CZ323699A3 - Kostní pasta - Google Patents

Abstract

Kostní pasta využitelnáv ortopedických oborech, např. při rekonstrukci pseudoartróz, zvětšování periodontálního oblouku, v kranioíaciální chirurgii, při fixacích implantátů a jiných postupech, kdeje nutné generování nové kosti, přičemž její složení obsahuje v podstatě biologicky vstřebatelnou osteogenní složku v želatinové hmotě. V různých provedeních je osteogenní složka vybírána z následujících možností: (i) demineralizovaná kostní hmota (DBM); (ii) bioaktivní sklokeramika, bioaktivní sklo, bioaktivní keramika, fosforečno-vápenitá keramika, hydroxyapatit, uhličitan hydroxyapatitu, koralický hydroxyapatit, kaldnovanákost, fosforečnan vápenatý nebo podobnýmateriál; (iii) kostní morfogenetický protein, růstové faktory TGF-β, PDGF nebo jejich směsi, přírodní či rekombinované a (iv) směsi (i) až (iii).

Description

Kostní pasta

Oblast techniky

Vynález se týká nového osteogenního, osteoindukčniho složení pro použití v oblasti ortopedie ke spojování kostí, fixaci implantátů ke kosti, vyplňování kostních defektů a v libovolných dalších aplikacích, v nichž je potřebné osteoindukční osteogenni složeni.

Dosavadní stav techniky

Ve Spojených státech se provádí každoročně více než 100 000 zákroků týkajících se kostních štěpů (Cornell). Ve většině rekonstrukčních procesů se používá materiál štěpu jako výplň mezi kostními částicemi ve snaze dosáhnout nepřetržitým kontaktem mezi kostními částicemi rychlejšího a dokonalejšího hojeni v místě zákroku (i lepší mechanické integrity) (Bloebaum). V případech zvětšování kosti a spojů v oblasti páteře mohou tyto kostní štěpy tvořit celou strukturu štěpu, protože v dané oblasti nejsou žádné kostní fragmenty. S možnou výjimkou jednoho produktu (u jehož použití to návod nepovoluje) vyžadují všechny materiály štěpu chirurgický zásah s potřebnou kožní incisí.

Osteogenni materiály pro kostní štěpy mohou být rozděleny do dvou skupin, konkrétně na osteokondukční materiály a osteoindukční materiály. Přesná definice obou pojmů je předmětem diskusi, lze však říci, že ostekondukční štěpy vedou* pň implantování do kostní tkáně růst kosti přes defekty (Einhorn).

• · • · • · ·· · 4

Osteoindukční štěpy dokáží na druhé straně indukovat* v buňkách v příslušné oblasti, aby vytvořily kost samy (Einhom). Tyto osteoindukční štěpy budou vyvolávat tvorbu kosti, i když budou implantovány do jiné tkáně než kostní (např. při podkožní nebo nitrosvalové implantaci) (Einhorn; Benedict; Strates; Urist).

Všechny uměle vytvořené materiály pro kostní štěpy, které jsou nyní k dispozici, spadají do osteoindukční kategorie štěpů. Patří sem Bioglass®, Norian®, Collagraft®, koralický hydroxyapatit (pozn. pfekl.: hydroxyapatit ve formě zvápenatělé korálové pěny), práškový hydroxyapatit, krystalický a amorfní hydroxyapatit (hydroxylový apatit) a řada dalších produktů. Všechny tyto štěpy vycházejí ze své podobnosti s hyroxyapatitem přirozené kosti. Analogický mechanismus procesu vedení v kostech spočívá ve schopnosti těchto materiálů podporovat difúzi trofických faktorů a buněk po veimi rozsáhlých povrchových plochách a poskytováni mechanické podpory rostoucím tkáním. Výčet příslušných vlastnosti vybraných materiálů kostních štěpů je na obrázku 1.

Jinou kategorii v současné době dostupných materiálů kostních štěpů tvoří autoštěpy a aloštěpy. Nejsou-li příliš hrubě zpracovány, jsou tyto materiály obecně osteoindukční (Yazdi). Protože jde o tkáňové štěpy, jejich použití s sebou nese určitá rizika. Autoštěpy jsou spojeny s komplikacemi souvisejícími s místem ocfoěru přesahujícími 20 % (Younger). Zmražené či vymražené aloštěpy vyvolávají určitou imunologickou reakci a nejsou-ii správně sledovány, mohou přenášet choroby (Hordin). Poslední variantou aloštěpů je demineralizovaná kostní hmota.

Demineralizovanou kostní hmotu (zkratka DBM z anglického Demineralized Bone Matrix) poprvé popsal Senn v roce 1889 (Senn). Koncem šedesátých let byla znovu objevena, z velké části náhodou, kdy ji podrobně prostudovali Urist a Strates. Stala se hlavním produktem tkáňových bank po celém světě. Jak název napovídá, jedná se kost, která byla zbavena minerálů ošetřením kyselinou. Podrobné schéma procesu, jak vyrobit tento produkt, je na obrázku 2.

DBM dokáže vyvolat formováni kosti dokonce i v nekostnich tkáních během 4 týdnů (Strates; Urist; Lasa). Standardně se pro stanoveni aktivity DBM

-3používá podkožní nebo nrtrosvalové implantace (Nathan). Hlavním aktivním faktorem v DBM je pravděpodobně jeden nebo větší počet kostních morfogenetických proteinů (zkratka BMP z anglického Bone Morphogenetic Proteins) (viz patent Spojených států č. 4 294 753, který je zde uveden v odkazech). Další růstové faktory, mezi nimi např. TGF-beta (viz patent Spojených států č. 5 422 340, který je zde uveden v odkazech), růstový faktor získaný z krevních destiček (PDGF), a podobné složky, mohou být pro tuto funkci také důležité.

Biogiass® je materiál pro kostní štěpy. Jedná se o sklo z oxidů SÍ02, Na0₂, CaO, P₂O₅, které dokáže vytvořit bioaktivní povrchovou vrstvu hydroxyapatitového uhličitanu řádově v minutách po implantaci (Hench).

Užiti materiálu DBM a Biogiass je spojeno se dvěma problémy. Oba materiály jsou dodávány jako velké částice a nezůstávají vždy v oblasti, do niž jsou implantovány. (Scarborough; Frenkel). V důsledku hrubého složeni se také obtížně tvaruji a těžko se v operačni místnosti zpracovávají. Je tedy třeba vyvinout produkt, který neumožňuje migraci částic, a zároveň se s ním v operačním prostředí snadněji pracuje.

Jak je uvedeno v tabulce 1, objevilo se v posledních několika letech na trhu několik operačních past sloužících jako kostní výplň. Rozsah těchto produktů se pohybuje od jednoduchých směsí fyziologického roztoku s práškem podobným pisku až po nedávno vytvořený gel s názvem GRAFTON®, což je složení na bázi glycerolu, které neprovádí zesiťováni. Všechny tyto produkty se používají v ortopedii k rekonstrukci kostních defektů, jako jsou např. prázdná místa, dutiny, praskliny atp. Tyto defekty mohou být následkem úrazu či mohou být vrozené a známé pasty lze použit k jejich opravě nebo vyplnění, nebo k vytvoření nadstavby nad stávajícími kostními strukturami. Konečný cíl těchto postupů spočívá v tom, aby pasta vyvolala tvorbu kosti a aby bylo možno pastu nahradit při zachováni tvaru, který lékař vytvořil při aplikaci pasty.

» · · · » · · · ·· · ·· ·

-4Je žádoucí, aby kostní pasta byla osteokondukčnl (tzn. aby rozváděla kostní buňky do oblasti) a osteoindukční (tzn. indukovat v kmenových buňkách tvorbu kostních buněk, které začnou formovat novou kost). Obecně jsou kostní pasty, jež jsou v oboru známy, osteokondukčnl pouze se slabými osteoindukčními účinky. Proto nejsou tyto známé pasty vhodné pro vyplňování velkých dutých míst a často nemají ani správný účinek na formováni kosti ani u malých dutin. Se všemi v současné době dostupnými kostními pastami, včetně těch, které prokazují určitou osteoindukční aktivitu, se obtížně manipuluje, nezůstávají na místě implantace či prokazuji oba tyto nedostatky.

Jeden z komerčně dostupných produktů, GRAFTON® (viz patent Spojených států č. 5 484 601) je složení, neprovádějící zesíťování, přičemž se jedná o demineralizovaný kostní prášek rozpuštěný v polyhydroxylové sloučenině (např. glycerolu) nebo jejích esterech, obsahující další složky dle výběru, včetně želatiny. Tento materiál je pravděpodobně rychle odplavován z místa implantace, protože nosičem je giycerol, který je rozpustný ve vodě.

