CZ315596A3

CZ315596A3 - Use of thermostable xylanase and additional feeding stuff

Info

Publication number: CZ315596A3
Application number: CZ963155A
Authority: CZ
Inventors: Andrew John Morgan; Kathleen A Clarkson; Elizabeth A Bodie; William A Cuevas
Original assignee: Finnfeeds Int Ltd
Priority date: 1994-04-28
Filing date: 1995-04-28
Publication date: 1997-05-14
Also published as: FI121469B; EP0926234A2; DE69516133D1; CA2188874C; FI964283A; US5437992A; DE69521534D1; NZ285406A; EP0926234A3; DK0926234T3; DE69521534T2; HUT75662A; DE69516133T2; AU2448595A; CN1147271A; CA2188874A1; CA2188558A1; CZ285839B6; JPH09512709A; EP0758378B1

Description

né krmivo (57) Anotace:

Použití termostabilní xylanázy, získatelné z mikroorganismů Microtetraspora flexuosa jako přídatného krmivá, přičemž xylanáza je charakterizována stálostí při zahřátí na dobu 1 minuty ve vodní lázni, nastavené na teplotu 95 °C bez podstatné ztráty účinnosti, jak je možno stanovit schopností enzymu snižovat viskozitu 1 % roztoku pšeničného arabinoxylanu při pH 6.5 a teplotě 40 °C na stejnou viskositu ž 0,01 Ps, jako je tomu v případě nezahřátého kontrolního vzorku enzymu. Součást řešení tvoří rovněž přidatné krmivo s obsahem tohoto enzymu a krmivo na bázi obilovin, obsahující nejméně 20 % hmotnostních obilovin a 0,00001 až 10 g termostabilní xylanázy na kg krmivá. Obilovinou může být pšenice, ječmen, kukuřice, čirok, rýže, žito, oves a triticale. Krmivo je vhodné pro hospodářská zvířata, zejména drůbež a vepře.

<C rc —o

07'

Použití thermostabilní xylanázy a prídatné krmivo

Q_b_l_a_s_t___i_k_y

Předložený vynález se týká použití enzymu jako krmného doplňku u zvířat a to zejména v takových případech, kdy enzym je thermostabilní a proto nedochází během působení vysoké teploty při způsobu výroby krmivá k významnějšímu snížení enzymatické aktivity.

Vynález se týká také krmného doplňku a na bázi obilovin založených krmiv, včetně zmíněného thermostabilního enzymu.

Q_o_s_a_v_a_d_n_í___s_t_a_v___

Zkvalitnění v oblasti krmiv v živočišné výrobě, umožňující zvířatům trávit krmivo - mnohem efektivněji, je cílem stálého bádání, Jeden z hlavních problémů spočívá ve zlepšení ukazatele FCR ( Peed Conversion Ratio), t.j. míra využití krmivá, spočívající v relaci spotřebovaného krmivá ku přírůstku hmotnosti zvířete., aniž se zvýší náklady na jednotku hmotnosti.

Nízká hodnota FCR naznačuje, že danné určité množství krmivá vytváří u zvířete proporcionálně vyšší hmotnostní přírůstky, což znamená, že zvíře je schopné zužitkovat krmivo mnohem efektivněji.

Jedním ze způsobů, jak lze hodnoty FCR snížit, spočívá ve zlepšení trávících schopností zvířete a tím i zvýšení nutričního efektu, který se u zvířete může projevit.

Existují různé negativní faktory ovlivňující stravitelnost nutričních složek krmivá, jako je na _ pr. obsah škrobovin, tuků, proteinů a aminokyselin·

Tyto faktory zahrnují :

I. Viskozitu složek přítomných ve střevním traktu zvířat. Tato viskozita je ovlivně alespoň zčásti, rozpustnými neškrobovými polysacharidy, jako jsou na př. beta-glukany a arabinoxylany, se smíšenými vazbami.

II. Nadržení nutričních složek uvnitř buněčných stěn krmivá, zejména v aleuronové vrstvě obilovin. Tato zádrž je vyvolána vysokými hladinami neškrobových polysacharidů v buněčných stěnách obilovin, které jsou relativně odolné vůči degradaci systémem zvířecího trávícího traktu, což zabraňuje nutričním složkám, aby byly zadrženy uvnitř buněk a byly zvířetem nutričně využity a

III. Nedostatek endogenní enzymatické aktivity, jak u samotného zvířete, tak u střevní mikrobiální populace, zejména u zvířete mladého.

Výše uvedené problémy, působící interferenčně s trávícími schopnostmi, jsou zejména pozoruhodné v případě krmiv, založených na obilovinách, jako na př. těch, které se vyznačují vysokým obsahem pšeničného zrna.

Vzhledem k problematice, týksjící se nedostatečného trávení nutričních složek krmivé, je normálně nezbytné, upravit složení krmných směsí tak, aby obsa- 3 hovaly energeticky vysoce hodnotné složky a proteiny, které by postačily pokrýt nutriční potřeby zvířat»

K dispozici je už značná část důkazů o tom,že přídavek určitých ( doplňkových ) enzymů do krmných směsí, založených na obilovinách, může být z aspektů snižovaní viskozity složek, přítomných ve střevním traktu zvířat, výhodný. Tato redukce může být docílena enzymy, jakými jsou xylanázy, které hydrolyzují rozpustné xylany, čímž snižují při trávení viskozitu, která je významným negativním faktorem v trávícím procesu·

Xylanázy, které jsou přidávány jako doplňky,musí být stabilní a účinné při píT a teplotních podmínkách, zjištěných v gastrointestinálním traktu zvířat, která jsou středem zájmu. V případě, že xylanázy nejsou účinné a stabilní při vystavení podmínkám in vivo, potom nebudou ani schopné snižovat při trávení ve významném rozsahu viskozitu.

V současné době je známo, že jako doplňky jsou v krmných směsích uvažovány xylanázy, odvozené z hub, jako je na př. Trichoderma longibrachiatum, Aspergillus niger a Humicola insolens.

Bedford a Classen zjistili, a v odborném časopise The Journal of Nutrition, 122,strany 560 - 569/publikovali, že existují významné korelace mezi viskozitou v trávícím traktu, testované in vivo při výkrmu kuřat-broilerů a posuzované na základě přírůstků hmotnosti a hodnot FCR ( definice viz výše). V případě krmných směsí s obsahem pšenice a žita, jako základních

3ložek_; a používaných k výkrmu drůbeže, se prokázalo, že 70 - 80%ní variabilita v hmotnostních přírůstcích a FCR, spočívá v rozdílech samotné viskozity ve střevním traktu»

Tyto poznatky naznačují značný význam viskozity pro trávení v krmných směsích, založených na obilovinách a obsahujících vysoké koncentrace rozpustných arabinoxylanů. Tak, jak vzrůstá viskozita v trávícím traktu, tím se snižuje i stravitelnost všech nutričních slo žek v důsledku, interference s difúzí pankreatických enzymů, substrátů a finálních produktů trávícího procesu.

Bylo také zjištěno, že zahrnutí xylanázy do krmných směsí pomáhá snižovat u skotu viskozitu v trávícím traktu. V důsledku toho je schopnost zvířat trávit potravu zvýšena, stejně jako hodnota hmotnostních přírůstků v relaci k jednotkovému množství spotřebovaného krmivá a FG5 krmivá je snížena.

Je běžné zabudovávat enzymatické doplňky, jako na př. xylanázu, do krmných směsí obdukcí enzymu fyziologicky akceptovatelným nosičem, na př. obilninou. Obdukovaný nosič je smíchán s dalšími složkami krmné směsi a poté slisován do tvaru kostiček nebo pelet,použitelných přímo ku krmení zvířat.

Od nedávné doby jsou intenzivně vyvíjeny postupy přípravy různých finálních forem krmných směsí,jako na př. kostiček a pelet. V rámci zmíněných, nově vyvinutých postupů, se používají relativně vysoké teploty, které mají v prvé řadě zvýšit efektivnost vý- 5 rotního procesu, a ze druhé vyprodukovat krmné směsi, prosté škodlivých bakterií, zejména Salmonell.

Kromě toho zvyšuje používání vysokých teplot kvalitu a trvanlivost finálních kostiček a pelet, rozšiřuje spektrum složek,které mohou být efektivně zpracovány a umožňuje zvýšení koncentrací tekutých složek, jako na př. tuků a melasy, které mohou být do receptury krmivá zabudovány.

