CZ392497A3 - Buněčná linie produkující sloučeniny s analgetickým účinkem pro léčení bolesti - Google Patents

Description

Buněčná linie produkující sloučeniny s analgetickým účinkem pro léčení bolesti

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká buněčné linie pouzitezne k léčení bolesti. Konkrétněji, buněčná linie podle tohotovynálezu byla upravena metodami genového inženýrství tak, aby produkovala alespoň jednu analgetickou sloučeninu každého druhu ze skupiny endorfinů, enkefalinů a katecholaminů.

Dosavadní stav techniky

Bolest je obecným příznakem nemoci. Povrchové vrstvy zadního rohu míšního, kde končí primární aferentní vlákna nesoucí nociceptivní (reagující na bolestivý podnět) informaci, obsahuje enkefalinergní interneurony a vysokou hustotu opioidních receptorů. Navíc je v povrchových vrstvách míšních vysoká koncentrace noradrenergních vláken.

Akutní bolest vzniká jako odpověď na akutní škodlivé stimuly. Chronická bolest je převážně způsobena neuropatiemi centrálního nebo periferního původu. Tato neuropatická bolest je výsledkem narušeného somatosensorického procesu, který může mít za následek zvýšenou citlivost na bolestivé podněty (hyperalgezii) a bolest spojenou s podnětem, který obvykle bolest nevyvolává (allodynie).

Intratekálni injekce morfinu do subarachnoidálního prostoru míšního vede k silné analgezii (snížená citlivost k bolesti). K analgezii rovněž vede intratekálni podání norepinefřinu nebo noradrenergních agonistů. Viz např. Sagen a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 83, 7522 - 26 (1986).

Společné podání více opiátů v cávkácn nizsrcn ne účinných, např. enkefalinů a katecholaminů, jako je norepinefrin, může pro navození analgezie účinkovat synergicky. Viz výše. Chromafinni buňky ve tvoří a uvolňují řadu neuroaktivnich látek epinefrinu, met-enkefalinu, vazoaktivního intestinálního peptidu, dřeni nadledvin vcetne norepinefrinu, neuropeptidu Y, somatostatinu, příbuzného kalcitoninu. Viz Sagen a kol., Sci. USA, 83, 7522 - 26 (1986) a Sagen a aJ. .

Neurochem., 56, 623-27 (1991).

Jelikož chromafinni buňky tvoří jak tak i katecholaminy, jeden z možných přístupů, nociceptivní odpověď nebo citlivost na bolest, pomocí transplantace tkáně dřeně nadledvin či adrenálních chromafinních buněk přímo do oblasti CNS modulující bolest, za účelem navození analgezie. Viz Sagen a kol., Brain Research, 384, 189-94, (1986), Vaquero a kol., jak sníží byl to izolovaný:

Neuroreport, 2,

523,

Research,

Brain také prováděny pokusy, ve kterých měla být navozena pomocí jak alogenních tak xenogenních

Tkáň pro aloštěp snadno přístupná,

Kromě toho

Bylý analgezie transplantátů chromafinni tkáně nebo buněk, je dostupná jen v omezeném množství a není zejména pro programy léčení lidské bolesti, alogenní lidská tkáň s sebou nese riziko patogenní kontaminace. Viz Hama a Sagen, Brain Research, 651, 183-93 (1994).

Xenogenni dárci mohou poskytnout velké množství materiálu, který může být snadno získán. Z tohoto důvodu se

používá tkáň hovinních (novězích) nadledvzn. Viz Hama a

Sagen, Brala Research, 651, 183-93 (1994).

Avšak při transplantacích mezi neslučitelnými biologickými druhy jsou podstatným problémem možné vážné důsledky pro hostitele, jakož i konečné odvržení štěpu. Vzhledem k přítomnosti silně antigennich buněk v xenoštěpu, zejména endoteliálních, může dojit k uoinému odvržení štěpu celé nebo rozdělené tkáně dokonce i v CNS, který je z imunologického hlediska považován za privilegovaný. Navíc musí být dárcovská tkáň pečlivě vyšetřena, aby se zabránilo zanesení virové kontaminace nebo jiných patogenů do organismu hostitele. Aby se předešlo odvržení štěpu, je potřebná imunosucrese, při které se typicky používá cyklosporin A.

Užitím takových transplantátů bylo podle publikovaných výsledků dosaženo určitého snížení citlivosti na bolest, zejména při málo intenzivní chronické bolesti. Významného rozdílu mezi kontrolou a transplantovaným zvířetem se ve většině publikovaných zpráv dosáhlo až po podání nikotinu, který stimuloval tvorbu opioidnich peptidů. Avšak existuje několik zpráv o tom, že u krysího modelu chronické bolesti bylo dosaženo analgezie aloštěpy chromafinní tkáně s bazální úrovní aktivity. Viz Vaquero a kol., Neuroreport, 2, 149-51 (1991), Hama a Sagen, Brain Research, 651, 183-93 (1994).

Chromafinní buňky bovinních nadledvin byly opouzdřeny a vytvořily tak biologický umělý orgán („BAO) pro implantaci krysám k léčbě akutní a chronické bolesti. Viz např. Sagen a kol., J. Neurosci., 13, 2415-23 (1993) a Hama a kol., 7th World Congress Pain, Abstract 982, Paříž, Francie (1993). První pokusy používající opouzdřené bovinní buňky byly provedeny na lidech. Viz Aebischer a kol., Transplantation, 58, 1275-77. (1994) .

·· ···· · ·· ·· ···· ··· · · · · ·· · ····· · · ·· ·

I» ······ ····· • · · · · · · ·· ··· ··· ···· ·· ·

Byly také provedeny pokusy navodit sníženou reakci na bolestivé podněty použitím jiných buněk, např. buněk AtT-20. Buňky AtT-20 původně pocházejí z tumoru myšího předního laloku hypofýzy. Tyto buňky syntetizují a secernují βendorfin. Viz např., Wu a kol., J. Neural. Transpl. & Plasticity, 5, 15-26 (1993). Buňky AtT-20/hENK jsou buňky AtT-20, které byly upraveny metodami genového inženýrství tak, že nesou celý gen lidského proenkefalinu A (tj.

obsahující 6 sekvencí met-enkefalinu a jednu sekvenci leuenkefalinu) s 200 bázemi z 5'-okrajové sekvence a 2,66 kilobázemi ze 3'-okrajové sekvence. Viz Wu a kol., výše, Comb a kol., EMBO J., 4, 3115-22 (1985).

Wu a kol., J. Neural. Transpl. & Plasticity, 5, 15-26 (1993) uvádějí krysí hostitele, kterým byly transplantovány buňky AtT-20 nebo AtT-20/hENK. Néstimulované buňky AtT20/hENK byly účinnější při navození snížené reakce na bolestivé podněty (test škubnutí ocasem), než implantáty buněk AtT-20. Naopak stimulace izoproterenolem byla účinnější s buňkami AtT-20 než s buňkami AtT-20/hENK. Výše.

U myšího hostitele implantáty buněk AtT-20 nebo AtT20/hENK neovlivňovaly základní odpověď na tepelné nociceptivní podněty. U myší, které obdržely implantáty AtT20, se vyvinula tolerance na β-endorfin a agonistu μ-opioidu (DAMGO). U myší, které obdržely implantáty AtT-20/hENK, se vyvinula tolerance na agonistu δ-opioidu (DPDPE). Jako odpověď na opakované dávky agonisty μ-opioidu se u myší, které dostávaly implantáty buněk AtT-20/hENK, vyvinula menší tolerance ve srovnání s myšmi, které dostávaly buňky AtT-20, nebo s kontrolními zvířaty.

Antinociceptivní účinek izoproterenolu byl tentýž jak u myši, které dostávaly buněčné implantáty AtT-20, tak u myší s AtT-20/hENK. Viz Wu a kol., J. Neuroscience, 14, 4806-14, (1994). Wu a kol. se domnívali, že jednou z přičiň chybějící přídatné snížené reakce na bolestivé podněty u myší s transplantovanými buňkami AtT-20/hENK produkujícími enkefalin může být nedostatek citlivosti behavioráiních testů. Další možné zdůvodnění bylo, že známý antagonistický účinek met-enkefalinu na morfinem navozenou sníženou reakci na bolestivé podněty vykompenzoval potencující účinek samotného leu-enkefalinu, obzvláště vzhledem k tomu, že v pro-enkefalinu A je 6 sekvencí met-enkefalinu na každou sekvenci leu-enkefalinu.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje buněčnou linii, která byla upravena metodami genetického inženýrství tak, že tvoří alespoň jednu analgetickou sloučeninu každého druhu ze skupin endorfinů, enkefalinů a katecholaminů. Buněčná linie může být použita v léčení bolesti.

Použití buněčné linie je výhodnější než použití primárních buněk. Aby se zajistila bezpečnostní a prováděcí kritéria pro použití buněk, musí být jednotlivé izoláty primárních buněk draze a časově náročně testovány. Buněčná banka vyžaduje menší testování. Není třeba izolovat primární buňky. Produkce požadovaných analgetik může být stabilnější, protože výkonnost primárních buněk může záviset na věku, pohlaví, zdraví nebo stavu hormonů dárcovského zvířete. Je také možné dosáhnout vyšší tvorbu požadovaných produktů, a také zavést do buněčné linie specificky modifikované peptidy. Toto umožňuje dodávání několika rozmanitých analgetik současně. Exprese jednoho nebo více analgetik může

být regulována {za použiti reguiovatelneno promotoru k řízení exprese). Navíc může být pro bezpečnost do bunecne linie inkorporován „sebevražedný gen. Dále pro účel opouzdření mají proliferující buňky tu výnodu, ze se děli, a tak nahrazují umírající nebo mrtvé buňky.

Abv bvl tento vynález Plně srozumitelný, následuje detailní popis.

Molekulami rekombinantní DNA tohoto vynálezu může být transformována jakákoliv vhodná buněčná linie. Mezi buňkami přicházejícími do úvahy jsou chromafinní buňky, včetně chromafinních buněk podmíněně nesmrtelných, jako jsou buňky popsané ve WO 96/02646, Neuro-2A, PC12, PC12a, SK-N-MC, AtT20 a buňky RIN včetně RINa a RINb. Výhodně má buňka endogenní konvertázy prchormonu a/nebo dopa-dekarboxylázy.

Buňky SK-N-MC, neuroepiteliomová buněčná linie, exprimují společně několik neuropeptidů, včetně enkefalinu, cholecystokininu a peptidů uvolňujícího gastrin. Viz Verbeeck a kol., J. Biol·. Chem., 265, 18087-090 (1990). V buňkách SK-N-MC byl exprimován gen proenkefalinu A. Viz např. Folkesson a kol., Mol. Brain Res., 3, 147-54 (1988). My dáváme přednost buňkám AtT-20 a RIN, nejvýhodněji buňkám RIN.

Buňky RIN jsou pankreatickou endokrinní buněčnou linií pocházející od laboratorního potkana. Viz např. Horellou a kol., J. Physiol., 85, 158-70 (1991). Je známo, že buňky RIN endogenně produkují GABA. a β-endorfin.

Některé vlastnosti různých buněk přicházejících do úvahy jsou ukázány v tabulce 1.

Tabulka 1

Buňky	Analgetické	látky	Další složky
Chromafinní	NE, met-enkefalin	TH, DDC, ΏβΗ, PC
PC12, PC12a	nízký NE, met-enkefalin	DDC, ΏβΗ, PC
AtT-20	β-endorfin		DDC, PC
RINa	β-endorfin,	GABA	DDC, PC
RINb	β-endorfin		DDC, PC
Neuro2A			DDC, ΏβΗ, PC

ΤΗ = tyrosínhydrcxyláza konvertuje tyrosin - 1-dopa

DDC — dopami ndekarboxyláza konvertuje 1-dopa - dopamin (DA)

ΏβΗ = dopaminP-hydroxyláza konvertuje DA - norepinefrin (NE) PC = konvertázy prohormonu zpracovávající POMC na β-endorfin a Pro-enkealin A (ProA) na met-enkefalin

AtT-20 = kortikotropní buněčná linie myší hypofýzy, která endogenně secernuje β-endorfin cestou exprese Proopiomelanokortinu (POMC)

RIN = inzulinom laboratorního potkana

Neuro2A = myší neuroblastom

Primární dodávané produkty zahrnují alespoň jeden každý endorfin, enkefalin a katecholamin.

Enkefaliny a endorfíny jsou endogenní opioidní peptidy u lidí. Tyto opioidní peptidy zahrnují přibližně 15 sloučenin v rozmezí od 5 do 31 aminokyselin. Tyto sloučeniny se váží na a alespoň částečně působí přes stejný opioidní receptor μ jako morfin, ale nejsou morfinu chemicky příbuzné. Navíc tyto sloučeniny stimulují další opioidní receptory. Yaksh a Malmberg, Textbook of Pain, 3rd Ed. (Eds.