Patenty Spojených států č. 5 236 456 a 5 405 390 (O’Leary a Prewett) ukazují osteogenní gelové složení, tvořené demineralizovanou kostní hmotou (DBM) ošetřenou koncentrovanou kyselinou (3M HCI) a zahřátou na 40°C až 50°C. Patent stručně popisuje promíchání gelu s DBM a několika dalšími složkami. Postup výroby gelu však spočívá v tom, že vytváří zejména vlákna kolagenu (tzn. nárůst teploty nepostačuje k vytvoření želatiny). V důsledku toho nejsou kolagenová vlákna rozpustná v neutrálních roztocích. Aby se získal gel, patent stanovuje, že kolagen musí být rozpuštěn v kyselině s nízkým pH (např. v HCI nebo 1 %-ní kyselině octové s pH menším než 4,0). Složení s nízkým pH však nejsou v typickém případě příliš kompatibilní s biologickými implantáty. Je též třeba poznamenat, že ve sloupci 5, řádku 20, a ve sloupci 6, řádku 15, je stanoveno, že teplota, v niž gel tuhne, je 0 až 5°C, což vylučuje gelaci v podmínkách in vivo.

Patent Spojených států č. 4 440 750 (Glowacki a Pharris) ukazuje standardní enzymatický postup extrakce kolagenu z tkáně užitím pepsinu. Velmi ♦ · » · · • · · fl

-5jemně čištěný kolagen se získává ze zvlFat, přičemž před přípravou pracovního složeni je rekonstituován. Kolagen bez přidáni dalších chemikálií (např. aldehydů, chondritinsulfátu atp.), jež nejsou ve složení specifikovány, neprovádí zesíťování. Není zde uvedeno nastavení teploty a ani zmínka o zesíťováni.

V patentu Spojených států č. 4 394 370 a 4 472 840 (Jefferies) jsou zaznamenány komplexy rekonstituovaného kolagenu s demineralizovaným kostním či solubilizovaným kostním morfogenetickýcm proteinem, dle volby zesfténé s glutaraldehydem, jako osteogennl při implantaci in vivo. Rekonstituovaný kolagen podle těchto patentů je rozdrobený, lyofilizovaný a mikrokrystalický a byl předem dialyzován, aby se odstranila kyselina chlorovodíková použitá při přípravě kolagenu. Složení podle těchto patentů nezahrnuje konverzi kolagenu na želatinu předcházející zformování složení. Složení v daném stavu tedy neprovádí zesíťování.

Patent Spojených států č. 4 678 470 (Nashef a kol.) se zabývá nevstřebatelným materiálem pro kostní štěpy, obsahujícím demineralizovanou kostní hmotu, která síťovala po ošetření glutaraldehydem nebo jiným síťovadlem, suspendovanou v želatinovém nebo polotuhém nosiči. Za předpokladu, že demineralizovaná kost podle tohoto patentu je chemicky zesítěna, budou její schopnosti kostní indukce zničeny a složení v zásadě tvoří strukturální výplň nebo hmotu, do níž může vrůstat kost příjemce.

Ve WO 89/04646 (Jefferies) je popsán materiál pro rekonstrukci kostí, vyznačující se dobrou strukturální pevností. Materiál obsahuje demineralizovanou kostní hmotu, která je povrchově aktivována ošetřením glutaraldehydem nebo podobným síťovadlem za účelem zvýšení vazebných schopností s biokombatibilními hmotami. Výsledný materiál má tak pevnou strukturu, že jej ize před implantaci do biologického příjemce strojově obrábět.

Kostní pasta podle vynálezu vyhovuje potřebám stavu techniky, jelikož poskytuje materiál, s nímž se snadno manipuluje a lehce se skladuje, drží se na místě implantace, vykazuje osteokondukční i osteoindukční vlastnosti, je termálně • ·

-6• · • · · 4 • · · 4 • · « · · 4 • 4 • · ·· síťovatelný a je v podstatě biologicky vstřebatelný. Složení má přednostně formu gelu, obsahujícího minerálovou a proteinovou složku, u nichž bylo klinicky prokázáno, že vyvolávají rychlé vrůstání kosti. Složení lze dodat operatérovi v předem připravené injekční stříkačce, která je již připravena k výkonu. Při první dané teplotě je gel přednostně snadno formovatelný do libovolného tvaru a je adhezivní. Jakmile je gel již v biologickém prostředí, neboli při druhé, nižší, teplotě, ztvrdne do pružného prostorového útvaru, který není odplavován ani se jinak nepohybuje z místa implantace. Při růstu kosti se materiál štěpu stane zcela součásti biologického systému. Způsob vytvoření a použití tohoto složení je podrobně popsán níže.

Podstata vynálezu

Kostní pasta využitelná v ortopedických oborech, např. pn rekonstrukci pseudoartróz, zvětšování periodontálního oblouku, v kraniofaciální chirurgii, při fixacích implantátů, artrodéze v oblasti páteře či jiných kloubů, včetně spojů v oblasti páteře a při dalších postupech, kde je nutné generování nové kosti, přičemž její složeni obsahuje želatinu a další osteogenni komponenty. Želatina je přednostně termálně zesítěna a osteogenni složky se volí z následující skupiny:

(i) demineralizovaná kost, přednostně odebraná z druhů, do nichž má být implantována kostní pasta nebo (ii) bioaktivnf sklokeramika, BIOGLASS®, bioaktivní keramika, fosforečno-vápenřtá keramika, hydroxyapatit, uhličitan hydroxyapatitu, koralický hydroxyapatít, kalcinovaná kost, fosforečnan vápenatý a podobné materiály nebo jejich směsi a (iii) kostní morfogenetický protein, TGF-beta, PDGF nebo jejich směsi, přírodní či rekombinované a (iv) směsi (i) až (iii).

-7• a ··

Použye-li se (ii) či podobný materiál, zvýši se rozsah manipulovatelných vlastnosti pevnosti a osteoindukce, které vykazuje složeni. V případě (iii) se snižuje potřeba použití demineralizované kosti, což jinak slouží jako zdroj osteoindukčnich faktorů.

Demineralizovaná kost se ukázala jako velmi účinná při indukci formování kosti. Želatin slouží jako síťovatelná, adhezivní a snadno manipulovatelná hmota, v niž se přenášej! osteoindukční a osteokondukčnl prvky složeni. Lze zahrnout i další faktory, jako jsou antibiotika, kostní morfogenetické či jiné proteiny, ať jsou získávány z přírodních, či rekombinovaných zdrojů, smáčedla, glycerol, dextran, karboxymethylovou ceiulosu (CMC), růstové faktory, steroidy, nesteroidni a protizánětlivé sloučeniny nebo jejich kombinace či jakýkoli daiši materiál, podporujíc! žádouci vlastnosti základního složení vynálezu.

Složeni může být vymraženo nebo připraveno předem a lze jej dodat ve vhodném dávkovacím zařízení, jako je např. předem připravená injekční stříkačka. Gel je přednostně v tekutém nebo ve velmi tvárném stavu při teplotě zhruba nad 40°C, při teplotě rovnající se nebo mírně převyšující teplotu organismu, do níž je implantován (např. 38°C u lidského organismu), se však mění na tvrdý gel.

Přehled obrázků na výkresech

Na obrázku 1 je přehled stávajících materiálů pro kostní štěpy.

Obrázek 2 znázorňuje postup demineralizace kostí.

Na obrázku 3 je graf závislosti kinematické viskozity (jednotky - centistoky) na koncentrace (v %) pro lidskou želatinu zpracovávanou při různých teplotách ve fosforečném tlumivém fyziologickém roztoku (PBS).

Obrázek 4A je fotomikrograf části štěpu obsahující demineralizovanou kostní hmotu (DBM) bez nosiče po čtyřech týdnech nitrosvalové aplikace u krysy.

-8Obrázek 4B je fotomikrograf části štěpu obsahujíc! 33 % DBM v želatině (tzn. týká se pasty podle vynálezu) po čtyřech týdnech nítrosvalové aplikace u krysy.

Příklady provedeni vynálezu

Odbornici v oboru budou vědět, že specifické stránky složení tohoto vynálezu, postup jeho přípravy a použiti jsou aplikovatelné na složení tohoto typu používaná u jakéhokoli druhu obratlovců. Nicméně, jelikož tento nový materiál bude v ortopedii aplikován zejména na člověku, zaměřuje se následující popis na příklady využití materiálu v humánní medicíně.

