lines will also have male sterility because they will contain male sterility causing mtDNAs. This is a problem with seed plants such as corn or rapeseed, which require the formation of pollen to produce seeds that are the harvested product. Fortunately, specific dominant nuclear genes have been discovered in many plant species, which have been termed fertility restoration (Rf) genes, which suppress the male sterility phenotype and restore fertility in Fl hybrids. The components of the CMS system are therefore: CMS lines that contain a male sterile cytoplasm (S) (or mtDNA) and that are homozygous for a recessive or maintenance allele of the fertility restoration gene; a maintenance line that contains fertile or normal mtDNA (F) but is isogenic to the CMS line at nuclear genetic loci; and a line of restored fertility, which usually contains male sterility mtDNA but which is homozygous for A · · · · · · · · · · · · · <· · ·

A ······ ···* · ··· ···· ·· *· dominantní jaderný Rf gen. Použití těchto složek ve výrobě hybridních semen je uvedeno na obr. 1.A dominant nuclear Rf gene. The use of these components in the production of hybrid seeds is shown in Figure 1.

Pro přípravu různorodé sady hybridů za použití CMS musí být k dispozici adekvátní počet linií s obnovenou fertilitou, které obsahují Rf geny, stejně jako adekvátní počet udržovacích linií, které jsou sterilizované CMS mtDNA.To prepare a diverse set of hybrids using CMS, an adequate number of restored fertility lines containing Rf genes as well as an adequate number of maintenance lines that are sterilized by CMS mtDNA must be available.

Vývoj takových linií za použití konvenčních genetických postupů je pomalým procesem, který vyžaduje minimálně několikaleté úsilí. Například, při vývoji nové linie s obnovenou fertilitou je nutné nejprve křížení recipientní linie s existující linií s obnovenou fertilitou, což způsobí vložení Rf alely. Potom je nutná serie zpětných křížení pro obnovení genotypu recipientní linie. I po mnoha generacích zpětného křížení může být nějaká donorová DNA stále ještě navázána na Rf gen, což je fenomen, který se nazývá vazebná přítěž; tato donorová DNA může nést škodlivé znaky a může ohrožovat kvalitu recipientního kmene.The development of such lines using conventional genetic techniques is a slow process that requires at least several years of effort. For example, when developing a new restored fertility line, it is necessary to first cross the recipient line with an existing restored fertility line, causing the introduction of the Rf allele. A series of backcrosses is then required to restore the recipient line genotype. Even after many generations of backcross, some donor DNA can still be linked to the Rf gene, a phenomenon called a binding burden; this donor DNA may carry harmful traits and may compromise the quality of the recipient strain.

Omezené použití dvou CMS systémů je ověřeno v produkci hybridních semen řepky. Polima nebo pol cytoplasma může způsobit samčí sterilitu u mnoha řepkových kultivarů a byly identifikovány účinné linie s obnovenou fertilitou, které obsahují dominantní alely v jediném jaderném obnovovacím lokusu. Finanční výhodnost výroby hybridů tímto způsobem je omezena skutečností, že pol - indukovaná samčí sterilita má tendenci být nekompletní nebo unikající, zejména tehdy, pokud jsou samičí linie vystaveny teplejším podmínkám pěstování. V důsledku toho mohou být pol· hybridní semena kontaminována CMS semeny, které vznikly v důsledku samooplození samičí linie. Protože mají tyto CMS rostliny samčí sterilitu a netvoří samovolně semena, může jejich přítomnost významně snížit celkový výnos hybridní směsi.The limited use of two CMS systems has been verified in the production of hybrid rapeseed seeds. Polima or pol cytoplasm can cause male sterility in many rapeseed cultivars, and effective fertility lines have been identified that contain dominant alleles at a single nuclear recovery locus. The financial advantage of producing hybrids in this way is limited by the fact that semi-induced male sterility tends to be incomplete or leaking, especially when female lines are exposed to warmer growing conditions. As a result, semi-hybrid seeds may be contaminated with CMS seeds resulting from self-fertilization of the female line. Since these CMS plants have male sterility and do not spontaneously produce seeds, their presence can significantly reduce the overall yield of the hybrid composition.

• · • · · • · · ·· · ·· · • « • · · · • ·· • ♦ · · ·· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·

• · · • · • · · · · · ·• · · · · · · · · · · · · · · ·

Druhý CMS systém je založen na použití hybridní cytoplasmy, ve které je determinanta samčí sterility odvozena od ředkvičkové cytoplasmy, která se nazývá Ogura nebo ogu. Samčí sterilita způsobená ogu cytoplasmou je kompletní. Linie obnovující fertilitu pro tento systém, které byly vyvinuty vložením jediného ředkvičkového genu pro obnovení fertility (který je zde označen jako Rfo) do Brassica napus, jsou nově dostupné, ale vývoj linií obnovujících fertilitu je omezen vazebnou zátěží mezi genem obnovujícím fertilitu a geny, které mají negativní vliv na kvalitu semen.The second CMS system is based on the use of a hybrid cytoplasm in which the male sterility determinant is derived from a radish cytoplasm called Ogura or ogu. Male sterility due to ogu cytoplasm is complete. The fertility restoration lines for this system, which were developed by inserting a single radish fertility restoration gene (referred to herein as Rfo) in Brassica napus, are now available, but the development of fertility restoration lines is limited by the binding burden between the fertility restoration gene and genes that have a negative effect on seed quality.

Je velmi žádoucí vývoj způsobů pro posílení přirozené cytoplasmatické samčí sterility a pro obnovení samčí fertility a jejich použití při přípravě hybridních plodin.It is highly desirable to develop methods for enhancing natural cytoplasmic male sterility and restoring male fertility and their use in preparing hybrid crops.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Jedním předmětem předkládaného vynálezu jsou způsoby pro posílení přirozené cytoplasmatické samčí sterility a pro obnovení samčí fertility a jejich použití při přípravě hybridních plodin.One object of the present invention are methods for enhancing natural cytoplasmic male sterility and restoring male fertility and their use in preparing hybrid crops.

Předkládaný vynález obsahuje způsob pro posílení přirozené cytoplasmatické samčí sterility u rostlin, který obsahuje následující kroky:The present invention includes a method for enhancing natural cytoplasmic male sterility in plants, comprising the steps of:

a) vložení genového konstruktu, který se skládá v podstatě ze sekvence kódující mitochondriální transitní peptid fůsovaný před a v rámečku s alespoň jedním genem vybraným z needitované formy atp6 genu a orf224 genu mitochondrií Brassica napus, do jádra rostlinné buňky;a) introducing into the nucleus of the plant cell a gene construct consisting essentially of a sequence encoding a mitochondrial transit peptide fused in front of and in frame with at least one gene selected from a non-edited form of the atp6 gene and the oroch224 mitochondrial gene of Brassica napus;

b) selekci rostlinných buněk, které získaly genový konstrukt v kroku a); ab) selecting plant cells that have received the gene construct in step a); and

c) indukci regenerace selektovaných rostlinných buněk za vzniku zralé rostliny.c) inducing regeneration of the selected plant cells to form a mature plant.

Předkládaný vynález také obsahuje způsob pro obnovení přirozené samčí fertility u rostlin s cytoplasmatickou samčí sterilitou, který obsahuje následující kroky:The present invention also provides a method for restoring natural male fertility in plants with cytoplasmic male sterility, comprising the steps of:

a) vložení genového konstruktu, který se skládá v podstatě ze sekvence kódující mitochondriální transitní peptid fůsovaný před a v rámečku s editovanou formou normálního mítochondriálního genu, který je transkribován současně s neobvyklým mitochondriálním genem spojeným s CMS, do jádra rostlinné buňky;a) introducing into the nucleus of the plant cell a gene construct consisting essentially of a sequence encoding a mitochondrial transit peptide fused before and in frame with an edited form of a normal mitochondrial gene that is transcribed simultaneously with an unusual mitochondrial gene associated with CMS;

b) selekci rostlinných buněk, které získaly genový konstrukt v kroku a) ; ab) selecting plant cells that have received the gene construct in step a); and

c) indukci regenerace selektovaných rostlinných buněk pro vznik zralé rostliny.c) inducing regeneration of the selected plant cells to produce a mature plant.

Výhodnou rostlinou je Brassica napus.The preferred plant is Brassica napus.

Výhodně je krok (b) proveden za použití rostlinného transformačního vektoru, jako je pRD400.Preferably, step (b) is performed using a plant transformation vector such as pRD400.

