CZ303186B6 - Zpusob testování inhibitoru tvorby virových cástic ve velkém formátu s použitím znacených oligonukleotidu ci nukleových kyselin - Google Patents
Zpusob testování inhibitoru tvorby virových cástic ve velkém formátu s použitím znacených oligonukleotidu ci nukleových kyselin Download PDFInfo
- Publication number
- CZ303186B6 CZ303186B6 CZ20100718A CZ2010718A CZ303186B6 CZ 303186 B6 CZ303186 B6 CZ 303186B6 CZ 20100718 A CZ20100718 A CZ 20100718A CZ 2010718 A CZ2010718 A CZ 2010718A CZ 303186 B6 CZ303186 B6 CZ 303186B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- inhibitor
- protein
- testing
- viral particle
- nucleic acid
- Prior art date
Links
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims description 62
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims description 59
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 title claims description 46
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 34
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 34
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 34
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims description 23
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 16
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title description 11
- 238000010998 test method Methods 0.000 title 1
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 50
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 38
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 38
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 28
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 26
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 claims description 26
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 23
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 18
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 12
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 12
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 claims description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 5
- 108010007577 Exodeoxyribonuclease I Proteins 0.000 claims description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 claims description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 claims description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000012268 protein inhibitor Substances 0.000 claims description 2
- 229940121649 protein inhibitor Drugs 0.000 claims description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims 1
- 102000008779 Exonuclease 1 Human genes 0.000 claims 1
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 claims 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 claims 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 16
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 12
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 4
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 4
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 4
- 102100029075 Exonuclease 1 Human genes 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 229940122313 Nucleoside reverse transcriptase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 229940121357 antivirals Drugs 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000003419 rna directed dna polymerase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical class [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VWFCHDSQECPREK-LURJTMIESA-N Cidofovir Chemical compound NC=1C=CN(C[C@@H](CO)OCP(O)(O)=O)C(=O)N=1 VWFCHDSQECPREK-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 206010011831 Cytomegalovirus infection Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011225 antiretroviral therapy Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000724 cidofovir Drugs 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 238000003271 compound fluorescence assay Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000010218 electron microscopic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003028 enzyme activity measurement method Methods 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 1
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- JTEGQNOMFQHVDC-NKWVEPMBSA-N lamivudine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1O[C@@H](CO)SC1 JTEGQNOMFQHVDC-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- 229960001627 lamivudine Drugs 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229940042402 non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000002726 nonnucleoside reverse transcriptase inhibitor Substances 0.000 description 1
- PGZUMBJQJWIWGJ-ONAKXNSWSA-N oseltamivir phosphate Chemical compound OP(O)(O)=O.CCOC(=O)C1=C[C@@H](OC(CC)CC)[C@H](NC(C)=O)[C@@H](N)C1 PGZUMBJQJWIWGJ-ONAKXNSWSA-N 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxotungsten Chemical compound O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.OP(O)(O)=O IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 229940061367 tamiflu Drugs 0.000 description 1
- 229960004556 tenofovir Drugs 0.000 description 1
- VCMJCVGFSROFHV-WZGZYPNHSA-N tenofovir disoproxil fumarate Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O.N1=CN=C2N(C[C@@H](C)OCP(=O)(OCOC(=O)OC(C)C)OCOC(=O)OC(C)C)C=NC2=C1N VCMJCVGFSROFHV-WZGZYPNHSA-N 0.000 description 1
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000011295 triple combination therapy Methods 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000001790 virustatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Zpusob testování úcinnosti látek inhibujících skládání viru nebo inkorporaci genetické informace do vznikající virové cástice, založený na použití izolovaného rekombinantního retrovirového strukturního proteinu v kombinaci se znaceným oligonuklotidem nebo nukleovou kyselinou. Použití modifikovaných oligonukleotidu ci nukleových kyselin je založeno na poznatku, že tyto složky jsou do cástic úcinne inkorporovány, což vede k eliminaci meritelného signálu.
Description
Způsob testování inhibitorů tvorby virových částic ve velkém formátu s použitím značených oligonukleotidu či nukleových kyselin
Oblast techniky:
Vynález se týká testování účinnosti látek inhibujících skládání virů nebo inkorporaci genetické informace do vznikající virové částice. Použití izolovaného rekombinantního virového proteinu v kombinaci s oligonukleotidem či nukleovou kyselinou, označenými například fluorescenčně, io umožňuje testovat zároveň dva principiálně odlišné typy inhibitorů tj. inhibitory vzájemných interakcí virových proteinů a inhibitory interakcí nukleových kyselin s těmito proteiny při skládání částic. Oba zmíněné typy inhibitorů jsou schopny účinně blokovat vznik infekční virové částice. Metoda je založena na stínění značeného oligonukleotidu či nukleové kyseliny v sestavené částici. Ve výhodném provedení v případě inhibice skládání Částice vede oddělení fluoroforu od is zhášeče degradací specifického oligonukleotidu nebo nukleové kyseliny k emisi fluorescence.