Běžně používané výrobní postupy zahrnují působení relativně vysokých teplot po relativné dlouhou dobu na složky krmných směsí. Vromě toho je krmná směs vystavena během výrobního procesu relativné vysokým tlakům, které tak přispívají ku zvýšení trvanlivosti finálních forem krmivá, t.j. kostiček a pelet.

Jeden z produkčních postupů, vyvinutých s cílem zlepšit nutriční vlastnosti krmivá, je příprava pelet pomocí páry. Tento postup zahrnuje stupeň, při kterém na slisované krmivo působí za účelem zvýšení teploty a vlhkosti směsi/ pára. Tento stupeň je označován jako kondicionování, které probíhá v rozmezí od několika sekund až do několika minut, v závislosti na typu a konečné receptuře směsi. Teplota v příslušném kondicionéru může vystpupit až na 1OO°C. Poté se krmná směs zpracuje na peletizačním lisovacím zařízení, při kterém dochází k rychlému zvýšení vnitřní teploty krmné směsi v důsledku tření.

^edávno bylo do výroby uvedeno nové zařízení pro předběžné zpracování nebo úpravu krmných směsí, nazývané expander, které umožňuje zachování podmínek pro

- β kondicionování pod tlakemf\?£teré%ásleduje χ přípravě pelet. Při použití tohoto technologického postupu, jeou různé složky krmné směsi, které byly předtím zpracovány kondicionováním parou, předloženy do lisocího Šneku, do kterého je vháněno více páry a hmota je tak vystavena zvýšenému působení tlaku a nožů, a nakonec je prolisována výstupním otvorem různých rozměrů.

Slisovaný produkt je po úpravě na požadovanou velikost částic zpracován ve standardním lise na pelety.

Zpracování jednotlivých složek krmné směsi v expanderů probíhá v časovém rozmezí cca 5 až 20 sekund, přičemž může být dosažena teplota až 145°C. Dosahuje se lisovacích tlaků až 3,5 MPa, ale zvýšení jak teploty, tak tlaku je velmi rychlé, ale obě tyto veličiny se rychle snižují v momentě, kdy produkt je vytlačován výstupním otvorem.

Použití expanderů je výhodné vzhledem k účinné eliminaci škodlivých bakterií, zejména Salmone11.Kromě toho je možné použít v receptuře směsi, ještě před přípravou pelet, relativně vysoké koncentrace tuků a dalších tekutých složek.

Kromě toho var a působení tlaků a rozrněInovacích nožů má za následek vyšší gelovatění škrobu.

Bohužel výrobní podmínky, při kterých jsou používány vysoké teploty a vysoké tlaky, vyskytující se při produkci pelet, zejména při současném působení vlhkosti, jsou pro určité složky krmných směsí potenciálně destruktivní, což platí zejména pro některé

- 7 přítomné enzymy, včetně xylanáz.

Jak je všeobecně známo, enzymy jsou proteiny, vytvářené z aminokyselin. Zvláštní sekvence aminokyselin, t.j. ,,primární struktura, určuje povahu proteinu. Řetězec aminokyselin může být poté uspořádán ve formě řady ,,sekundárních struktur, jako jsou na př. pláty ( ,,skládané listy) a šroubovice.

Tyto struktury jsou také uspořádány ve vzájemných vztazích a vytvářejí ,,terciární struktury”. Na př. plá ty mohou být umístěny k sobě navzájem, spíše jako novinové stránky. Konečně i některé podjednotky mohou být v určitém enzymu navzájem spojeny a tak vytvářejí ,,kvarterní strukturu.

Aby enzym byl funkční, musí obsahovat aktivní vazebnou palohu, která je selena katylyaovat reakci určitého substrátu. Aktivní vazebné centrum se často vyznačuje specifickým uspořádáním, které je determinováno primárními, sekundárními, terciárními a kvarterními strukturami enzymu.

Příčinami deaktivace enzymu jsou pravděpodobně změny ve tvaru katalytické vazebné polohy.

Existuje několik faktorů, včetně tepla,tlaku a pH, které mohou ovlivnit vazebné funkční skupiny enzymu a tedy i aktivní centra.Během technologického výrobního procesu krmných směsí, je už některý enzym, přítomný ve směsích, vystaven vlivům teplot a tlaků, které mohou velmi dobře způsobit, že enzym je alespoň zčásti denaturován, a tak ztrácí část ?.a:nebo všechnu svoji aktivitu.

Čítn vyšší je teplota během výrobního procesu,tím nastává i větší pokles enzymatické aktivity.

Je typické, že mezofilní xylanázy, jsou stálé při teplotách do 65°C, ale ztrácejí všechnu aktivitu v případě, že jsou vystaveny, alespoň ve vodném roztoku, teplotě 95°C.

V případě, že se projeví během výrobního procesu krmných směsí v důsledku zmíněné teploty denaturaee, je to samozřejmě nevýhodné vzhledem ktomu, že enzym nepřispívá ku .zvýšení efektu, pro který byl ku směsi přidán, nebo projevuje-li se jeho působení pouze v omezeném rozsahu.

Jedna z možností, jak se vyrovnat s tímto problémem, by mohla spočívat v přidání podstatně relativně většího množství enzymu do krmné směsi tak, aby se do určité míry deaktivace enzymu vykompenzovala.

Přidávání dodatečného množství enzymu je však z ekonomického hlediska nevýhodné vzhledem ktomu, že enzymy, používané při výrobě krmných směsí, jsou relativně nákladné.

Byla také zkoumána možnost stabilizace enzymů jejich zakotvením na speciální nosiče, nebo jejich obdukcí, za použití speciálních obdukčních technologií, které nelze dosud efektivně využít za relativně tvrdých podmínek u výrobních technologií pelet, za použití páry o vysoké teplotě v expanderu, nebo extruderu ( vytlačovací lis ).

Alternativní řešení b,y mohla spočívat v přidávání enzymů, jako na př. xylanázyj do již předem vy- 9 lisovaných pelet, které bylyjjiž tepelně zpracovány»

To není však ideální řešení, protože pro dosažení relativního množství enzymu, zabudovaného do pelet, je v prvé řadě nutná dokonalá obdukce enzymu v peletách, která vyžaduje komplexní a nákladné strojní vybavení.

Za druhé, roztoky enzymů, používané při zmíněných obdukčních postupech, vykázaly při skladování omezenou stabilitu a mohou být i kontaminovány bakteriemi.

I když jsou částečná řešení problematiky stability enzymů během výrobního pronesu dostupná, žádné z nich se nevypořádává s touto problematikou zcela efektivním způsobem.

V popisu a v dále uvedených patentových nárocích, jsou odkazy zaměřené na jednotky xylenázové aktivity. Tato aktivita, uváděná v předloženém vynálezu, je testována analytickými postupy, uvedenými na dalších stranách»

- 10 Analytické postupy při hodnocení xylěnázové aktivity ^edna jednotka xyl^názové aktivity je množství enzymu, které uvolňuje ze substrátu během 1,0 minutý, za uvedených podmínek/ jeden /umol redukujících cuk rů, vyjádřených v ekvivalentech xylózy.

R e a g e n s

1. 1%ní ( hmotnost/objem ) xylanový substrát

Ku 1,0 g xylanu ( Fluka 95590) se přidá 10,0 ml 0,5M roztoku hydroxidu sodného a tato směs se mí chá 30 minut pomocí magnetického míchadla.

Poté se ku směsi přidá cca 40,0 ml Q,G5M pufru octanu sodného ( pH 6,50)/a pH se upraví na hodnotu 6,50 pomocí 1M kyseliny octové, a doplní se na objem 100,0 ml s 0,05M^; pufru octanu sodného, pH 6,50.

Zmíněný substrát by měl být míchán po celou dobu kdy výše uvedené operace probíhají.

2. 1M kyselina octová

Do odměrné baničky se napipetuje 5,70 ml ledové kyseliny octové a doplní se na objem 100,0 ml de stilovanou vodou.

Pufr 0,05M octan sodnýJ pH 6,50

- 11 Α» Octan sodný ( 4,1 g) se rozpustí v destilované vodě a doplní se na objem 1000 ml destilovanou vodou·

B. Naředí se 3,0 g ledové kyseliny octové v destilované vodě a doplní se na objem 1000 ml destilovanou vodou.

Pomocí roztoku B se upraví pH roztoku A na pH 6,50.