Předkládaný vynález také obsahuje způsob pro obnovení přirozené samčí fertility u B. napus s polimacytoplasmatickou samčí sterilitou, který obsahuje následující kroky:The present invention also includes a method for restoring natural male fertility in B. napus with polimacytoplasmic male sterility, comprising the steps of:

a) vložení genového konstruktu, který se skládá v podstatě ze sekvence kódující mitochondriální transitní peptid fůsovaný před a v rámečku s editovanou formou atp6 mítochondriálního genu B. napus, do jádra rostlinné buňky;a) introducing into the nucleus of the plant cell a gene construct consisting essentially of a sequence encoding a mitochondrial transit peptide fused upstream and downstream of the edited atp6 form of the B. napus mitochondrial gene;

Naše výsledky mají důsledky pro praktické použití pol CMS pro výrobu hybridní řepky a jiných plodin rodu Brassica. Vložení genetických konstruktů umožňujících vnesení produktu editovaných forem atp6 genu Brassica do mitochondrií pól CMS rostlin představuje novou techniku, kterou může být obnovena samčí fertilita rostlin; tato technika umožní produkci nových pol CMS linií s obnovenou fertilitou v jednom kroku, pomocí transformace rostlin. Toto bude znamenat významnou úsporu času a nákladů, ve srovnání s běžnými technikami křížení rostlin pro přípravu takových linií, které jsou jedinou technikou, kterou mohou být takové linie připraveny. Kromě toho, vložení konstruktů umožňujících vnesení needitovaných forem atp6 genu nebo orf224 do mitochondrie pro přípravu rostlin s posílenou samčí sterilitou představuje techniku, kterou mohou být potenciálně připraveny nové pol CMS linie s posílenou samčí sterilitou; jak bylo uvedeno výše, unikání pol samčí sterility je hlavní překážkou rozšíření této techniky v přípravě hybridní řepky a neexistují účinné prostředky pro překonání této překážky. Je také možné, že tyto postupy mohou představovat obecnější strategii pro přípravu variet s posílenou CMS nebo s obnovenou fertilitou v jiných CMS systémech a v jiných druzích rostlin.Our results have implications for the practical use of pol CMS for the production of hybrid rapeseed and other Brassica crops. The insertion of genetic constructs to introduce the product of the edited forms of the atp6 gene of Brassica into the mitochondria pole of the CMS plant is a new technique by which the male fertility of plants can be restored; this technique allows the production of new pol CMS lines with restored fertility in one step, by plant transformation. This will entail significant time and cost savings compared to conventional plant crossing techniques for preparing such lines, which is the only technique that such lines can be prepared. In addition, the insertion of constructs allowing the introduction of unaltered forms of the atp6 gene or orf224 into mitochondria for the preparation of male sterile enhanced plants is a technique by which potentially new male C ster enhanced pol CMS lines can be prepared; as mentioned above, escaping half-male sterility is a major obstacle to the spread of this technique in the preparation of hybrid rapeseed and there are no effective means to overcome this obstacle. It is also possible that these procedures may represent a more general strategy for preparing varieties with enhanced CMS or with restored fertility in other CMS systems and other plant species.

Přehled obrázků na výkresechBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

Obr. 1 ilustruje použití cytoplasmatické samčí sterility (CMS) ve výrobě hybridních semen;Giant. 1 illustrates the use of cytoplasmic male sterility (CMS) in the production of hybrid seeds;

Obr. 2A-2J ukazují květy fertilních,pol CMS a transgenních B. napus cv Westar rostlin;Giant. 2A-2J show flowers of fertile, pol CMS and transgenic B. napus c in Westar plants;

Obr. 2A ukazuje kompletní květy pol CMS Westar (vlevo) a pol CMS Westar transformovaných mas2'/A9A6e konstruktem (pozoruje se větší velikost okvětních lístků u transgenních rostlin);Giant. 2A shows complete flowers of pol CMS Westar (left) and pol CMS Westar transformed with the mas2 '/ A9A6e construct (larger petal size is observed in transgenic plants);

Obr. 2B ukazuje kompletní květy transgenních rostlin se samčí sterilitou získaných vložením AP3/A9-A6u do Westar (nap) (vlevo) a Westar se samčí sterilitou (nap) (pozoruje se snížená pigmentace okvětních lístků transgenních rostlin);Giant. 2B shows complete flowers of transgenic male sterility plants obtained by introducing AP3 / A9-A6u into Westar (nap) (left) and Westar male sterility (nap) (reduced pigmentation of transgenic plant petals observed);

Obr. 2C ukazuje květy pol CMS Westar (vlevo) a pol CMS Westar transformovaných mas2'/A9A6e konstruktem s odstraněnými okvětními lístky a kališními lístky (pozoruje se větší velikost okvětních lístků a více vyvinutých prašníků u transgenních rostlin);Giant. 2C shows flowers of pol CMS Westar (left) and pol CMS Westar transformed with a mas2 '/ A9A6e construct with removed petals and calyxs (larger petal sizes and more anthers developed in transgenic plants are observed);

Obr. 2D ukazuje květy transgenních rostlin s částečnou samčí sterilitou získaných vložením AP3/A6-A6u do Westar (nap) (vlevo) Westar se samčí fertilitou s odstraněnými okvětními lístky a kališními lístky (pozoruje se zmenšení velikosti prašníků u transgenních rostlin);Giant. 2D shows flowers of transgenic plants with partial male sterility obtained by introducing AP3 / A6-A6u into Westar (nap) (left) Westar male fertility with removed petals and calyxs (reduction of anthers in transgenic plants observed);

Obr. 2E ukazuje celé květy pol CMS Westar, transgenních rostlin 40-8 se samčí sterilitou získaných vložením AP3/A9ORF konstruktu do Westar se samčí fertilitou (nap) a Westar se samčí fertilitou (nap) (zleva doprava);Giant. 2E shows whole flowers of pol CMS Westar, transgenic male-sterile 40-8 plants obtained by introducing the AP3 / A9ORF construct into Westar male fertility (nap) and Westar male fertility (nap) (left to right);

Obr. 2F ukazuje květy transgenní rostliny 40-8 s odstraněnými okvětními a kališními lístky; pozoruje se, že čtyři vnitřní tyčinky byly přeměněny na pestíky;Giant. 2F shows flowers of transgenic plant 40-8 with the petals and calyxs removed; it is observed that the four inner sticks have been converted into pistils;

Obr. 2G ukazuje celé květy částečně fertilní transgenní rostliny 40-10 získané vložením AP3/C4-ORF konstruktu do Westar se samčí fertilitou (nap) (vlevo); květ recipientního druhu Westar (nap) je uveden vpravo (pozoruje se redukce velikosti okvětních lístků u transgenní rostliny);Giant. 2G shows whole flowers of the partially fertile transgenic plant 40-10 obtained by introducing the AP3 / C4-ORF construct into Westar male fertility (nap) (left); the flower of the recipient Westar (nap) species is shown on the right (a reduction in petal size is observed in the transgenic plant);

• ·• ·

Obr. 2H ukazuje květy transgenní rostliny 40-10 a Westar se samčí fertilitou s odstraněnými okvětními a kališními lístky;Giant. 2H shows flowers of transgenic plant 40-10 and Westar male fertility with the petals and calyx removed;

Obr. .21 ukazuje celé květy pol CMS Westar (vlevo) a.Giant. .21 shows the whole flowers of pol CMS Westar (left) and.

transgenních rostlin s částečnou fertilitou získaných vložením AP3/A9-A6e konstruktu do pol CMS Westar (pozoruje se zvětšení velikosti okvětních lístků u transgenních rostlin);transgenic plants with partial fertility obtained by introducing the AP3 / A9-A6e construct into pol CMS Westar (increase in petal size in transgenic plants is observed);

Obr. 2J ukazuje květy pol CMS Westar (vlevo) a transgenních rostlin s částečnou fertilitou získaných vložením AP3/A9-A6e konstruktu do pol CMS Westar (pozoruje se zvětšení velikosti tyčinek a prašníků u transgenních rostlin);Giant. 2J shows flowers of pol CMS Westar (left) and transgenic plants with partial fertility obtained by introducing the AP3 / A9-A6e construct into pol CMS Westar (increases in rod and anthers in transgenic plants are observed);

Obr. 3A a 3D ukazují fenotypové změny doprovázející expresi A9-A6e řízenou mas2' v pol CMS Westar; A: květenství transgenní rostliny; B: květenství pol CMS Westar; C: celá transgenní rostlina; D: pol CMS Westar rostlina (pozoruje se větší velikost květenství a vegetativních internodií u transgenních rostlin);Giant. 3A and 3D show phenotypic changes accompanying mas2 'driven A9-A6e expression in pol CMS Westar; A: inflorescence of transgenic plant; B: inflorescence pol CMS Westar; C: whole transgenic plant; D: pol CMS Westar plant (larger inflorescence and vegetative internodes observed in transgenic plants);

Obr. 4 ukazuje použití AP3/A9-A6e konstruktu jako dominantního genu obnovujícího fertilitu u B. napus; aGiant. 4 shows the use of the AP3 / A9-A6e construct as the dominant fertility restorer gene in B. napus; and

Obr. 5 ukazuje použití AP3/C4-ORF konstruktu pro posílení pol cytoplasmatické samčí sterility u B. napus.Giant. 5 shows the use of the AP3 / C4-ORF construct for enhancing pol cytoplasmic male sterility in B. napus.