Dosavadní stav techniky:
Antivirotiky používanými v současnosti proti patogenním virům jsou zejména inhibitory retrovirových enzymů. Převážná část těchto antivirotik je založena na inhibici polymerázy replikující genom příslušného viru. Například Gancyklovir, Cidofovír nebo Foscamet, inhibující DNA polymerázu, se používají pro léčbu cytomegalovirové infekce. Foscamet je navíc účinný i proti herpetickým virům. Další specifické inhibitory virových enzymů jsou například Tamiflu nebo Zanami25 vir, které inhibují neuraminidasu viru chřipky (influenza virus). Velká variabilita genomu virů, zejména pak virů využívajících k replikaci genomu nepřesné enzymy jako jsou RNA polymeráza nebo reversní transkriptáza, vede k rychlé selekci kmenů resistentních k těmto lékům. Takto nabytá resistence k používaným lékům, která je hlavní příčinou selhávání terapie, vyvolala nutnost hledání nových terapeutik.
V případě HIV se používá tzv. kombinační terapie, využívající simultánní podávání zpravidla tří léků, které mají alespoň dva různé zásahové cíle. Zejména se jedná o kombinaci léků inhibujících proteázu a reversní transkriptázu. Úspěch zaznamenala tzv. HAART terapie (Highly Active Anti-Retroviral Therapy), která přinesla významné zlepšení prognózy HIV pozitivních pacientů.
HAART zahrnuje různé kombinace nukleosidových inhibitorů reversní transkriptázy (NRTI), nenukleosidových inhibitorů reversní transkriptázy (NNRTI) a inhibitorů proteázy (PI). Proto je v současné praxi doporučována takováto trojnásobná kombinační terapie již v počátku léčby. Některé inhibitory reversní transkriptázy, jako např. Tenofovir nebo Lamivudin, se používají i pro léčbu hepatitidy B, neboť hepadnaviry, mezi něž patří původce tohoto onemocnění, využívají při svém replikačním cyklu reversní transkriptázu (přestože je jejich genom ve formě DNA). Avšak ani přístup HAART terapie není schopen zcela odstranit HIV a vede po delší době k selekci resistentních kmenů HIV. Nadto zde existuje riziko infekce nových jedinců těmito kmeny resistentními k více lékům zároveň. Je zřejmé, že v případě léčby jiných virových infekcí, kdy se zpravidla podává jediný lék, je resistence ještě závažnější komplikací. Proto je nezbytné hledat nové inhibitory preferenčně inhibující jiné kroky životního cyklu virů než jsou ty, na nichž se podílí polymerázy. Jedním ze slibných cílů jsou vzájemné interakce protein-protein nebo protein-nukleová kyselina, vedoucí ke vzniku virové částice.
Pro testování inhibitorů retrovirových enzymů byla vyvinuta celá rada metod, při nichž lze využít so přímého měření úbytku aktivity rekombinantních enzymů. Jsou to běžně používané metody, jimiž lze poměrně úspěšně monitorovat účinnost nových sloučenin. Vzhledem k nutnosti hledat nové typy inhibitorů však vyvstal požadavek na vhodnou metodu pro testování inhibitorů skládání virových částic. Například u retroviru jde o blokování interakcí mezi doménami kapsidového proteinu, který představuje nejen hlavní interakcí motiv celé nezralé virové částice, ale i klíčovou strukturu (tzv. core) ve zralém - infekčním virionú. Další blokovatelnou interakcí při tvorbě
-1 CZ 303186 B6 virové kapsidy je interakce nukleokapsidového proteinu s nukleovou kyselinou. Tato interakce iniciuje skládání částic a je zároveň zodpovědná za inkorporaci geonomové RNA retrovirů.
Pro monitorování účinnosti inhibitorů skládání in vitro se jako vhodný jeví „samoskladný“ sys5 tém rekombinantního virového proteinu a nukleové kyseliny, umožňující kvantifikovat množství částic, vzniklých v přítomnosti jednotlivých inhibitorů. Pro řadu virů byly publikovány metody skládání částic in vitro; např. retrovirů včetně HIV (Journal of Virology, 1995, 69, 1093-1098), polyomaviru (FEBS Lett. 1999, 445, 119-125) a hepatitis C viru (Journal of Virology, 2001, 75, 2! 19-2129). Ke sledování účinného skládání se používá elektronmikroskopická analýza, která je io časově i finančně náročná a nehodí se pro analýzu většího počtu vzorků. Jediná publikovaná kvantitativní metoda pro stanovení účinnosti skládání retrovirové částice je založena na tom, že kapsidový protein (CA) o koncentraci 4 mg/ml v přítomnosti vysoké iontové síly (1 až 2,5 mol.l“ 1 NaCl) vytváří tubulámí útvary, které vedou ke zvýšení turbidity, která je monitorována spektrofotometricky (Journal of Virology, 2002, 76, 6900-6908).