P. Wall a R. Melzack), „Centrál Pharmacology of Nociceptive

Transmission, 165-200, 1994 (New York).

Opioidní peptidy mají společné chemické vlastnosti, ale jsou syntetizovány odlišnými cestami.

β-endorfin, nejhojněji se vyskytující endorfin, je syntetizován jako část velké prekurzorové molekuly, proopiomelanokortinu („POMC). Molekula POMC obsahuje celou sekvenci adrenokortikotropního hormonu („ACTH), amelanocyty stimulujícího hormonu („a-MSH), β-MSH a βlipotropinu. Prekurzorová molekula POMC má potenciál vytvářet také další endorfiny, včetně α-endorfinu a gammaendorfinu. Zpracováni prekurzorů POMC je v různých tkáních odlišné podle lokalizace štěpících enzymů, jako jsou konvertázv prohormonu, v těchto tkáních.

V hypofýze je POMC štěpen za vzniku ACTH a β-endorfinu a ACTH již není dále zpracováván. Naopak v hypothalamu je ACTH přeměněn na β-MSH. Zatímco odlišné buněčné typy mohou syntetizovat tentýž primární genový produkt, konečný profil hormonální sekrece se široce liší.

Tento vynález počítá s použitím sekvence DNA, která kóduje jakýkoliv vhodný endorfin s analgetickou aktivitou. Kromě toho se počítá s analogy nebo fragmenty těchto endorfinů, které mají analgetickou aktivitu. Tak endorfin, který má být tvořen buňkami tohoto vynálezu je charakterizován inzercemi, delecemi, substitucemi a modifikacemi aminokyselin v jednom nebo více místech přirozeně se vyskytující aminokyselinové sekvence požadovaného endorfinů. Dáváme přednost konzervativním

• · ♦ • ··· • ·* modifikacím a substitucím (~j.

takovým, které maj í minimální účinek na sekundární nebo terciární strukturu endorfinu a na jeho analgetické vlastnosti). Takové konzervativní substituce zahrnují ty, které jsou popsané Dayhoffem v Atlas of Protein Sequence and Structure, 5, (1987) a Argosem, Embo

J., 3, 779-85 (1989) .

Techniky pro tvoření takových variant přirozeně se vyskytujících endorfinu jsou dobře známy. Například kcdony v sekvenci DNA kódující divoký typ endorfinu mohou být změněny cílenou mutagenezi („site specific mutagenesis).

Tento vynález počítá s použitím sekvence DNA kódující celou prekurzorovou molekulu POMC. Toto provedení využívá štěpící enzymy hostitelské buňky (tj. prohormonkonvertázy 2) pro tvorbu řady endorfinu, z nichž mají některé nebo všechny analgetické vlastnosti.

Tento vynález také počítá s použitím fragmentů DNA. genu POMC, které kódují konkrétní požadovaný endorfin.

DNA a sekvence aminokyselin POMC jsou dobře známy. Cochet a kol., Nátuře, 297, 335-9 (1982), Takahashi a kol., Nucl. Acids Res., 11, 6847-58 (1983).

Dáváme přednost sekvenci DNA kódující POMC, ve které byla odstraněna oblast kódující ACTH. Preferovaný endorfin kódovaný tímto konstruktem je β-endorfin.

Některé proenkefaliny jsou syntetizovány v adrenálních žlázách jako část velkého proteinu, pro-enkefalinu A, který obsahuje šest repetic sekvence Met-enkefalinu a jednu strukturu Leu-enkefalinu. Met-enkefalin, a také Metenkefalin-Arg-Phe a Met-enkefalin-Arg-Gly-Leu, významně aktivně snižují reakci na bolestivé podněty. Viz Sagen a kol. Brain Res., 502, 1-10 (1989).

Další enkefaliny, tj. dynorfiny a neo-endorfiny, .pocházejí z odlišné molekuly, proenkefalinu B. Ve struktuře

těchto orekurzorových proteinů jsou kódovány také další „latentní peptidy a mohou být uvolněny štěpením „prohormonového typu. Viz napr. Harrison „Principles of Interna! Medicíně, 12th edition, 1168-69 /1991).

Tenoo vynález počítá s použitím sekvence DNA, která kóduje jakýkoliv vhodný enkefalin s analgetickou aktivitou. Kromě toho se také počítá s analogy a aktivními fragmenty, které mají analgetické vlastnosti. Takové analogy nebo fragmenty tedy mají inzerce, delece, substituce aminokyselin v jednom nebo více místech přirozeně se vyskytující aminokyselinové sekvence. Takové varianty vznikají jak popsáno výše.

Tento vynález počítá s použitím sekvence DNA kódující požadovaný enkefalin ve své „zralé formě. Kromě toho tento vynález počítá s použitím sekvence DNA kódující celý prekurzor pro-enkefalinu A nebo celý prekurzor proenkefalínu B. Dále počítáme také s použitím DNA kódující fúzi nebo fragment těchto sekvencí, které při expresi poskytují jednu nebo více molekul podobných enkefalinu, které mají analgetické vlastnosti.

Dáváme přednost sekvenci DNA kódující celou prekurzorovou molekulu pro-enkefalinu A. DNA a sekvence aminokyselin pro-enkefalinu A jsou dobře známy. Folkesson, viz výše. Toto provedení využívá štěpící enzymy hostitelské buňky, jako je konvertáza prohormonu, aby se vytvořila řada enkefalinů, z nichž některé nebo všechny mají analgetické vlastnosti. Preferovaný enkefalin kódovaný tímto konstruktem je Met-enkefalin.

Existují tři přirozeně se vyskytující katecholaminy, které působí jako neurotransmitery v centrálním nervovém systému, norepinefrin (NE), epinefrin (E) a dopamin. NE je • ·

spojen s postgangliovými zakončeními sympatických nervů. NE účinkuje lokálně v bezprostředním okolí svého uvolnění.

Katecholaminy jsou syntetizovány z aminokyseliny tyrosinu, která je postupně hydroxylována za tvorby dihydroxyfenylalaninu (dopa), dekarboxylována za tvorby dopaminu a poté hydroxylována v beta pozici postranního řetězce dopaminbetahydroxylázou za tvorby NE. Harrison, viz výše, s. 380. NE je metylován na N konci na epinefrin (E) fenyletanolamin-N-metyltransferázou (PNMT).

Hydroxylace tyrosinu tyrosinhydroxylázou (TH) je krok limitující rychlost syntézy NE. Regulace syntézy dopa a NE ve dřeni nadledvin může být dosaženo změnami množství a aktivity TH.

Kromě toho může regulace syntézy E z NE nastat při změnách množství a aktivity fenyletanolamin-Nmetyltransferázy (PNMT). PNMT je indukovatelná glukokortikoidy z kůry nadledvin. Viz výše.

Katecholaminy jsou v chromafinní tkáni dřeně nadledvin udržovány ve vysoké koncentraci, většinou jako E. V adrenální žláze jsou také skladovány opioidní peptidy.

NE a E mají podobnou afinitu k a₂ receptorům, a proto oba přispívají potenciálně k analgezii. Bylund, FASEB J., 6, 832-39 (1992). Enkefalinové peptidy, což zahrnuje převážně met-enkefalin, selektivně aktivují delta (δ) opioidní receptory. Reisine a Bell, Trends Neurosci., 16, 506-10 (1993). Aktivace obou a₂ adrenergních a δ opioidních receptorů v míše vede ke snížené reakci na bolestivý podnět a tato aktivace je potenciálně synergická. Yaksh a Malmberg, Progress in Pain Research and Management, díl 1, ed. Fields a Lisbeskind, IASP Press, Seattle, 141-71 (1994). Aktivace δ proti (μ) opioidním receptorům u experimentálních zvířat má • 000 ··· 0 · 0 · ·· · ····· · · · · · ·· · · · ······ 0 0 0 · · · 0 ·· ··· ······· ·· 0 za následek méně nepříznivých vedlejších účinků včetně zácpy a rizika závislosti (Lee a kol., J. Pharmacol. Exp. Ther., 267, 883-87 (1993). Kombinované podávání různých opioidergních a adrenergních přípravků může snížit rozsah tolerance, která se vyvíjí k jednomu přípravku, a vede k trvalé úlevě od bolesti. Yaksh a Reddy, Anesthesxol., 54, 451-67 (1981).

Tento vynález počítá s použitím sekvence DNA, která kóduje katecholaminové biosyntetické enzymy nebo jejich analogy či fragmenty, aby se získaly katecholaminy, které mají analgetické vlastnosti. Preferované katecholaminy tohoto vynálezu jsou NE a E.

V jednom provedení je hostitelská buňka transformována geny, které jsou nezbytné pro dosažení tvorby NE nebo Ξ, jak se vyžaduje. Výběr požadovaných heterologních genových sekvencí závisí na doplňku enzymů syntetizujících katecholaminy, které se normálně vyskytují v hostitelské buňce. Například buňky RIN a AtT-20 postrádají tyrosinhydroxylázu(TH) a dopaminbetahydroxylázu (DBH). Avšak buňky RIN a AtT-20 obsahují endogenní dopadekarboxylázu (DDC). Jestliže je požadovaný katecholamin E, pak je také vyžadován gen kódující PNMT. Gen kódující PNMT je znám. Baetge a kol·., Proč. Nati. Acad. Sci., 83, 5455-58 (1986).

Gen kódující TH je znám. Viz např. Patent Spojených Států

300 436, zahrnut zde v odkazech. Jsou také známy modifikované varianty TH. Patent Spojených Států 5 300 436. Kromě toho jsou také známy zkrácené verze TH, které obsahují nezbytné katalytické domény na C konci. Viz např. Daubner a kol., Protein Science, 2, 1452-60 (1993).

• · · ·

Buňky AtT-20 byly transformovány divokým typem TH, a také různými mutanty TH. Viz např. Wu a kol·., J. Biol.

Chem., 267, 25754-758 (1992).

Je také dobře známa sekvence genu DBH. Viz např.

Lamoroux a kol., EMBO J., 6, 3931-37 (1987).

Je nutné si uvědomit, že kromě preferovaných sekvenci DNA zde popsaných je mnoho degenerovaných sekvenci DNA, které kódují požadovaná analgetika.

Buňkami tohoto vynálezu mohou být také tvořeny sekundární sloučeniny s potenciálním anaígetickým účinkem. Takové sloučeniny zahrnují galanin a somatostatin. Kromě toho může být transformovanými buňkami tohoto· vynálezu produkován neuropeptid Y, neurotenzin a cholecystokinin. Buňky podle tohoto vynálezu mohou některé nebo všechny tyto sloučeniny tvořit normálně, nebo mohou být geneticky manipulovány standardními technikami tak, aby je tvořily.

Pro získání nebo syntézu genů kódujících analgetické sloučeniny, které mají být produkovány buňkami tohoto vynálezu, mohou být použity standardní metody.

Například kompletní aminokyselinová sekvence může být použita ke konstrukci genu, jehož sekvence je zpětně přeložena ze sekvence aminokyselin. Může být syntetizován oligomer DNA obsahující nukleotidovou sekvenci kódující požadovanou analgetickou sloučeninu. Například může být syntetizováno několik malých oligonukleotidů kódujících části každého požadovaného polypeptidu, které jsou poté ligovány (spojeny). Pro sestavení obsahují jednotlivé oligonukleotidy typicky přesahy na 5' nebo 3' konci.

Sekvence DNA kódující každou požadovanou analgetickou sloučeninu může nebo nemusí také obsahovat sekvence DNA kódující signální sekvenci. Taková signální sekvence, je-li přítomná, by měla být rozpoznávána buňkou vybranou pro ·· ···· «* ·· ·· ···· ··· ···· · · · ····· · · · · · • · · · · ······ • · · · · · · ·· ··· ··· ···· ·· · excresi analgetické sloučeniny. Může být prokaryotická, eukarvotická nebo kombinace obou. Může to také být signální sekvence přirozeně se vyskytující sloučeniny. Obecně je výhodné, když je signální sekvence kódovaná a nejvýhodnější je použití signální sekvence přirozeně se vyskytující.

Jakmile jsou sekvence DMA kódující požadovanou sloučeninu sestaveny, jsou vloženy do jednoho nebo více excresních vektorů a funkčně spojeny s vhodnými sekvencemi řídícími expresi v požadované transformované buňce.

Správné sestavení může být potvrzeno sekvencovánim nukleotidů, restrikčním mapováním a expresí biologicky aktivního polypeptidu v transformované buňce. Jak je v oboru dobře známo, aby se získala vysoká hladina exprese transferovaného genu v hostiteli, gen musí být funkčně spojen s transkripčnimi a translačními sekvencemi řídicími expresi, které jsou funkční ve vybrané expresní buňce.