Složení materiálu podle vynálezu obsahuje želatinu a další osteogenní složky. Želatina tvoři přednostně termální zesiťování a osteogenní složky se vybírají z následující skupiny:

(i) demineralizovaná kost, přednostně odebraná z druhů, do nichž má být implantována kostni pasta nebo (ii) bioaktivní skiokeramika, BIOGLASS®, bioaktivní keramika, fosforečno-vápenitá keramika, hydroxyapatit, uhličitan hydroxyapatitu, koralický hydroxyapatit, kalcinovaná kost, fosforečnan vápenatý a podobné materiály nebo jejich směsi a (iii) kostni morfogenetický protein, TGF-beta, PDGF nebo jejich směsi, přírodní či rekombinované a (iv) směsi (i) až (iii).

Složeni je při první teplotě (např. nad 38°C) tekuté a termální zesiťování se aktivizuje při druhé teplotě či mirně nad touto teplotou, odpovídající normální tělesné teplotě organismu, do něhož má být složení implantováno (tzn. u člověka při 38°C).

0

0 > 0 » 0

000

-9·0·

Pojmy “termálně zesltěný nebo termálně síťovatelný se zde používají k popisu vlastnosti složeni, kdy se v něm obsažené molekuly při dané teplotě a koncentraci nebo při nižších hodnotách teploty a koncentrace spojují takovým způsobem, že z roztoku obsahujícího tyto molekuly vzniká gel.

Pojem v podstatě biologicky vstřebatelný se zde používá k popisu schopnosti materiálu spolupracovat s nově zformovanou kosti a stát se její součásti. Např. demineralizovaná kostní hmota, která byla chemicky zesítěna s činidlem, jako je např. glutaraldehyd, se tedy nepovažuje za v podstatě biologicky vstřebatelnou. Avšak demineralizovaná kostní hmota sama o sobě, bioaktivni sklo nebo keramika, želatina a kostnf morfogenetické faktory jsou všechny považovány za v podstatě biologicky vstřebatelné, protože neposkytuji pouze strukturální oporu, ale kooperuji s nově zformovanou kostí.

Želatina funguje jako nosič a má schopnost termálního zesíťování ve velmi úzkém teplotním rozsahu. Tato reakce termálního zesíťování je převážně řízena fyzikálními zákonitostmi a vodíkovými vazbami mezi řetězci, a je tedy závislá na koncentraci a teplotě (Speriing). Navíc, jelikož je želatina v medicíně často využívána, její vlastnosti in vivo jsou důkladně prostudovány (McDonald). Nejznámějšl aplikací tohoto polymeru je pěnová houba. Studie ukázaly, že želatina je po implantaci jen mirně antigenní a lze ji v některých vlastnostech srovnávat s kolagenem. (McDonald). Kolagen však nemá schopnost termálního zesíťování, jež je pro složení podle vynálezu tak důležitá.

Zde se bioaktivnf sklo, jako je BIOGLASS®, bioaktivni keramika, fosforečno-vápenitá keramika, hydroxyapatít, uhličitan hydroxyapaiitu, hydroxyapatit, kalcinovaná kost, fosforečnan vápenatý a podobné materiály používají k rozšíření rozsahu manipulovatelných vlastností pevnosti a osteogeneze (osteoindukce a osteokondukce), jimiž se vyznačuje složení.

Výroba želatiny je založena na částečné hydrolýze kolagenu. Kolagen se získává z kůže, kostí, chrupavek, šlach a dalších pojivových tkání. Kůže a kosti jsou zdrojem molekul kolagenu Typu I a Typu III, zatímco šlachy jsou zdrojem

-10»· 44 • 4 • · »44 ··« <

» · ·· téměř čistého kolagenu Typu I a chrupavky dávají kolagen Typu II a vzácnější typy molekul kolagenu. Molekuly želatiny připomínají trojité šroubovice jako u kolagenu, jsou však částečně hydrolyzovány. V důsledku toho jsou v roztoku jen v malé míře organizovány. Jak však roztok chladne, začínají molekuly želatiny vytvářet šroubovité struktury. S tím, jak roztok dále chladne, poroste viskozita a dojde k fázové změně z roztoku na gel. Tato fázová změna je reverzibilní, dodá-li se tepelná energie.

Doba a teplota tuhnuti želatlnového roztoku jsou závislé na koncentraci želatiny v roztoku, molekulové hmotnosti a vnitřní viskozitě molekul želatiny a na pH roztoku. V izoelektrickém bodu neboli pH, při němž jsou molekuly želatiny elektricky neutrální, je doba tuhnutí nekratší.

Kolagen lze částečně hydrolyzovat několika metodami. Postup typu A je nejjednodušší a nejrychlejší, kdy se k částečné hydrolyzaci kolagenu používá zředěná kyselina (např. méně než 1M HCI). Zpracováni typu A se obecně používá u vepřové kůže a demineralizované hovězi kosti. Postup typu B využívá alkalický roztok k částečné hydrolyzaci kolagenu. Zpracování typu B se obecně aplikuje pro hovězi kůži a demineralizovanou hovězí kost. A nakonec lze k částečné hydrolyzaci kolagenu použit enzymy, jako je pepsin. Pepsin přednostně štěpí peptidové vazby mezi aromatickými aminokyselinami. Pepsin také působí jako esteráza, amidy aminokyselin však nejsou hydrolyzovány.

Jako jeden z příkladů tohoto postupu slouží želatina, připravovaná z kostí druhů, do nichž má být složení implantováno, rozdrcením kostí a zbaveni kostí tuku, po němž následuje ponoření po dobu 24 hodin do přibližně 300 mg/l pepsinu v 0,5M kyseliny octové při teplotě 33°C. Hodnota pH výsledného roztoku je nastavena pomocí hydroxidu sodného na 9,0 za účelem denaturace pepsinu, pak se s pomocí kyseliny chlorovodíkové vraci na 7,0. Teplota roztoku vzroste na 15 až 30 minut na 60°C a vrátí se na 4°C, aby došlo k denaturaci zbývajícího kolagenu a kompletní přeměně na želatinu. Výsledný roztok je filtrován za účelem odstraněni partikulárních složek a po dobu 48 hodin dialyzován proti destilované

-11 vodě v dialytické membráně s molekulovou propustností 50K-100K (50 K -100 K MWCO). Po lyofilizaci se želatina znovu rozpustí ve fosforečném tlumivém fyzilogickém roztoku (PBS) nebo ve vodě až na účinnou koncentraci, která činí asi 30 - 45 hmotnostních procent želatiny v roztoku.

Obsah želatiny ve složeni je přednostně mezi 20-45 % (hmotnostních procent - w/w). Želatinu lze získat ze stejných nebo jiných druhů v porovnání s těmi, do nichž má být složeni implantováno. Např. želatina z lidského, vepřového, hovězího, koňského nebo psího těla ze získává ze zdrojů kolagenu, jako jsou kosti, kůže, šlachy nebo chrupavky, a lze ji pak smíchat s DBM nebo s jinými osteogennimi materiály. Jak je uvedeno výše, mění se kolagen na želatinu vápenným louženlm, okyselením nebo enzymatickou extrakci např. pepsinem či podobným enzymatickým ošetřením, po němž následuje denaturace teplem nebo jinými prostředky. Želatinu lze z tkáně získat mastikací tkáně, po nfž následuje rozsáhlé ošetřeni směřující k narušení zeslťovaných vazeb v dlouhých kolagenových řetězcích. V jednom provedeni je tkáň rozmělněna, pak namočena na cca 24 - 72 hodin při teplotě asi 2^QC až 40 °C do zředěné kyseliny, např. 0,1 normální kyseliny octové. Přednostně se přidá enzym, např. pepsin, v dostatečně vysoké koncentraci. Do zředěné kyseliny se na počátku ošetřeni přidává pepsin v koncentracích asi 10-20 000 i.u./litr, 100-2000 i.u./litr nebo v analogických koncentracích, přičemž perioda ošetřeni se přizpůsobuje podle použité koncentrace enzymu. Ze složeni se např. odstředěním odstraní pevné částice a ziská se materiál nad sedlinou v roztoku s molekulární hmotnosti asi 50 000 daltonů či vyšší. To lze provést jedním z řady postupů známých v oboru včetně dialyzace sedliny v membráně s molekulární hmotností 50 000 daltonů proti několika změnám roztoku, ultrafiltracl přes membránu s obdobnou molekulární propustností (MWCO) nebo gelovou permeační chromatografií přes médium s molekulární propustnosti 50 000 daltonů. Odbornici budou vědět, že čim vyšší MWCO želatiny, tím nižší výnos. Proto lze použit přípravky s nižším MWCO, až

-12• · · · · φ « φ φ φ » • · ··· · · φ • · · • ·«» ·· ·Φ asi do 1000 daltonů, přičemž je nutno si uvědomit, že pak mohou být získány i nežádoucí druhy s nízkou molekulární hmotností.