Zde předkládaný způsob využívá skutečnosti, že virové strukturní proteiny mají schopnost vzájemně asociovat za současné inkorporace nukleové kyseliny a tvořit tak nezralou částici i za nepřítomnosti buněčných proteinů a ostatních částí viru, jako jsou např. virové enzymy. Je založen na schopnosti skládání částic in vitro z izolovaných proteinů odvozených od virových struk2o turních proteinů, překvapivě i bez přítomnosti buněčných faktorů. Tato metoda má řadu předností ve srovnání s jediným publikovaným postupem pro in vitro stanovení, tj. měřením zákalu vzniklého při tvorbě částic (Journal of Virology, 2002, 76, 6900-6908). Hlavním nedostatkem publikovaného postupuje, že neodlišuje tvorbu precipitátu (k níž může in vitro docházet) od skutečné tvorby částic, která je prokazatelná metodou podle zde předkládaného vynálezu. Ve srovnání s publikovaným postupem, který popisuje skládání pouze kapsidového proteinu, je způsobu podle předkládaného vynálezu schopný identifikovat, látky blokující nejen interakce protein-protein, ale i interakce mezi proteinem a nukleovou kyselinou. Předností předkládané metody ve srovnání s publikovaným postupem je i to, že probíhá za fyziologických podmínek a v případě použití fluorescenční značky vykazuje podstatně vyšší citlivost.
Podstata vynálezu:
Předmětem vynálezu je jednoduchá metoda pro testování antivirotik ve velkém formátu. Je zalo35 žena na měření inhibíce vzájemné interakce virového strukturního proteinu, schopného vytvářet virové částice, se značeným oligonukleotidem či nukleovou kyselinou, obsahujícími fluorescenční, luminiscenční či chromogenní značku. V případě účinného skládání jsou tento oligonukleotid či NA inkorporovány do nově vznikající částice a tím jsou chráněny před působením přidané nukleázy. Pokud dojde k inhibici tvorby částic, oligonukleotid či NA zůstanou volné v roztoku a je možno je kvantifikovat na základě měření jedné z výše zmíněných připojených značek. Tato metoda je optimalizována pro použití ve formátu mikrotitračních destiček a nevyžaduje žádné promývání jamek.
Předmětem předkládaného vynálezu je způsob testování inhibitorů tvorby virových částic ve vel45 kém formátu s použitím značených oligonukleotidů nebo nukleových kyselin, který zahrnuje následující kroky:
1) retrovirový strukturní protein se smíchá s inhibitorem v žádaném poměru a reakční směs se inkubuje v ledové lázni či ve vodní lázni při teplotě od 4 °C do 37 °C, po dobu od 30 minut do 24 hodin,
2) reakční směs retrovirového strukturního proteinu s inhibitorem se naředí fyziologicky přijatelným pufrem o koncentraci soli v rozmezí od 0,1 mmolT1 do 1,5 mol.l“1, umožňujícím vytvoření virových částic,
3) následně se k reakční směsi naředěného retrovirového strukturního proteinu s inhibitorem přidá diagnostický oligonukleotid, nebo jedno- či dvojřetězcová nukleová kyselina, označe-2CZ 303186 B6 né detegovatelnou značkou, v hmotnostním poměru protein:oligonukleotid či nukleová kyselina od l : 0,01 do 1 : 1 a směs se inkubuje po dobu od 1 hodiny do 24 hodin při teplotě od 4 °C do 37 °C,
4) poté se ke směsi přidá hořečnatá sůl, zvolená z chloridu či síranu, v rozmezí koncentrace od 0, l do 100 mmol.!-1 a nukleáza v rozmezí koncentrace od 0,1 do 1000 U/μΙ,
5) v reakční směsi se následně stanoví změna dostupnosti diagnostického oligonukleotidu či nukleové kyseliny, které nebyly inkorporovány do in vitro vytvořené částice v důsledku přítomnosti inhibitoru.
Význakem způsobu podle předkládaného vynálezu je skutečnost, že v kroku 1 se retrovirový strukturní protein smíchá s inhibitorem přímo v jamkách mikrotitrační destičky.
Význakem způsobu podle předkládaného vynálezu je dále skutečnost, že jako ředicí pufr v kroku 2 se s výhodou použije pufr obsahující Tris-HCI o pH 8,0 a NaCl nebo jinou sůl, zvolenou ze skupiny zahrnující chloridy, fosfáty a sírany sodné a/nebo amonné tak, aby výsledná koncentrace soli v jamce mikrotitrační destičky byla v rozmezí od 0,1 mol.r' do 1,5 mol.r1.
Význakem způsobu podle předkládaného vynálezu je rovněž skutečnost, že inkubace v prvním kroku se výhodně provádí po dobu od 30 minut do 3 hodin a inkubace v kroku tři po dobu od 3 hodin do 24 hodin.
Význakem způsobu podle předkládaného vynálezu je i skutečnost, že oligonukleotid či nukleová kyselina se s výhodou přidají v hmotnostním poměru k proteinu od 0,01:1 do 0,2: l.
Význakem způsobu podle předkládaného vynálezu je dále skutečnost, že v kroku 3 se s výhodou použije oligonukleotid o velikosti od 1 do 30 000 páru bází či nukleová kyselina.
Význakem způsobu podle předkládaného vynálezu je fakt, že jako oligonukleotid může být použita jakákoliv sekvence nukleové kyseliny v rozmezí od 1 do 30 000 páru bází.
Význakem způsobu podle předkládaného vynálezu je i to, že jako horečnatá sůl se použije chlorid hořečnatý, který se výhodně přidá v množství od 1 mmol.r1 do 10 mmol.r1 a nukleáza se přidá v množství od 1-100 LI/μΙ.