Výběr sekvence řídící expresi a expresního vektoru závisí na výběru buňky. Může být použita celá řada kombinací expresní hostitel/vektor. Použitelné expresní vektory pro eukaryotické hostitele například zahrnují vektory obsahující sekvence řídící expresi ze SV40, bovinního papilomaviru, adenoviru a cytomegaloviru.

Dáváme přednost pcDNA3, pCEP4, pZeoSV (InVitrogen, San Diego) a pNUT.

V těchto vektorech může být použita jakákoliv z celé řady sekvencí řídicích expresi. Takové použitelné sekvence řídící expresi zahrnují sekvence spojené se strukturálními geny uvedených expresních vektorů. Příklady použitelných sekvencí řídících expresi například zahrnují časné a pozdní promotory SV40 nebo adenoviru, promotor 3-fosfoglycerát kinázy nebo jiných glykolytických enzymů, promotory kyselé fosfatázy, např. Pho5, promotory kvasinkového α-konjugačního systému a další sekvence, o kterých je známo, že řídí expresi genů eukaryotických buněk nebo jejich virů a jejích různé kombinace.

Samozřejmé se rozumí, že ne všechny vektory a sekvence řídící expresi fungují stejně dobře pro expresi sekvencí DNA zde popsaných. Ani že všechny buňky fungují stejně dobře se stejným expresním systémem. Avšak odborník může provést selekci mezi těmito vektory, sekvencemi řídícími expresi a buňkami bez nadbytečného experimentování. Například při výběru vektoru se musí uvažovat o hostitelské buňce, protože vektor se v ní musí množit. Také se musí brát ohled na počet kopii vektoru, schopnost tento počet řídit a na expresi jakýchkoliv dalších proteinů kódovaných vektorem, jako· jsou antibiotické značky.

Při výběru sekvence řídící expresi se musí uvažovat také o celé řadě faktorů. Tyto zahrnují například relativní sílu sekvence, její regulovatelnost a kompatibilitu s aktuální sekvencí DNA kódující požadované analgetické sloučeniny, konkrétně co se týká potenciálních sekundárních struktur. Hostitelské buňky by měly být vybírány s ohledem na jejich kompatibilitu s vybraným vektorem, toxicitu produktu kódovaného sekvencemi DNA, jejich sekreční vlastnosti, jejich schopnost správně skládat polypeptidy a jejich požadavky na kultivaci. Jestliže má být hostitelská buňka opouzdřena, měla by být vzata do úvahy také životaschopnost buňky při opouzdření a implantaci do příj emce.

V rámci těchto parametrů může odborník vybrat různé kombinace vektor/sekvence řídící expresi/hostitel, které budou exprimovat požadované sekvence DNA v tkáňové kultuře.

• 9	····	• · ·	·· 9999
•	9	9	99 9 ·	• · 9
•	•	99·	9 ·	9 9 9
•	•	9 9	9 9	• 99 9 9
• 99	•	9 999	• 9 9*9 9999	9 9 99 9

V jednom provedení jsou buňky (např. buňky RIN) postupně transformovány 4 samostatnými expresními vektory obsahujícími gen POMC, gen pro-enkefalinu A, gen Tri a gen DBH. V takové transformované hostitelské buňce je obtížnější dosáhnout amplifikaci počtu kopií heterologních genů. Takže se preferuje použití méně expresních vektorů. Nejvýhodnější je použití jednoho expresního vektoru obsahujícího všechny 4 heterologní geny.

V konkrétním provedení jsou buňky RIN postupně transformovány 3 expresními vektory. První vektor obsahuje gen POMC funkčně spojený s promotorem CMV. Výhodně je použita zkrácená verze genu POMC, která má odstraněnou kódující oblast pro ACTH. Druhý vektor obsahuje gen proenkefalinu A funkčně spojený s promotorem CMV. Konstrukt proA výhodně obsahuje souhlasnou Kozákovu sekvenci umístěnou bezprostředně v protisměru od počátečního (iniciačního) kodonu. Třetí vektor obsahuje oba geny TH (výhodně zkrácený a mající Kozákovu souhlasnou sekvenci v protisměru od počátečního kodonu) a DBH. V tomto provedení je gen TH funkčně spojený s promotorem CMV. Gen DBH je funkčně spojený s promotorovou sekvencí vnitřního vstupního místa pro ribozom. Buňky RIN jsou pak postupně transformovány každým expresním vektorem podle známých protokolů.

V dalším provedení je zkonstruován jeden expresní vektor obsahující gen pro-enkefalinu A, gen POMC, gen TH a gen DBH. Výhodně je odstraněna oblast ACTH genu POMC. Výhodně je zkrácený gen TH.

Výhodná je mnohonásobná genová exprese z jednoho transkriptu ve srovnání s expresi z mnohonásobných transkripčních jednotek. Jeden přístup, jak dosáhnout expresi mnoha genů z jednoho eukaryotického transkriptu využívá sekvence mRNA picorna virů, které jsou známy jako • · ·· · ·«···· • · · · · · · ·· ··· ··· ···· ·· · vnitřní vstupní místa pro ríbozcm („interna! ribosome entry sites - IRES). Tato místa fungují tak, že usnadňují translaci proteinu ze sekvencí lokalizovaných po směru od prvního AUG na mRNA..

Macejak a Sarnow uvádějí, že mRNA pro 5' nepřekládanou sekvenci proteinu vázajícího těžký řetězec imunoglobulinu (BiP, také známý jako CRP 78, glukózou řízený protein o molekulové hmotnosti 78 000; může přímo působit vnitřní navázání ribozomu na mRNA v savčích buňkách způsobem nezávislým na čepičce na 5'-konci. To naznačuje, že tato buněčná mRNA využívá pro iniciaci translace vazebný mechanismus vnitřního vstupního místa pro ribozom. Nátuře 353, 90-94 (1991) .

WO 94/24870 uvádí použití více než dvou IRES pro iniciaci translace z jednoho transkriptu, a také použití mnoha kopií téhož IRES v jednom konstruktu.

Tento vynález také uvažuje použiti „sebevražedných genů v transformovaných buňkách. Nejvýhodněji buňky nesou gen TK (thymidinkinázy) jako bezpečnostní opatření, což umožňuje, že hostitelská buňka může být zabita in vivo ošetřením gancyklovirem.

V oboru je známo použití „sebevražedného genu. Viz např. Anderson, publikovaná žádost PCT WO 93/10218, Hamre, publikovaná žádost PCT WO 93/02556. První úroveň ochrany před nepříznivými reakcemi na implantované buňky poskytuje vlastní imunitní systém příjemce. Při opouzdření může být imunologicky izolující vlastní polymerové pouzdro.

Přítomnost genu TK (nebo jiného sebevražedného genu) v expresním konstruktu přidává další stupeň bezpečnosti pro příjemce implantovaných buněk.

··· ···· ·· · ····· · · · · · • · ·· · ······ • · · · · · · ·· ··· ·♦· ···· ·· ·

Vektory preferované pro použití v tomto vynálezu zahrnuli tv, které umožni, že DNA kódující analgetické sloučeniny je amplifikována ve velkém počtu kopii. Takové zmnoženi schopné vektory jsou v oboru dobře známy. Zahrnují například vektory, které jsou schopné se množit amplifikací DHFR (viz např. Kaufman, patent Spojených Států 4 470 461, Kaufman a Sharp, „Construction Of A Modular Dihydrafolate Reductase cDNA Gene: Analysis Of Signals Utilized For Efficient Expression, Mol. Cell. Biol., 2, 1304-19 (1982)) nebo amplifikací glutaminsyntetázy (GS) (viz např. patent Spojených Států

122 464 a evropskou publikovanou žádost 336 841). Taková amplifikace může být použita ke zvýšení produkce požadovaných analgetických sloučenin.

Jsou uvažovány další metody zvýšení produkce požadovaných analgetických sloučenin. Například předpokládá se subklonování existujících polyklonálních buněčných linií. Buňky se klonují konečným ředěním k jedné buňce v každé jamce. Buněčné klony jsou tkáňové kultury, a klony se testují, aby se vybral klon s největší tvorbou analgetických sloučenin.

Jiná metoda zvýšení produkce požadovaných analgetických sloučenin se týká klonováni pozměněných forem biosyntetických enzymů s vyšší aktivitou než má divoký typ (tj. zkrácený TH 1-155) . Některé zkrácené formy TH mají 4 až 6krát vyšší aktivitu než má divoký typ TH. Viz např. Daubner a kol., „Expression and characterization of catalytic and regulátory domains of rat tyrosine hydroxylase, Protein Science, 2, 1452-60 (1993).

Kromě toho použití kultivačních médií bez tyrosinu k selektivnímu zvýšení hladiny kofaktoru tetrahydrobiopterinu může potenciálně zvýšit aktivitu tyrosinhydroxylázy. Viz ·· ···· · ·· ·· ··♦· ··· · · · · ·· · ····· · · ··· • · · · · ······ • · · · · · · ·· ··· ··· ···· ·· · např. Horellou a kol., „Retroviral transfer of a human tyrosine xydroxylase cDNA in various cell lineš, regulated release of dopamine in mouše anterior pituitary AtT-20 cells, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 86, 7233-37 (1989).

Výhodně se tvorba β-endorfinu pohybuje v rozmezí mezi 1 a 10 000 pg/10⁶ buněk/h. Výhodně se tvorba met-enkefalinu pohybuje v rozmezí mezi 1 a 10 000 pg/10⁶ buněk/h. Výhodně se tvorba katecholaminů pohybuje v rozmezí mezi 1 a 10 000 pg/10° buněk/h.

Buňky tohoto vynálezu mohou být implantovány savci, včetně člověka, pro léčení bolesti. Jestliže se implantují neopouzdřené, může být použit jakýkoliv vhodný implantační protokol, včetně protokolů navržených Sagenem a kol., patent Spojených Států 4 753 635, zahrnuto v odkazech.

Může být žádoucí geneticky modifikované buňky tohoto vynálezu před implantací opouzdřit. Takové opouzdřené buňky tvoří biologický umělý orgán (BAO). BAO může být navržen pro implantaci do příjemce nebo může být vytvořen tak, aby fungoval extrakorporálně. BAO použitelné v tomto vynálezu typicky mají alespoň jednu semipermeabilní vnější povrchovou membránu nebo plášť obklopující jádro obsahující buňky.

Plášť umožňuje difúzi živin, biologicky aktivních molekul a dalších vybraných produktů skrze BAO. BAO je biokompatibilni.

V některých případech může membrána také sloužit k tomu, že imunologicky izoluje buňky blokádou buněčných a molekulárních efektorů imunologické rejekce. Použití imunologicky izolujících membrán umožňuje implantaci alogenních a xenogenních buněk jedinci bez použití imunosuprese.

Při konstrukci BAO byla použita celá řada různých typů membrán. Obecně jsou membrány použité v BAO bud' mikroporézního nebo ultrafiltračniho stupně.

Pro použití tně

BAO byly navrženy různé druhy membránových materiálů, vce

PAN/PVC, polyurethany, polvsulfony, polvvinylideny a polystyreny. Typické sestavení membrány zahrnuje ploché listy, z kterých mohou být sestaveny konstrukce „sendvičového typu, které mají vrstvu živých buněk umístěnou mezi dvě rovinné paralelní membrány se spoji vytvořenými po obvodě zařízení. Alternativně mohou být použita zařízení z dutých vláken, kde jsou živé buňky umístěny uvnitř tubulární membrány. BA.O z dutých vláken mohou být tvořeny postupně vložením živých buněk do lumina dutého vlákna a zalepením konců vlákna. ΒΑΌ z dutých vláken mohou být také tvořeny procesem společné extruze, kdy jsou živé buňky vytlačovány společně s roztokem polymeru, který vytváří kolem buněk membránu.

BAO byly popsány například v patentech Spojených Států č. 4 892 538, 5 106 627, 5 156 844, 5 158 881 a 5 182 111 a žádostech PCT č. PCT/US/94/07015, WO 92/19195, WO 93/03901 a

WO 91/00119, všechny jsou zahrnuty v odkazech.

BAO mohou obsahovat další složky, které podporují dlouhodobé přežití opouzdřených buněk. Například WO 92/19195 se týká implantabilních imunologicky izolujících biokompatibilních nosičů, které mají hydrogelovou živnou půdu pro zvýšení životaschopnosti buněk.

Opouzdřující membrána BAO může být vyrobena z materiálu, který je tentýž jako materiál jádra, nebo může být z materiálu jiného. V každém případě je vytvořena ohraničující nebo periferní membránová oblast, která je selektivně permeabilní a biokompatibilní. Je-li to žádoucí, membrána může být také vytvořena tak, aby byla imunologicky izolující. Jádro obsahuje izolované buňky, bud’ suspendované v tekutém médiu nebo imobilizovctné půdě.