Předkládaný vynález obsahuje způsob pro vývoj udržovacích linií a linií s obnovenou fertilitou pomocí genetického inženýrství. Předkládaný vynález se konkrétně týká pol CMS systému řepky (Brassica napus, campestris). Tento způsob může být, nicméně, použit pro modifikaci produkce pylu takovými • · • 0 ·The present invention includes a method for developing genetic engineering maintenance and regeneration lines. In particular, the present invention relates to a pol CMS rapeseed system (Brassica napus, campestris). This method may, however, be used to modify pollen production by such a.

liniemi v jiných CMS systémech pro řepku a CMS systémech pro mnoho jiných plodin.lines in other CMS systems for rapeseed and CMS systems for many other crops.

Předkládaný vynález je založen na výzkumu molekulárního základu cytoplasmatické samčí sterility (CMS) u řepky (Brassica napus L.), který byl proveden v naší laboratoři v letech 1987 - 1993. Analýza organizace a exprese mitochondriálního genomu Brassica ukázala, že polima nebo pol forma B. napus CMS koreluje s expresí regionu mitochondriálního genu, který obsahuje chimérický gen, orf224, který je transkribován současně s normálním mitochondriálním genem, atp6 (Singh, M.P. and Brown, G.G. (1991), The Plant Cell 3: 1349-1362; Bonen, L. and Brown,The present invention is based on research into the molecular basis of cytoplasmic male sterility (CMS) in rape (Brassica napus L.), which was carried out in our laboratory in 1987-1993. Analysis of the organization and expression of the Brassica mitochondrial genome showed that polima or pol form B napus CMS correlates with expression of a region of the mitochondrial gene containing the chimeric gene, orf224, which is transcribed simultaneously with the normal mitochondrial gene, atp6 (Singh, MP and Brown, GG (1991), The Plant Cell 3: 1349-1362; Bonen, L. and Brown,

G.G. (1993), Can. J. Bot. 71: 645-660). Předpokládali jsme, že pol CMS je způsoben mitochondriální dysfunkcí, která je důsledkem buď (i) přítomnosti orf224 proteinu v mitochondriální membráně, nebo (ii) možné deficience ATP6 proteinu, která může být způsobena interferencí orf224 v translaci atp6.G.G. (1993) Can. J. Bot. 71: 645-660. We hypothesized that pol CMS is due to mitochondrial dysfunction resulting from either (i) the presence of orf224 protein in the mitochondrial membrane, or (ii) a possible ATP6 protein deficiency that may be caused by orf224 interference in atp6 translation.

Mitochondriální proteiny mají duální genetický původ: některé z těchto proteinů, snad 10%, včetně proteinů specifických pro CMS, jsou kódovány v mtDNA; jiné jsou kódovány jadernou DNA. Proteiny kódované mtDNA jsou syntetizovány na mitochondriálních ribosomech a zůstávají v mitochondriích. Mitochondriální proteiny kódované v jádru jsou syntetizovány jako prekursory, které obvykle obsahují další řetězec aminokyselin na N-konci, který se nazývá přenosový peptid nebo presekvence. Tento přenosový peptid slouží pro nasměrování proteinu do mitochondrie; po přenosu proteinu do mitochondrie je odstraněn proteasou. Pokud je DNA sekvence pro protein normálně kódovaný mtDNA fúsována se sekvencí mitochondriálního přenosového peptidu a výsledný konstrukt je vložen do jádra a exprimován v jádru, tak může ·♦ 99 • · ♦ * • · · · být vzniklý prekursorový protein importován do mitochondrie a konečný produkt může působit stejným způsobem jako forma vyrobená v mitochondriích.Mitochondrial proteins have dual genetic origin: some of these proteins, perhaps 10%, including CMS-specific proteins, are encoded in mtDNA; others are encoded by nuclear DNA. The proteins encoded by mtDNA are synthesized on mitochondrial ribosomes and remain in mitochondria. Mitochondrial proteins encoded in the nucleus are synthesized as precursors, which usually contain an additional amino acid chain at the N-terminus, called a transfer peptide or presequence. This transfer peptide serves to direct the protein to mitochondria; after transfer of the protein to mitochondria it is removed by protease. If the DNA sequence for the protein normally encoded by mtDNA is fused to the mitochondrial transfer peptide sequence and the resulting construct is inserted into the nucleus and expressed in the nucleus, the resulting precursor protein can be imported into the mitochondria and the final product it can act in the same way as a mold produced in mitochondria.

Soudili jsme, že pokud je hypotesa (i) správná, pak budeme schopni vyvolat samčí sterilitu na rostlinách se samčí fertilitou pomocí exprese DNA konstruktů, které umožní přenos ORF224 proteinu kočovaného v jádru, translatovaného v cytoplasmě, do mitochondrie. Podobně jsme usoudili, že pokud je hypotesa (ii) správná, pak budeme schopni obnovit samčí fertilitu na pol CMS rostlinách pomocí exprese DNA konstruktů, které umožní přenos ATP6 proteinu kódovaného v jádru, translatovaného v cytoplasmě, do mitochondrie. Pokud mění konstrukty samčí sterilitu/fertilitu, pak mohou být orf224 transgeny považovány za syntetické udržovatele samčí sterility, zatímco atp6 transgeny mohou být považovány za syntetické restaurátory samčí fertility. Další komplikace těchto hypotel vzešla z pozorování, že jak orf224, tak atp6 transkripty jsou, podobně jako většina rostlinných mitochondriálních transkriptů, upravovány (Stáhl, R. et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22: 2109-2113). Úprava rostlinných mitochondriálních transkriptů zahrnuje přeměnu specifických C zbytků v molekule mRNA na U zbytky, což mění aminokyselinovou sekvenci kočovaného proteinu (upravená mRNA kóduje funkční formy proteinu). Jak atp6, tak orf224 transkripty jsou upravovány v jediném místě, což vede, v obou případech, k jedné změně aminokyselinové sekvence. Jelikož jaderná exprese DNA konstruktu umožňujícího přenos neupraveného pšeničného ATP9 proteinu do mitochondrií způsobuje samčí sterilitu transgenního tabáku (Hernould, M. et al., (1993), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 90: 2370-2374), tak se zdá pravděpodobné, že exprese/přenos neupraveného Brassica ATP6 proteinu může také způsobit samčí sterilitu a působit jako syntetický udržovací gen.We hypothesized that if the hypothesis (i) is correct, then we will be able to induce male sterility on male fertile plants by expressing DNA constructs that allow the transfer of ORF224 protein traveling in the nucleus, translated in the cytoplasm, into mitochondria. Similarly, we hypothesized that if hypothesis (ii) is correct, then we will be able to restore male fertility on pol CMS plants by expressing DNA constructs that allow the transfer of ATP6 protein encoded in the cytoplasm-translated nucleus to mitochondria. If the constructs alter male sterility / fertility, then orf224 transgenes can be considered synthetic male sterility maintainers, while atp6 transgenes can be considered synthetic male fertility restorers. A further complication of these hypothelies arises from the observation that both orf224 and atp6 transcripts, like most plant mitochondrial transcripts, are altered (Stahl, R. et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22: 2109-2113). Modification of plant mitochondrial transcripts involves the conversion of specific C residues in the mRNA molecule to U residues, altering the amino acid sequence of the nomadic protein (the modified mRNA encodes functional forms of the protein). Both atp6 and orf224 transcripts are engineered at a single site, resulting, in both cases, in one amino acid sequence change. Since nuclear expression of a DNA construct allowing the transfer of untreated wheat ATP9 protein to mitochondria causes male sterility of transgenic tobacco (Hernould, M. et al., (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2370-2374), it seems likely that expression / transfer of untreated Brassica ATP6 protein can also cause male sterility and act as a synthetic maintenance gene.