Význakem způsobu podle předkládaného vynálezu je skutečnost, že použitou nukleázou je s výhodou exonukleáza 1.
Význakem způsobu podle předkládaného vynálezu je dále skutečnost, že detegovatelná značka se zvolí ze skupiny, zahrnující fluorescenční, luminiscenční či chromogenní značku.
Význakem způsobu podle předkládaného vynálezu je i to, že změna dostupnosti diagnostického oligonukleotidu či nukleové kyseliny, které nebyly inkorporovány do in vitro vytvořené částice v důsledku přítomnosti inhibitoru, se stanoví metodou, zvolenou ze skupiny, zahrnující fluorescenční, luminiscenční či chromogenní stanovení.
Podstatnou výhodou předkládaného řešení je skutečnost, že k vytvoření virové částic in vitro dochází přímým naředěním retrovirového proteinu za přídavku diagnostického oligonukleotidu či nukleové kyseliny. Kromě toho se celá metoda provádí v jednom objemu, ať už větší nádoby nebo výhodně mikrotitrační jamky a proto je velmi reproducibilní, neboť nedochází k žádným ztrátám během stanovení.
V případě inkorporace diagnostického oligonukleotidu či nukleové kyseliny do částice vytvořené virovým proteinem jsou pak tento oligonukleotid či nukleová kyselina chráněny před působením předané nukleázy ajejich přidaná detekční značka není detegovatelná.
Pro tento účel lze použít jak endonukleázu, tak exonukleázu, štěpící jak ve směru 3-5', tak ve směru 5' - 3'. Exonukleáza 1, štěpící zde použitý jednořetězcový oligonukleotid ve směru 3'-5', je pro tento účel ovšem nejvýhodnější.
Další výhodou popsaného způsobuje rovněž fakt, že počet testovaných látek, inhibujících tvorbu virové částice, není limitován ničím jiným než použitým formátem mikrotitračních destiček (96, 384, 1536 jamek) a je proto možné souběžně testovat značný počet případných virostatik.
io Použitou zobrazovací metodou je výhodně měření fluorescence, emitované v důsledku uvolnění fluoroforu od zhášeče působením nukleázy na nechráněný diagnostický oligonukleotid či nukleovou kyselinu, nesoucí ve své molekule zároveň fluorofor i zhášeč. Další možností je použití luminiscenčního či chromogenního stanovení.
Podstatou předkládané metody je využití správného složení retrovirové Částice k ochraně inkorporované nukleové kyseliny či oligonukleotidu před působením nukleázy a tím eliminovat fluorescenci detekční značky na této nukleové kyselině či oligonukleotidu. Kritickým parametrem citlivosti metody je tedy dosažení co největšího rozdílu fluorescenčního signálu v přítomnosti inhibitoru a bez jeho přítomnosti, tj. docílit skládání virových částic a co nejvyšší inkorporace značené nukleové kyseliny a opačně co nejvyššího signálu při inhibici skládání, kdy nukleové kyseliny mohou sice interagovat svolným proteinem, ale nevznikají částice, které by zabránily jejich degradaci nukleázou. Proto byly optimalizovány podmínky jak pro in vitro skládání kapsidového nukleokapsidového proteinu (CANC) s nukleovou kyselinou, tak pro vlastní měření detekčního signálu.
Optimalizovány byly:
- koncentrace proteinu a nukleové kyseliny ajejich vzájemný poměr,
- složení reakčního pufru; zejména koncentrace NaCl,
- podmínky inkubace proteinu s inhibitorem,
- detekční značka nukleové kyseliny,
- typ a reakční podmínky nukleázy.
Bylo ověřeno, že:
1. žádná ze složek reakční směsi nevykazuje fluorescenci, k níž dochází pouze při štěpení zna35 Čeného oligonukleotidu nukleázou,
2. v přítomnosti nespecifického proteinu nedochází ke zhášení fluorescence,
3. v přítomnosti účinného inhibitoru je zaznamenána fluorescence v důsledku specifického potlačení interakcí vedoucích k tvorbě částic,
4. naopak při použití nespecifického inhibitoru o stejném složení, ale jiné sekvenci dochází k potlačení fluorescence v důsledku tvorby částic.
Popis obrázků na výkresech:
Obr. 1: SDS PAGE gel dokumentující čistotu purifikováného retrovirového proteinu při nanášeče 1, 5 a 20 μΐ (část A); elektron mikroskopický snímek částic vytvořených retrovirovým proteinem v přítomnosti diagnostického oligonukleotidu (část B).
Obr. 2: Časová změna fluorescence, odpovídající volnému diagnostickému oligonukleotidu při skládání retrovirových částic.
-4CZ 303186 B6
Záznam signálu je odpovídající:
- volnému diagnostickému oligonukleotidů tq ON v „samoskladných“ podmínkách po přídavku nukleázy Exol (A);
volnému diagnostickému oligonukleotidů tq ON v přítomnosti inertního proteinu (BSA, hovězí sérový albumin) v „samoskladných“ podmínkách po přídavku nukleázy Exol ();
- volnému diagnostickému oligonukleosidu tq ON neinkorporovánému po přídavku nukleázy
Exol do přítomných částic složených z retrovirového proteinu CANC v „samoskladných“ podmínkách (□);
- volnému diagnostickému oligonukleotidů tq on v „samoskladných“ podmínkách v přítoio mnosti retrovirového proteinu CANC bez přídavku nukleázy (x).