Výběr materiálů použitých pro řadou faktorů a je detailně popsán v Dionne WO 92/19195. Ve stručnosti, pro výrobu pláště pouzdra mohou být použity různé polymery a směsi polymerů. Polymerm membrány tvořící BAO a vnitřní růstové povrchy mohou zahrnovat polyakryláty kopolymerů), polyvinylideny, kopolymery polyurethany, polystyreny, polyamidy, nitrátové celulózy, polysulfony, (včetně akrylových polyvinylchloridu, acetátové celulózy, polyfosfazeny, polyakrylonitrily, póly (akrylonitril/kovinyl ) chlorid, a také jejich deriváty, kopolymery a směsi.

BAO mohou být tvořeny jakoukoliv vhodnou metodou v oboru známou. Jedna taková metoda se týká společné extruze polymerového licího roztoku a srážedla, což může zahrnovat fragmenty biologické tkáně, organel nebo buněčné suspenze a/nebo jiné léčebné přípravky, jak je popsáno v Dionne, WO 92/19195 a patentech Spojených Států 5 158 881, 5 283 187 a 5 284 761, zahrnuto v odkazech.

Plášť může být jedno nebo dvouvrstevný. Jednovrstevné duté vlákno může být tvořeno rychlým ochlazením pouze jednoho z povrchů roztoku polymeru, když je extrudován. Dvojvrstevné duté vlákno může byt tvořeno rychlým ochlazením obou povrchů roztoku polymeru.

Jsou možné různé vnější tvary pouzdra, jako je tvar cylindrický, ve tvaru disku nebo sférický.

Plášť BAO má póry o velikosti, selektivně permeabilní membrána se síto s limitem nominální molekulové která zajišťuje, že chová jako molekulární hmotnosti (nMWCO).

Molekulám větším než nMWCO je fyzikálně bráněno v přechodu přes membránu. Molekulární síto s limitem nominální • · · · · molekulové hmotnosti je definováno 90% rejekci v konvekčnich podmínkách. V situacích, kdy je žádoucí, aby BAO byl imunologicky izolující, je velikost pórů membrány vybrana tak, aby umožnila konkrétním faktorům produkovaným buňkami difundovat ven z nosiče, ale nepřipouštěla vstup faktorů imunitní odpovědi hostitele do BAO. Typicky je nMWCO v rozmezí mezi 50 a 200 kD, výhodně mezi 90 a 150 kD. Nejvhodnější složení membrány také minimalizuje reaktivitu mezi imunitními efektorovými molekulami hostitele, o kterých se ví, že jsou přítomny ve vybraném místě implantace, a vnějšími měrnéranovými složkami BAO.

Jádro BAO je zkonstruováno tak, aby poskytovalo vhodné lokální prostředí pro konkrétní buňky v něm izolované. Jádro může obsahovat tekuté médium postačující pro udržení růstu buněk. Tekuté jádro je obzvláště vhodné pro udržováni transformovaných buněčných linií jako jsou buňky PC12. Alternativně může jádro obsahovat gelovou živnou půdu. Gelová živná půda se může skládat z hydrogelu (alainát, „Vitrogen™, atd.) nebo extracelulárních složek živné půdy. Viz např. Dionne WO 92/19195.

Prostředky, které tvoří hydrogely, spadají do tří obecných tříd. Hydrogely první třídy nesou čistý negativní náboj (např. alginát). Ve druhé třídě jsou hydrogely nesoucí čistý pozitivní náboj (např. kolagen a laminin). Příklady komerčně dostupných složek extracelulární živné půdy jsou Matrigel™ a Vitrogen™ . Třetí třída je nábojově neutrální (např. vysoce zesítěný polyetylenoxid nebo polyvinylalkohol).

Na utěsnění BAO může být použita jakákoliv vhodná metoda, včetně použití polymerových lepidel a/nebo obrubování, zauzlení a sváření. V oboru jsou tyto utěsňovací techniky známy. Kromě toho může být použita jakákoliv vhodná ·· ···· · ·· ·· ···· ··· ···· · · · ····· · · ·· · ·· ·· · ······ • · · · · · · ·· ··· ··· ···· ·· · „suchá těsnicí metoda. Takové metody používají v podstatě neporézní fitink (spojku), přes který se přivádí roztok obsahující buňky. Následně po naplnění je BAO utěsněn. Takový způsob je popsán v dosud projednávané žádosti Spojených Států pořadového č. 08/082 407, zahrnuto v odkazech.

Před implantací in vivo je výhodné použít jeden nebo více testů in vitro pro stanovení funkčnosti BAO. Pro tyto účely mohou být použity zkoušky nebo diagnostické testy v oboru dobře známé. Viz např. Methods In Enzymology, Abelson (Ed.), Academie Press, 1993. Mohou být použity například testy ELISA. (enzyme-linked immunosorbent assay) , chromatografický nebo enzymatický test nebo biologická zkouška specifická pro vylučovaný produkt. Je-li to žádoucí, může být sekreční funkce implantátu sledována v průběhu času sběrem příslušných vzorků (např. sérum) od příjemce a jejich testováním. Je-li příjemce primát, může být použita mikrodialýza.

Počet BAO a jejich velikost, dostatečná pro zajištění léčebného účinku po implantaci, jsou určovány množstvím biologické aktivity potřebné pro konkrétní aplikaci. V případě sekrečních buněk uvolňujících léčebné látky jsou pro stanovení množství potřebné sekreční látky použity standardní dávkovači zřetele a kritéria v oboru známé. Faktory, které je nutno brát do úvahy jsou diskutovány v práci Dionne, WO 92/19195.

Implantace BAO se provádí za sterilních podmínek. Obecně se BAO implantuje na takové místo v organismu hostitele, které umožní přiměřenou dodávku secernovaného produktu nebo funkce hostiteli a dodávku živin opouzdřeným buňkám či tkáni a umožní také přístup k BAO pro odstranění ··· · · · · · ·φ φ φ φ φ φ φ · · · · φ φ · · · φ φ φ φ φφ φ · φ φ φ ·· • Φ ··· φφφ ···· φφ φ a/nebo výměnu. Preferovaný hostitel je primát, nej výhodněji člověk.

Počítá se s několika různými implantaóními místy. Tatoimplantační místa zahrnují centrální nervový systém, včetně mozku, míchy a komorové vody a sklivce oka. Preferovaná místa v mozku zahrnují striatum, mozkovou kůru, subthalamická jádra a nucleus basalis Meynerti. Další preferovaná místa jsou mozkomíšní mok, nej výhodněji subarachnoidální prostor a postranní komory. Tento vynález také počítá s implantací do dalších míst, jako je pod pouzdro ledvin, intraperitoneálně, subkutánně nebo do jiného léčebně prospěšného místa.

Následující příklady jsou uvedeny proto, aby bylo možné vynálezu lépe porozumět. Tyto příklady jsou pouze pro účely ilustrace a nemají být chápány ve smyslu jakéhokoliv omezení oblasti vynálezu.

Přehled obrázků

Obr. 1 je plazmidová mapa vektoru pBS-hPOMC-027, pBSIgSP-hPOMC-028 a pBS-IgSP-hPOMC-AACTH-029.

Obr. 2 je plazmidová mapa vektorů pCEP4-hPOMC-030, pCEP4-hPOMC-031, pcDNA3-hPOMC-034 a pcDNA3-hPOMC-035.

Obr. 3 je plazmidová mapa vektorů pCEP4-hPOMC-AACTH032, pCEP4-hPOMC-AACTH-033, pcDNA3-hPOMC-AACTH-036 a pcDNA3hPOMC-AACTH-037 .

Obr. 4 je plazmidová mapa vektorů pcDNA3-rTH-044, pcDNA3-rTHA-045 a pcDNA3-rTHDKS-075 (také označen jako· pcDNA3-rTHAKS-075).

• 4···· • ·· • ·· · ·

4· ·4

444 4 4

Obr.	5 ίθ c±a~midova	mapa	vektorů	pcDNA3-rTHA-IRES-
bDBH-088	a vektorů pcDNA3-	-rTHAKS-IRES-bDBH-076.
Obr.	6 je plazmidová	mapa	vektoru	pZeo-Pcmv-rTHAKS-
IRES-bDBH	- 0 8 8 .
Obr.	7 je plazmidová	mapa	vektoru	pBS-Pcmv-rTHAlRES
bDBH-067.
Obr.	8 je plazmidová	mapa	vektoru	pBS-hPOMC-AACTH-IRES-
rTHÁIRES-	bDBH-06 8.
Obr.	9 je plazmidová	mapa	vektoru	pcDNA3-hPOMC-AACTH-

IRES-rTHA-IRSS-bDBH-069.

Obr. 10 je plazmidová mapa vektoru pcDNA3-IRES-Zeocin072.

Obr. 11 je plazmidová mapa vektoru pcDNA3-hPOMC-AACTHIRES-rTHA-IRES-bDBH-IRES-Zeocin-073.

Obr. 12 je plazmidová mapa vektoru pcDNA3-hPROA+KS-091.

Příklady provedeni vynálezu

Konstrukce polycistronického expresního vektoru

Konstrukce IgSP-POMC fúze

Fragment DNA mezi restrikčními místy Smál a Sáli (dále jen Smal-Sall fragment) obsahující 3. exon z lidského genu POMC byl subklonován do pBS vektoru (Stratagene). Viz Takahashi, výše, Cochet, výše. Výsledný plazmid byl pojmenován pBS-hPOMC-027 (Obr.l).

PCR fragment (fragment DNA vzniklý v polymerázové řetězové reakci -PCR) byl syntetizován užitím dvou oligonukleotidových primerů oCNTF-003 (sekvence identifikačního čísla 1) a oIgSP-018 (sekvence identifikačního čísla 2) z plazmidu pNUT obsahujícího lidský gen CNTF. Viz Baetge a kol., Proč. Nati. Acad. Sci.

USA, 83, 5454-58 (1986). Oba primery oCNTF-003 a oIgSP-018 obsahovaly syntetická restrikční místa BamHI a Smál na svých

5' koncích.

PCR fragment dlouhý 196 párů baží (bp) byl naštěpen restrikrázami BamHI a Xmal (která je izoschizomérou Smál), a poté elektroforeticky rozdělen na 1% gelu ze SeaPlaque agarózy. HindlII/Xmal fragment DNA byl z gelu vyříznut a přečištěn pomocí purifikační soupravy SpinBind (FMC BioProducts, Rockland, ME).

Plazmid pBS-hPOMC-027 byl také naštěpen enzymy BamHI a Xmal, izolován a přečištěn z 1% agarózy pomocí purifikační soupravy SpinBind (FMC BioProducts, Rockland, ME). Ligační směsí pak byly transformovány buňky E. coli DH5a (Gibco BRL, Gaitherburg, MD).

Pozitivní subklony byly nejdříve identifikovány postupem „cracking gel (Promega Protocols and Application Guide, 1991). Poté byly připraveny minilyzáty užitím purifikační soupravy SpinBind (FMC BioProducts, Rockland, ME) a naštěpeny restriktázami BamHI a Smál. Pozitivní subklon byl pojmenován pBS-IgSP-hPOMC-028 (Obr. 1). Nukleotidová sekvence místa spoje fúzovaných genů v plazmidu pBS-IgSP-hPOMC-028 byla zjištěna sekvencováním dideoxynukleotidovou metodou pomocí soupravy „Sequenase (USBC, Cleveland). Sekvence je uvedena na obr. 3 jako sekvence identifikačního čísla 3.

Konstrukce expresních vektorů IgSP-POMC

IgSP-hPOMC fragment DNA v plazmidu pBS-IgSP-hPOMC-028 byl subklonován do plazmidu pcDNA3 (Invitrogen Corp., San ·· ···· *· ·· · ·····♦ • · · · · · * ·· ··· · · · · · · · · · ·

Diego, CA) a pCEP4 (Invitroqen Corp., San Diego, CA) v orientaci shodné se směrem čtení („sense) a v orientaci opačné směru čtení („anti-sense).

IgSP-hPOMC fragment vymezený místy Notl-Sall z pBSIgSP-hPOMC-028 byl ligován (spojen) s Notl-Xhol fragmentem z příslušně naštěpeného pCEP4, což vedlo ke vzniku klonu se „sense orientací klonovaného genu, nazvaného pCEP4-hPOMC030 (Obr. 2) . BamHI-SalI fragment IgSP-hPOMC z plazmidu pBSIgSP-hPOMC-028 byl ligován s plazmidem pCEP4 naštěpeným restriktázami BamHI a Xhol, čímž vznikl klon s „anti-sense orientací klonovaného genu nazvaný pCEP4-hPOMC-031 (Obr. 2). Orientace inzertu (vloženého fragmentu) ve vektorech pCEP4hPOMC-030 a pCEP4-hPOMC-031 byla ověřena štěpením BamHI, Notl, Sáli a Notl/Sall a současně také dideoxynukleotidovým sekvencováním užitím soupravy „Sequenase (USBC, Cleveland).