Želatinový roztok, který vznikne z této extrakce, je přednostně denaturovaný, např. tepelnou úpravou při teplotě přesahujici 50°C. Denaturovaný protein je pak uložen ve zmraženém stavu, může být vymražen či ve formě sraženiny, např. v těkavém organickém roztoku a rekonstituován v roztoku, jako je např. izotonický fyziologický roztok, v koncentraci mezi 30-45 % (w/w) želatiny.

Demineralizovaná kost je přednostně ve formě prášku a přednostně se skládá z částic o průměru v rozsahu 80 - 850 pm. Postupy výroby demineralizovaného kostního prášku jsou v oboru známy (viz např. Patent Spqených států č. 5 405 390, který je zde pro tento účel uveden v odkazech), proto zde nejsou rozebírány. Demineralizovaný kostní prášek, který se získává standardními postupy, se smíchá s želatinovým roztokem podle výše uvedeného popisu, aby vzniklo složeni obsahující asi 0 - 40 % (w/w) demineralizovaného kostního prášku. Tam, kde jsou přítomny kostní morfogenetické proteiny (BMP), je ve složeni potřebné menší množství DBM. BMP jsou přednostně přítomny v koncentraci mezi 0,0001 až 0,1 mg/ml, případně 0,001 mg/ml až 0,01 mg/hnl či v podobné koncentraci v závislosti na množství přítomného DBM (0 - 40 % w/w).

V určitém provedeni vynálezu a u určitých ortopedických aplikaci, v nichž je důležitá silová odolnost v ohybu tvořeném kostní pastou, se preferuje přídavek bioaktivnlho skla. Je-li přidáno bioaktivní sklo, snižuje adhezivitu složeni, avšak po ztuhnutí zvyšuje pevnost složení. Proto se do gelového (demineralizovaného) kostního složení přidává bioaktivnf sklo, např. BIOGLASS® o průměru asi 0,5 až 710 pm. Kromě toho se též uvažuje o složeni obsahujícím přibližně 0 až 40 % (w/w) bioaktivnlho skla s želatinou, tvořici 20 až 45 % (w/w) složeni.

Složeni připravovaná podle výše uvedeného popisu se snadno odebírají ze stříkačky, zejména po zvýšeni teploty nad 40°C, např. ponořením do vodní lázně, předepsaným ošetřením mikrovlnami, umístěním do ohřívače injekčních stříkaček nebo řadou jiných postupů, jak zahřát nádobu. Protlačený gel je

resilientnl, lepivý a lehce tvárný do jakéhokoli požadovaného tvaru. Kromě toho si složeni po ztvrdnutí zachovává silovou odolnost a bude špatně rozpustné ve fyziologickém roztoku.

Po uvedení obecného popisu složeni podle vynálezu, vezmeme-li v úvahu specifika pomocného příkladu uvedeného níže, následují pokyny pro přípravu a využití složeni podle vynálezu.

Želatina z DBM by měla být připravována při teplotě mezi 30 a 37°C. Když je získané množství při 37°C vyšší (60 %), kvalita je podle měření kinematické viskozity mírně nižší než kvalita při 30°C. Želatina přednostně vzniká limitovanou hydrolýzou kolagenu s enzymatickou podporou, přičemž enzymem může být pepsin afp. Koncentrace pepsinu nastavená na 300 U/L až 500 U/L funguje dobře, odborníci však budou vědět, že by základě zde uvedených poznatků mělo být otestováno velké množství enzymů. Odborníci budou vědět, že alternativou k metodě pracujicí s pepsinem je kyselé či alkalické zpracování kůže a šlachy.

Konečné složení přednostně obsahuje želatin s viskozitou při 44°C asi 3600 centipoise (měřeno na lineární stupnici viskozity/řídnutí - 0,87/s) nebo s kinematickou viskozitou při 44°C asi 0,7 centistoků. Koncentrace želatiny v nosné fázi (tzn. bez přidaných osteogenních složek) je přednostně 30 až 45 % (w/w), (přibližně 50 až 60 % objemových procent - w/v), čimž je zajištěn vznik gelu při 38°C v přiměřeném časovém intervalu. Odbornici budou samozřejmě vědět, že v závislosti na druhu organismu, do něhož bude složeni implantováno, budou potřebné různé teploty. Tyto požadavky lze splnit změnou koncentrace želatiny zvýšením koncentrace, je-li nutná vyšší teplota gelu, a snížením koncentrace, je-li nutná nižší teplota gelu.

Obsah DBM ve složení je zde vymezen koncentrací potřebnou k tomu, abychom získali kostnf formaci analogickou samotné DBM. Zjistili jsme, že účinné je asi 5 až 40 % (w/w) DBM ve složení. Méně než 5 % se zřejmě při formováni kosti neuplatní, pokud nejsou ve složení přidány BMS (složka iii), přičemž v tomto pilpadě může být koncentrace DBM podstatně snížena či zcela eliminována.

Přirozeně, že na základě tohoto poznatku budou již odborníci vědět, že dodáním různých koncentraci a složeni kostních morfogenetických proteinů nebo dalších osteogenních či osteoindukčních faktorů tze ovlivňovat hmotností procento DBM ve složeni směrem nahoru nebo dolů. Kromě toho je známo, že v závislosti na druhu, do něhož je složení knplantováno, je třeba hmotnostní procento DBM regulovat směrem nahoru či dolů.

Ve studiích prováděných in vivo jsme zjistili, že všechna složeni s obsahem DBM 15 až 33 % vytvářejí zvápenatělou tkáň. Zjistili jsme dobrou korelaci mezi množstvím DBM ve složeni a úrovní indukce kosti, je-li DBM větší než asi 19 % (w/w). Horní hmotnostní limit pro DBM je asi 38 až 40 % (w/w). Tuto složku je tedy žádoucí použít v rozsahu 0 až 40 % DBM, přednostně 5 až 30 % (w/w), 7 až 33 % (w/w) nebo 15 až 25 % (w/w).

Z histologického hlediska je patrné, že po implantaci do zvířecího organismu se žeiatinová fáze zcela vstřebá během cca 2 týdnů. Navíc se během dvou týdnů vytvoři chrupavka a mineralizovaná kost, přičemž asi ve čtvrtém týdnu dojde k dozrání kosti. Zvířata v těchto studiích neměla v průběhu studie vážné zdravotní problémy a nevykazovala ani známky podráždění, hematomů, bolesti, horečky ani úbytku hmotnosti. Složeni podle tohoto vynálezu, obsahujíc! želatinu nebo osteogenní prvky (i-iv), může sloužit jako nosič pro korové, spongiózni nebo korové a spongiózni kostni fragmenty. Tato složení jsou vhodná pro vyplňování větších kostnich dutin. Kromě toho plati, že když tyto kostní fragmenty nejsou demineralizovány, vykazuji další spektrum biologických vlastností, které želatina sama o sobě ani želatina s osteogennimi prvky (i-iv) nemá. Preferuje se velikost těchto kostních fragmentů od 80 pm do asi 10 mm.

V dalším provedení tohoto vynálezu je složení želatinových a osteogennich prvků (i-iv) zformováno do pevného tvaru injekčním, vakuovým nebo rotačním tvářením, vyfukováním nebo vytlačováním nebo jinými způsoby. Tyto prvky by měly mit přednostně tvar meziobratlových plotének, acetabulárních hemistér, trubte, elipsoidů pro výplň dutin a intrameduiárních vsuvek, které se

-15vhodným způsobem vkládal do intramedulárního kanálu různých kostí (tzn. do dřeňové části kosti), aby se zabránilo pronikáni kostniho cementu do zdravé kostní tkáně. Tyto tvary vzniknou např. tak, že se zvýši teplota složeni nad teplotu zkapalňování (např. cca 45°C), přičemž se umožní, aby složení vytvořilo gel ve formě příslušného tvaru. Pro takovéto formy je obsah želatiny přednostně tak velký, jak to je možné, aby se zajistilo, že tvar po implantaci do přfjemce-obratlovce zůstane pevný.