Na ose x je vynesen čas v minutách, na ose y fluorescence v relativních jednotkách fluorescence RFU.
Obr. 3: Časová změna fluorescence, odpovídající volnému diagnostickému oligonukleotidů v přítomnosti inhibitoru skládání částic.
Záznam signálu odpovídají:
volnému diagnostickému oligonukleotidů tq ON v „samoskladných“ podmínkách v příto20 mnosti aktivního inhibitoru CAI a retrovirového proteinu po přídavku nukleázy (0),
- volnému diagnostickému oligonukleotidů tq ON v „samosk ladých“ podmínkách v přítomnosti neaktivního inhibitoru CAIctrl a retrovirového proteinu CANC po přídavku nukleázy Exol ();
- volnému diagnostickému oligonukleotidů tq ON neinkorporovanému po přídavku nukleázy
Exol do přítomných částic složených z retrovirového proteinu CANC v „samoskladných podmínkách (□);
volnému diagnostickému oligonukleotidů tq ON v „samoskladných“ podmínkách po přídavku nukleázy Exol (A),
- volnému diagnostickému oligonukleotidů tq ON v „samoskladných“ podmínkách v příto30 mnosti aktivního inhibitoru CAI po přídavku nukleázy Exol (♦),
- volnému diagnostickému oligonukleotidů tq ON v „samoskladných“ podmínkách v přítomnosti neaktivního inhibitoru CAIctrl po přídavku nukleázy Exol (*),
- volnému diagnostickému oligonukleotidů tq ON v „samoskladných“ podmínkách v přítomnosti retrovirovému proteinu CANC bez přídavku nukleázy Exol (x).
Na ose x je vynesen čas v minutách, na ose y fluorescence v relativních jednotkách fluorescence RFU.
Příklady provedení vynálezu:
Seznam používaných zkratek:
HIV virus lidské imunitní nedostatečnosti
CANC kapsidový nukleokapsidový protein CAI aktivní inhibitor skládání retrovirové částice
CAIctrl neaktivní inhibitor skládání retrovirové částice EDTA ethylendiamintetraacetát disodný DTT dithiothreitol
PMSF fenylmethansulfonylfluorid rpm otáčky za minutu
DEAE diethylaminoethyl
-5CZ 303186 B6
SDS dodecylsulfát sodný
PAGE elektroforéza v polyakrylamidovém gelu
ON oligonukleotid tq ON oligonukleotid s fluorescenční značkou BSA hovězí sérový albumin
Exol Exonukleáza I
RFU Relativní jednotka fluorescence
Příklad 1
Exprese a purifikace retrovirového proteinu
Fúzní kapsidový-nukleokapsidový protein H1V-I (HIV CANC) byl exprimován v E. coli BL21 (DE3). Bakteriální peleta (5g) byla resuspendována v 25 ml pufru D (20 mmol.l1 Tris-HCl, pH 8, 0,5 mol.T1 NaCl, 10% glycerol, 1 mmol.l1 EDTA, 10 mmol.l1 DTT, 1 mmol.T1 Triton X100, 1 mmoLl1 PMSF) a buňky byly dezintegrovány ultrazvukem (sonikací 4x20 s) na ledu. K buněčnému lyzátu byl přidán polyethylenimin do finální koncentrace 0,3 % (hmotn./objem) a buněčné zbytky a nukleové kyseliny byly odstraněny ultracentrifugací (Beckman, TI 90, 55 000rpm, 3h, 4°C). HIV CANC protein byl ze supematantu vysrážen síranem amonným (finální koncentrace 25% (hmotn./objem)), Vysrážený protein byl centrifugován (Beckman, TI 90, 15 000 rpm, 15 min, 4 °C), resuspendován v pufru E (20 mmol.l 1 Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 mol.l 1 NaCl, 50 μΜ ZnCE, 10 mmol.l“1 DTT, 1 mmol.!'1 PMSF) a dialyzován přes noc proti stejnému pufru při 4 °C. Preeipitát byl odstraněn centrifugací a čirý supematant byl aplikován na kolonu s nosičem DEAE celulóza (objem náplně 40 ml, průtok 0,5 ml/min) v pufru E. Podíly obsahující CANC protein byly spojeny a naneseny na sloupec fosfocetulózy (objem náplně 50 ml, průtok 0,5 ml/min). Navázané proteiny byly eluovány gradientem NaCl od 0,1 mol.l' do 1 mol.l“' NaCl v pufru E. Podíly obsahující CANC protein byly spojeny a dialyzovány přes noc proti skladovacímu pufru (pufr E obsahující 0,5 mol.T1 NaCl) pri 4 °C. Protein byl koncentrován do objemu přibližně 5 ml, nanesen na sloupec Sephadexu G-100 (objem náplně 470 m, průtok 0,1 ml/min), který byl ekvilibrován skladovacím pufrem (20 mmol.r' Tris-HCl, pH 8,0, 0,5 mol.T' NaCl, 50 μ mol.T1 ZnCI2, 10 mmol.T1 DIT, 1 mmol.l“' PMSF). HIV CANC protein ze spojených frakcí byl koncentrován na 2 až 4 mg/ml a skladován pri -70 °C. Čistota proteinu byla analyzována pomocí SDS-PAGE (Obr. 1 A)
Příklad 2
Skládání částic in vitro zředěním
Purifikovaný HIV-1 CANC protein ve skladovacím pufru byl zředěn pufrem C (20 mmol.T1 Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 mol.l“' NaCl) v 96 jamkové mikrotitrační destičce tak, aby finální koncentrace ve 100 μΙ byla 0,3 mol.T1 NaCl a aby tento roztok dále obsahoval 60 μβ CANC proteinu na 100 μΐ. Po zředění byl přidán diagnostický oligonukleotid (ON) do hmotnostního poměru protein:ON obvykle 1:0,05 (tj. 60 μg CANC proteinu a 3 μg ON na 100 μΐ objem vzorku) a reakční směs byla inkubována 3 h za laboratorní teploty.