BamHI-SalI fragment IgSP-hPOMC z plazmidu pBS-IgSPhPOMC-028 byl ligován s pcDNA3 štěpeným BamHI-XhoI, což vedlo ke vzniku klonu se „sense orientaci klonovaného genu zvaného pcDNA3-hPOMC-034 (Obr. 2). Notl-HindlII fragment IgSP-hPOMC z pBS-IgSP-hPOMC-028 byl ligován s pcDNA3 naštěpeným NotI-HindIII, čímž vznikl klon s „anti-sense orientací klonovaného genu zvaný pCDNA3-hPOMC-035 (Obr.2). Štěpení restriktázami Smál, BamHI, EcoRl a BamHI/HindlII bylo použito k potvrzení orientace inzertu v pCDNA3-hPOMC034, zatímco restriktázy HindlII, Notl a Sáli byly použity k potvrzení orientace vektoru pCDNA3-hPOMC-035.

Konstrukce fúzovaného genu IgSP-POMC s odstraněnou oblastí genu ACTH

V plazmidu pBS-IgSP-hPOMC-028 byla deletována (odstraněna) oblast kódující ACTH. Plazmid pBS-IgSP-hPOMC028 byl nejdříve štěpen restriktázou Xma I a pak ošetřen DNA ·· ····

• · · · · · · polymerázou Pfu (Promega, Madison, WI). Takto upravený pBSIgSP-hPOMC-028 byl štěpen restriktázou Stul, pak izolován z 1% agarózy SeaPlaque a přečištěn užitím purifikačni soupravy FMC SpinBind (FMC BioProducts, Rockland, NE). Poté, co proběhla „šelf ligace (spojení volných konců lineárního plazmidu navzájem, takže vytvoří opět kruhovou molekulu) byly ligační směsí transformovány baktérie E. coii DH5a (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Pozitivní subklcny byly identifikovány štěpením BamHI/HindlII a pak byl vybraný klon pojmenován pBS-IgSP-hPOMCz\ACTH-029 (Obr.l). Nukleotidová sekvence deletované (odstraněné) oblasti ACTH v plazmidu pBS-IgSP-hPOMCAACTH-029 byla potvrzena sekvencováním dideoxvnukleotidovou metodou. Sekvence fúzovaného genu IgSPhPOMC-AACTH je uvedena jako sekvence s identifikačním číslem

4.

Konstrukce expresních vektorů s genem IgSP-hPOMC bez oblasti kódující ACTH

Úsek DNA obsahující IgSP-hPOMC-AACTH z plazmidu pBSIgSP-hPOMCAACTH-029 byl subklonován do plazmidů pcDNA.3 (Invitrogen Corp., San Diego, CA) a pCEP4 (Invitrogen Corp., San Diego, CA) jak v „sense tak i v „anti-sense orientaci. Notl-Sall fragment IgSP-hPOMC-AACTH z plazmidu pBS-IgSP-hPOMCAACTH-029 byl ligován s plazmidem pCEP4 naštěpeným Notl-Xhol, což vedlo ke vzniku „sense klonu pojmenovaného pCEP4-hPOMC-AACTH-032 (Obr.3). BamHI-SalI fragment IgSP-hPOMC-AACTH z plazmidu pBS-IgSP-hPOMCAACTH-029 byl ligován s pCEP4 naštěpeným BamHI-XhoI, což vedlo ke vzniku „anti-sense klonu pojmenovaného pCEP4- hPOMC-AACTH033 (Obr.3). Orientace inzertů (vložených fragmentů) v • · · · · · plazmidech pCEP4-hPOMC-AACTH-032 a pCEP4-hPOMC-AACTH-033 byla potvrzena jak štěpením restriktázami BamHI a EcoRI tak i sekvencovánim pomocí soupravy Sequenase (USBC,

Celeveland) .

BamHI-SalI fragment IgSP-hPOMC-AACTH z plazmidu pBSIgSP-hPOMCAACTH-029 byl ligován s pcDNA3 naštěpeným restriktázami BamHI-XhoI, a tím byl vytvořen „sense klon nazvaný pcDNA3- hPOMCAACTH-036 (Obr.3). Notl-HindlII fragment IgSP-hPOMC-AACTH z pBS-IgSP-hPOMCAACTH-029 byl ligován s pcDNA3 naštěpeným restriktázami Notl-HindlII a byl vytvořen „anti-sense klon nazvaný pcDNA3-hPOMC-z\ACTH037 (Obr.3).

Orientace inzertů byla u plazmidu pcDNA3-hPOMC-AACTH036 ověřena užitím restriktáz PvuII a EcoRI, zatímco u plazmidu pcDNA3-hPOMC-AACTH-037 reastriktázami Sáli a EcoRI.

Klonování cDNA genu TH úplné a zkrácené délky

Celková RNA byla připravena z buněk PC12 postupem založeným na guanidium thiokyanátu soupravou chemikálií TRI (Molecular Researcn Center, lne., Cincinnati, OH). Pět set ng celkové RNA z PC12 buněk bylo podrobeno přepsáni reverzní transkriptázou při 42 °C za 30 minut v reakční směsi o objemu 20 μΐ obsaující 10 mM Tris.HCl (pH 8,3), 50 mM KC1, 4mM každého z dNTP, 5 mM MgCl₂, 1,25 μΜ oligo(dT)15-mer, 1,25 μΜ náhodné hexamerv, 31 jednotek inhibitoru Rnázy Rnase Guard (Pharmacia, Sweden) a 200 jednotek reverzní transkriptázv SuperScript II (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Dva mikrolitry výše popsané cDNA byly přidány k reakční směsi PCR o objemu 25 μΐ obsahující 10 mM Tris.HCl (pH 8,3), 50 mM Kel, 800 nM každého z dNTP, 2mM MgCl₂, 400 nM každého z

primerů č.l a č.2 a 2,5 jednotky Taq (Thermus aquaticus) DNA polymerázy (Boehringer Manheim, Germany).

Pro syntézu cDNA genu TH o plné délce byly použity oligonukleotidové primery orTH-052 (sekvence s identifikačním č. 5) a orTH-053 (sekvence s identifikačním č. 6). Pro syntézu zkráceného genu TH byly použity primery orTH-054 (sekvence s identifikačním č. 7) a orTH-053 (sekvence s identifikačním č. 6). Sekvence primerů byly převzaty ze sekvence TH genu, kterou publikoval Grima a kol., Nátuře, 326, 707-11 (1987), a patent USA č. 5 300 436, a také Daubner, viz výše.

Primery orTH-052 (sekvence s identifikačním č. 5) a orTH-054 (sekvence s identifikačním č. 7) obsahují na svém 5' konci syntetické restrikční místo HindlII, zatímco orTH-053 má na 5' konci místo BamHI.

Reakční směs PCR byla podrobena 30 amplifikačním cyklům skládajícím se z 30 sekundové denaturace při teplotě 94 °C (v prvním cyklu 2 minuty), nasednutí primerů při 50 °C po 1 minutu a syntézy (prodlužování řetězce) při 72 °C po 3,5 minuty (v posledním cyklu 5 minut). PCR fragment (fragment syntetizovaný v PCR) představující krysí gen TH plné délky dlouhý 1537 bp a zkrácený fragment o délce 1087 bp byly štěpeny restriktázami BamHI a HindlII, a pak rozděleny na 1% gelu z SeaPlaque agarózy. HindlI/BamHI fragmenty dlouhé 1531 bp a 1081 bp byly z gelu vyříznuty a přečištěny užitím purifikační soupravy FMC SpinBind (FMC BioProducts, Rockland, ME).

Expresní vektor pcDNA3 byl také naštěpen BamHI a HindlII a izolován a přečištěn z 1% SeaPlaque agarózy užitím purifikační soupravy FMC SpinBind (FMC BioProducts, • · · · · ·

Rockland, ΜΕ). Ligačni směsi pak byly transformovány baktérie E. coli DH5oc (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) .

K vyhledání pozitivních subklonů byl použit poostup „cracking gel (Promega Protocols and Application Guide, 1991). Identita a správnost vybraných klonů byla ověřena dvojitým štěpením BamHI/HindlII.

Pozitivní subklony obsahující úplný a nebo zkrácený krysí gen TH v plazmidu pcDNA3 byly pojmenovány pcDNA3-rTH044 (Obr. 4) a pcDNA3-rTHA-045 (Obr. 4). Sekvence jak úplného tak i zkráceného PCR odvozeného krysího genu TH ve výše popsaných klonech byly ověřeny sekvencováním pomocí soupravy Sequenase (USBC, Celeveland). Sekvence konstruktu rTHÁ je zde uvedena jako sekvence s identifikačním číslem 16.

Aby byla optimalizována účinnost translace (překladu sekvence DNA do proteinu) u zkráceného genu TH, byl oligonukletidový primer orTH-078 (sekvence s identifikačním č. 8) navržen tak, že souhlasná Kozáková sekvence je bezprostředně před (t.j. proti směru čtení, „upstream) počátečním kodonem ATG. Plazmid pcDNA3-rTHÁ-45 byl využit jako templát (vzor) v reakci PCR o objemu 50 μΐ se složení shodným s reakční směsí PCR popsanou výše kromě toho, že oligonukleotidové primery byly nahrazeny primery orTH-078 (sekvence s identifikačním č. 8) a orTH-053 (sekvence s identifikačním č. 6). Výsledný produkt PCR reakce o délce 1097 bp byl klonován do vektoru pcDNA3 stejným způsobem jak bylo popsáno výše. Výsledný subklon byl pojmenován pcDNA3rTHAKS-75 (Obr. 4). Sekvence konstruktu pcDNA3-rTHÁKS-75 je ukázána jako sekvence s identifikačním č. 17).

Konstrukce fúzovaného genu rTH-IRES-bDBH φ φ

Κ vytvoření fúzovaného genu rTH-IRES-bDBH byla použita metoda rekombinantní DNA s využitím PCR.

Oligonukleotidy oIRES-057 (sekvence s identifikačním číslem 9) a obDBH-065 (sekvence s identifikačním číslem 10) jsou specifické pro sekvence genů LRES a bDBH, přičemž oIRES-057 obsahuje na svém 5' konci syntetické restrikční místo BamHI a obDBH-065 obsahuje místo Notl. Oligonukleotidy oIRES-bDBH-064 (sekvence s identifikačním číslem 11) a oIRES-bDBH-066 (sekvence s identifikačním číslem 12) jsou navzájem komplementární. Navíc oligonukleotidový primer oIRES-bDBH-064 (sekvence s identifikačním číslem 11) má 16-ti nukleotidový úsek na svém 5' konci identický se sekvencí IRES a 18-ti nukleotidový úsek na svém 3' konci identický se sekvencí bDBH. Totéž ale v opačném pořadí platí pro oligonukleotid oIRES-bDBH-066 (sekvence s identifikačním číslem 12).

První dvě PCR reakce byly provedeny s dvojicemi oligonukleotidů oIRES-057/oIRES-bDBH-066 a oIRES-bDBH-064/ obDBH-065 a plazmidy pCTI-001 (inzert obsahuje sekvenci IRES uvedenou zde pod identifikačním číslem 30) a pBS-bDBH-006 (obsahuje bovinní gen DBH klonovaný z bovinních chromafinních buněk nadledvin dle Lamoruox a kol., EMBO J., 6, 3931-37 (1987)) jako templáty. Sto ng templátové DNA bylo přidáno k reakční směsi PCR o objemu 50 μΐ obsahující 10 mM Tris.HCI (pH 8,3), 50 mM KC1, 800 nM každého z dNTP, 2mM MgCl?, 400 nM každého z primerů č.l a č.2 a 2,5 jednotky Taq (Thermus aquaticus) DNA polymerázy (Boehringer Manheim, Germany).

Reakční směs PCR byla podrobena 30 amplifikačním cyklům skládajícím se z 30 sekundové denaturace při teplotě 94°C (v prvním cyklu 2 minuty), nasednutí primerů při 50°C po 1 minutu a syntézy (prodlužování řetězce) při 72°C po 3,5 minuty (v posledním cyklu 5 minut). Produkty PCR byly rozděleny v 1% agarózovém gelu z TrivieGel 500 (TrivieGen). Dva bločky gelu obsahující produkty PCR byly použity v následující reakci PCR, ve které byla reakční směs identická s výše popsanou kromě toho, že byly užity oligonukleotidy oIRES-057 a obDBH-065. Druhá PCR reakce proběhla ve 30 amplifikačních cyklech skládajících se z 30 sekundové denaturace při teplotě 94°C (v prvním cyklu 2 minuty), nasednutí primerů při 60°C po 30 vteřin (ve druhém až čtvrtém cyklu 37°C po 2 minuty) a syntézy (prodlužování řetězce) při 72°C po 30 vteřin (v posledním cyklu 2 minuty). Produkt PCR o délce 2407 bp představující fúzovaný gen IRESbDBH a klonovací vektor pcDNA3-rTHA-45 byly naštěpeny restriktázami BamHI a Notl a poté přečištěny po rozdělení v 1% agaróze SeaPlaque užitím purifikační soupravy FMC SpinBind (FMC BioProducts, Rockland, ME).