4. Reagens z kyseliny dinitrosalicylové

Do cca 800,0 ml destilované vody se nasuspenduje 20,0 g 3,5- dinitrosalicylové kyseliny a za stálého míchání se postupně přidá 300,0 ml roztoku hydroxidu sodného, připraveného rozpuštěním 32,0 g hydroxidu sodného ve 300,0 ml destilované vody.

Poté se vzniklá suspenze zahřeje na vodní lázni, přičemž teplota nesmí přesáhnout +48°e a směs se míchá tak dlouho, dokud nevznikne čirý roztok.

Poté se přidá postupně 600,0 g vinanu sodnodraselného a roztok se zahřívá tak, aby teplota nepřesáhla +48°C a v případě potřeby tak dlouho, dokud se roztok nevyčeří.

Roztok se poté doplní na 2000 ml destilovanou vodou a zfiltruje se přes hrubý sklěněný sintr ( slinuté zrněné sklo).

Takto připravené reagens se skladuje ve tmavé lahvi při teplotě místnosti. Reagens je stálé maximálně po dobu 6 měsíců.

Postup

1. Vzorek enzymu

Teplota zředěného roztoku enzymu ( 1,0 ml) v 0,05 M pufru octanu sodného (pH 6,50), se ustálí na +50°C. Poté se přidá 1,0 ml xylanového substrátu a směs se míchá a inkubuje při teplotě +50°C přesně po dobu 30 minut.

Po přidání reagens s kyselinou dinitrosalicylovou (3 q se směg za míchání povaří přesně po dobu 5,0 minut.

Po ochlazení reakční směsi na teplotu místnosti v lázni se studenou vodou, se měří absorbance při 540 nm proti destilované vodě.

2. Slepý pokus s enzymem

Při teplotě +50°C se inkubuje 1,0 ml xylanového substrátu po dobu 30 minut a poté se přidají 3,0 ml roztoku kyseliny dinitrosalicylové a směs se zamíchá. Poté se přidá 1 ,0 ml neředěného enzymu ( v 0,0514 pufru octanu sodného^ pH 6,50 a směs se uvede do varu na dobu přesně 5,0 minut.

Po ochlazení v lázni se studenou vodou na teplotu místnosti se měří absorbance směsi při 540 nm proti destilované vodě.

Rozdíly v ábsorbanci mezi vzorkem enzymu a slepým vzorkem by měly být mezi 0,3 až 0,5.

Standamí kalibrační křivka.

- 13 řř Připraví se standardní roztoky bezvodé xylosy v 0,05M'pufru octanu sodnéhoj pH 6,50.

Koncentrace xylosy by se v tědhto standardech měla pohybovat v rozmezí od 0,05 do 0,50 mg/ml.

Do skleněné zkumavky se napipetuje 1,0 ml standardního roztokuj 1,0 ml xylanového substrátu a 3,0 ml reagens s kyselinou dinitrosalicylovou/a směs se míchá a povaří přesně po dobu 5,0'minut.

Po ochlazení v lázni se studenou vodou se^měří absorbance při 540 nm opět proti standardnímu slepému roztoku.

Ve standardním slepém roztoku je roztok xylosy nahrazen s 1,0 ml 0,05M acetátového pufruj pH 6,50. Jinak je standardní srovnávací roztok zpracován stejným způsobem, jako standard s xylosou. Grafická závislost koncentrace xylosy je funkcí absorbance. Pro každé nové reagens s kys.dinitrosalicylovou '7 ý p je/nutňé připravit novou atd.kalibrační křivku.

W ý ρ o δ e t

Aktivita xylanázy ve vzorku se propočte dle následující rovnice:

Aktivita (J/g) ( A(X) - A(0) x K + C) x 1000 x Df xyl

V uvedeném vzorci jednotkové symboly znamenají: A(0) = absorbance slepého vzorku enzymu A(X) - absorbance vzorku enzymu k » sklon standarníC kalibrační) křivky C = úsek xylosové standarní křivky 1000 = faktorJ mmol - /umol

- 14 Df = faktor zředění ( ml/g ) molekulární hmotnost xylosy (150,13 mg/mmol) t » reakční doba ( 30 minut )

Podstata vynálezu

Na základě výše uvedených úvah spočívá jeden z nároků předloženého vynálezu v použití xylanázy jako krmného doplňku pro zvířata, který zachovává v podstatě všechny aktivity v případě zpracování za použřtí^Ž§íSnologií, při kterých jsou používány relativné vysoké teploty.

Předložený vynález chrání tedy používání thermostabilních xylanáz, které lze získaz z mikroorganismu Microtetraspora flexuosa, jako doplňků krmiv určených pro zvířata, přičemž je xylanáza charakterizována svojí stálostí při zahřátí po dobu l,Qrminuty ve vodní lázni, nastavené na teplotu 95°C, aniž dochází k podstatným ztrátám aktivity, jak bylo stanoveno schopností tohoto enzymu snižovat/ve srovnání s nezahřívanou kontrolou/ viskozitu líního roztoku pšeničného arabinoxylanu, při pH 6,50 a při teplotě 40°O, na stejnou finální vi&kozitu, t.j. + 0,001 Pascal sekund··

Xylanáza je výhodně schopna snižovat/ve srovnání s nezahřívanou kontrolou/viskozitu líního roztoku pšeničného arabinoxylanu při pH 6,50 a teplotě 40°C_zna stejnou finální viskozitu, t.j. + 0,0005 Pascal sekund.

Metoda stanovení aktivity xylanázy, uvedená výše, je založená na snižování viskozity in vitro, za použití pšeničného arabinoxylanu, jako viskozního substrátu, za podmínek, které napodobují podmínky zjištěné v gastro• 15 inteatinálnim traktu*- zvířete.

Takováto ipetoda in vitro funguje jako ukazatel, zda xylanáza ( nebo směs xylanáz), by mohla vykázat žádaný efekt při snižování viskozity v trávícím traktuj v případě jejího ( jejich) použití jako doplňku v krmných směsích pro zvířata.

Všechny podrobnosti o metodě, založené na snižování viskozity, a používané pro měření účinnosti xylanázy snižovat viskozitu, jsou uvedeny dále.

Éetoda'je ve všech případech prováděna duplicitně.

Xylanázový enzyxjL, který má být hodnocen, je zředěn s O,1M pufrem fosforečňanu sodného, majícího pH 6,50, přičemž koncentrace xylanázy je upravena tak, aby výsledný roztok vykazoval xylanázovou aktivitu v koncentracích jedné jednotky na 1,0 ml.

Tato xylanázová aktivita je určována dle metody pro, stanovení xylanázové aktivity, popsané podrobněji výše.

Roztok enzymu o koncentraci 100 /ul byl přidán ku 400 /ul roztoku pšeničného arabinoxylanu ( získaného od firmy Megazyme, Austrálie) v 0,1M roztoku fosforečňanu sodného; pH 6,5O; předloženého ve skleněné zkumavce, takže finální koncentrace enzymu byla 0,2 jed notek/ml a koncentrace pšeničného arabinoxylanu byla 1% ( hmotnostní poměr ).

Zkumavky, obsahující roztok, byly poté pevně uzavřeny a umístěny ve vodní lázni, nastavené po určitou

- 16 dobu na teplotu 95°C, typicky lj© minutu/nebo 5,0 minut·· Po tomto zahřátí byly zkumavky ochlazeny v ledové lázni.

Viskozita výsledného roztoku byla měřena po 20 minutách při teplotě 40°C, za použití Bromfieldova SC-IV, CP 40 viskozimetru, nastaveného na měření vÍ3kozity jednou za sekundu.

Použití thermostabilní xylanázy, jako doplňku pro krmné směsi pro zvířata, je dle předloženého vynálezu výhodné, protože aktivita xylanázy není po smíšení s ©ataními složkami krmivá, podstatněji snížena, a po zpracování konvenčními postupy, používanými při výrobě krmiv, na příklad při použití expanderu nebo extruderu.

Thermostabilní xylenázu, použitelnou dle postupu popsaném v předloženém vynálezu, lze získat z mikroorganismu Microtetraspora flexuosa.

- 17 Izolace thermostabilních xylanáz z mikroorganismu Microtetraspora flexuosa je podrobně popsána dále.

Bylo zjiStěno, že z mikroorganismu Microtetraspora flexuosa lze případně izolovat 5 různých thermostabilních xylanáz..