Odborník nalezne mnoho ortopedických aplikací kostní pasty podle vynálezu. Pro účely artrodézy spojeni v oblasti páteře bude však jedním z obzvláště preferovaných způsobů užiti tohoto složení časné či poúrazové stádium degenerace meziobratlové ploténky, sloužící zde spiše pro ilustraci než jako omezeni rozsahu vynálezu. Po diagnóze traumatu či degenerace následuje vytvoření malého otvoru nebo několika malých otvorů v meziobratlové chrupavce v místě degenerace. Kostní pasta je pak vstříknuta do meziobratlového prostoru, aby iniciovala artrodézu. Obdobný proces lze provést s jinými klouby či poškozenými kostmi.

Po uvedení obecného popisu vynálezu následuji příklady, ukazující specifické vlastnosti a aplikace vynálezu. Měli bychom mít na paměti, že vynález se v žádném případě neomezuje na specifické rysy níže uvedených příkladů a hranice vynálezu jsou definovány připojenými patentovými nároky.

Přikladl:

Vytvořeni želatiny, kinematická viskozita a kritická koncentrace pro želatinu pň 38 °C

V tomto experimentu byl zdrojem kolagenu prášek z demineralizované kortikálni komponenty lidské kosti v rozsahu velikosti 250 až 850 pm. Do trubice odstředivky byl přidán prášek z demineralizované kostní hmoty (DBM), 0,5M roztok kyseliny octové a pepsin. Trubice odstředivky byla po dobu 24 hodin *9 «

«9 ·· ·» »· ·· * · « * • · 9 9 9 ·

9 * ··· ··* • · 9 9

999 999 99 99 překlopena při požadované teplotě 4°C, 30°C, 33°C a 37°C. Hodnota pH byla nastavena na 9,0, pak snížena pomoci 1N NaOH a 1N HCI na 7,0 a byla provedena deaktivace pepsinu. Roztok byl umístěn na dobu 15 minut do vodní lázně teplé 60°C, a pak zchlazen ve vodě s ledem. Roztok b>1 odstředěn a kapalina nad sedlinou byla nalita do trubice dialytické ment) rány s molekulárni propustnosti 1000 daltonů. Kapalina nad sedlinou byla dialyzována, aby bylo dosaženo faktoru ředěni 1000:1, zmrazená a lyofilizována, dokud nebyla zcela suchá. Tento experiment byl pro každou teplotu proveden pětkrát.

Kinematické viskozity zředěných koncentrací želatiny ve výši 0,0625 w/v%; 0,125 w/v% a 0,5 wA/% ve fosforečném tlumivém fyziologickém roztoku (pH 7,4 při 25°C) byly měřeny Ubbelhodovým viskozimetrem při teplotě 44°C. Kinematické viskozity lidské želatiny zpracovávané při 4°C, 30°C, 33°C byty měřeny dvakrát, kromě hodnoty při 33°C, která byla měřena jen jednou. Kinematické viskozity (jednotky centiskoky) byly vyneseny do grafu v závislosti na koncentraci roztoku lidské želatiny, viz obrázek 3. Byla provedena extrapolace lineárního poklesu na nulu, a tak stanovena kinematická viskozita při nulové koncentraci. Byla určena optimální teplota zpracováni daná teplotou, která byla spojena s nejvyšší viskozitu při nulové koncentraci, nejvyšší strmostí lineárniho poklesu, nejvyššim výtěžkem a nakonec i vznikem želatiny generujícím pevné složení kosti při teplotě mírně převyšující teplotu lidského těla.

Jak se zvyšovala teplota zpracování, rostl výtěžek želatiny, normalizované pro stejný pepsin na poměr DBM (0,03 % w/v pepsinu/1 g DBM). Kinematická viskozita při nulové koncentraci, neboli úsek na ose y, měla opačný trend. Jak se zvyšovala teplota zpracováni, klesaly extrapolované kinematické viskozity, viz Tabulka 1.

Lidská želatina zpracovávaná při 30°C vykazovala nejvyšší strmost kinematické viskozity v závislosti na koncentraci při hodnotě 0,40 (centistoků/%), po niž následovala lidská želatina zpracovaná při 4°C s hodnotou 0,26 (centistoků/%), lidská želatina zpracovaná při 33°C s hodnotou 0,21

-17(centistoků/%) a nakonec lidská želatina zpracovaná pň 37°C s hodnotou 0,17 (centistoků/%), viz Tabulka 1.

Aby se našel vztah mezi kinematickou viskozitou a molekulární hmotností želatiny, musí být kinematická viskozita převedena na vnitřní viskozitu. Vnitřní viskozíta však není definována v důsledku polyelektrolytické povahy želatiny. Proto nelze stanovit přímý vztah mezi viskozitou a molekulární hmotností lidské želatiny.

Tabulka 1

Fyzikální vlastnosti lidské želatiny a lidské želatiny ve fosforečném tlumivém fyziologickém roztoku. Lidská želatina byla zpracovávána pil teplotách 4°C, 30°C, 33^QC a 37°C od 1 g DBM a 0,03 w/v% roztoku pepsinu v 0,5N kyselině octové;

Lidská želatina zpracovaná při různých teplotách	Průměrný výtěžek v % hmotnosti	Extrapolovaný úsek na ose y (centistoky)	Strmost lineárního poklesu (centiskoky/%)	ř hodnota lineárního poklesu
4°C	6 % (n=5)	0,72 (pokus 1&2)	0,26 (pokus 1&2)	0,985 (pokus 1&2)
30°C	18 % (n=5)	0,71 (pokus 1&2)	0,40 (pokus 1&2)	0,993 (pokus 1&2)
33°C	30 % (n=4)	0,71 (pokus 1)	0,21 (pokus 1)	0,994 (pokus 1)
37°C	60 % (n=5)	0,70 (pokus 1&2)	0,17 (pokus 1&2)	0,996 (pokus 1&2)

Byla určena teplota tuhnutí pro různá složení kostních past, viz Tabulka 2. Ve složeních kostní pasty byla použita lidská želatina získaná z DBM pomocí pepsinu pil teplotě 33°C, 35 C a 37 °C. Koncentrace pepsinu se pohybovaly v rozmezí od 19 wAw% z celkového složení až do 25 w/w% celkového složení (což odpovídá 40 w/v% až 60 w/v% želatiny v nosné hmotě) ve fosforečném tlumivém fyziologickém roztoku (PBS) s pH 7,4. Všechna testovaná složeni kostní pasty obsahovala DBM v koncentraci 33 w/w% celkového složeni. Aby se vyzkoušelo, zda kostní pasta bude pevná, nebo tekutá, byly použity různé teploty prostředí tzn. 45°C, 43°C, 41°C, 40°C, 38°C a 35,5°C. Teplota tuhnutí byla stanovena následným snížením teploty prostředí a zvýšením teploty prostředí.

Tabulka 2

Teploty prostředí odpovídajíc! ztuhlým (tzn. injekčně neapíikovatelným) složením kostní pasty

Lidská želatina jako procento celkové hmotnosti složeni	Teplota pň zpracováni 37°C	Teplota pň zpracování 35°C	Teplota pň zpracování 33°C
25w/w%	< 35,5°C	< 35,5°C	40,5°C
24wAv%	<35,5°C	< 35,5°C	< 35,5°C
22w/w%	<35,5°C	<35,5°C	< 35,5°C
21 vj/w%	< 35,5°C	< 35,5°C	< 35,5°C
19w/w%	< 35,5°C	< 35,5°C	< 35,5QC

Proto je kritická koncentrace želatiny ve složení kostní pasty, která ztuhla mírně nad hodnotou teploty lidského těla, 38°C až 39°C, 25 w/w% celkového složení lidské želatiny, zpracované pň 33°C, přičemž 33 w/w% činila DBM a zbytek PBS. Lidská želatina zpracovaná pil 33°C měla kinematickou viskozitu při nulové koncentraci 0,71 centistoků. Roztoky lidské želatiny s nižšími kinematickými viskozitami měly kritické koncentrace zhruba přes 25 w/w%. Želatina s vyšší viskozitou než 0,71 centistoků tedy budou pravděpodobně tvořit termálni zesiťováni v koncentracích nižších než přibližně 25 % (w/w)Příklad 2: Složení a aktivita kostní pasty v podmínkách in vivo

Tato studie ukazuje, že kostní pasta podle vynálezu je osteoindukční. Kromě toho studie ukazuje velikosti částic pro komponentu DBM složeni, která dobře funguje pň podpoře růstu nové kosti u zvířete, do něhož je implantována.

Nitrosvalový model krysy je standardním modelem pro testování osteoindukčnosti demineralizované kosti a dalších osteoindukčních faktorů. Strates et al. používají tento model již mnoho let (Strates).