Ligací fragmentů IRES-bDBH/BamHI/Notl a pcDNA3-rTHA45/BamHI/NotI vznikl expresní vektor nazvaný pcDNA3-rTHAIRES-bDBH-066 (Obr.6), zatímco ligace fragmentů IRESbDBH/BamHI/Notl a pcDNA.3-rTHAKS-075/BamHI/NotI vedla ke vzniku expresního vektoru pojmenovaného pcDNA3-rTHAKS-IRESbDBH-076 (Obr.5), přičemž v úseku rTHA je před počátečním kodonem ATG souhlasná Kozáková sekvence. Sekvence konstruktu rTHAKS-IRES-bDBH je zde uvedena pod identifikačním číslem 18. Ligační směsi pak byly transformovány baktérie E. coli DH5a (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Pozitivní klony byly vyhledány postupem „cracking gel (Promega Protocols and Application Guide, ·· ···· • · · · · ·· ··· ·······

1991) a správnost byla ověřena štěpením restriktázami

HindlII, BamHI, BamHI/HindlII, Smál a Notl.

Z plazmidu pcDNA3-rTHAKS-IRES-bDBH-076 byl vyňat NrulXhol fragment o délce 4114 bp obsahující promotor CMVrTHÁKS-IRES-bDBH a tento fragment byl poté subklonován do klonovacího vektoru pZeoSV (Invitrogen Corp., San Diego, CA) , naštěpeného restriktázami Scal a Xhol v mnohočetném klonovacím místě. Takto vzniklý vektor byl pojmenován pZeoPcmv-rTHAKS-IRES-bDBH-088 (Obr. 6).

Konstrukce fúzovaného genu IgSP-hPOMC ACTH-rTHD-IRES-bDBH Nrul-Notl fragment dlouhý 4100 bp, obsahující promotor

CMV, fúzovaný gen rTHD-IRES-bDBH a polyadenylační sekvenci BGH, byl vyňat z plazmidu pcDNA3-rTHA-IRES-bDBH-066 a subklonován do klonovacího vektoru pBS (Stratagene, La Jolla, CA) .

Výsledný plazmid pBS-Pcmv-rTHÁ-IRES-bDBH-067 (Obr. 7) byl využit jako přechodný konstrukt, do kterého byl vložen rekombinantní PCR fragment obsahující IgSP-hPOMCDACTH-IRES.

Oligonukleotid oIgSP-068 (sekvence s identifikačním číslem 13) obsahující syntetické restrikční místo EcoRV, je specifický pro sekvenci IgSP.

Oligonukleotidový primer orTHA-073 (sekvence s identifikačním číslem 14) je specifický pro sekvenci rTHA a obsahuje vnitřní restrikční místo Smál.

Oligonukleotidové primery ohPOMC-IRES-069 (sekvence s identifikačním číslem 15) a ohPOMC-IRES-070 (sekvence s identifikačním číslem 20) jsou navzájem komplementární. Navíc oligonukleotidový primer ohPOMC-IRES-069 má 18-ti nukleotidový úsek na svém 5' konci identický se sekvencí hPOMC a 12-ti nukleotidový úsek na na svém 3' konci identický se sekvencí IRES. Totéž ale v opačném pořadí platí prc^ oligonukleotid ohPOMC-IRES-070.

Oligonukleotidové primery oIRES-rTHA-071 (sekvence s identifikačním číslem 21) a oRIRES-rTHA-072 (sekvence s identifikačním číslem 22) jsou navzájem komplementární. Navíc oligonukleotidový primer oIRES-rTHA-071 má 15-ti nukleotidový úsek na svém 5' konci identický se sekvencí rTHA a 18-ti nukleotidový úsek na na svém 3' konci identický se sekvencí IRES. Totéž ale v opačném pořadí platí pro oligonukleotid oRIRES-rTHA-072.

Tři různé primární PCR reakce byly provedeny.

PCR reakce A: Templátem byl pBS-IgSP-hPOMCDACTH-029, primery byly oligonukleotidy oTgSP-O68/ohPOMC-IRES-069.

PCR reakce B: Templátem byl pCTI-001, primery byly oligonukleotidy ohPOMC-IRES-070/oIRES-rTHA-071.

PCR reakce C: Templátem byl pcDNA3-rTHA-045 a primery byly oligonukleotidy orIRES-rTHA-072/orTHA-073.

Tyto tři primární PCR reakční směsi o objemu 50 μΐ obsahovaly 100 ng templátové DNA, 10 mM Tris.HCl (pH 8,3), 50 mM KC1, 800 nM každého z dNTP, 2mM MgCl?, 400 nM každého z primerů č.l a č.2 a 2,5 jednotky Taq (Thermus aquaticus) DNA polymerázy (Boehringer Manheim, Germany).

Reakční směs PCR byla podrobena 30 amplifikačním cyklům skládajícím se z 30 sekundové denaturace při teplotě 94°C (v prvním cyklu 2 minuty), nasednutí primerů při 50°C po 1 minutu a syntézy (prodlužování řetězce) při 72°C po 3 vteřin (v posledním cyklu 5 minut).

Produkty PCR byly rozděleny v 1% gelu z agarózy

TrivieGel 500 (TrivieGen). Dva bločky gelu obsahující produkty PCR z reakcí B a C byly použity v následující reakci PCR se shodnou reakční směsí, jaká je popsána výše, kromě toho, že byly použity oligonukleotidy ohPOMC-IRES-070 a ογΤΗΔ~073.

Druhá následná reakční směs PCR byla podrobena 30 amplifikačním cyklům skládajícím se z 30 sekundové denaturace při teplotě 94°C (v prvním cyklu 2 minuty), nasednutí primerů při 60°C po 30 vteřin a syntézy (prodlužování řetězce) při 72°C po 30 vteřin (v posledním cyklu 2 minuty).

Produkty PCR byly izolovány stejně jako je popsáno dříve. Bločky gelu obsahující produkty PCR z druhé reakce a z reakce A byly kombinovány v následující třetí amplifikační reakci PCR s oligonukleotidy oIgSP-068/rTHÁ073. PCR fragment obsahující fúzovaný gen IgSP-hPOMC-IRESrTHA a klonovací vektor pBS-Pcmv-rTHA-IRES-bDBH-067 byly naštěpeny restriktázami EcoRV a Xmal a poté přečištěny po rozdělení v 1% agaróze SeaPlaque užitím purifikační soupravy FMC SpinBind (FMC BioProducts, Rockland, ME). Ligační směsí pak byly transformovány baktérie Ξ. coli DH5a (Gibco BRL, Gaithersburg, MD).

Pozitivní klony byly vyhledány postupem „cracking gel (Promega, Madison, WI) a správnost byla ověřena štěpením restriktázami EcoRI, KpnI a Notl. Výsledný klon byl pojmenován pBS-IgSP-hPOMCAACTH-IRES-rTHA-IRES-bDBH-068 (Obr. 8). Sekvence tohoto konstruktu je zde uvedena jako sekvence s identifikačním číslem 23.

Konstrukce expresního vektoru IgSP-hPOMCAACTH-IRES-rTHAIRES-bDBH

Notl fragment o délce 4491 bp obsahující gen IgSPhPOMCAACTH-IRES-rTHÁ-IRES-bDBH byl vyňat z plazmidu pBS37 ·· ····

IgSP-hPOMCAACTH-IRES-rTHA-IRES-bDBH-068 a subklonován do plazmidů pcDNA3 (Invitrogen Corp., San Diego, CA) v poloze Notl mnohočetného klonovacího místa. Štěpení restriktázami Notl a Smál potvrdilo, že gen IgSP-hPOMCAACTH-IRES-rTHAIRES-bDBH byl vložen v „sense orientaci a takto vzniklý plazmid byl pojmenován pcDNA3-IgSP-hPOMCÁACTH-IRES-rTHAIRES-bDBH-069 (Obr. 9).

Konstrukce expresního vektoru IgSP-hPOMCAACTH-IRES-rTHÁIRES-bDBH-Zeocin

Fúzovaný gen IRES-Zeocin byl vytvořen metodou rekombinantní PCR. Oligonukleotid oIRES-074 (sekvence s identifikačním číslem 24) je specifický pro sekvenci genu IRES a obsahuje na svém 5' konci syntetické restrikční místo Notl, oligonukleotid oZeocin-077 (sekvence s identifikačním číslem 25) je specifický pro sekvenci genu Zeocinu, přičemž obsahuje restrikční místo Xhol. Oligonukleotidv oIRES-Zeocin-075 (sekvence s identifikačním číslem 26) a oIRES-Zeocin-076 jsou navzájem komplementární. Kromě toho má oligonukleotid IRES-rTHA-071 15-ti nukleotidový úsek na svém 5' konci identický se sekvencí genu pro Zeocin a 18-ti nukleotidový úsek na svém 3' konci identický se sekvencí IRES. Stejně, ale v opačném pořadí, je tomu u oligonukleotidu oIRES-Zeocin-076.

První dvě PCR reakce byly provedeny s dvojicemi olígonukleotidů oIRES-074/oIRES-Zeocin-075 a oIRES-Zeocin076/oZeocin-075 a plazmidy pCTI-001 a pZeoSV (Invitrogen Corp., San Diego, CA) jako templáty.

Sto ng templátové DNA bylo přidáno k reakční směsi PCR o objemu 50 μΐ obsahující 10 mM Tris.HCl (pH 8,3), 50 mM KC1, 800 nM každého z dNTP, 2mM MgCl₂, 400 nM každého z • · · · ·· ♦··· : P··.. i f

*.·* ··· ··· ···· ·· · primerů č.l a č.2 a 2,5 jednotky Taq (Thermus aquaticus) DNA polymerázy (Boehringer Manheim, Germany).

Reakční směs PCR byla podrobena 30 amplifikačnim cyklům skládajícím se z 30 sekundové denaturace při teplotě 94°C (v prvním cyklu 2 minuty), nasednuti primerů při 50°C po 1 minutu a syntézy (prodlužování řetězce) při 72°C po 3,5 minuty (v posledním cyklu 5 minut).

Produkty PCR byly rozděleny v 1% agarózovém gelu z TrivieGel 500 (TrivieGen). Dva bločky gelu obsahující první produkty PCR byly přeneseny do zkumavky obsahující reakční směs identickou s výše popsanou kromě toho, že byly užity oligonukleotidy oIRES-074 a oZeocin-077.

Druhá PCR reakce proběhla ve 30 amplifikačních cyklech skládajících se z 30 sekundové denaturace při teplotě 94°C (v prvním cyklu 2 minuty), nasednutí primerů při 50°C po 30 vteřin (ve druhém až čtvrtém cyklu 37°C po 2 minuty) a syntézy při 72°C po 30 vteřin (v posledním cyklu 2 minuty).

Produkt PCR o délce 974 bp představující fúzovaný gen IRES-Zeocin a klonovací vektor pcDNA3 byly naštěpenv restriktázami Notl a Xhol, a poté přečištěny po rozdělení v 1% agaróze SeaPlaque užitím purifikační soupravy FMC SpinBind (FMC BioProducts, Rockland, ME).

Ligací fragmentů IRES-Zeocin/NotI/Xhol a pcDNA3/NotI/XhoI vznikl přechodný klonovací vektor nazvaný pcDNA3-IRES-Zeocin-072. Obr. 10.

Pozitivní klony byly vyhledány postupem „cracking gel (Promega, Madison, WI) a štěpením restriktázami HindlII, Smál, Xhol, Notl a Notl/Xhol.

Aby vznikl konečný expresní vektor IgSP-hPOMCDACTHIRES-rTHD-IRES-bDBH-IRES-Zeocin, byl z plazmidu pBS-IgSPhPOMCAACTH-IRES-rTHÁ-IRES-bDBH-068 (obr. 8, sekvence s • · · · • · · · * .· ··· »·· ···· ·· identifikačním číslem 23) vyňat Notl fragment o délce 4491 bp obsahující gen IaSP-hPOMCAACTH-IRES-rTHA-IRES-bDBH a byl subklonován do pcDNA3-IRES-Zeocin-072 (obr. 10) v místě Notl mnohočetného klonovacího místa.

Štěpení restriktázami Notl a Smál potvrdilo, ze gen IgSP-hPOMCAACTH-IRES-rTHA-IRES-bDBH byl vložen v „sense orientaci a takto vzniklý plazmid byl pojmenován pcDNA.3IgSP-hPOMCAACTH-IRES-rTHA-IRES-bDBH-IRES-Zeocin-073. Sekvence tohoto konstruktu je ukázána v sekvenci s identifikačním číslem 28. Obr. 11.