Odkaz na tyto xylanázy, označené 1 až 5_t je uveden dále.

Tyto xylanázy byly přečištěny tak, až byly homogenní, jak bylo zjištěno pomocí stříbrem značených izoelektrických fokuzačních gelů. Xylanázy byly přečištěny kombinovaným použitím chromatografie na iontoměničích a hydrpfobní interaktivní chromatografií.

Žiaždá přečištěná xylenáza je v širokém rozsahu pH charakaterizována jako thermostatbilní.

Specificky si každá xylenáza zachovává v rozmezí pH 6,0 až 9,0 vyšší, jak 80%ní aktivitu.

- 18 Xylanázy mohou být charakterizovány dále následovně :

Xylanáza 1, má molekulovou hmotnost cca 33.000 daltonů a pí cca 8,5. Maximální enzymatickou aktivitu vykazuje při teplotě 70°C a v rozmězí pH 7,0 až 7,50.

Xylenáza 2, má molekulovou.'hmotnost cca 13.300 daltonů a pí cca 7,50. Maximální enzymatickou aktivitu vykazuje při teplotě cca 65°C a v rozmezí pH 7,0 až 7,50.

Xylenáza 3, má molekulovou hmotnost cca 31.000 daltonú a pí cca 6,20. Maximální enzymatickou aktivitu vykazuje okolo pH 7,50 a při teplo tě cca 65°C.

Xylenáza 4, má molekulovou hmotnost cca 50.000 daltonů a pí cca 5,80. Maximální enzymatickou aktivitu vykazuje při pH cca 7,50 a při teplotě cca 65°CL.

Xylenáza 5„ má molekulovou hmotnost cca 35.000 daltonů a pí cca 7,50. M_axi_mální enzymatickou aktivitu vykazuje při pH cca 5.30 a při teplotě cca 70°C.

Xylanázy z mikroorganismu Microtetraspora flexuosa mohou být na základě předloženého vynálezu použity buá jako směs pěti xylanáz, t.j. jako celkový xylanázový supernatant, nebo jednotlivě, nebo jako kombinace jedno- 19 tlivých xylanáz.

Alternativní způsob přípravy xylanáz, vhodných pro použití dle předloženého vynálezu, zahrnuje jejich získání pomocí technik rekombinace DUA za pomoci vhodného hostitelského mikroorganismu, který produkuje žádanou thermostabilní xylanázu.

Tak může být xylanáza získána z hostitelského mikroorganismu způsobem, kdy by byl hostitelský bakteriální nebo fungální kmen geneticky manipulován vneseným zakódovaným genem pro thermostabilní xylanázu z mikroorganismu Microtetraspora flexuosa.

lylanázy 1 až 5, získané z Microtetraspora flexuosa, mohou být odvozeny z kmene, označeného jako ATCC 35.864 a deponovaného ve sbírce mikroorganismů instituce ATCC, Sethesda, Sev.5akota( USA), kde lze tento kmen snadno získat.

Izolace nových xylanáz zahrnuje čistící operace mimobuněčných xylanáz kombinovaným použitím chromátografie na iontoměničích a hydrofóbní interaktivní chromatofrafie v sestavě, závislé na xylanáze, která má být přečištěna.

Dále jsou popsány dva čistící postupy, použitelné pro izolaci a charakterizaci pěti chemicky odlišných xylanáz, získaných z mikroorganismu Microtetraspora flexuosa.

Obě metody zahrnují odstranění buněk Microtetraspora flexuosa odstředěním a zahuštěním kultivačního media pomocí ultrafiltrace.

Při prvé metodě jsou odděleny a přečištěny:

Xylanáza i; ( pí = 8,0 a

Xylanáza 2ζ ( pí = 7,5 ):

a

Xylanáza 3*_f ( pí = 5,3 );

Všechno kultivační medium, zbavené buněk, se aplikuje na sloupec měniče iontů anex a poté se promyje a naředí za·zvyšujícího se gradientu chloridem sodným.

Po shromáždění frakcí je xylanázová aktivita měřena pomocí metody, zahrnující použití s remazolovou briliantovou modří zbarveného xylanu z březového dřeva ( RBB- xylanová metoda ).

Xyllnáza 1 a xylanáza 2 se eluují při průchodu sloupcem. Protékající kapalina je shromažáována a zno•Svu nanesena na hydrfobní interaktivní sloupec (fenylSepharosa).

Xyldnáza 1 a xylBnáza 2 se od sebe separují alučí sloupcejpři použití zvyšujících se koncentrací ethylenglykolu.

Xylenáza 4 se váže na sloupci anexu a eluuje se za použití solného gradient spolu s dalšími vázanými xylanázemi ( xylanázy 3 a 5 ).

Xylanáza 4 byla oddělena od ostatních xylanáz pomocí hydrofobní interaktivní chromatografie, jak je mnohem obšírněni popsáno dále v Příkladu 1.

Přečištěné xylanázy 1J a 4J byly dále analyzovány izoelektrickou fokusací a hmotnostní spektroskopií, nebo elektroforézou na Na -dodecylsulfátovém- polyakrylamidovém gelu.

Při použití druhé metody, je výše popsané, buněk zbavené kultivační medium zpracováno v prvém stupni pomocí hydrofobní interaktivní chromatografie za účelem přečištění xylanázy 3 ( pl ^s 6,20 ) a xylanázy 5 ( pl = 5,30 ).

Obě zmíněné xylanázy jsou eluovány společně při stejné koncentraci síranu amonného.

Pro vzájemnou separaci xylanázy 3 od xylanázy 5, byla použita pro zpracování shromážděného eluovaného/ enzymatického materiálu^chromatografie na iontoměniči anexu.

XylBnáza 3 ae eluuje na sloupci anexu při nižších koncentracích sole než je to u xylanázy 5.Obě přečištěné xylěnázy byly po prvé charakterizovány pomocí izoelektrické fokusace a hmotnostní spektroskopií, nebo elektroforézou na Na-dodecylsulfátovém-polyakrylamidovém gelu.

fFaždá jednotlivá xylenáza byla odlišena od ostatních na základě svých unikátních biochemických charakteristik, na př. molekulové hmotnosti^ pij optimální teploty a pH* hydrofobních vlastností a tepelné stability^

Všech pět xylanáz je odolných vůči teplotám až do 90°C a alkalickému prostředí v rozmezí pH 7,00 až 10,00.

Všech pět přečištěných xylanáz vykazuje poločas při teplotě 80°£ v rozmezí od 30 minut do 110 minut.

#alší charakterizace každé z pěti xylanáz, přečištěných do homogenního stavu, je popsána dále v referenčním Příkladu 2.

Další aspekljzahrnuje/v rámci předloženého vynálezu/ předpokládané krmné směsi/obsahující fyziologicky při22 jatelný nosič a thermostabilní xylanázu, získanou z mikroorganismu Microtetraspora flexuosa, charakterizovanou schopností tolerovat zahřívání po dobu 1,0 minuty ve vodní lázni, nastavené na teplotu 95°C, aniž by došlo k podstatnějším ztrátám aktivity, jak bylo zjištěno stanovením schopnosti enzymu snižovat^ve srovnání s neza hřívanou kontrolou^viskozitu 1%ního roztoku pšeničného arabinoxylanu při pH 6,50 a při teplotě 40°C, na stejnou finální viskozitu, t.j. + 0,001 Pascal sekund.

Vzhledem k tomuto aspektu, může být použita thermostabilní xylanáza buč samotná, nebo ve formě směsi výše popsaných xylanáz.

Z aspektů předloženého vynálezu je jako fyziologický vhodný nosič upřednostňována obilovina, nebo produkt z obilovin. Tfcové obiloviny zahrnují mletou pšenici, kukuřici, sóju,a :dále cukry, škroby, nebo další produkty ze Xmíněných surovin.

Zmíněné nosiče jsou z hledisek předloženého technického řešení běžné a proto nejsou dále podrobněji popisovány.

Z tohoto aspektu, zahrnutého do předloženého vynálezu, jsou krmné doplňky kombinovány s dalšími krmnými složkami, s cílem, zajištění produkce na obilovinách založených krmiv.

Tyto a ostatní krmné složky zahrnují jeden nebo více dalších ( výhodně thermostabilních) enzymatických doplňků, vitaminové krmné doplňky, krmné doplňky s obsahem minerálů a krmné doplňky s obsahem aminokyselin.