Jakje uvedeno v příkladu 1 výše, stanovili jsme, že želatina při 38°C má mit koncentraci 40 až 60 % w/w (30 až 45 % w/w roztoku bez přidaných osteogennich složek). Při této koncentraci želatina, působící jako nosná hmota, vytvoř! termální zesltění při 38°C během přibližně 8 minut. V této studii jsme pokládali otázku, kolik DBM musí být přítomno v této fixní 40 až 60 %-ní nosné želatinové hmotě k vyvolání formování kosti s příznivou korelaci v porovnání s pozitivními kontrolami. Porovnávali jsme 4 různá složení DBM/žeiatina s pozitivními kontrolami (pozn. překl.: zde pozitivní kontrola ve smyslu provedení se 100 % aktivní látky) a negativními kontrolami (pozn. překl.: zde negativní kontrola ve smyslu provedeni s0% aktivní látky) u nitrosvalového modelu krysy.

a) Příprava štěpu

Z čerstvě zabitých (maximálně před 24 hodinami, uchovaných v teplotě 4°C) Sprague-Dawleyových krys byly odebrány kosti stehenní, kosti holenní a kosti lýtkové. Z kosti byly odstraněny diafýzy, bylo provedeno odstraněni kostní dřeně disekčnl sondou a umyti sterilní vodou. Diafýzy pak byly demineralizovány v 0,6M HCI po dobu 24 hodin při teplotě 4°C s poměrem kostní hmoty ke kyselině 1/10 či nižším. Kostní segmenty byly lyofilizovány, a poté smíchány se suchým ledem a rozdrceny v laboratorním kostním mlýnku. Prášek DBM byl roztříděn síťováním a byly ponechány částice o velikosti 125 až 450 pm.

Zahřátím fosforečného tiumivého fyziologického roztoku (PBS) na 60°C byla vytvořena nosná hmota s želatinou o koncentraci 50 % (w/v), pak byla přidána vepřová želatina v práškové formě (Sigma, výkvět 300) a vše bylo důkladně rozmícháno. Nosná hmota dozrávala po dobu 15 minut (aby se vyrovnalo rozložení želatiny v roztoku), pak byla ponechána, aby zchladla na 50°C. V tomto okamžiku byla do želatinového roztoku přidána DBM v následujících množstvích: 0 (negativní kontrola), 15, 19, 24 a 33 % w/w celkového složeni. Složeni bylo ručně důkladně promícháno.

-20Štěpy byly připraveny vstříknutím vlákna složení do Petriho misky. Tato vlákna byla rozdělena na kratší úseky (cca 4 mm), zvážena a umístěna do sterilních Petriho misek. Pozitivní kontroly byly připraveny peletizacl DBM smíchané s PBS v odstředivce. Aby se během rizikových situaci při zákroku udržela integrita pelety, byly pelety zmrazený a takto implantovány.

b) Zákrok na krysách

Mladým Sprague-Dawleyovým krysám (200 až 410 g) bylo nitrosvalově podáno anestetikum ve složeni 86 mg/kg ketaminu a 13 mg/kg xylazinu (do stehna). Od vrcholu sterna až nad tříslo byl veden podélný řez. Boční části m. rectus abdominis byly zpřístupněny tupým oddělením tkáně na obou stranách zvířete. Ve svalu na každé straně byly vedeny tři krátké incise a byly vloženy implantáty. Následovalo sešití 1 až 2 stehy materiálem Prolene 3-0 (za účelem označeni místa a jako prevence vyhřeznutí implantované hmoty). Na každou stranu byla vložena jedna pozitivní a jedna negativní kontrola a dvě experimentální složení. Umístěni implantátů bylo náhodné s výjimkou toho, že každá krysa měla na jedné straně jednu pozitivní kontrolu a na druhé straně jednu negativní kontrolu.

Zvířata byla vrácena do klecí a byla jim podána potrava a voda ad-lib. Všichni členové studijní skupiny byly drženi po dobu 4 týdnů kromě jednoho zvířete (R1), které bylo po 2 týdnech usmrceno za účelem histologického rozboru.

Po 4 týdnech byla zvířata usmrcena předávkovánfm Nembutalem. M. rectus abdominis byl odstraněn ostrým oddělením tkáně, čímž bylo odejmuto maximální množství tkáně.

c) Analýza vzorků

Každý sval byl označen zářezem k vyznačení horní části zvířete a umístěn do Petriho misky se štítkem. Sval byl mammografickým zařízením zrentgenován s použitím mammografického filmu (DuPont). Rentgenogramy byly analyzovány

užitím digitálnt kamery spojené s počítačem Apple LCII vybaveným softwarem NIH Image 4.1. Obrazy byly zpracovány tak, aby byl osvícen stín implantátu, a počítáním obrazových bodů (pixelů) byla stanovena plocha stínu

Ze svalu byly odstraněny dva z každé skupiny vzorků a zafixovány v desetiprocentním tlumivém roztoku formalinu. Byly odebrány histologické řezy a další řezy byly zbarveny hematoxylin-eoslnem a Massonovým trichromem. Tyto histologické vzorky byty prohlédnuty kvalifikovaným patologem.

Zbývající vzorky byly odebrány ze svalové tkáně a spalovány po dobu 4,5 hodin v muflové peci pň teplotě 700 až 750°C. Byla stanovena hmotnost popela a normalizována na původní hmotnost štěpu. Popel byl rozpuštěn v 1,0N HCI a atomovou absorpční spektroskopii byl analyzován obsah vápníku.

Všechny analýzy byly provedeny jako slepé a dekódování bylo provedeno po zpracování dat

d) Histologie

Dvoutýdenní histologické vzorky 15 %-ního a 19 %-ního složení DBM ukázaly zformování kosti, dokonce i v tomto raném stadiu. Směr formováni kosti není bezprostředně patrný, ale zřejmě bude endochondrální. Čtyřtýdenní histologické vzorky ukázaly, že v místě implantace vznikla zralá kost. Jak ukázaly analýzy popela a procenta vápníku, byla kvalita vytvořené kosti srovnatelná s kvalitou přirozené kosti. Všechny štěpy obsahující DBM vedly k vytvoření kosti. Ty, které obsahovaly více než 20 % DBM, tvořily kosti nejvyšší kvality. Obrázky 4A a 4B znázorňují fotomikrografy částí štěpů po čtyřech týdnech in vivo u nitrosvalového krysího modelu. Zjistili jsme, že 33 % (w/w) DBM v želatinovém roztoku (obrázek 4B) podle tohoto vynálezu vyprodukovalo stejné množství nové kosti jako čistá, 100 %-ní DBM (obrázek 4A). V těchto obrázcích jsou přítomny následující struktury: 10 je zralá kost, jak dokazuje červené barvivo z Massonova barviva, 20 je nově utvořená chrupavka, jak dokazuje modré barvivo z Massonova barviva a přítomnost buněk, 30 je residuálnl DBM, jak dokazuje modré barvivo z

-22« · · · a · · · • · · · • · · · · · · • · • · « »

Massonova barviva a nepřítomnost buněk, z nichž vznikají všechny chrupavčité a kostní struktury ve svalovém řezu, a 40 je nezralá kost, jak dokazuje světle modré zbarvení a přítomnost buněk. Sledované buňky jsou osteoklasty degradující nově utvořenou chrupavku a osteoblasty ležící pod novou kostí. Kromě toho je v části obarvené Massonovým barvivém, z níž byly nasnímány černobílé fotografie, patrná svalová infiltrace do zralé kosti.

e) Analýza složeni

Užitím 2σ testu nebyl zjištěn žádný statisticky významný rozdíl v obsahu popela mezi negativní kontrolou, pozitivní kontrolou a složeními s 15 % až 19 % (w/w) DBM. To nutně nemusí znamenat, že tato složení nefungují (prohlídka rentgenogramů tento závěr vysvětluje). Spíše to znamená, že citlivost metody pracující s popelem neumožňuje detekci rozdílu. Studie dat pro 24 %-ní a 33 %-ní složení ukazuje podstatně lepší výsledky než pro 19 %-ní a 15 %-ní složeni a negativní kontroly, přičemž se podstatně neliší od (pozitivní) kontroly viz Tabu!. 3.