·«· «

Syntetické udržovací geny tohoto typu mohou být v zásadě použity pro tvorbu nových udržovacích linií pomocí genetické transformace. Tento postup překonává dlouhodobé a nákladné pokusy s křížením rostlin, pomocí kterých jsou takové linie v současnclti vytvářeny. Dostupnost syntetických udržovacích genů může umožnit vývoj linií pomocí transformace rostlin, které si budou zcela zachovávat pol sterilitu. Takové linie v současné době neexistují a tyto technologie proto účinně odstraní poslední překážku zvyšování výnosu za použití hybridů řepky založených na pol. Konečně, je možné, ba dokonce pravděpodobné, že analogické strategie mohou být použity pro vývoj syntetických linií s obnovenou fertilitou a udržovacích linií pro plodiny jiné než je řepka, a proto je možné, že může být vyvinuta obecná strategie pro genetické udržování a obnovování CMS.Synthetic maintenance genes of this type can basically be used to generate new maintenance lines by genetic transformation. This procedure overcomes long-term and costly cross-breeding experiments with which such lines are currently being established. The availability of synthetic maintenance genes can allow the development of lines by transforming plants that will fully retain half-sterility. Such lines do not currently exist and these technologies therefore effectively remove the last obstacle to yield increase using pollen-based rapeseed hybrids. Finally, it is possible, and even likely, that analogous strategies can be used to develop synthetic fertility lines and maintenance lines for crops other than rapeseed and it is therefore possible that a general strategy for the genetic maintenance and recovery of CMS may be developed.

Důkaz toho, že jaderně kódované formy ATP6 a ORF224 přenášené do mitochondrií mohou působit jako syntetické obnovovací a udržovací geny, v příslušném pořadí.Evidence that nuclear encoded forms of ATP6 and ORF224 transferred to mitochondria can act as synthetic restorer and maintenance genes, respectively.

Pro první testování těchto možností jsme fušovali DNA odpovídající upravené (A6e) a neupravené (A6u) formy atp6 kódující sekvenci s DNA kódující jednu ze dvou presekvencí pro přenos do mitochondrií, kvasinkovou COX4 (C4) a Neurospora ATP9 (A9). Podobné konstrukty byly připraveny fušováním stejných presekvencí na neupravenou formu orf224 (ORFu). Tyto sekvence byly navázány, na svém 5' konci, na mas2' promotor (van der Leegt-Plegt, L.M. et al., (1992), Plant Cell Reports 11: 20-24) a na svém 3'-konci na polyadenylační signál pro 35S RNA viru květákové mozaiky. Vzniklé konstrukty byly vloženy do kotyledonů B. napus pomocí Agrobacterium-zprostředkované transformace (Moloney, M. et al., (1989), Plant Cell Rep. 8:238-242). Nebyli jsme schopni • fl ··· · ·· ·♦ ·· * fl · 9 9 9 9 «fl·· « 9 9 9 9 9 9 • fl * · flflflfltfl··For the first testing of these possibilities, we fused DNA corresponding to the modified (A6e) and untreated (A6u) forms of the atp6 coding sequence with the DNA encoding one of the two mitochondrial transfer sequences, yeast COX4 (C4) and Neurospora ATP9 (A9). Similar constructs were prepared by fusing the same presequences to the unmodified form of orf224 (ORFu). These sequences were linked, at their 5 'end, to the mas2' promoter (van der Leegt-Plegt, LM et al., (1992), Plant Cell Reports 11: 20-24), and at the 3'-end to a polyadenylation signal for cauliflower mosaic virus 35S RNA. The resulting constructs were introduced into cotyledons of B. napus by Agrobacterium-mediated transformation (Moloney, M. et al., (1989), Plant Cell Rep. 8: 238-242). We were not able to • fl ··· · ·· · fl · 9 9 9 9 «fl · ·« 9 9 9 9 9 9 • fl * · flflflfltfl · ·

1^ ······1 ^ ······

9999 9 999 9999 ·· ·· regenerovat rostliny, do kterých byly vloženy ORFu konstrukty. Tři z transgenních rostlin, které regenerovahy po vložení A9/A6u konstruktu do fertilní B.9999 9 999 9999 ·· ·· regenerate plants into which ORFu constructs have been inserted. Three of the transgenic plants that regenerate after insertion of the A9 / A6u construct into fertile B.

napus cv Westar měly částečnou samčí sterilitu, zatímco jedna rostlina, která získalo po vložení A9/A6e konstruktu do sterilní pol CMS B. napus měla částečnou samčí fertilitu.napus c in Westar had partial male sterility, while one plant that obtained after insertion of the A9 / A6e construct into sterile pol CMS B. napus had partial male fertility.

Toto naznačuje, že konstrukt exprimující neupravenou formu atp6 působí jako gen indukující sterilitu, neboli udržovací gen, zatímco upravená forma působí jako gen obnovující pol fertilitu. Naneštěstí jsme nebyli schopni získat semena z žádné rostliny exprimující kterýkoliv konstrukt a proto nebylo možno prokázat, zda mohou být změny v fertilitě/sterilitě geneticky přeneseny do dalších generací rostlin, ani nebylo možno potvrdit, že fenotypy vznikly v důsledku exprese transgenu.This suggests that the construct expressing the unaltered form of atp6 acts as a gene inducing sterility, or a maintenance gene, while the engineered form acts as a gene restoring half-fertility. Unfortunately, we were unable to obtain seeds from any plant expressing any construct, and therefore it was not possible to demonstrate whether changes in fertility / sterility could be genetically transferred to future generations of plants, nor could it be confirmed that phenotypes were due to transgene expression.

Novější výzkumy se zaměřily na přípravu konstruktů, ve kterých byl vývojově regulovaný protmotor, získaný z APETALA3 (AP3) genu Arabidopsis thaliana (Jack, T. et al., (1994) Cell 76: 703-716), použit pro řízení exprese atp6 a orf224 konstruktů. AP3 byl vybrán jako tkáňově specifický promotor, protože je exprimován velmi časně ve vývoji tyčinek (stejně jako okvětního lístku). Předchozí data naznačovala, že zástava vývoje pylu spojená s pol CMS je premiotická a proto k ní může dojít v časném stadiu vývoje tyčinky; proto jsme usoudili, že kompenzace nebo napodobení pol CMS fenotypu bude nutná pro expresi konstruktů v časném stadiu vývoje tyčinky.More recent investigations have focused on the preparation of constructs in which a developmentally regulated prototype engine derived from the APETALA3 (AP3) Arabidopsis thaliana gene (Jack, T. et al., (1994) Cell 76: 703-716) has been used to control atp6 expression and orf224 constructs. AP3 was selected as a tissue-specific promoter because it is expressed very early in the development of rods (as well as petal). Previous data suggested that pollen development arrest associated with pol CMS is premotic and therefore may occur at an early stage of rod development; therefore, we considered that compensation or imitation of the pol CMS phenotype would be necessary for expression of the constructs at an early stage of rod development.

Byly připraveny nebo jsou připravovány další konstrukty, včetně konstruktu, ve kterém byl použit pro expresi konstitutivní*’mas2' promotor. Všechny konstrukty byly insertovány do binárního transformačního vektoru pRD400, který byl optimalizován pro účinnou transformaci u Brassica, a byly vloženy do rostlin pomocí transformace kotyledonu.Other constructs have been or are being prepared, including a construct in which the constitutive * mas2 'promoter was used for expression. All constructs were inserted into the binary transformation vector pRD400, which was optimized for efficient transformation in Brassica, and introduced into plants by cotyledon transformation.

·* ·· * ·

Souhrn připravených konstruktů a získaných fenotypů transgenních rostlin je uveden v tabulce 1.A summary of prepared constructs and obtained phenotypes of transgenic plants is given in Table 1.