- 23 Výsledný ( kombinovaný) krmný doplněk může být, včetně některých možných odlišných typů sloučenin, smíchán poté ve vhodném množství s dalšími krmnými složkami, jako jsou na př. obiloviny a proteinové doplňky, a tak připravit krmivo pro zvířata.

Výrobní technologie, zahrnující zpracování zmíněných složek do krmných směsí pro zvířata, mohou být realizovány na běžně používaných výrobních aparaturách,jako jsou na př. stroje na výrobu dvojitých pelet,, parní peletizační zařízení, expander a extruder ( výtlačný lis).

Přítomnost thermostabilní xylázy ve finálním, na obilovinách založeném krmivu, ovlivňuje snižování ukazatele FCS, t.j. mířy využití krmivá v relaci spotřebovaného krmivá ku přírůstkům hmotnosti zvířat. Xylenáza může alternativně a nebo dodatečně stimulovat trávící proces na obilovinách založeného krmivá.-^alší působení xylanázy může alternativně nebo dodatečně zvyšovat hodnoty přírůstků hmotnosti u zvířete, v závislosti na jednotce množství krmivá, které zvíře zkonzumuje.

Předložený vynález zahrnuje další aspekt, t.j. na obilovinách založené krmivo, obsahující alespoň 20% obilovin ( hmotnostní poměry) a 0,00001g až 1,0 g thermostabilníhoy xylanázového proteinu, na 1,0 kg krmivá, přičemž xylanáza, kterou lze získat z mikroorganismu Microtetraspora flexuosa, je charakterizována schopností tolerovat zahřívání po dobu 1,0 minuty ve vodní lázni, nastavené na teplotu 95°C, aniž dojde k podstatným ztrátám aktivity, jak bylo stanoveno na základě schopností zmíněné xylanázy snižovat, ve srovnání s ne zahřívanou kontrolou, viskozitu l%ního roztoku p&eničného arabinoxylanU/při pH 6,50 a teplotě 40°C, na stejnou finální viskozitu, t.j. + 0,001 Pascal sekund.

Na základě uvedeného aapektu, zahrnutého do předloženého vynálezu, může být thermostabilní xylanáza použita opět jako samotná, nebo ve směsi thermostabilních xy&aná^ popsané už výše.

V takovémto, na obilovinách založeném krmivu, je výhodnější, aby alespoň jedna z obilovin, byla pšenice, ječmen, kukuřice, čirok, žito, oves, jiné obiloviny pšeničného typu a rýže.

Zejména je výhodné., kdyby obilovina byla pšenice.

Na obilovinách založené krmivo může být^le předloženého vynálezu použito k výkrmu zvířat, jako jsou kroca ni, husy, kachny,ovce a skot. Je však zejména výhodné, že zmíněné krmivo lze použít ku krmení prasat nebo drůbeže^a zvláště kuřat-broilerů.

Je výhodnější, když na obilovině založené krmivo zahrnuje 0,0001 g až 1,0 g xylanázového proteinu na 1,0 kg krmivá a nejvýhodnější je 0,001 g až 1,0 g/ kg.

Na obilovině založené krmivo obsahuje alespoň 20% obiloviny ( hmotnostní pbměry). Výhodněji by mělo zahrnovat alespoň 30% ( hmotnostní poměry) obilovin a nejvýhodněji alespoň 50% ( hmotnostní poměry) obilovin.

Obilovina může být jedna už z výše zmíněných obilovin, z nichž je zejména pšenice zvláště výhodná.

Ačkoliv obilná složka v krmivu založeném na obilovinách je zdrojem proteinu, je obvykle nutné zahrnout do krmivá ještě dodatkové zdroje proteinu, na příklad takové, které jsou odvozené od rybí moučky, masných produktů nebo rostlinného materiálu.

- 25 Zdroje proteinů rostlinného původu zahrnují alespoň jeden z následujících zdrojů, t.j. tuky obsahující sojové boby, řepkové semeno, canolu, sojovou moučku, moučku z řepkového semene a moučku z canoly.

Ve srovnání s konvenčními krmivý, relativní množství dalších zdrojů proteinů, jako je rybí moučka ,.mouěka z mas n^x^roduktů nebo rostlinné proteiny, může být při využití poznatků uváděných v předloženém vynálezu omezováno a tím významně přšpět i k úsporám nákladů, protože relativní náklady na obiloviny jsou podstatně nižší než u konvenčních proteinových doplňků.

Z těchto hledisek lze ve srovnání s konvenčními krmivý připravit₍na základě poznatků uváděných v předloženém vynálezu,krmivo o stejné nutriční hodnotě, vyjádřenou dostupnou energií, hodnotami aminokyselin a proteinů, které ale obsahuje relativně vyšší podíl obilovin a relativně nižší podíl proteinových doplňků.

Bylo také zjištěno, že zahrnutí thermostabilní xylanázy do krmivá pro zvířata umožní snížit obsah energeticky bohatých doplňků, jako jsou tuky a pleje,které je jinak zapotřebí použít, aby se docílilo určitých nutričních efektů.

Použití thermostabilní xylanázy v krmivech pro zvířata umožňujejna základě předloženého vynálezu, zvýšení nutričního využití surových proteinů a/nebo efektivitu trávícího procesu a/nebo obsahu aminokyselin, a/nebo koeficientu trávení krmivá, které umožňuje snížit množství alternativních zdrojů proteinu a/ nebo doplňků aminokyselin, které musely být dříve do receptur krmných směsí zabudovány· , , . , a/nebo obaah dostupného

V případě, že koeficient tráveníYSUroueft'0 pše ničného proteinu^je při použití thermostabilní xylanázy zvýšen, lze zji^i^aťv^pory v důsledku sníženého obsahu proteinů, a/nebo energetických doplňků, kteřé je jinak zapotřebí při konvenční přípravě do krmných směsí dodat.

Při alternativě, kdy se po přídavku thermostabilní xylanázy zvýší pouze obsah aminokyselin, nebo hodnoty trávícího koeficientu, lze zjistit významné úspory v důsledku sníženého obsahu doplňkových aminokyselin, které by bylo nutné jinak při konvenční přípravě do krmných směsí přidávat.

Krmné směsi, připravené dle předloženého vynálezu, mohou také zahrnovat i jiné enzymatické doplňky, jako na příklad jednu nebo více beta-glukanáz, glukoamyláz? mannáz, alfa-galaktosidáz, fytáz, lipáz, alfa-arabinofuranosidáz, proteáz,alfa-amyláz a pektináz.

Zejména výhodné je zahrnout do krmných směsí, jako další enzymatický doplněk, proteázu, jako je na příklad subtilisin, získávaný pomocí mikroorganismu rodu Bacillus.

Takové substilisiny jsou na příklad popsány podrobně v US patentové přihlášce A-4- č.760.025.

Výhodně lze krmnou směs získat na základě předloženého patentu přípravou krmných doplňků, skládajících se z fyziologicky vhodného nosiče a thermostabilních xylanáz^ a smíšením těchto doplňků v množstvích od 0,01g do 50,0 g na 1,0 kg, s ostatními složkami krmivá pro zvířata( včetně obilovin a ostatních zdrojů proteinových doplňků), ještě výhodnější v množstvích 0,1 až 10,0 g/ kg/a nejvýhodněji v množstvích cca 1,0 g/kg.

Na následujících stranách je uveden krátký popis každého ze tří obrázků, týkajících 3e této specifikace!-.

- 27 Přehled obrázků_na výkresech

Obrázek 1, zobrazuje profil pH aktivit pěti přečištěných xylanáz z mikroorganismu Microtetraspora flexuosa.

Obrázek 2, zobrazuje tepelný profil aktivit pěti přečištěných xylanáz z mikroorganismu Microtetraspora flexuosa.

Obrázek 3, zobrazuje profil tepelné stability pěti pře čištěných xylanáz z mikroorganismu Microtet raspora flexuosa.

Předložený vynález je dále podrobněji objasněn pomocí dále uvedených Referenčních příkladů a Příkladů.

______y y _η á 1 e _rz 'u

Referenční příklad 1

Čištění pěti xylanáz získávaných z mikroorganismu Microtetraspora flexuosa.

Metoda stanovení xylanáz.