Tabulka 3

Složeni (% DBM)	% získaného popela/ 9 štěpu	Standardní odchylka
0 (negativní kontrola)	10,1	9{n=6)
15	5,5	12,7 (n=6)
19	11,9	12,2(0=6)
24	34,5	14,9 (n=5)
33	30,0	8,0 (n=4)
100 (pozitivní kontrola)	31,9	8,8 (n=6)

f) Atomová absorpční spektroskopie

Atomová absorpční spektroskopie složek popela DBM/zelatiny vytvořila ve vzorcích určité množství vápníku. Složeni o15%a19% nevykázala statisticky významný rozdíl v porovnání s negativní kontrolou. Očekává se však, že s větší citlivostí odběru by byly pozitivní účinky DBM v želatinovém nosiči v koncentracích

-23« *« · ♦ ·· ·· » · · · · · · * · · ♦ · • · · · ···» • · · · * · ······ • · · · · · ··· ···« ··· ··· ·· ·· již tak nízkých jako je 7 % (w/w) měřitelné. Průměrný obsah vápníku vytvořený složením vyšším nebo rovným 24 % byl úměrný hmotnosti DBM ve složení.

Tabulka 4

Porovnáni výsledků atomové absorpční spektroskopie spálených vzorků čtyř různých složeni DBM/želatina odebraných z krys po 4 týdnech in vivo

Složení (% DBM w/w)	Průměrný obsah Ca/ gram	Standardní odchylka (σ)
0 (negativní kontrola)	1.2	1,2 (n=6)
15	3,9	2,4 (n=4)
19	7,3	7,5 (n=4)
24	23,1	8,7 (n-3)
33	28,0	4,4 (n=4)
100 (pozitivní kontrola)	81,3	30,0 (n=5)

g) Digitální rentgenová analýza

Hrubá prohlldka/porovnánl rentgenovými paprsky ukazuje, že 24 %-nl a 33 %-ní složení se v podstatě neliší od pozitivních kontrol. Složení s 15 %-ním a 19 %-ním obsahem zřejmě nevytvářejí statisticky významnou kost. Očekává se však, že při větši citlivostí odběru by byly pozitivní účinky DBM v želatinovém nosiči měřitelné již v tak nízkých koncentracích, jako je 7 % (w/w). V místech s negativní kontrolou nebylo zřejmé pod rentgenovými paprsky vytvoření kosti. Proto docházíme k závěru, že DBM v koncentracích asi 24 % až 33 % (w/w) v želatině je aktivní v indukci tvorby kosti. Stejná data indikují, že koncentrace DBM menši než 20 % jsou méně efektivní v generování významné kosti v porovnání s pozitivními kontrolami. Je zaznamenáno, že Grafton obsahuje je 8 % DBM v glycerolovém nosiči.

ΐ. *

-2400 ·· • 9 0 · » « 0 0 · · 0 * 0 · 9 0 0 0 000000

0 0 · 0 0 00 0000 000 ·0 0 0 0 00

Tabulka 5

Složeni (% DBM w/w)	Normalizovaná plocha (% pozitivních kontrol)	Standardní odchylka (σ>
0 (negativní kontrola)	0	0(n=10)
15	2,8	1,9 (n=7)
19	4,1	4,2 (n=7)
24	33,0	15,2(n=10)
33	36,7	14,9(n=10)
100 (pozitivní kontrola)	100	43,1 <n=10)

Příklad 3

Postup výroby kostní pasty podle vynálezu

Tento příklad ukazuje postup výroby kostní pasty z želatiny a demineralizované kosti. Protože jsou potřebné zlomky celkové hmoty, jsou váženy následující složky (jsou dána procenta celkové hmotnosti složení):

Suchá demineralizovaná kost: 0 - 40 % (w/w)

Lyofilizovaná termálně zesltěná želatina: 20 - 45 % (w/w)

BIOGLASS®: 0 - 40 % (w/w)

Kostní morfogenetický protein: 0,001 mg/ml

Složky jsou za sucha důkladně zamíchány, rovnováhy složeni se docilí přidánim vody, fosforečného tlumivého roztoku nebo jiného fyziologicky přijatelného tekutého roztoku. Složení může být v této formě zabaleno či lyofilizováno pro pozdější rekonstrukci s vodou. Ohebnosti se docílí zahřátím na teplotu dostatečnou k překročení bodu kapalněni želatiny. Pak se umožní, aby složení vychladlo na teplotu, při níž vzniká gel.

Odkazy

Cornell, C.: Techniques in Orthopaedics 1992, 7, 55 - 63.

Bloebaum, R. D.: Human Bone Ingrowth and Materials; Bloebaum, R. D., Ed.; Society for Biomaterials: Denver, CO, 1996.

Einhom, T. A.; Enhancement of Bone Repair Using Biomaterials; Einhorn, T. A., Ed.; Society for Biomaterials: Denver, CO, 1996.

Benedict, J. J.: The Role of Carrier Matrices on Bone Induction in Vivo; Benedict, J. J., Ed.; Society for Biomaterials: Denver, CO, 1996.

Strates, B.; Tiedeman, J.: European Journal of Experimental Musculoskeletal Research 1993, 2, 61 - 67.

Urist, M. R.: Bone Morphogenic Protein; Urist, M. R. Ed.; W. B. Saunders Co.: Philadeplhia, 1992, s. 70 - 83.

Yazdi, M; Bernick, S.; Paule, W.; Nimmi, M.: Clinical Orthopaedics and Related Research 1991, 262, 281 - 285.

Younger, E.; Chapman, M.: Youngerof Orthopaedic Trauma 1989, 3,192 -195. Hardin, C. K.: Otolaringologic Clinics of North America 1994, 27, 911 - 925.

Senn, N.: The American Journal of Meical Sciences 1889, 98, 219 - 243.

Urist, M. R; Huo, Y. K.; Brownell, A. G.; Hohi, W. M.; Buyske, J.; Liefze, A.; Tempst, P.; Hunkapiller, M.; DeLange, R. J.: Procedures of National Acadamy of Sciences, USA 1984, 81, 371 - 375.

Urist, M. R.; Chang, J. J.; Lielze, A.; Huo, Z. K.; Brownell, A. G.; DeLang, R. J.: Methods in Enzymology 1987,146, 294 - 313.

Lasa, C.; Hollinger, J.; Drahám, W.; MacPhee, M.: Piastic and Reconstructive Surgery 1995, 96, 1409 -1417.

Nathan, R.; Bentz, H; Armstrong, R.; Piez, K.; Smestad, T.; Ellingsworth, L.; McPherson, J.; Sezedin, S.: Journal of Orthopaedic Research 1988, 6, 324- 334. Hench, L. L.; Andersson, O. H.: Bioactive Glasses; Hench, L. L; Andersson, O. H., Ed; World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd.: Singapore, 1993, s. 41 - 63.

Scarborough, N.: Bone Repair Using Allografts; Scarborough, N., Ed.; Society for Biomaterials, 1996.

Frenkel, S. R.; Moskovich, R.; Spivak, J.; Zhang, Z. H.; Prewett, A. B.: Spině 1993, 18, 1634-1639.

Sperling, L. H.: Introduction to Physical Polymer Science; John Wiley and Sons, lne.: New York, 1992.

McDonald, T. O.; Britton, B.; Borgmann, A. R.; Robb, C. A.: Toxicology 1977, 7, 37 - 44.

Culling, C. F. A.; Allison, R. T; Barr, W. T.: Cellular Pathology Technique; 4. ed.;

Claims (26)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Složení implantovatelné kostní pasty vyznačující se tím, že obsahuje želatinu jako nosič v podstatě biologicky vstřebatelných osteogenních složek pro použití příjemcem v případě potřeby.
2. 2. Kostní pasta podle nároku 1, vyznačující se tím, že se používá při rekonstrukci pseudoartróz, zvětšování periodontálního oblouku, v kraniofaciální chirurgii, artrodéze páteře či jiných kloubů, při postupech týkajících se spojení v oblasti páteře a při fixaci implantátu.
3. 3. Složení podle nároku 1, vyznačující se tím, že želatina tvoří termální zesítění při teplotě organismu, do něhož má být implantována, nebo mírně nad touto teplotou.
4. 4. Složení podle nároku 3, vyznačující se tím, že uvedené složení tvoří gel při přibližně 38°C.
5. 5. Složení podle nároku 3, vyznačující se tím, že uvedená želatina je přítomna v koncentraci mezi přibližně 20 až 45 % želatiny vyjádřeno podílem na hmotnosti složení.
6. 6. Složení podle nároku 5, vyznačující se tím, že osteogenní složka je vybírána ze skupiny, již zastupují:

   (i) demineralizovaná kostní hmota (DBM);

   (ii) bioaktivní sklokeramika, bioaktivní sklo, bioaktivní keramika, fosforečno-vápenitá keramika, hydroxyapatit, uhličitan hydroxyapatitu, koralický hydroxyapatit, kalcinovaná kost, fosforečnan vápenatý nebo jejich směsi;

   (iii) kostní morfogenetický protein, růstový faktor TGF-beta, růstový faktor získaný z krevních destiček PDGF nebo jejich směsi, přírodní či rekombinované a (iv) směsi (i) až (iii).