Konstrukce fúze ProA+KS

Konstrukt obsahující kódující oblast lidského genu proenkefalinu A se souhlasnou Kozákovou sekvenci bezprostředně v protisměru k iniciačnímu kodonu ATG. Sekvence tohoto konstruktu je ukázána v sekvenci s identifikačn im čís”’ Sil 2 9

Konstrukce expresního vektoru hProA+KS

HindlII/BamHI fragment obsaující fúzi hProA+KS byl vložen do expresního vektoru pcDNA3 naštěpeného BamHI a HindlII způsobem v podstatě popsaným výše. Po výběru provedeném jak popsáno výše, byl pozitivní subklon nazván pcDNA3-hProA+KS-091. Obr. 12. Konstrukce vektoru pBS-CMV ProA je detailně uvedena v Mothis, J. A Lindberg, I., Endocrinologv, 131, 2287-96 (1992).

Transformace buněk

Buňky RIN a AtT-20 byly transformovány, jak je popsáno dále.

Buněčné linie založené na RIN a AtT-20 byly pěstovány v médiu DMEM (Gibco) s 10% fetálním bovinním sérem a základním živným médiem se směsí antibiotik pen-strep-fungizon ·· ···· (Gibco). Buňky byly umístěny na Petriho misky P100 (750 000 buněk/miska) v 10 ml základního média. O 18 až 24 hodin později byly buňky transfekovány pomocí soupravy firmy Stratagene (San Diago, CCA), založené na využití kalcium fosfátové metody. 10 μα plazmidové vektorové DNA bylo naředěno 450 μΐ sterilní deionizované vody. Poté bylo k plazmidové DNA přidáno 50 μΐ lOx pufru (roztok č. 1). K roztoku obsahujícímu DNA bylo okamžitě přidáno 500 μΐ roztoku č. 2 a jemně promícháno. Směs se inkubovala při teplotě místnosti po dobu 20 minut a poté byl 1.0 ml roztoku přidán k buňkám na Petriho miskách. Buňky se inkubovalv přes noc a o 18 až 24 hodin později byly buňky 2x promyty Hanksovým balancovaným solným roztokem bez kalcia a magnézia. Poté byly buňky pěstovány v základním živném médiu + selekčních lécích. Buňky byly selektovány buď v 600 ug/ml geneticinu (Gibco) nebo 400 ug/ml hygromycinu (Boehringer Mannheim) nebo 500 ug/ml Zeocinu (InVitrogen, San Diego, CA). Buňky byly postupně transfekovány a selektovány tak, aby se získala konečná buněčná linie.

Buňky RIN byly transfekovány plazmidem pCEP4-hPOMC-030 obsahujícím gen POMC. Toto je vektor rezistentní na hygromycin. Buňky byly také transformovány plazmidem pcDNA3hProA+KS-091. Toto je vektor rezistentní na geneticin. Konečně byly buňky transfekovány plazmidem pZeo-PCMV-rTHAKSIRES-bDBH-088 s prokázanou rezistencí na Zeocin.

Buňky AtT-20 byly transfekovány plazmidv pBS-CMV-ProA a pCEP4-POMC-AACTH-32, které prokazovaly rezistence na geneticin a hygromycin, v uvedeném pořadí. Konečně byly buňky transfekovány plazmidem pZeo-Pcmv-rTHAKS-IRES-bDBH088 .

• · · · · · ·· ·· ··· ·

Testovali jsme množství médii na buněčný růst. Překvapivě jsme nalezli, že v určitých živných médiích bez séra měly výše uvedené buněčné linie ve srovnáni se živnými médii obsahujícími sérum vyšší tvorbu neurotransmiteru. Dáváme přednost CHO-Ultra (Biowhitaker) pro pěstování buněk AtT-20 a Ultra-Culture pro pěstování buněk RIN.

Tvorba různých analgetik jednou transformovanou buněčnou linií RINa (RINa/ProA/P030/P088) je ukázána v tabulce 2. Všechny hodnoty představují nestimulované buňky. Produkce β-endorfinu a met-enkefalinu je v pg/10⁶ buněk/h. βendorfin a met-enkefalin byly měřeny radioimunotestem za použití souprav Incstar (Stillwater, Minnesota). Produkce katecholaminů je v pmol/10^s buněk/h. Čísla v závorkách představují hodnoty z buněk, které byly preinkubovány 18 hodin s 100 μΜ tetrahydrobiopterinu. Katecholaminy byly měřeny HPLC, jak je popsáno v Lavoie a kol., „Two PC12 pheochromocytoma lineš sealed in hollow fiber-based capsules tonically release 1-dopa in vitro, Cell transplantation, 2, 163-173 (1993). Produkce GABA těmito buňkami RIN byla 28 ng/10^D buněk/h.

Tabulka 2

Buněčná linie	Endogenní analgetické lát ky	β-endorfin	met-enk	DA E
RINa/ProA/	β-endorfin	22	17	3 0
POMC/	GABA			(6) (2)

TH-IRES-θβΗ

	.. ♦· ····
• · • · • · • ·	• · · · • • 9 · • ·	• · • •	• · · I · • · · - • · ··· · • · ·
• ·	···		···· ·· ·

Existuji latentni fragmenty enkefalinu, které nevznikají plným zpracováním prekurzorové molekuly proenkefalinu. Tyto latentni enkefaliny mají vazebnou aktivitu pro opioidní receptory. Štěpili jsme tyto latentni enkefaliny pro změření jejich opioidní aktivity. Protokol štěpení trypsinem je popsán dále. 2 gg/ml trypsinového (Worthington č. 34E470) roztoku se přidá do vzorků živného média na ledu. Vzorky se protřepou, a poté se inkubuji po dobu 20 minut ve vodní lázni při 37 °C. Po době štěpení 20 minut se vzorky vrátí na led a přidá se 100 ng/ml karboxypeptidázy B (Sigma č. C-7011). Vzorky se protřepou a vrátí na 15 minut do vodní lázně 37 °C. Poté se vzorky ještě jednou umístí na led a přidá se 10 ug/ml inhibitoru trypsinu. V tomto stupni se ze vzorků buď extrahuje metenkefalin, nebo jsou okamžitě zmrazený pro budoucí extrakci. Toto má za následek plné enzymatické štěpení všech volných met-enkefalinů z dlouhých latentních fragmentů. Radioimunotest pro stanovení met-enkefalinu v naštěpeném vzorku udává celkový met-enkefalin ze supernatantu. Ukazuje se, že transformované buňky RINa mají více než 5x více latentních enkefalinů než plně zpracovaných met-enkefalinů.

Vznik a vlastnosti vláknitého pouzdra

Dutá vlákna jsou vyráběna z 12,5 až 13,5% roztoku póly(akrylonitrilvinylchloridu) mokrou zvlákňovaci metodou. Cabasso, Hollow Fiber Membranes, díl 12, Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, Wiley, New York, 3.

• · ··· ·

Ed., 492-517, (1980), patent Spojených Států 5 158 881, zahrnuto v odkazech.

Výsledná membránová vlákna mohou být buď dvouvrstevná nebo jednovrstevná vlákna PAN/PVC. Aby se vytvořila implantovatelná pouzdra, dlouhé vlákno je nejprve nařezáno na segmenty dlouhé 5 cm a jeden konec každého segmentu je zalepen akrylátovým lepidlem. Vláknité pouzdro s plnicím hrdlem vznikne tak, že jeden konec vlákna je zalepen jednou kapkou LCM 24 (světlem tvrditelné akrylátové lepidlo, dostupné od ICI), lepidlo se pak vytvrdí modrým světlem a krok se opakuje s druhou kapkou. Opačný konec vlákna se předem připojí ke křehkému plnicímu hrdlu se silikonovou přepážkou, kterou může být zaveden roztok buněk. Vlákno je přilepeno k hrdlu aplikací LCM 22 na vnější průměr hrdla a přetažením vlákna přes ně, poté je lepidlo vytvrzeno modrým světlem. Vlákna spojená s plnicím hrdlem jsou umístěna do sterilizačních sáčků a sterilizována ETO.

Po sterilizaci etylendioxidem a odplynění jsou vlákna deglycerinována ultrafiltrací nejdříve 70% EtOH a poté fyziologickým roztokem pufrovaným HEPES přes stěny vláken ve va kuu.

Příprava a opouzdření transformovaných buněk

Transformované buňky jsou připraveny a opouzdřeny jak je popsáno dále:

Je připraven roztok živné půdy za použití komerčně dostupného alginátu, kolagenu nebo jiného vhodného materiálu pro živnou půdu. Roztok buněk je naředěn v poměru dva díly roztoku živné půdy k jednomu dílu buněčného roztoku obsahujícího transformované buňky popsané výše. Dáváme přednost Vitrogenu (Celtix, Santa Clara) jako živné půdě pro buňky AtT-20.

Jako živné půdě pro buňky RIN dáváme přednost Organogenu (Organogenesis, Canton, MA) . Buňky RINa jsou pro opouzdření připraveny následující metodou. Buňky jsou pěstovány v základním živném médiu DMEM s 10% fetálním bovinním sérem během proliferační fáze. Tyto buňky jsou odstraněny z lahví tkáňových kultur dvojím promytím v Hanksově balancovaném solném roztoku bez kalcia a magnézia. Poté jsou buňky inkubovány 1 minutu v 0,25% trypsinu + EDTA. Roztok se odstraní a buňky jsou propláchnuty mimo láhev za použití Hanksova balancovaného solného roztoku bez kalcia a magnézia. Buňky jsou umístěny do 10 ml základního živného média a centrifugovány ve 100 x g po dobu 2 minut. Buňky jsou poté resuspendovány v 10 ml preferovaného živného média bez séra (Ultra culture, Biowhitaker, Walkersville, MD). Překvapivě buňky RIN secernují více analgetických látek, jsou-li pěstovány v živném médiu bez séra, než v základním médiu obsahujícím sérum.

Buňky jsou dvakrát centrifugovány při 100 g v preferovaném médiu bez séra před tím, než jsou buňky koncentrovány 1:1 preferovanou živnou půdou Organogen. Organogen je 1% kolagen z bovinních šlach k dostání jako sterilní roztok. 8 částí tohoto roztoku se smísí s 1 částí lOx DPBS. Přidává se 0,5 N hydroxid sodný, dokud se nedosáhne fyziologického pH (přibližně 250 μΐ).

Konečná koncentrace roztoku buňky + živná půda používaného pro opouzdření může kolísat v rozmezí od 20 000 do 50 000 buněk/μΐ. Buňky se počítají standardním způsobem na hemocytometru.

Suspenze buňky/živná půda se umístí do 1 ml injekční stříkačky. Mikrolitrová stříkačka typu Hamilton 1800 série 50 je nastavena na 15 mikrolitrové vzduchové bubliny, je *· · · · · vložena do 1 ml stříkačky obsahující roztok buněk a je vytaženo 30 mikrolitrů. Buněčný roztok se injikuje přes silikonovou přepážku v plnicím hrdle do lumina dutého vlákna z akrylátové membrány, která se chová jako molekulární síto s limitem přibližně 50 000 až 100 000 daltonů. Je možné pozorovat ultrafiltraci podél celé délky vlákna. Po jedné minutě je hrdlo odlomeno, čímž se odhalí čistý povrch nesmáčený buněčným roztokem. Aplikuje se jedna kapka LCM 24 a lepidlo se vytvrdí modrým světlem. Naplněné vlákno se pak umístí nejdříve do roztoku NaCl pufrovaného HEPES, a poté po dobu 5 minut do roztoku CaCl₂, aby se zesítil alginát. Každý implantát j.e 5 cm dlouhý, v průměru 1 mm a obsahuje přibližně 2,5 milionu buněk.

Poté, co jsou dutá vlákna naplněna a zalepena, je na proximální konec takto vzniklého pouzdra umístěno silikonové uvazovací lanko (Speciality Silicone Fabrication, Pašo Robles, CA) (ID: 0,69, OD: 1,25). Do lumina silikonového uvazovacího lanka je vložena radiokontrastní titaniová zátka, která účinkuje jako radiografická značka. Naplněná a ošetřená pouzdra jsou poté umístěna na misky pro tkáňové kultury o průměru 100 mm v 1,5 ml PC-1 živného média a uschována při 37 °C v inkubátoru s 5% CO₂ pro analýzu in vitro a uskladnění do doby implantace.

Opouzdřené buňky jsou poté implantovány do lidského subarachnoidálního prostoru jak je popsáno v následující části.

Chirurgický postup

Po zajištění i.v. přístupu a podání profylaktických antibiotik (cefazolin sodný, 1 gram i.v.) je pacient umístěn na operačním stole, obecně buď v laterální poloze vleže nebo v genu-pektorální pozici, s lumbální páteří ohnutou dopředu.