Přítomnost xylanázy byla stanovena pomocí s ramazalovou briliantovou modří značeného xylanového substrátu z březového dřeva ( RBS-xylen), přičemž dodavatelem zmíněného substrátu je firma Megazyme(Austrálie).

Vzorky ( 200 /ul) jsou smíchány s 250,0 /Ul roztoku substrátu ( 2%ní^ hmotností ob janfc ·) RBB-xylanu, v 50 mM'citrátu sodného^ pH 6,5O^a jsou inkubovány při teplotě 37°C po dobu 10,0 minut.

Nestrávený xylan je vysrážen přídavkem 1,0 ml 95$ního ethanolu a odstředěním je odstraněn.

Uvolněné barvivo, zbývající v roztoku, je kvantitativné vyhodnoceno spektrofotometričky (ΟΏ^θ), ve srovnání s ethanolem, jako slepým vzorkem, a je proporcionálně použito při měření aktivity xylanázy.

Aktivita může být vyjádřena kvantitativně za použití standradní kalibrační křivky a je vyhodnocena ve formě XAj/ml ( XAU/ml), t.j. aktivita xylanázy vyjádřená v jednotkách, v 1,0 ml.

Překrývací gelová metoda, použitelná pro zjištění přítomnosti více xylanáz a stanovení jejich izoelektrických bodu ( pí), byla rovněž vyvinuta pro použití s

BBB-xylanového substrátu.

Izoelektrické fokuzační gely ( pH gradient 3,0 3,0 ), jsou pokryty mletou agarosovou/suspenzí substrátu ( 4%ní /hmota/objem? agarosy*» dále ?,Q mg/ml RBB-xylan* 0,5%ní /objem/objem/ glycerol v 50,0 ml roz toku citrátu sodného /pH 6,50/, a jsou inkubovány při teplotě 37°C.

Po cca 1,0 hodině je aktivita xylanázy patrná z vyjasněných zón. Gely jsou ponechány samovolně vyschnout a poté jsou uloženy.

Izoelektrický bod xylanázy je stanoven ve srovnání se současně analysovanými izoelektrickými fokusač nimi gely, obsahujícími stříbrem značené standardy izo elektrického bodu.

Vzorek

Buněk prostý supernatant fermentačního media mikroorganismu Microtetraspora flexuosa* ATCC 15.864, ( cca 14 XAj./ml), byl 5x zahuštěn pomocí ultrafiltrace ( Amicon- míchání buněkj 350 mlj PM-10 membrána).

Všechny vzorky byly filtrací sterilizovány.Koncentrace proteinů byla 12,50 mg/ml_{ jak bylo stanoveno metodou BCA ( Pierce).

Překrývací gelovou analysou byla stanovena pří-* tomnost pěti xylanáz^ izoelektrický bod 8,50^ 7,50^ 6,2O; 5,80 a 5,30.

íěchto pět xylanáz je dále v předložené specifikaci zmiňováno jako xylanázy 1, až případně 5.

- 30 Čistící postupy

Jak je uvedeno dále, byla pro čištění všech pěti xylanáz použita kombinace chromatografie na iontom^ničích a hydrofobní interaktivní chromatografie.

Přečištění xylanáz 1 a 2.

Jako prvý krok, byla použita pro přečištění xylanázy 1 a 2, chromatografie na iontoměničích.

Zahuštěný vzorek byl kompletně dialyzován proti 10 mM roztoku tris-HClJ pH 9,0 ( pufr & ).

Na standardní chromátografický sloupec ( Pharmacia C 16/40), vyplněném se 72,0 ml iontoměniče Q-SepharoseHP ( Pharmacia) a uvedeného do rovnovážného stavu s pufrem A, za použití průtoku 1,0 ml/min., a systému Pharmacia PGL, bylo aplikováno 50,0 ml koncentrovaného vzorku.

Sloupec byl promyt s 50,0 ml pufru A a poté eluován se 400,0 ml solného, lineárně stoupajícího gradientu_rpufrem A, až ku koncentraci O,25M chloridu sodného v pufru A.

Poté byl ze sloupce vymyt ^zbývající, vázaný protein, s 2M NaCl v pufru A.

kyly shromážděny frakce o objemu 10,0 ml,které byly poté hodnoceny výše popsanými postupy.

Xylanázy 1 a 2 se vymývají společně ze sloupce za počátečního průtoku, přičemž značné množství zbytkového proteinu je na sloupci vázáno ( xylenázy 1a 2 představují na sloupci nevázané frakce ).

použita hydrofóbní interaktivní chromatografie.

Aktivní frakce byly shromážděny a upraveny, na konečnou 0,2M koncentraci síranu amonného přídavkem 2M roztoku síranu amonného.

Přidáním 50M roztoku citrátu sodného*_t pH 6,50^ byla upravena finální koncentrace na 10 mM'a tento materiál ( cca 100 ml ) byl aplikován na standardní chromatograficky sloupec ( Pharmacia C 16/20 ), naplněný se 36,0 ml Phenyl-Sepharosy 01-48 ( Pharmacia), a uvedeného -do rovnovážného stavu se směsí roztoku

s průtokem 0,5 ml/min.

Poté byl sloupec promyt se 60,0 ml pufru B a následně eluován s postupně klesající koncentrací solného roztoku se 70,0 ml 10mM citrátu sodného; pH 6,5;

( pufr C)/ na postupně klesající 10%ní koncentraci ( ob jem/ob jemr) ethylenglykolu v 50,0 ml pufru C, při aplikaci 200,0 ml lineárního gradientu ethylenglykolu 10-32%, promytím s 80,0 ml 32%ního ethylenglykolu a dále se 150,0 ml , gradientovým promytím_/32% - 38% ním ethylenglykolem a nakonec až postupně se 70,0 ml na 50%ní zvyšující se koncentraci ethylenglykolu,kterými bylo promytí sloupce dokončeno.

Byly jímány frakce o objemu 10,0 ml, podobným způsobem, jako je popsáno výše.

Za uvedených podmínek byly získány homogenní eluáty xylanázy 2 při promývání s 32%ním ethylenglykolem, zatímco homogenní eluáty xylanázy 1 byly zaznamenány až v konečných fázích ( chvostu) chromatografie, při použití 32- 38%ního gradientu ethylenglykolu.

- 32 Přečištění xylanázy 4.

Za použití výše popsaného prvého stupně při čistících postupech xylanázy 1 a 2 ( chromatografie na iontomeničíoh), byly společně eluovány při cca 0,16M NaCl v pufru A, i xylanázy 4 a 5.

Aktivní frakce byly shromážděny a přeneseny do směsi 0,4M roztoku síranu amonného/10 mM citrát sodný* pH 6,507 ( pufr D), podobným postupem, popsaným výše.

ílfeteriál, cca 100,0 ml, byl nanesen rychlostí 1,0 ml/mim. na sloupec hydrofobní interaktivní chromatografie, popsané výše, který byl stabilizován do rovnovážného stavu s pufrem Π..

Poté byl sloupec promyt s 50,0 ml pufru D, a eluován v lineárním gradientu se ?30,0 ml pufru Q, až k pufru G, a bezprostřední následnou gradientovou eluci se 200,0 ml pufru CL, do 50%ního ethylenglykolu.

Byly jímány frakce o obsahu 10,0 ml a byly vyhodnoceny analyticky stejným postupem, popsaným výše.

Xylanáza 4 se eluuje při cca· 20% ethylenglykolu.

Přečištění xylanáz^ a 5.

V případě xylanáz 3 a 5 byla jako prvý stupeň použita hydrofobní interaktivní chromatografie.

Zahuštěný vzorek byl vnesen dolopM roztoku síranu amonného v pufru C, přidáním 2M roztoku síranu amonného a roztoku 50 mM citrátu sodného^ pH 6,50ζ postupem, popsaným už výše.

Po zfiltrování celkového materiálu byly stopy sraženiny odstraněny a 50,0 ml filtrátu bylo aplikováno při rychlosti průtoku 1,0 ml/min. na výše popsaný sloupec hydrofobní interaktivní chromatografie,který

- 33 byl uveden do rovnovážného stavu a O,5MT roztokem sfránu amonného v pufru C ( pufr E).

Chromátografický sloupec byl poté promyt s 87,5° ml pufru E, a poté byl v lineárním gradientu promyt se 147 ml pufru E až k pufru C.

Byly jímány frakce o obsahu 10,0 ml a vyhodnoceny stejným postupem, popsaným výše.