   -284 4« 4 · 44·· « 4 · 4 4 4 4

   44 4 4 4444

   Β 44444 4 4

   4 4 4 4 4

   444 44 44 4 » 4
7. 7. Složení podle nároku 6, vyznačující se tím, že želatina, demineralizovaná kostní hmota nebo obě jmenované se získávají z druhů, do nichž má být implantována kostní pasta.
8. 8. Složení podle nároku 7, vyznačující se tím, že demineralizovaná kostní hmota je přítomna v přibližně 0 až 40 % celkové hmotnosti složení.
9. 9. Složení podle nároku 8, vyznačující se tím, že demineralizovaná kostní hmota je přítomna v přibližně 15 až 33 % celkové hmotnosti složení.
10. 10. Složení podle nároku 6, vyznačující se tím, že složka (ii) je přítomna v přibližně 0 až 40 % (hmotnostních procent) celkové hmotnosti složení.
11. 11. Složení podle nároku 6, vyznačující se tím, že obsahuje antibiotika, kostní morfogenetické či jiné proteiny, ať jsou získávány z přírodních či rekombinovaných zdrojů, smáčedla, glycerol, karboxymethylovou celulosu, růstové faktory, steroidy, nesteroidní protizánětlivé sloučeniny nebo jejich kombinace.
12. 12. Složení podle nároku 6, vyznačující se tím, že obsahuje přibližně mezi 0,0001 až 0,1 mg/ml kostního morfogenetického proteinu.
13. 13. Složení podle nároku 1, vyznačující se tím, že se jedná o zmrzlý roztok nebo vymražený roztok.
14. 14. Složení podle nároku 1, vyznačující se tím, že želatina je z lidského, hovězího, ovčího, koňského nebo psího zdroje nebo jejich směsí.
15. 15. Složení podle nároku 1, vyznačující se tím, že želatina se získává ze zdrojů lidského kolagenu enzymatickou, kyselou nebo alkalickou extrakcí.

    -2916. Složení podle nároku 15, vyznačující se tím, že zdroje lidského kolagenu jsou lidská kůže, kost, chrupavka, šlacha, pojivové tkáně nebo jejich směsi.
16. 17. Složení podle nároku 16, vyznačující se tím, že se tvoří ošetřením zdroje kolagenu pepsinem při přibližně 33°C, tepelnou denaturací takto ošetřeného kolagenu v řízených podmínkách, aby vznikla želatina, a smícháním takto vytvořené želatiny s osteogenní sloučeninou tak, že želatina je přítomna v konečné koncentraci přibližně 20 až 45 % hmotnostních.
17. 18. Složení podle nároku 17, vyznačující se tím, že denaturace se docílí zahřátím alespoň na 50°C.
18. 19. Složení podle nároku 18, vyznačující se tím, že želatina má molekulární hmotnost větší než 50000 daltonů.
19. 20. Složení podle nároku 1, vyznačující se tím, že osteogenní složka je demineralizovaná kostní hmota v práškové formě, skládající se z částic v rozsahu velikosti průměru přibližně mezi 80 až 850 μιτι.
20. 21. Složení podle nároku 20, vyznačující se tím, že obsahuje 0 až 40 % hmotnostních práškové demineralizované kostní hmoty za předpokladu, že chybí-li prášková demineralizovaná kostní hmota, je růstový faktor kosti přítomen v koncentraci alespoň 0,0001 mg/ml.
21. 22. Složení podle nároku 21, vyznačující se tím, že uvedený růstový faktor kosti je morfogenetický protein, TGF-^ nebo jejich směs, ať přirozená, nebo v rekombinaci.
22. 23. Složení podle nároku 6, vyznačující se tím, že bioaktivní sklo je o průměru přibližně 0,5 až 710 μιτι.
23. 24. Složení podle nároku 1, vyznačující se tím, že dále obsahuje kortikální, spongiózní nebo kortikální a spongiózní kostní fragmenty.

    9 9·· ✓

    -30• · *9 « · · 9 · · · ♦ » ♦ ·

    9 9 9 9 9 9 9 9 9 · 9 ·

    9 9999· 9 9 · 9 99 ·

    9 9 99 9 » · 9 ·

    999 99 9» · · · · 9 9 ·
24. 25. Složení podle nároku 24, vyznačující se tím, že uvedené kostní fragmenty jsou v rozsahu velikosti 80 pm až 10 mm.
25. 26. Složení podle nároku 1, vyznačující se tím, že je formováno do pevného tvaru injekčním tvářením, vakuovým tvářením, rotačním tvářením, vyfukováním nebo vytlačováním nebo jiným způsobem.
26. 27. Složení podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený tvar se volí z následujících možností: meziobratlové ploténky, acetabulární hemisféry, trubice, elipsoidy, podlouhlé tvary a tvary U pro výplň dutin, vytvoření intramedulárních vsuvek a vklínění štěpů.

    • ·« » · ·· 99 ·· · · 99 ·· · 9 · · • · 9 9 9 9 9 9

    9 9 9 9 · · ··&···

    9 9 9 9 9 9

    999 9999 999 999 99 99

    Obrázek 1

    Vybrané materiály pro kostnf štěpy

    Materiál Štěpu Kategorie Fyzikální forma Distributor Poznámky Collagraft kondukCnl Pasta z kolagenového TCP a HA Zimmer Nevhodné pro velké štěpy. HA není znovu vstřebatelný. Nákladné. Norlan kondukCnl Reakční pasta, která tuhne SRS Nové zajímavé výsledky. Nevhodné pro velké štěpy. KoralickýHA kondukCnl Zvápenateiá korálová pěna z HA Interpore Dobré mechanické vlastnosti, obtížná manipulace Práškový HA kondukCnl HA v formě Částic v různých prezentacích různi Problémy s migraci z místa implantace. Není znovu vstřebatelný. Bloglass kondukcm SIO₂, NazO. CaO. P2O5. sklo, tvoři uhličitan HA in vivo U.S. Biomaterials Problémy s migraci z místa implantace. Není znovu vstřebatelný. Autoštěp kosti indukční Obvykle kyčelnl nebo hofennl vklíněn) nebo pouze dřeň N/A > 20 % komplikaci souvisejících s místem odběru (Younger) AloStěp celé kosti kondukCnl nebo indukční Celě kostní segmenty nebo fragmenty, často obsahující uměle složky. Zmražené či vymražené Tkáňová baňka University of Florida (UFTB) a další tkáňové banky Indukční, je-ll omezeno zpracováni a sterilizace. KondukCnl při nadměrném zpracováni. Problém s pfenosem chorob Grafton indukční DBM v glycerolové matrici, předem připraveno ve stflkaCce Osteotech Problémy s migraci z místa implantace. (Frenkel) 778 Glycerol je neurofytické Činidlo DBM indukční Práškový nebo ve formé fragmentů, vymrazený UFTB nebo jiné tkáňové banky Problémy s migraci z místa implantace. (Lasa; Frenkel)

    Pozn. překl.; HA = zde zkratka pro hydroxyapaťit ·· · * • · *· ·Φ • φ φ • φ · φ • · · ···· *»φ Φ·« ·· ·· • · 9 · • ♦ · · • Φ·Φ ··· • · ΦΦ ·Φ

    Obrázek 2

    PosUp demšneralizace kosti

    Krokč. Postup Účel 1 Asepticky odebrat dlouhé kosti, odstranit připojené tkáně 2 Rozdrtit kosti při 4°C na minimální velikost 80 mikronů Rychlejší demineralizace prášku 3 Ponořit při 4°C do peroxidu vodíku (3 %) na 24 hodin Okysličení proteinů, snížení antigenicity, antiseptický proces 4 Ponořit při 4°C do 70 %-niho ethanolu na 24 hodin Zbavení kosti tuku, snížení antigenicity, antiseptický proces 5 Ponořit při 4oC do 0,5N HCl na 24 hodin Rozpouští a odstraňuje minerální složky, odstraňuje kyselé rozpustné proteiny, snižuje antigenicitu, antiseptický proces 6 Prosit, aby se rozdělily částice v rozsahu 80 až 400 pm, > 400 pm, < 80 pm, odstranit velikost 80 pm Částice v rozsahu 80 až 400 jim se prodávají jako prášek DBM, > 400 pm jako fragmenty, < 80 pm je makrofagickou aktivitou in vivo absorbováno a je neúčinné, proto se odstraní 7 lyofilizace Umožňuje uložení při pokojové teplotě až po dobu 4 let, snížení antigenicity

    •j i