Operační pole je sterilně připraveno a zarouškováno tak, že je odhalena dorzální lumbální oblast ve střední čáře od úrovně S-l do L-l, a je umožněno intraoperativní zobrazení lumbální páteře rentgenovou skiaskopií. Je použita lokální infiltrace 1,0% lidokainem pro zajištěni anestezie kůže, periostu a dalších hlubokých struktur pojivové tkáně až k a včetně ligamentum flavum.

V parasagitální rovině je provedena 3 až 5 cm dlouhá incize kůže 1 až 2 cm vpravo nebo vlevo od střední čáry, která pokračuje dolů k lumbodorzální fascii při použití elektrokauterizace pro zástavu krvácení. Za použití tradičních kostních orientačních bodů včetně kyčelních hřebenů a výběžků lumbální páteře, a také skiaskopického navádění, je zavedena do subarachnoidálního prostoru mezi L3 a L-4 Touhyho jehla kalibru 18 cestou šikmého paramediánního přístupu. Jehla je namířena tak, že vstoupí do prostoru v mělkém nahoru nasměrovaném úhlu, který není větší než 30 až 35°, s ohledem na míchu v každé z rovin sagitálni i příčné. Příslušná pozice špičky jehly je potvrzena vytažením několika ml mozkomíšního moku (CSF) pro stanovení hladin katecholaminů, enkefalinu, glukózy, proteinů a počtu buněk před implantací.

Hrdlo Touhyho jehly je znovu vyšetřeno, aby se potvrdilo, že otvor ve špičce je orientován nahoru (směr otvoru je označen zářezem pro obturátor na hrdle jehly) a zaváděcí drát je protlačen dolů luminem jehly, dokud se nedostane 4 až 5 cm do subarachnoidálního prostoru (určeno předběžným měřením). Během pasáže drátu se dbá na to, že postupu drátu z jehly není kladen žádný odpor a že si pacient nestěžuje na významné neurogenni příznaky, každé z těchto pozorování by mohlo indikovat špatný směr zaváděcího drátu a možné ohrožení nervového kořene nebo poranění míchy.

Poté, co je zaváděcí drát patřičně umístěn v subarachnoidálním prostoru, je Touhyho jehla samostatně vytažena a odstraněna z drátu. Pozice drátu ve střední čáře míšního kanálu, před očekávanou lokalizací cauda equina a bez smyček nebo nevysvětlitelných ohybů, je poté potvrzena skiaskopicky. Po odstranění Touhyho jehly by měl být zaváděcí drát schopný volného pohybu do a z prostoru s pouze velmi slabým odporem způsobeným drsným povrchem drátu běžícího skrze hutné a fibrózní ligamentum flavum.

Na zaváděcí drát se poté umístí Frenchův dilatátor č. 7 a drát se použije k vedení dilatátoru, který je jemně, ale pevně protlačován přes fascie, paraspinální svaly a ligamentum flavum, sledující dráhu drátu směrem k subarachnoidálnímu prostoru. Jakmile se detekuje ztráta odporu po průchodu ligamentum flavum, je postup Frenchova dilatátoru č. 7 zastaven a dilatátor je z drátu odstraněn. Toto je prováděno za účelem zabránit postupu a manipulaci tohoto relativně rigidního dilatátoru v subarachnoidálním prostoru do jakkoli významného stupně.

Poté co je dráha drátu „přespříliš roztažena použitím

Frenchova dilatátoru č.

7, jsou spojeny Frenchův dilatátor

č.

a pouzdro kanvlv a jsou umístěny na zaváděcí drát.

Frenchův dilatátor č.

a kanyla jsou opatrně posouvány vpřed do subarachnoidálniho prostoru, dokud není otvor špičky kanyly umístěn 7 cm v prostoru. Stejně jako u Frenchova dilatátoru č. 7 je Frenchův dilatátor č. 6 spojený s kanylou směrován drátem v lumen dilatátoru. Umístění v neurologickému poranění.

subarachnoidálním prostoru je určeno předchozím měřením zařízení a je přibližně potvrzeno skiaskopií. Manipulaci dilatátoru a kanyly v subarachnoidálním prostoru je věnována velká péče, aby se zabránilo špatnému směru a možnému

Když je potvrzeno příslušné umístění kanyly, jsou zaváděcí drát a Frenchův dilatátor č. 6 postupně jemně

odstraněny z lumina kanyly. V závislosti na pozici pacienta na operačním stole může být v tomto bodě znatelný až velmi výrazný průtok mozkomíšního moku kanylou, což vyžaduje zazátkováni kanyly nebo velmi rychlé umístění implantovaného

pouzdra,	aby se zabránilo nadměrné ztrátě mozkomíšního moku.
Οροι	izdření (transformované buňky) je poskytováno ve
sterilní	nádobě s dvojitým obalem, ponořeno v transportním

médiu a plně sestaveno včetně tubulárního silikonového uvazovacího lanka. Před implantací kanylou do subarachnoidálního prostoru je pouzdro přeneseno na podnos inzerčního kitu, kde je umístěno v pozici, která umožňuje udržovat pouzdro v transportním médiu, zatímco je zhruba vyšetřováno na poškození nebo větší defekty, a zatímco je kráceno silikonové uvazovací lanko a jeho délka upravena pro posunovací zařízení a odstraňuje se svorka hemaclip™, která uzavírá zevní konec pouzdra.

Když se mebránová část zařízení opatrně vloží do kanyly, je uvazovací část pouzdra umístěna na posunovací zařízení z nerezavějící oceli zasunutím drátu o malém průměru, který tvoří část posunovacího zařízení. Pouzdro se posunuje vpřed, dokud nedosáhne vrcholek membrány bodu, který je 2 až 10 mm v kraniální špičce kanyly v subarachnoidálním prostoru. Tohoto umístění je dosaženo přeměřením kanyly a spojení pouzdro-uvazovací lankoposunovací zařízení, a zajišťuje, že membránová část pouzdra je chráněna kanylou po celou dobu, kdy je posunována na místo.

Poté, co je pouzdro umístěno v kanyle, je posunovací zařízení použito k tomu, aby drželo pouzdro na místě (bez posunu vpřed či vzad) v subarachnoidálním prostoru, zatímco je kanyla kompletně vytažena z pouzdra a posunovacího zařízení. Poté je z pouzdra odstraněno posunovací zařízení tak, že jeho drátěná část sklouzne ze silikonového uvazovacího lanka. Za použití této metody je konečné umístění pouzdra takové, že 5 cm dlouhá membránová část pouzdra leží plně v subarachnoidálním prostoru obsahujícím mozkomíšní mok ventrálně ke cauda equina. Na svém kaudálním konci je ukotveno přibližně 1 až 2 cm silikonového uvazovacího lanka, které běží v subarachnoidálním prostoru, než lanko opustí prostor přes důra a ligamentum flavum. Silikonové uvazovací lanko pokračuje od této úrovně externě přes paraspinální svaly a vynořuje se z lumbodorzální fascie při ponechání obecně 10 až 12 cm volného materiálu, který je dostupný pro zajištění pouzdra.

Únik mozkomíšního moku je minimalizován injekcí fibrinového lepidla (Tissel®) do dráhy, kterou uvazovací lanko zabírá v paraspinálním svalu a pevným uzavřením otvoru dráhy v superfaciální fascii tabákovým stehem. Volný konec uvazovacího lanka je poté ukotven neabsorbovatelným stehem a kompletně zakryt 2-vrstevným uzavřením kůže a subkutánní tkáně.

Pacient je poté převezen do zotavovacího prostoru po neurochirurgickém výkonu a držen vleže v přísném klidu na lůžku po 24 hodin po operaci. Po implantačním výkonu se také 24 hodin pokračuje v antibiotické profylaxi.

Claims (29)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Buňka stabilně transformovaná tak, aby tvořila alespoň jednu sloučeninu s analgetickým účinkem z každé ze skupin zahrnující endorfiny, enkefaliny a katecholaminy.
2. 2. Buňka podle nároku 1, kde endorfin je β-endorfin.
3. 3. Buňka podle nároku 1,
4. 4. Buňka podle nároku 1, kde enkefalin je met-enkefalin.

   kde katecholamin je norepinefrin nebo epinefrin.
5. 5. Buňka podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, kde buňka je buňka RIN.
6. 6. Buňka podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, kde buňka je buňka AtT-20.
7. 7. Buňka podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, kde buňka navíc produkuje sloučeninu vybranou ze skupiny zahrnující galanin, somatostatin, neuropeptid Y, neurotenzin nebo cholecystokinin.
8. 8. Buňka transformovaná DNA kódující POMC, DNA kódující TH, DNA kódující DBH a DNA kódující ProA, každá molekula DNA je funkčně spojena se sekvencí řídící expresi.
9. 9. Buňka podle nároku 8, kde buňka je transformovaná pCEP4-

   POMC-030, pcDNA3-hproA+KS-091 a pZeo-pCMV-rTHÁKS-IRES-bDBH088.

   • ·
10. 10. Buňka podle nároku 8, kde buňka je transformovaná pCEP4hPOMC-AACTH-032, pBS-CMV-proA a pZeo-pCMV-rTHAKS-IRES-bDBH088 .
11. 11. Buňka podle nároku 8, kde buňka je transformovaná pcDNA3- hPOMCDACTH-IRES-rTHD-IRES-bDBH-IRES-Zeocin-073 a pcDNA3-proA+KS-091.
12. 12. Transformovaná buňka produkující alespoň jeden enkefalin, jeden endorfin a jeden katecholamin, kde buňka je transformovaná s:

    prvním vektorem obsahujícím DNA kódující POMC funkčně spojenou se sekvencí řídící expresi, druhým vektorem obsahujícím DNA kódující pro-enkefalin A funkčně spojenou se sekvencí řídící expresi, třetím vektorem obsahujícím DNA kódující TH funkčně spojenou se sekvencí řídící expresi a DNA kódující dopamin betahydroxylázu funkčně spojenou se sekvencí řídící expresi.
13. 13. Způsob pro léčení bolesti, vyznačující se tím, že zahrnuje implantování léčebně účinného množství buněk podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12 pacientovi do místa implantace.
14. 14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že buňky jsou opouzdřeny v semi-permeabilní membráně, aby vytvořily biologický umělý orgán.
15. 15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že biologický umělý orgán je imunologicky izolující.
16. 16. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 13 až 15, vyznačující se tím, že místo implantace je CNS.
17. 17. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 13 až 15, vyznačující se tím, že místo implantace je subarachnoidálni prostor.
18. 18. Způsob vytvoření buňky, která secernuje alespoň jeden enkefalin, jeden endorfin a jeden katecholamin, vyznačující se tím, že zahrnuje transformaci buňky DNA kódující POMC funkčně spojenou s první sekvencí řídící expresi, DNA kódující pro-enkefalin A funkčně spojenou s druhou sekvencí řídící expresi a DNA kódující TH funkčně spojenou s třetí sekvencí řídící expresi a DNA kódující dopamin betahydroxylázu funkčně spojenou se čtvrtou sekvencí řídící expresi.
19. 19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že první, druhá, třetí a čtvrtá sekvence řídící expresi jsou identické.
20. 20. Použití buněk podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12 pro přípravu léčiva pro léčení bolesti.
21. 21. Buňky podle nároku 20, kde buňky jsou implantovány.
22. 22. Buňky podle kteréhokoliv z nároků 21 a 22, kde buňky jsou opouzdřený v semipermeabilní membráně, aby vytvořily biologický umělý orgán.
23. 23. Buňky podle nároku 22, kde biologický umělý orgán je imunologicky izolující.
24. 24. Buňky podle kteréhokoliv z nároků 21 až 23, kde místo implantace je CNS.
25. 25. Buňky podle kteréhokoliv z nároků 21 až 23, kde místo implantace je subarachnoidální prostor.
26. 26. Biologický umělý orgán, vyznačující se tím, že obsahuje:

    (a) biokompatibilní, permeabilní plášť obklopující j ádro a (b) jádro obsahující alespoň jednu živou buňku transformovanou tak, aby produkovala alespoň jednu sloučeninu s analgetickým účinkem z každé ze skupin zahrnující endorfiny, enkefaliny a katecholaminy.
27. 27. Biologický umělý orgán podle nároku 26 pro použití k léčení bolesti.
28. 28. Způsob vytvoření biologického umělého orgánu, vyznačující se tím, že zahrnuje opouzdření jádra obsahujícího alespoň jednu živou buňku transformovanou tak, aby produkovala alespoň jednu sloučeninu s analgetickým účinkem z každé ze skupin zahrnující endorfiny, enkefaliny a katecholaminy, s biokompatibilnim permeabilním pláštěm.
29. 29. Použití biologického umělého orgánu obsahujícího buňky podle nároků 1 až 12 při přípravě léčiva pro léčbu bolesti.