Tabulka 1: Genetické konstrukty a odpovídající fenotypy transgenních rostlinTable 1: Genetic constructs and corresponding phenotypes of transgenic plants

Konstrukt¹ Vložen Získané do Kan^R rostlinyConstruct ¹ Inserted Obtained into a Kan ^R plant

Potvrzené transgenní rostliny² Confirmed transgenic plants ²

Fenotypy potvrzených transgenních rostlin • ··»·Phenotypes of confirmed transgenic plants • ·· »·

AP3/C4-ORF³ fertilní 17 Westar (nap)AP3 / C4-ORF ³ fertile 17 Westar (nap)

AP3/A9-ORF fertilní 21 Westar (nap)AP3 / A9-ORF fertile 21 Westar (nap)

AP3/A9-A6e samčí 9 sterilníAP3 / A9-A6e male 9 sterile

Westar (pol)Westar (pol)

Variabilní samčí sterilita v rozsahu od téměř plné sterility (2 rostliny) do plné fertility (většina rostlin); některé rostliny měly změněný počet, morfologii a identitu květních orgánůVariable male sterility ranging from near full sterility (2 plants) to full fertility (most plants); some plants had altered the number, morphology and identity of the flower organs

Variabilní samčí sterilita v rozsahu od téměř plné sterility (1 rostlina) do plné fertility (většina rostlin); některé rostliny měly změněný počet, morfologii a identitu květních orgánůVariable male sterility ranging from near full sterility (1 plant) to full fertility (most plants); some plants had altered the number, morphology and identity of the flower organs

Všechny rostliny měly část.samčí fertilitu; velikost tyčinek a okvětních lístků byla mezi velikostí fertilních Westar (nap) a Westar (pol) CMS rostlin ·· ···· ·· ·All plants had a part of the female fertility; the size of the stamens and petals was between the size of the fertile Westar (nap) and Westar (pol) CMS plants ·· ········

Tabulka 1 - pokračováníTable 1 - continued

Konstrukt^{1 2} Vložen doConstruct ^{1 2} Inserted into

ZískánéGained

Kan^R rostlinyKan ^R plants

Potvrzené transgenní rostliny2Confirmed transgenic plants2

Fenotypy potvrzených transgenních rostlinPhenotypes of confirmed transgenic plants

AP3/A9-A6u fertilní 20 Westar (nap)AP3 / A9-A6u fertile 20 Westar (nap)

Většina rostlin měla samčí fertilitu, s některými květy s částečnou sterilitou; některé rostliny měly redukované tyčinky; světle žluté okvětní lístky; změny charakteru přeslenu a/nebo počtu orgánů mas2'/A9A6e samčí sterilníMost plants had male fertility, with some flowers of partial sterility; some plants had reduced stamens; pale yellow petals; alteration of whorl character and / or organ number of mas2 '/ A9A6e male sterile

Westar (pol)Westar (pol)

Všechny rostliny měly částečnou samčí fertilitu; velikost tyčinek a okvětních lístků byla mezi velikostí fertilních Westar (nap) a Westar (pol) CMS rostlin; některé rostliny měly změny identity přeslenu; prodloužené květenství a vegetativní internodiaAll plants had partial male fertility; the size of the stamens and petals was between the size of the fertile Westar (nap) and Westar (pol) CMS plants; some plants had whorl identity changes; prolonged inflorescence and vegetative internodes

AP3/GUS Westar (nap)AP3 / GUS Westar

Stejné jako Westar (nap); GUS exprese pozorovaná při bázi okvětních lístků a tyčinek, jak byla předpokládána ¹ Prvky konstruktu přítomné v sekvenci:Same as Westar (nap); GUS expression observed at the base of the petals and stamens as predicted ¹ Elements of the construct present in the sequence:

promotor/presekvence-kodující sekvence; AP3, Arabidopsis APETELA3 promotor, C4, kvasinková COX4 presekvence; A9 Neurospora ATP9 presekvence; ORF, upravená orf224 kódující sekvence; A6e, upravená atp6 kódující sekvence; A6u, neupravená atp6 kódující sekvence ² Potvrzeno Souther blot analýzou za použití sondy odvozené za promoter / presequence-coding sequence; AP3, Arabidopsis APETELA3 promoter, C4, yeast COX4 presequence; A9 Neurospora ATP9 presequence; ORF, modified orf224 coding sequence; A6e, modified atp6 coding sequence; A6u, unadjusted atp6 coding sequence ² Confirmed by Southern blot analysis using a probe derived from

NPTII genu.NPTII gene.

φφ ·· • * φ · · · φ Φφφφ φ φ φφφ Φ·· φ · · φ φφφφ ·· ·· • φ ·φ· · ³ upravená atp6 kódující sekvence s připojeným epitopem fušovaná na A9 presekvenci ⁴ upravená atp6 kódující sekvence, bez přenosové presekvence ³ modified atp6 coding sequence with attached epitope fused to A9 sequence ⁴ modified atp6 coding sequence, ³ · ³ · · · · · · · · ^{3 3 3 3 3 3 3 3} without transmission presequence

Data uvedená v tabulce 2 ukazují frekvence, se kterou různé konstrukty indukovaly změny samčí sterility nebo fertility u transgenních rostlin. Některé pozorované změny samčí sterility/fertility a struktury kvetu transgenních rostlin jsou uvedeny na obr. 2.The data presented in Table 2 show the frequencies at which various constructs induced changes in male sterility or fertility in transgenic plants. Some observed changes in male sterility / fertility and flower structure of transgenic plants are shown in Figure 2.

Květy ukázané na levé straně Obr. 2A a na pravé straně Obr. 2B jsou květy rostlin pol CMS Westar a fertilní Westar (nap). Obrázky pod těmito obrázky (2C a 2D, v příslušném pořadí) ukazují květy stejných rostlin s odstraněnými okvětními lístky a kališními lístky. Jak je zřejmé z těchto obrázků, tyčinky a okvětní lístky pol CMS rostlin jsou významně menší než tyčinky a okvětní lístky květů Westar (nap). Za kontrolovaných podmínek růstu, které jsme použili (20 °C, 16 hodinový den, 15 °C, 8 hodinová noc) jsou tyčinky tvořící květy mladých pol CMS rostlin výrazně menší než je polovina výšky pestíku, netvoří plně utvořené prašníky a obsahují pouze malé množství pylu.Flowers shown on the left side FIG. 2A and on the right side of FIG. 2B are flowers of pol CMS Westar and fertile Westar (nap) plants. The figures below these figures (2C and 2D, respectively) show flowers of the same plants with the petals and calyxs removed. As can be seen from these figures, pol CMS sticks and petals of plants are significantly smaller than Westar (nap) flower sticks and petals. Under the controlled growth conditions we used (20 ° C, 16 hours day, 15 ° C, 8 hours night) the stamens forming the flowers of young CMS plants are significantly less than half the height of the pistil, do not form fully formed anthers and contain only a small amount pollen.

• · · ♦ · · ·· ·• · · · · · · ·

Tabulka 2: Počet transgenních rostlin s modifikovanou samčí fertilitou/sterilitouTable 2: Number of transgenic plants with modified male fertility / sterility

Konstrukt Construct Akceptor. rostlina Acceptor. plant Fertilní¹ Fertile ¹ Semi- fertilní² Semi-fertile ² Semi- sterilní³ Semi-sterile ³ Sterilní⁴ Sterile ⁴ AP3/A9- ORF AP3 / A9- ORF Westar (nap) Westar (nap) 6 6 3 3 1 1 AP3/C4- ORF AP3 / C4- ORF Westar (nap) Westar (nap) 5 5 5 5 2 2 AP3/A9- A6e AP3 / A9- A6e pol CMS Westar pol CMS Westar 5 5 2 2 AP3/A9- A6u AP3 / A9- A6u Westar (nap) Westar (nap) 9 9 6 6 mas2'/A9- A6e mas2 '/ A9- A6e pol CMS Westar pol CMS Westar 1 1 8 8 10 10

¹ nerozlišitelné od Westar (nap) ² redukované uvolňování pylu ve srovnání s Westar (nap); po sklizni získány lusky naplněné semeny ³ minimální uvolňování pylu; při sklizni malý obsah semen ⁴ při sklizni získáno málo nebo žádná semena; několik mas2'/A9-A6e rostlin produkovalo významné množství pylu, ale neobsahovaly semena a proto byly měly samčí a samičí sterilitu ¹ indistinguishable from Westar (nap) ² reduced pollen release compared to Westar (nap); after harvesting seeds filled with seeds ³ minimal pollen release; low seed content at harvest ⁴ little or no seed obtained at harvest; several mas2 '/ A9-A6e plants produced significant amounts of pollen but did not contain seeds and therefore were male and female sterile