Příklad 3
Inhibice skládání in vitro
Inhibitor byl přidán k HIV CANC proteinu ve skladovacím pufru (20 mmol.T1 Tris-HCl, pH 8,0,
0,5 mol.l“' NaCl, 50 μ mol.T1 ZnCI2, 10 mmol.T1 DTT, 1 mmol.T1 PMSF) ve finálním molámím
-6CZ 303186 B6 poměru protein:inhibitor 1:1 a směs byla inkubována 1 hodinu na ledu. Směs byla poté rychle zředěna pufrem C (20 mmol.l 1 Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 mol.r' NaCl) a experiment pokračoval podle výše zmíněného protokolu podle příkladu 2.
Příklad 4
Fluorescenční stanovení ίο K reakční směsi HIV-1, získané podle Příkladu č. 2 nebo 3 a obsahující částice CANC, byla přidána exonukláza 1 o finální koncentraci 20 U/μΙ a MgCI2 o finální koncentraci 6,7 mmol.l ’ a emitovaná fluorescence byla měřena při 518 nm.
Metoda byla validována, přičemž byly porovnány výsledky získané s tímto HIV CANC protei15 nem z různých šarží produkce a purifikace a s oligonukleotidy a nukleázami různých šarží, resp. od různých výrobců (Generi Biotech, Hradec Králové, ČR a nukleázy od New England Biolabs (NEB), USA a Invitrogen Life Sci, USA). Proces skládání proteinů do víru podobných částic byl úspěšný ve všech pěti testovaných případech a směrodatná odchylka nečinila více než 5 %. Pro ověření tvorby částic byla reakční směs podrobena analýze transmisní elektronovou mikroskopií, přičemž byl vzorek negativně barven fosfowolframovou kyselinou (Obr. 1). Ve všech případech, kdy byla zmíněnou metodou prokázána tvorba částic, byly tyto částice viditelné i pomocí elektronové mikroskopie a nebyly pozorovány žádné proteinové agregáty. Optimalizované podmínky metody jsou tedy zárukou tvorby částic a není třeba jejich vznik v případě použití uvedené metody ověřovat elektronovou mikroskopií.
Průmyslová využitelnost
Zde popsaný jednoduchý a citlivý způsob pro testování antivirotik ve velkém formátu, založený na interakci retrovirového strukturního proteinu se značeným oligonukleotidem nebo nukleovou kyselinou, obsahujícími fluorescenční, luminiscenční či chromogenní značku, je vhodný pro výrobu kitů pro testování knihoven antivirotik či souborů různých sloučenin s předpokládaným inhibičním účinkem na vzájemné interakce proteinů, nebo interakce mezi proteinem a nukleovou kyselinou.
Metoda, je i přímo využitelná podle protokolu uvedeného v příkladech 1 až 4 těmi subjekty, které se zabývají vývojem atestování antivirotik.
Reference:
1. Kliková M., Rhee S., Hunter E., Ruml T.: Efficient in vivo and in vitro assembly of retroviral capsids from Gag precursor protein expressed in bakteria, Journal of Virology, 1995, 69, 10931098.
2. Stokrová J, Pálková Z, Fischer L, Richterová Z, Korb J, Griffin BE, Forstová J.: Interactions of heterologous DNA with polyomavirus major structural protein, VPL FEBS Lett. 1999 445, 119125 .