Xylanázy 3 a 5 byly společně eluovány při koncentraci cca 0,05 síranu amonného.

Pro izolaci a přečištění xylanáz 3 a 5, byl použit postup chromatografie na iontoměničích, popsaný výšev prvém stupni.

Aktivní frakce', získané pomocí hydrofobní interaktivní chromatografie, byly shromážděny ( 70,0 ml), kompletně dialyzovány proti 10 mM tris-HCl* pH 8,0 ( pufr F),. a dle výše popsaného postupu byly zahuštěny na cca 20,0 ml.

Při průtoku 1 ,0 ml/min. byl aplikován materiál na chromá tograf ický sloupec s iontoměničem, popsaným výše, a poté byl uveden do rovnováhy s pufrem F.

Po promytí sloupce se 150,0 ml pufru F, byla provedena eluce se 150 ml pufru F v lineárním gradientu ku 0,25M NaCl v pufru F.

Byly jímány frakce o obsahu 10,0 ml a byly vyhodnoceny analytickými postupy, popsanými výěe.

Xylanáza 3 byla eluována při cca 0,05M NaCl, zatímco xylenáza 5 byla eluována při cca 0,15M NaCl.

Referenční vzorek 2

- 34 Charakterizace pěti xylanáz produkovaných mikroorganismem Microtetraspora flexuosa.

Po přečištění byla každá xylanáza podrobena izoelektrické fokusaci a dále popsanými postupy byla stanovena molekulová hmotnost.

Vý 3 le dkyy^araÉ^e ri za c e xylanáz jsou uvedeny v Tabulce 1, publikované na další straně.

techniky izoelektrické fokusace byly realizovány pomocí pSastSystemu ( Pharmacia Biotech), dle návodu výrobce.

Síarkery K ukazatele) použité pro stanovení izoelektrického bodu (pí) byly k dispozici v široké škále soupravy pro stanovení izoelektrického bodu, t.j. v rozmezí 3,5 až 9,3 ( Pharmacia Biotech).

Detekce proteinů, byla prováděna na základě příslušných instrukcí, pomocí vizualizace stříbrem vyvolaného značení.

Stanovení molekulární hmotnosti bylo prováděno dvěma postupy:

Elektroforézou na Na-dodecyl-polyakrylamidovém gelu a hmotnostní spektroskopií.

Elektroforéza na Na-dodecyl-polyakrylamidovém gelu a následná vizualizace detekcí stříbrem byla prováděna za použití Phast systému, jak je popsáno výše. 'Táhnika č.l je publikována na další straně.

β •rt s

P	O	o		O	O	O
03-H	O		ir\		o\
OS r-l	O	v—
XJ-rl	00
0X3
r-t CO	Ή
o p	Xd
Od 03	O.

Mikrotetrasppre flexuosa

	C. S Φ 3 6* s •rl P O. o co	O o	o o o c— ir\	o o IT\ MO O	o o IX\ M0 O	o o lT\ M0 O	ό o o c- o	3 r-t Φ t«0 0 XU > o
>>	P		•	«k	«k	«k	«k			Ό
	•rl		00	co	σ\	σ\	σ\			•rl
	r-t									s
N	•rt		1	I	»	1	1			co
	X5									i—1
	CO		o	O	o	o	o			>s
OJ	P		•k	k	*	·>	•k			3
	co		MO	MO	Ό	MO	MO			24
										CD
3										X
										r—1
	w									O
as	o.		O	o						o.
			irx	tr\
	a		«k	«k						1
r-t	3		ο-	c-	O	O	O			r-t
	S				ix\	m	m			X
	•rl		ι	1	«k	•k	«k			ϋ
>»	P				c—	c-	c—		Φ	Φ
	o.		o	o					•rl	Ό
	o		«k ·						O.	O
X			c—	c-					o	Ό
									24	1
									03	CO
									O	s
		as							n 3
		Ό			cg	co	co		O P	O
	XS	o	co	co	a	a	o		20 u	3
	> P	ρ	2	2	co	co	co		Φ
	O 03	φ							>» o.	CD
	r-t O	a	t	1	1	1	t		24 03	N
	3 3								O	XU
	24 -P	t		ΓΊ	o	o	o		•rl M	íd
	Φ O		•k	•k	*	•k	«k		3 3	O
	ι—1 0	z·**	m	f*3	r-	o	tr\		P P	<t-l
	03	A	m	r-	m	ir\	m		24 03	o
	2	a							Φ O	3
									r-l 3	P
									Φ P	24
									O O	Φ
								··	N Q	r-l
								(0	rl XÍ	Φ
			ir\	in	CJ	00	ΓΠ
	l-t		Ok	«k		«k	«k	0
	O,		00	c—	M0	IPi	IX\	xfl	II II	II
								3
								N		co
								o	l-t co	a
	o							Pd	o. 2	co
	w r-t
	03
	Ή			CJ	m	-M-
	KO

- 36 Markéry, použité pro stanovení molekulové hmotnosti, byly od firmy Sigma Chemical Co. ( St.Louis; Montana /USA/).

Hmotnostní spektroskopie byla prováděna firmou Charles Evans se sp.; ( 301 Chesapeake DriveJRedwood City; Kalifornie, 94063 /USA/).

Optimum. pH bylo stanoveno pomocí metody RBB, popsané už výše, s tím rozdílem, že pufry se lišily v závislosti na měřeném rozsahu pH, na př. ρΗ Δ,,,ξ až 12 ( viz Obrázek 1 ).

Příprava příslušných pufrů o selektivním pH,potřebných pro použití v rámci příslušných metod, je v možnostech příslušných odborných pracovníků.

Teplotní stabilita představuje dobu, po kterou přetrvává při danné teplotě ještě polovina aktivity. Aktivita je měřena přibližně při 1S - 37°C. Vzorek je inkubován při danné teplotě a aktivita je měřena pomocí RBB metody.

Poločas znamená čas v minutách, kdy polovina aktivity už vymizela.( viz Obrázek 3 )·

Teplotní optimum je teplota, při které je zjištěna nejvyšší aktivita.

Na Obrázku 2 je vyznačen teplotní profil xylanáz 1 až 5, měřený za použití RBB metody.

V obou Obrázcích, t.j. 1 a 2, jsou procenta maximální aktivity srovnávána s nejvyšší aktivitou měřenou při dosažené hodnotě 100% a všechny ostatní údaje jsou vztaženy při měření relativně ku standardům.

- 37 Příklad 1

Xylanázy 1 až 5, získané z mikroorganismu Microtetraspora flexuosa J. xylenáza TfxA z mikroorganismu Thermonospora fuscaj a xylenázy_rzískané z mikroorganismů Trichoderma viride a Aspergillus niger, byly testovány za účelem stanovení jejich reaktivních schopností snižovat viskozitu pšeničného arabinoxylanového subsatrátu, dle metody, používané pro stanovení snížené viskozity, a popsané podrobně výše.

Pro každou směs enzymů byla viskozita stanovena bez tepelného kontrolního zpracování a poté po tepelném zpracování po dobu 1,0 minuty, respektive 5 minut, ve vodní lázni, nastavené na teplotu 95°C.

Výsledky^těchto stanovení jsou shrnuty v Tabulce č.2, uvedené a publikované na následující straně.

Z výše uvedených výsledků vyplývá, že působení teploty 95°C na všechny xylanázy/nebo směsi xylanáz^ po dobu 5 minut, významně snižuje aktivitu xylanáz, jak bylo zjištěno metodou, založené na snižování viskozity.

tte ale nutno také poznamenat, že viskozita měřená u prvé xylanázy, vystavené teplotě 95°G po dobu 1,0 minuty, se podstatně nelišila od kontrolního stanovení, t.j. v rozmezí + 0,001 Pascal sekund.

Na druhou stranu je ale zřejmé, že xylanázy získané z mikroorganismů T.viride a A.niger_z jsou mnohem citlivější vůči působení tepla, ve srovnání s thermostabilními xylanázami, používanými v předloženém vynálezu.