Jak je uvedeno v tabulkách 1 a 2 , v přibližně polovině získaných transgenních rostlin byla exprese upravené orf224 kódující sekvence fušované na jednu z přenosových presekvencí řízená AP3 schopná redukovat samčí fertilitu a indukovat změny morfologie květů u Westar (nap) rostlin . Stupeň • v ·»·· · ····* • · * · » · ··· ···As shown in Tables 1 and 2, in approximately half of the transgenic plants obtained, the expression of the modified orf224 coding sequence fused to one of the AP3-directed transfer prerequisites was able to reduce male fertility and induce changes in flower morphology in Westar (nap) plants. Degree • v ····························

ΙΟ ··*♦··ΙΟ ·· * ♦ ··

ΙΟ 4494 4 999 4994 94 49 sterility, jak je hodnocen množstvím pylu, který je viditelný na prasnicích nově otevřených květů, stejně jako charakter květních abnormalit, se mezi různými transgenními rostlinami lišil a někdy, mnohem méně často, se lišil také mezi různými větvemi květenství jedné rostliny. Nebyl pozorovatelný rozdíl mezi konstrukty obsahujícími COX4 (C4) a ATP9 (A9) presekvence ani ve vyvolaném fenotypů, ani ve frekvenci indukce samčí sterility. Některé znaky získaných fenotypů je možno vidět na obr. 2 E-H, které ukazují květy z transgenních rostlin, u kterých byly pozorovány změny v produkci pylu. U těchto rostlin byly ve srovnání s Westar (nap) redukovány velikosti okvětních lístků a tyčinek, stejně jako množství produkovaného pylu, ačkoliv redukce nebyla taková, jaká je pozorována u pol CMS rostlin. Nej extrémnější fenotyp byl pozorován u transgenní rostliny 40-8, A9-ORF transformantu (obr. 2E a 2F): u těchto květů byly čtyři vnitřní tyčinky přeměněny na struktury podobné pestíku; prašníky tvořené na dvou zevních tyčinkách zůstávaly světle žluté a obsahovaly pouze velmi malé množství pylu.94 4494 4 999 4994 94 49 sterility, as measured by the amount of pollen seen in sows of newly opened flowers, as well as the nature of flower abnormalities, varied between different transgenic plants and sometimes, much less frequently, also between different branches of inflorescence one plant. There was no observable difference between constructs containing COX4 (C4) and ATP9 (A9) presequences in either phenotypic induced or male sterility induction frequency. Some features of the phenotypes obtained can be seen in Fig. 2 E-H, showing flowers from transgenic plants in which changes in pollen production have been observed. In these plants, the size of the petals and stamens, as well as the amount of pollen produced, were reduced compared to Westar (nap), although the reduction was not as observed in pol CMS plants. The most extreme phenotype was observed in the transgenic plant 40-8, 99-ORF transformant (Figs. 2E and 2F): in these flowers, four inner stamens were converted to pistil-like structures; the anthers formed on the two external sticks remained pale yellow and contained only a very small amount of pollen.

Hodnotili jsme kapacitu jednotlivých rostlin pro vývoj semen po samooplození jako praktické měření samčí/samičí fertility. Pro samooplození rostlin jsme obvykle umístili pytel nad květenství a jemně jsme květenstvím zaklepali, abychom navodili opylení. U normálních rostlin se samčí fertilitou byly všechny lusky plné semen; pol CMS rostliny tvořily za těchto podmínek pouze velmi málo nebo žádná semena. Když jsme se pokoušeli o samooplození transgenních rostlin exprimujících AP3/A9-ORF nebo AP3/C4-ORF konstrukty, nebyla v jednom případu zjištěna žádná semena (transgenní rostlina 40-8, obr. 2) a v několika případech bylo zjištěno pouze několik semen. Rostliny, u kterých byla zjištěna značná redukce tvorby semen, ale které si uchovávaly určitou schopnost tvorby pylu, byly označeny jako semi-sterilníWe evaluated the capacity of individual plants to develop seeds after self-fertilization as a practical measurement of male / female fertility. To self-fertilize plants, we usually placed a bag over the inflorescences and gently knocked the inflorescences to induce pollination. In normal male fertile plants, all pods were full of seeds; pol CMS plants produced very little or no seed under these conditions. When attempting to self-fertilize transgenic plants expressing AP3 / 99-ORF or AP3 / C4-ORF constructs, no seeds were detected in one case (transgenic plant 40-8, Fig. 2) and only a few seeds were found in a few cases. Plants that have been found to significantly reduce seed formation but which retain some pollen-forming ability have been identified as semi-sterile

99 9999 99

9 9 9 9 99

9 9 9 99

9 99 9 999 • · · • »»* ·· 99 ··»· • · · · • «9 99 9 999 · 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99

9 · ···· 9 9 (tabulka 2) . V tomto testu byly celkem 3 z 22 potvrzených transgenních ORF rostlin semi-sterilní.9 · ···· 9 9 (Table 2). A total of 3 out of 22 confirmed transgenic ORF plants were semi-sterile in this assay.

Exprese neupravené formy atp6 genu (A6u) fušovaného na ATP9 presekvenci, která byla řízena AP3 promotorem, byla takto schopná redukce fertility Westar (nap) rostlin (tabulka 1).0 něco méně než polovina získaných transgenních rostlin exprimujících tento konstrukt měla redukci samčí fertility (tabulka 2). Obecně byla, nicméně, redukce samčí sterility, hodnocená podle kapacity tvorby semen, výraznější než při použití ORF konstruktů; všechny transgenní rostliny, které měly požadovaný fenotyp, byly klasifikovány jako semisterilní. Většina rostlin s redukovanou fertilitou měla také malé, světle žluté okvětní lístky. Semi-sterilní fenotyp jedné z AP/A9-A6u rostlin je uveden na obr. 2B a D. Také jsme zjistili, že konstrukty tohoto typu, stejně jako ORF konstrukty a třetí typ AP3/A9-A6 konstruktu, AP3/A9-A6ep, ve které je ATP6 kódující sekvence přerušena sekvencí kódující malý peptid, mohou zvyšovat sterilitu pol CMS rostlin, pol CMS rostliny normálně produkují malá množství pylu; pol CMS rostliny exprimující AP3/A9-A6u neprodukuj í žádný pyl.Expression of the untreated form of the atp6 gene (A6u) fused to the ATP9 sequence, under the control of the AP3 promoter, was thus capable of reducing the fertility of Westar (nap) plants (Table 1) .0 slightly less than half the obtained transgenic plants expressing this construct had Table 2). In general, however, the reduction in male sterility, assessed by seed formation capacity, was more pronounced than using ORF constructs; all transgenic plants having the desired phenotype were classified as semi-sterile. Most plants with reduced fertility also had small, light yellow petals. The semi-sterile phenotype of one of the AP / A9-A6u plants is shown in Figures 2B and D. We also found that constructs of this type, as well as ORF constructs and the third type of AP3 / A9-A6 construct, AP3 / A9-A6ep, wherein the ATP6 coding sequence is interrupted by the small peptide coding sequence may increase the sterility of pol CMS plants, pol CMS plants normally produce small amounts of pollen; pol CMS plants expressing AP3 / A9-A6u produce no pollen.

Jak je uvedeno na obr. 21 a J, AP3-řízená exprese upraveného atp6 konstruktu v pol CMS rostlinách způsobuje změnu fenotypu, která je v souladu s předpokladem, že účinkuje jako syntetický gen obnovující fertilitu. Květy těchto transgenních rostlin měly tyčinky a okvětní lístky, které měly střední velikost mezi velikostí pol CMS a fertilních Westar (nap) rostlin. Prašníky těchto rostlin byly malé a žluté a produkovaly významná množství pylu, ačkoliv ne taková množství, jako Westar (nap) rostliny se samčí fertilitou (tabulka 1). Všechny transgenní rostliny měly alterovaný fenotyp (tabulka 2), ačkoliv množství produkovaného pylu se mezi rostlinami mírně lišilo. Všechny *0 000» • * ·0 « 0 • · 0 0 0 0As shown in Figures 21 and J, AP3-directed expression of the modified atp6 construct in pol CMS plants causes a phenotype change that is believed to act as a synthetic fertility restoring gene. The flowers of these transgenic plants had stamens and petals that were of medium size between the size of pol CMS and fertile Westar (nap) plants. The anthers of these plants were small and yellow and produced significant amounts of pollen, although not such amounts as Westar (nap) male fertile plants (Table 1). All transgenic plants had an altered phenotype (Table 2), although the amount of pollen produced varied slightly between plants. All * 0 000 »• * · 0« 0 • · 0 0 0 0

0 0 0 00 0 0 0

0 00« 0000 00 «000

0 0 0000 00 «0 • 00 0 0000 00 0 0 • 0

0»·· tyto rostliny byly schopny produkce semen po samoplození; dvě z těchto rostlin vytvářely pouze malé množství semen, zatímco pět zbývajících rostlin vytvářelo plné lusky při samooplození ve vaku nebo jiném zásahu. Těchto 5 rostlin může být proto považováno za rostliny s obnovenou fertilitou.0 »·· these plants were capable of producing seeds after self-breeding; two of these plants produced only a small amount of seeds, while the five remaining plants formed full pods during self-fertilization in a bag or other intervention. These 5 plants can therefore be considered to have restored fertility.