3. Kunkel M., Lorinczi M., Rijnbrand R., Lemon S. M., Watowich S. J.: Self-Assembly of Nucleocaspid-Like Particles from Recombinant Hepatitis C Virus Core Protein. Journal of Virology, 2001, 75, 2119-2129
4. Lanman J., Sexton J., Sakalian M., Preveligr P. E. Jr.: Kinetic analysis of the role of intersubunit interactions in HIV-1 capsid protein assembly tn vitro. Journal of Virology, 2002, 76, 6900-6908
5. Stich J., Humbert M., Findlow S., Bodem J., Muller B., Dietrich U., Werner J., Krausslich HG.: A peptide inhibitor of HIV-1 assembly in vitro. Nátuře structural and molecular biology,
2005, 12,671-677
-7CZ 303186 B6
Přehled sekvencí:
Identifikační číslo: 1 5
Charakteristika: aminokyselinová sekvence modifikovaného fúzního kapsidového a nukleokapsidového proteinu:
MPIVQNIQGQMVHQAISPRTLNAWVKWEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTML
NTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQ
EQ1GWMTNNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKT
LRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPAATLEETACQGVGGPGHKAR
VLAEAMSQVTNSATIQRGNFRNQRKTVKCFNCGKEGHTARNCRAPRKKGCWKCGK
EGHQMKDCTERQAN io
Identifikační číslo: 2
Charakteristika: nukleotidové sekvence diagnostického oligonukleotidu:
tqON: 5 '-AAAAAAGGTACCTTATTGTGACGAGGGGTCGt-FAM-TGCCAAAG-BHQ-
Claims (9)
1. Způsob testování inhibitorů tvorby virových částic ve velkém formátu s použitím značených oligonukleotidů, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:
25 1) retrovirový strukturní protein se smíchá s inhibitorem v žádaném poměru a reakční směs se inkubuje v ledové lázni či ve vodní lázni při teplotě od 4 °C do 37 °C, po dobu od 30 minut do 24 hodin,
2. Způsob testování inhibitorů tvorby virových částic podle nároku l, vyznačující se tím, že v kroku 1 se retrovirový strukturní protein smíchá s inhibitorem přímo v jamkách mikrotitrační destičky.
2) reakční směs retrovirového strukturního proteinu s inhibitorem se naředí fyziologicky přijatelným pufrem o koncentraci soli v rozmezí od 0,1 mmol.]-1 do 1,5 mol.Γ1, umožňujícím
30 vytvoření virové částice,
3) následně se k reakční směsi naředěného retrovirového strukturního proteinu s inhibitorem přidá diagnostický oligonukleotid, nebo jedno- či dvojřetězcová nukleová kyselina, označené detegovatelnou značkou, v hmotnostním poměru protein:oligonukleotid či nukleová kyselina od 1 : 0,01 do 1 : 1 a směs se inkubuje po dobu od 1 hodiny do 24 hodin při teplotě od
35 4 °Cdo37°C,
4. Způsob testování inhibitorů tvorby virových částic podle nároků 1, 2 nebo 3, vyznačující se tím, že inkubace v prvním kroku se výhodně provádí po dobu od 30 minut do 3 hodin a inkubace v kroku tři po dobu od 3 hodin do 24 hodin.
15 5. Způsob testování inhibitorů tvorby virových částic podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že olígonukleotid či nukleová kyselina se s výhodou přidají v hmotnostním poměru k proteinu od 0,01:1 do 0,2:1.
4) poté se ke směsi přidá hořečnatá sůl, zvolená z chloridu či síranu, v rozmezí koncentrace od 0,1 do 100 mmol.r1 a nukteáza v rozmezí koncentrace od 0,1 do 1000 U/μΙ,
5 3. Způsob testování inhibitorů tvorby virových částic podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že jako ředicí pufr v kroku 2 se s výhodou použije pufr obsahující Tris-HCl o pH 8,0 a NaCI nebo jinou sůl zvolenou ze skupiny zahrnující chloridy, fosfáty a sírany sodné a/nebo amonné tak, aby výsledná koncentrace v jamce mikrotitrační destičky byla v rozmezí od 0,1 motr1 do 1,5 οιοΙ.Γ1.
5) v reakční směsi se následně stanoví změna dostupnosti diagnostického oligonukleotidu či nukleové kyseliny, které nebyly inkorporovány do in vitro vytvořené částice v důsledku pří40 tomnosti inhibitoru.
-8CZ 303186 B6
6. Způsob testování inhibitorů tvorby virových částic podle kteréhokoliv z předcházejících
20 nároků, vyznačující se tím, že jako horečnatá sůl se použije chlorid hořečnatý, který se výhodně přidá v množství od 1 do 10 mmol.l'1 a nukleáza se výhodně přidá v množství od 1 do 100 U/μΙ.
7. Způsob testování inhibitorů tvorby virových částic podle kteréhokoliv z předcházejících
25 nároků, vyznačující se tím, že použitou nukleázou je s výhodou exonukleáza 1.
8. Způsob testování inhibitorů tvorby virových částic podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že detegovatelná značka se zvolí ze skupiny, zahrnující fluorescenční, luminiscenční či chromogenní značku.