'P	n	OJ	OJ	m
		G		1	1	1	1 o
		<33		o	o	o
		43	P	w—
	p	O	3
	3	ra	G
	3	•3	•P	X	X	X	X
	Ή	cu	e
	s	M	o	co	VO		m a*
	o	c ··	·»	*	«w	w
	OJ	o > 3	ir\	co	—	*·	ο-
	1	o n P O
		ra ό
	*	o
	0}	o.
	•	o
	a	CU .
04	CG	o
	IO		m	m	OJ	η
		IPi		1	l	1	1 o
•		r-, CV	3	O	O	o
KJ	<s		-P	t—
	P	o	3
	•P	O >,	G
3	N	O -P	•rl	X	X	X	X
O	-3 o	a
	44	r4
44	ra	•P CU	o	00	OJ		Ol
•P	>G 0)	•fc		*	*
	>	CU-P	rH	—	co	—	c-
rP		—
3
		ta		m	n	m	ΓΟ
		<U Ή		1	t	\|	1 o
43		43 C		o	o	o
	(O	Ό		»—
	rP	CU >
«9	O	3 'P-		X	X	X	X
	G	P >G
	-P	« 43
ΈΜ	3	O O		co	σ\	o	Tf
	O	CU ta		·*	«h	«*	«fc
	X			r4	o	OJ	a—

a	í	3 a	3 a	3 a
ta	IPi	<n		ra		ra		ra
Ό		•rl	«4	•rl		•p		•p
1	3	X	3		3		3
		3 3	<P	3		3		3
3	·—	b0 ra	£h	b0		b0		b0
3		G O		G		G 3		G	··
Sb	O 3	3	O 3	3	O Ό	3	O G	3
	ta	o X	ta	O O	ta	O -rl	ta	O 3	iÁ
(P	3	G Φ	*3	G ra	Ό	G G	*3	G b0	a
>»	3	44 H	3	44 3	3	44-rl	3	44-p	OJ
3	•P<G	3	•P<Gl	3	•rl >	3	P 3	c
X	H	B	t—1	a	ι-1	a	rP	a	ta
X	•	>»	•	Sb	•	>J	•	o
	X	»5	X	eaei	X	ta e-t	X	ta <;	(G

Pascal sekunda

- 39 Příklad 2

Thermoatability jednotlivých xylanáz 1 a 2, získané z mikroorganismu Microtetraspora flexuosa, byly stanoveny metodou snížené viskozity, použité v Příkladu 1.

Stejně jako v Příkladě 1, byla provedena současně pro každou xylanázu kontrola, která nebyla vystavena tepelnému působení.

Opět byly provedeny dvě tepelné operace, kdy enzymy byly zahřívány po dobu 1,0 minuty a 5 minut ve vodní lázni, nastavené na teplotu 95°C.

Výsledky těchto analys jsou shrnuty v další Tabulce δ.3, publikované na další straně.

Z výsledků, uvedených v Tabulce č.3 vyplývá, že viskozita, měřená u obou xylanáz, t.j. 1 a 2, po vystavení teplotě 95°C po dobu 1,0 minuty, se pohybuje v rozmezí hodnot 0,00006 Pascal sekund, kontrolní viskozity.

Na základě těchto zjištění je zřejmé, &e aktivita obou zmíněných xylanáz, není po vystavení teplotě 95°C po dobu 1,0 minuty, podstatně snížena.

Tabulka č.3, publikována na další straně.

- 40 3

X>

O ε*

	m	cn
Μ			1	I
β	··		ο	Ο
ο	3	Ρ
>	Χ3	3
	ο	3
-Ρ	Ό	•Η	X	χ
Β		S
X	Ο
>	Ο.	ο		ir\
		«fc	«fc	«fc
ο		ΙΡι	CM	CM
ο.	Ο
	Ο
	ICS
	σ\
•
β	¹ X
•	Ρ
ca	ο
Ρη	r4
*	Ο.		cn	m
Vm*	®		ι	I
	-Ρ	Ο	Ο	O
ca		-Ρ
ρ	Μ	3
•Η	3	β
CS3	33	•Η	χ	X
Ο	XI	S
34	Ο
03	π	ο	cn	cn
•Η	<3	•fc	*	«fc
>	Ο.	Η	»-	CM

Zastupuje:

Ν

CUM Φ 4 C Η Ό ο tx> fc 3μ -Ρ ·Ρ*« 3 03 Λ

Ο 0 33 X Ο.Ν

β

Ό ο

Β

>»		cm	··	P«	•
N	3	3	3	n
	N	N	34
3	Xfl	3	a
	3	3	xa	•
W	3	3	3	a
	i—J	i—t	N	•
	X	X	O	3
	X	X	di	dl

z7 _Γ 7~- 0’C

PATENTOVÉ N'Á ROKY

Claims

PATENTOVÉ N'Á ROKY

1. Použití termostabilní xylanázy, získatelné z mikroorganismů Microtetraspora flexuosa jako přídatného krmivá, přičemž xylanáza je charakterizována stálostí při zahřá* tí na dobu 1 minuty ve vodní lázni, nastavené na teplotu

95 °C bez podstatné ztráty účinnosti, jak je možno stanovit schopností! enzymu snižovat viskositu 1% roztoku pšeničného arabinoxylanu při pH 6,5 a teplotě 40 °C na stejnou viskositu ± 0,01.Ps, jako je tomu v případě nezahřátého kontrolního vzorku enzymu.

2. Použití podle nároku 1, při němž xylanáza má nejméně jeden z následujících souborů vlastností i) až v):

i) molekulová hmotnost 33 100, pí přibližně 8,5 a maximální účinnost při pH v rozmezí 7,0 až 7,5 při teplotě 70 °C, ii) molekulová hmotnost přibližně 13 300, pí přibližně

3. Přídatné krmivo, vyznačující se t í m , že obsahuje fyziologicky přijatelný nosič a termostabilní xylanázu, získatelnou z mikroorganismu Microtetraspora flexuosa, přičemž xylanáza je charakterizována stálostí při zahřátí na dobu 1 minuty ve vodní lázni, nastavené na teplotu 95 °C bez podstatné ztráty účinnosti, jak je možno stanovit schopností enzymu snižovat vískozitu 1% roztoku pšeničného arabinoxylanu při pH 6,5 a teplotě 40 °C na stejnou vískozitu ± 0,01 Ps, jako je tomu v případě nezahřátého kontrolního vzorku enzymu.

4. Přídatné krmivo podle nároku 3, vyznačují c í s e -t í m , že nosičem je obilovina nebo materiál, od obiloviny odvozený.

5. Použití přídatného krmivá podle některého z nároků 3 až 5, pro přidání ke krmivu na bázi obilovin ke zlepšení využitelnosti krmivá a/nebo jeho stravitelnosti a/nebo ke zvýšení přírůstku na použitou jednotku množství spotřebovaného krmivá.

5. Přídatné krmivo podle nároku 4, vy znač u jící se t í m , že jako nosič obsahuje mletou pšenici kukuřici, sóju nebo vedlejší produkt při zpracování těchto materiálů.

5.3 a maximální účinnost při pH 7,5 a při teplotě přibližně 70 °C.

5,8 a maximální účinnost při pH přibližně 7,5 a při • teplotě přibližně 65 °C a

v) molekulová hmotnost přibližně 35 000, pí přibližně

6.2 a maximální účinnost při pH přibližně 7,5 a při teplotě přibližně 65 °C, iv) molekulová hmotnost přibližně 50 000, pí přibližně

7. Krmivo na bázi obilovin, vyznačující se t í m , že obsahuje alespoň 20 % hmotnostních obiloviny a dále obsahuje 0,00001 až 10 g termostabilní xylanázy na kg krmivá, přičemž jde o xylanázu, získatelnou z mikroorganismů Microtetraspora flexuosa, charakterizovanou stálostí při zahřátí na dobu 1 minuty ve vodní lázni, nastavené na teplotu 95 °C bez podstatné ztráty účinnosti, jak je možno stanovit schopností enzymu snižovat vískozitu 1% roztoku pšeničného arabinoxylanu při pH 6,5 a teplotě 40 °C na stejnou vískozitu ± 0,01 Ps, jako je tomu v případě nezahřátého kontrolního vzorku enzymu.

7,5 a maximální účinnost při pH v rozmezí 7,0 až 7,5 při teplotě 65 °C, iii) molekulová hmotnost přibližně 31 000, pí přibližně

8. Krmivo na bázi obilovin podle nároku 7, v y značující se tím,že jako obilovinu obsahuje alespoň jeden materiál ze skupiny pšenice, ječmen, kukuřice, óirok, rýže, oves, triticale a žito.

9. Použití krmivá na bázi obilovin podle nároku 7 nebo 8 jako krmivá pro drůbež nebo vepře.