Také jsme hodnotili kapacitu A9-A6e konstruktu indukovat samčí fertilitu v pol CMS rostlinách při expresi za použití konstitutivního promotoru mas2'. Získali jsme šest transgenních rostlin, které měly prakticky identické květy s květy AP3/A9-A6e rostlin (obr. 1A a IC). Ostatní rostliny produkovaly buď malá množství pylu, nebo neprodukovaly žádný pyl. Pouze jedna z rostlin produkujících pyl byla schopna tvořit významný počet semen bez manuálního opylení, což naznačuje, že samičí fertilita mas2'/A9-A6e rostlin je obyčejně redukována. Toto odpovídá předešlým výsledkům s konstrukty tohoto typu, ve kterých jsme získali rostliny s fertilními květy, které nebyly schopné tvorby semen. Druhý rys získaných rostlin je také v souladu s našimi předběžnými výsledky: všechny rostliny exprimující A9-A6e z mas2' promotoru měly změny vegetativního růstu. Konkrétně, vegetativní internodia a internodia květenství byly delšíbWe also evaluated the capacity of the A9-A6e construct to induce male fertility in pol CMS plants when expressed using the constitutive mas2 'promoter. We obtained six transgenic plants that had virtually identical flowers to those of the AP3 / A9-A6e plants (Fig. 1A and IC). Other plants produced either small amounts of pollen or produced no pollen. Only one of the pollen-producing plants was able to produce a significant number of seeds without manual pollination, suggesting that female fertility of the mas2 '/ 99-A6e plants is usually reduced. This corresponds to previous results with constructs of this type in which we have obtained plants with fertile flowers that were not able to produce seeds. The second feature of the obtained plants is also consistent with our preliminary results: all plants expressing A9-A6e from the mas2 'promoter had changes in vegetative growth. In particular, vegetative internodes and inflorescence internodes were longer

Λ internodia u Westar (nap) nebo pol CMS Westar rostlin (obr.Od internodes in Westar (nap) or half CMS Westar plants (fig.

3); u některých transgenních rostlin byla také změněna morfologie listů. Podobné změny nebyly pozorovány u žádné rostliny, u které byl pro expresi použit AP3 promotor. Proto vznikají jak redukce samičí fertility, tak jiné abnormality v důsledku generalizované exprese fúsního proteinu z mas2' promotoru.3); leaf morphology has also been changed in some transgenic plants. Similar changes were not observed in any plant in which the AP3 promoter was used for expression. Therefore, both the reduction of female fertility and other abnormalities arise due to the generalized expression of the fusion protein from the mas2 'promoter.

y nežy than

Pozorování podobných typů modifikace sterility v mnoha nezávisle transformovaných rostlinách velmi silně podporují naší počáteční hypotesu, konkrétně to, že: (i) konstrukty, které umožňují přenesení ORF224 nebo neupravených ATP6 • · ·· · ··· • · • · · · polypeptidů do mitochondrií mohou způsobovat sterilitu rostlin se samčí fertilitou a proto mohou být použity jako syntetické geny pro udržení sterility; a (ii) konstrukty, které umožňují přenesení upraveného ATP6 polypeptidů do mitochondrií mohou sloužit jako syntetické geny pro obnovení fertility. Data také ukazují, že pro vyloučení negativního působení na vegetativní růst a samičí fertilitu je nutné exprimovat tyto konstrukty za použití tkáňově specifického nebo indukovatelného promotoru. Analýza Rl potomstva RO rostliny (rostliny získané transformačním - regeneračním protokolem) C4-ORF exprimující rostliny 40-8 (viz výše) přinesla důkaz, že pozorované fenotypy jsou dědičné a způsobené transgenem. Vypěstovali jsme 20 takových dospělých rostlin. Různost fenotypů květů byla jasná, od extrémních abnormalit rodičovské rostliny, kde byly vytvořeny pouze dva velmi sterilní prašníky a zbývající čtyři prašníky byly přeměněny na orgány podobné pestíku, do částečné samčí fertility pozorované u mnoha RO rostlin exprimujících tento konstrukt. Všechny rostliny v Rl potomstvu obsahovaly transgen, což ukazuje na to, že původní 40-8 RO rostlina může obsahovat více než jednu kopii genu. Tato skutečnost dále naznačuje, že stupeň vyjádřené sterility závisí na dávce genu. Tento efekt dávky genu je dalším prostředkem pro modifikaci stupně sterility exprimované transgennímí rostlinami.Observations of similar types of sterility modification in many independently transformed plants strongly support our initial hypothesis, namely that: (i) constructs that allow the transfer of ORF224 or untreated ATP6 polypeptides to mitochondria can cause sterility of male fertile plants and therefore can be used as synthetic genes to maintain sterility; and (ii) constructs that allow the transfer of engineered ATP6 polypeptides to mitochondria can serve as synthetic genes to restore fertility. The data also show that to avoid negative effects on vegetative growth and female fertility, it is necessary to express these constructs using a tissue specific or inducible promoter. Analysis of the R1 progeny of the RO plant (plants obtained by the transformation-regeneration protocol) of the C4-ORF expressing plants 40-8 (see above) yielded evidence that the phenotypes observed were hereditary and caused by the transgene. We have grown 20 such adult plants. The variety of flower phenotypes was clear, from the extreme abnormalities of the parent plant, where only two very sterile anthers were formed and the remaining four anthers were converted to pistil-like organs, to the partial male fertility observed in many RO plants expressing this construct. All plants in the R1 offspring contained a transgene, indicating that the original 40-8 RO plant may contain more than one copy of the gene. This further suggests that the degree of sterility expressed depends on the dose of the gene. This gene dose effect is another means of modifying the degree of sterility expressed by transgenic plants.

Naše pokusy představují první případ, ve kterém byla samčí sterilita indukována přenosem produktů mitochondriálních ORF (orf224 aVafpS) v homologní hostitelské rostlině a poprvé byly pro tento účel použity geny Brassica. Naše výsledky také silně naznačují, že exprese A9-A6e konstruktu řízená AP3 může sloužit jako gen pro obnovení fertility pro pol CMS. Toto je první případ, který je nám znám, kdy byla přirozená forma CMS potlačena syntetickým genovým konstruktem.Our experiments represent the first case in which male sterility was induced by the transfer of mitochondrial ORF products (orf224 and VafpS) in a homologous host plant and for the first time Brassica genes were used for this purpose. Our results also strongly suggest that expression of the A9-A6e construct driven by AP3 can serve as a gene for restoring fertility for pol CMS. This is the first case we know when the natural form of CMS was suppressed by a synthetic gene construct.

• · » · · 4 » · · « ·· · · · «• · »· 4 · · · · · · · ·«

Naše výsledky jsou v souladu s pokusy provedenými jinými výzkumníky, kteří zjistili, že exprese/přenesení proteinových produktů fazolových ORF spojených s CMS (He, S. et al., 1996, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93: 11763-11768) nebo neupraveného ATP9 genu pšenice (Hernould, M. et al. 1993, Proč. Nati.Our results are consistent with experiments conducted by other researchers who have found that expression / transfer of CMS-associated bean ORF protein products (He, S. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11763-11768 ) or unmodified ATP9 gene of wheat (Hernould, M. et al. 1993, Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 90: 2370-2374) v heterologní akceptorové rostlině, tabáku, může indukovat samčí sterilitu. Zajímavé je, že podobné pokusy s ORF spojenými s CMS z kukuřice a petúnie selhaly v získání rostlin se samčí sterilitou (Chaumont, F. et al., (1995), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92: 1167-1171; Wintz, H. et al., 1995, Plant. Mol. Biol. 28: 8392). Frekvence, se kterou jsme získali rostliny se samčí sterilitou byla vyšší než frekvence pozorovaná pro ORF fazole a bylo obtížné provést srovnání s výsledky získanými za použití ATP9 genu pšenice.Acad. Sci. USA 90: 2370-2374) in a heterologous acceptor plant, tobacco, can induce male sterility. Interestingly, similar experiments with ORFs associated with corn and petunia CMS failed to obtain male sterile plants (Chaumont, F. et al., (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1167-1171; Wintz, H. et al., 1995, Plant Mol Biol 28: 8392). The frequency with which we obtained male sterile plants was higher than that observed for ORF beans and it was difficult to compare with the results obtained using the ATP9 wheat gene.