9. Způsob testování inhibitorů tvorby virových částic podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že změna dostupnosti diagnostického oligonukleotidu či nukleové kyseliny, které nebyly inkorporovány do in vitro vytvořené částice v důsledku přítomnosti inhibitoru, se stanoví metodou, zvolenou ze skupiny, zahrnující fluorescenční, luminis35 cenění či chromogenní stanovení.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20100718A CZ303186B6 (cs) | 2010-10-04 | 2010-10-04 | Zpusob testování inhibitoru tvorby virových cástic ve velkém formátu s použitím znacených oligonukleotidu ci nukleových kyselin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20100718A CZ303186B6 (cs) | 2010-10-04 | 2010-10-04 | Zpusob testování inhibitoru tvorby virových cástic ve velkém formátu s použitím znacených oligonukleotidu ci nukleových kyselin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2010718A3 CZ2010718A3 (cs) | 2012-04-11 |
| CZ303186B6 true CZ303186B6 (cs) | 2012-05-16 |
Family
ID=45923904
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20100718A CZ303186B6 (cs) | 2010-10-04 | 2010-10-04 | Zpusob testování inhibitoru tvorby virových cástic ve velkém formátu s použitím znacených oligonukleotidu ci nukleových kyselin |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ303186B6 (cs) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001066805A1 (en) * | 2000-03-06 | 2001-09-13 | Uab Research Foundation | Method of monitoring hiv assembly and maturation |
| US20020094523A1 (en) * | 2000-09-28 | 2002-07-18 | Michael Sakalian | Chimeric retroviral gag genes and screening assays |
| WO2003057178A2 (en) * | 2002-01-02 | 2003-07-17 | Regents Of The University Of California | Viral capsid assembly intermediates |
| US20070082359A1 (en) * | 2005-10-12 | 2007-04-12 | Adam Zlotnick | Methods for detecting compounds that interfere with protein aggregation utilizing an in vitro fluorescence-based assay |
-
2010
- 2010-10-04 CZ CZ20100718A patent/CZ303186B6/cs not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001066805A1 (en) * | 2000-03-06 | 2001-09-13 | Uab Research Foundation | Method of monitoring hiv assembly and maturation |
| US20020094523A1 (en) * | 2000-09-28 | 2002-07-18 | Michael Sakalian | Chimeric retroviral gag genes and screening assays |
| WO2003057178A2 (en) * | 2002-01-02 | 2003-07-17 | Regents Of The University Of California | Viral capsid assembly intermediates |
| US20070082359A1 (en) * | 2005-10-12 | 2007-04-12 | Adam Zlotnick | Methods for detecting compounds that interfere with protein aggregation utilizing an in vitro fluorescence-based assay |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Lanman a kol. (2002) J. Virol. 76 (14), 6900-6908 * |
| Sticht a kol. (2005) Nat. Struct. Mol. Biol. 12 (8), 671-677 * |
| Ulbrich a kol. (2006) J. Virol. 80 (14), 7089-7099 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2010718A3 (cs) | 2012-04-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pollpeter et al. | Deep sequencing of HIV-1 reverse transcripts reveals the multifaceted antiviral functions of APOBEC3G | |
| Kutluay et al. | Analysis of the initiating events in HIV-1 particle assembly and genome packaging | |
| Li et al. | A role for DEAD box 1 at DNA double-strand breaks | |
| Zhao et al. | Influenza virus infection causes global RNAPII termination defects | |
| Ruiz et al. | Recruitment of DNA replication and damage response proteins to viral replication centers during infection with NS2 mutants of Minute Virus of Mice (MVM) | |
| US20040082068A1 (en) | Incorporation and priming function of trnalys in hiv and related viruses | |
| Friew et al. | Intracellular interactions between APOBEC3G, RNA, and HIV-1 Gag: APOBEC3G multimerization is dependent on its association with RNA | |
| US9677143B2 (en) | Compositions and methods for the identification of inhibitors of retroviral infection | |
| Bou-Nader et al. | HIV-1 matrix-tRNA complex structure reveals basis for host control of Gag localization | |
| Majumder et al. | The NS1 protein of the parvovirus MVM Aids in the localization of the viral genome to cellular sites of DNA damage | |
| Frasson et al. | Parallel G-quadruplexes recruit the HSV-1 transcription factor ICP4 to promote viral transcription in herpes virus-infected human cells | |
| Hmila et al. | A novel method for detection of H9N2 influenza viruses by an aptamer-real time-PCR | |
| Eschbach et al. | Capsid lattice destabilization leads to premature loss of the viral genome and integrase enzyme during HIV-1 infection | |
| Bogdanow et al. | Cross-regulation of viral kinases with cyclin A secures shutoff of host DNA synthesis | |
| Vasudevan et al. | Enhancing the catalytic deamination activity of APOBEC3C is insufficient to inhibit Vif-deficient HIV-1 | |
| Han et al. | A high-throughput assay for HIV-1 integrase 3′-processing activity using time-resolved fluorescence | |
| Qi et al. | Peptide-RNA complexation-induced fluorescence “turn on” displacement assay for the recognition of small ligands targeting HIV-1 RNA | |
| Yi et al. | Interferon-induced MXB protein restricts vimentin-dependent viral infection | |
| CZ303186B6 (cs) | Zpusob testování inhibitoru tvorby virových cástic ve velkém formátu s použitím znacených oligonukleotidu ci nukleových kyselin | |
| Hwang et al. | Human cytomegalovirus harnesses host L1 retrotransposon for efficient replication | |
| Venus | Characterizing the Impact of Viral Protein Binding on the Function of the Dead-Box RNA Helicase DDX3X | |
| BenDavid et al. | Host WD repeat-containing protein 5 inhibits protein kinase R-mediated integrated stress response during measles virus infection | |
| Cao et al. | A comprehensive procedure for antiviral inhibitor discovery using EV71 as an example | |
| Diefenbacher et al. | Interactions between influenza A virus nucleoprotein and gene segment UTRs facilitate selective modulation of viral gene expression | |
| Schütz | Studies on the human cytomegalovirus kinase− cyclin interaction that determines host regulation and viral replication efficiency |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20191004 |