Předkládaný vynález bude dále popsán za pomoci následujících příkladů, které pouze ilustrují vynález a nijak neomezují jeho rozsah.The present invention will be further described with reference to the following examples, which are intended to illustrate the invention and not to limit its scope.

Příklady provedení vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Příklad 1: Použití AP3/A9-A6e konstruktu jako dominantního genu pro obnovení fertility u B. napusExample 1: Use of the AP3 / A9-A6e construct as a dominant gene for restoring fertility in B. napus

V tomto příkladu, uvedeném na obr. 4, je A9/A6e konstrukt vložen genetickou transformací do genomu variety jako je například Westar, která je normálně sterilizována (pol) cytoplasmou. Gen je vložen do linie s pol cytoplasmou a očekává se, že výsledné získané transgenní rostliny budou mít částečnou samčí fertilitu. Tato linie je potom samooplozena za zisku linie obnovující částečnou samčí fertilitu, která je homozygotní pro A9/A6e transgen. Tato linie může být potom • · · · • · · · ··« ·»· • · · · · ·In this example, shown in Figure 4, the A9 / A6e construct is inserted by genetic transformation into a genome of a variety such as Westar, which is normally sterilized by (pol) cytoplasm. The gene is inserted into a line with a pol cytoplasm and it is expected that the resulting transgenic plants obtained will have partial male fertility. This line is then self-fertilized to yield a partial male fertility restoring line that is homozygous for the A9 / A6e transgene. This line can then be

křížena s různými pol CMS liniemi za vzniku Fl hybridů s obnovenou fertilitou.crossed with different pol CMS lines to produce Fl hybrids with restored fertility.

Příklad 2: Použití AP3/C4-ORF konstruktu pro posílení pol cytoplasmatické samčí sterility B. napusExample 2: Use of the AP3 / C4-ORF construct to enhance the half cytoplasmic male sterility of B. napus

Sterilita indukovaná pol cytoplasmou ve většině genotypů B. napus je nekompletní, zejména při vyšších teplotách. Tato zbytková produkce pylu vede k různému stupni samooplození v CMS linii při produkci hybridních semen. Rostliny vzešlé z takových semen nejsou hybridní a mají omezenou schopnost tvorby semen. Tyto faktory dohromady mohou významně redukovat výnos z „hybridní sadby. V tomto příkladu, uvedeném na obr. 5, jsou dominantní rysy C4-ORF způsobující sterilitu použity pro redukci nebo eliminaci zbytkové produkce pylu v CMS linii a tak pro zvýšení procenta získaných hybridních semen a proto ke zvýšení výnosu z hybridní sadby. C4-ORF konstrukt je vložen genetickou transformací do Westar linie s plnou samčí fertilitou (nap) za zisku linie s částečnou samčí fertilitou, která obsahuje C4-ORF transgen. Tato linie je potom samooplozena za zisku udržovací linie s částečnou samčí fertilitou a je také křížena s netransformovanou linií stejného jaderného genotypu, ale s pol cytoplasmou, za zisku kompletně sterilní pol CMS linie, která je heterozygotní pro C4-ORF.The sterility induced by the pol cytoplasm in most B. napus genotypes is incomplete, especially at higher temperatures. This residual pollen production results in varying degrees of self-fertilization in the CMS line in hybrid seed production. Plants resulting from such seeds are not hybrid and have a limited ability to form seeds. Taken together, these factors can significantly reduce the yield of “hybrid seedlings. In this example, shown in Figure 5, the dominant sterility-inducing C4-ORF features are used to reduce or eliminate residual pollen production in the CMS line and thus to increase the percentage of hybrid seeds obtained and therefore to increase the yield of hybrid seed. The C4-ORF construct is inserted by genetic transformation into the Westar full male fertility (nap) line to obtain a partial male fertility line that contains the C4-ORF transgene. This line is then self-fertilized to yield a partial male fertility maintenance line and is also crossed with a untransformed line of the same nuclear genotype but with a pol cytoplasm, to yield a completely sterile pol CMS line that is heterozygous for C4-ORF.

Tato linie je zpětně křížena s C4-0RF udržovací linii s částečnou samčí fertilitou, za zisku pol CMS linie s kompletní samčí sterilitou, která je homozygotní pro C4-ORF. Při křížení této CMS linie s pol linií pro obnovení fertility vznikne fertilní Fl hybrid. Kompletně sterilní pol CMS linie se propaguje křížením, jako samičí linie, s C4-ORF transgenní udržovací linií s nap cytoplasmou s částečnou samčí fertilitou.This line is back-crossed with the C4-0RF partial male fertility maintenance line, yielding a full male sterile pol CMS line that is homozygous for C4-ORF. Crossing this CMS line with the fertility restoration half-line produces a fertile F1 hybrid. The completely sterile pol CMS line is propagated by crossing, as a female line, with a C4-ORF transgenic maintenance line with a nap cytoplasm with partial male fertility.

• · · · • · · · · · ·• · · · · · · · · · · · ·

Ačkoliv jsme popsali způsob pro posílení sterility pol CMS rostlin využívající AP3/C4-ORF konstrukt, mohou být pro tento účel vybrány také konstrukty AP3/A9-A6a a AP3/A9-A6ep, protože exprese všech těchto konstruktů vede k zisku pol CMS transgenních rostlin s kompletní samčí sterilitou.Although we have described a method for enhancing the sterility of pol CMS plants using the AP3 / C4-ORF construct, the AP3 / A9-A6a and AP3 / A9-A6ep constructs may also be selected for this purpose, since expression of all of these constructs results in pol CMS transgenic plants with complete male sterility.

Je třeba si uvědomit, že ačkoliv byl vynález popsán v specifických provedeních, existují další variace těchto provedení a tento vynález zahrnuje jakékoliv varianty, použití nebo adaptace vynálezu využívající obecných principů vynálezu, včetně takových odchylek od předkládaného vynálezu, které jsou známé nebo běžné v oboru, kterého se vynález týká a které mohou být použity ve spojení se základními popsanými rysy vynálezu a které spadají do rozsahu připojených patentových nároků.It will be appreciated that although the invention has been described in specific embodiments, there are other variations of these embodiments and the invention encompasses any variations, uses or adaptations of the invention utilizing the general principles of the invention, including such departures from the present invention as are known or conventional in the art. to which the invention relates and which may be used in connection with the basic features of the invention described and which fall within the scope of the appended claims.

Claims

PATENT CLAIMS (changed)

CLAIMS 1. A method for enhancing natural pol-induced cytoplasmic male sterility in plants comprising the steps of:

a) introducing into the nucleus of the plant cell a gene construct consisting essentially of a sequence encoding a mitochondrial transit peptide fused before and in frame with at least one of the gene selected from the unmodified form of the atp6 gene and the orf224 mitochondrial gene of Brassica napus;

b) selecting plant cells that have received the gene construct in step a); and

c) inducing regeneration of the selected plant cells to produce a mature plant.

The method according to claim 1, wherein the plant is Brassica napus.

The method of claim 1, wherein step (a) is performed using a plant transformation vector.

4. A method for restoring male fertility in plants with induced cytoplasmic male sterility, comprising the steps of:

a) insertion of a gene construct consisting essentially of a sequence encoding a mitochondrial transit peptide fused before and in frame with a modified form of a normal mitochondrial gene that is transcribed simultaneously with

An unusual mitochondrial gene associated with CMS, into the plant cell nucleus;

b) selecting plant cells that have received the gene construct in step a); and

c) inducing regeneration of the selected plant cells to produce a mature plant.

5. The method of claim 6 wherein the plant is Brassica napus.

The method of claim 4, wherein step (a) is performed using a plant transformation vector.

A method for restoring male fertility in B. napus with polimacytoplasmic male sterility, comprising the steps of:

a) introducing into the nucleus of the plant cell a gene construct consisting essentially of a sequence encoding a mitochondrial transit peptide fused before and in frame with an edited form of the B. napus mitochondrial gene;

b) selecting plant cells that have received the gene construct in step a); and

c) inducing regeneration of the selected plant cells to produce a mature plant.