CZ302856B6 - Zpusob prípravy derivátu polysacharidu - Google Patents

Abstract

Rešení se týká zpusobu prípravy derivátu polysacharidu pomocí smesných anhydridu v prostredí organického rozpouštedla nebo smesi vody a organického rozpouštedla v prítomnosti prídavných látek, pricemž polysacharidem muže být napríklad chitosan, chitin, glukan, kyselina hyaluronová, kyselina alginová a oxycelulóza.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu přípravy derivátů polysacharídů pomocí směsných anhydridů v prostředí organického rozpouštědla nebo směsi vody a organického rozpouštědla v přítomnosti přídavných látek, přičemž polysacharidem může být například chitosan, chitin, glukan, kyselina hyaluronová, kyselina alginová a oxycelulóza.

Dosavadní stav techniky

Póly sacharidy jsou biopolymery složené zjednoduchých cukerných monomerů spojených glykosidickou vazbou. Polysacharidy tvořené pouze jedním typem monomeru nazýváme homopolymery, pokud obsahují dvě a více typů monomerů heteropolymery. Podle počtu opakujících se jednotek rozlišujeme oligosacharidy (2 až 10 jednotek) a polysacharidy (10 a více jednotek). Význam polysacharídů je obrovský. Polysacharidy plní funkci nutriční, ochrannou, stavební (celulóza, chitin) nebo zásobní (škrob). Polymery obecně jsou charakterizovány průměrnou molekulovou hmotností, protože se jedná o polydisperzní molekuly, běžně se pohybuje okolo 16.10³ g.mol“¹ až 16.10⁶ g.mor¹. Počet opakujících se jednotek je dán stupněm polymerizace.

Nej rozšířenějším polysacharidem je homopolymer celulóza, chemicky p-(l,4)-D-glukopyranosa, snadno dostupný a levný. Díky vysokému stupni intra a intermolekulámích vazeb je celulóza nerozpustná ve vodě. Je to nej častěji modifikovaný biopolymer a její deriváty jako např. oxycelulóza mají široké uplatnění.

Z glukosových jednotek jsou také složeny extracelulámí polysacharidy hub, obecně nazývané glukany.

Obr. 3 p-(l,3)-D-glukan

Schizophyllum commune je zdrojem polysacharídů schizophylanu. Je to neutrální polysacharid tvořený p-(1.3)-D- glukosou s postranně navázanou P (l,6)-D-glukosylovou skupinou, tvořící triple-helix. Tento polysacharid není v savčím těle degradován, je biodegradabilní, jeho molekulová hmotnost se pohybuje okolo 10⁶ g.mol“¹. Mezi jeho chemické analogy patří skleroglukan, který je produkován houbou Sclerotium rolfsii. Podobnou strukturu vykazují i lentinan, curdlan,

-1 CZ 302856 B6 izolovaný mikrobiální fermentací kmene Alcaligenes faecalis, grifolan etc. Tyto mucopolysacharidy disponují řadou léčivých účinků a mají imunomodulační efekt (Wakshull, Immunopharmacology 41 (1999) 89 až 107)

₅ Obr. 4 Schizophylan

Dalším v přírodě hojně vyskytujícím se polysacharidem je chitin, součást endo a exoskeletu hmyzu, hub a mořských korýšů; chemicky p-(l,4)-2-acetyl-2-deoxy-D-glukopyranosa. Chitin je nerozpustný ve vodě, aleje rozpustný v organických rozpouštědlech jako hexafluoroisopropanol, ío hexafluoroaceton, chlorovaných alkoholech v konjugaci s vodnými roztoky minerálních kyselin a /V_T;V-dimethylacetamidu s obsahem 5 % lithných solí (Μ. Ν. V. Ravi Kumar, Reactive and Functional Polymers 46 (2000) 1-27). Deacetylovanou formou je chitosan, chemicky |3-(l,4)-2-Damino-2-deoxy-D-glukopyranosa. Chemické a fyzikální vlastnosti chitosanu jsou výrazně ovlivněny stupněm acetylace, který uvádí procentuální obsah acetylo váných skupin. Chitosan je díky své chemické struktuře nerozpustný při pH větším než 6,5 a rozpustný v kyselém prostředí.

V běžně používaných organických rozpouštědlech je nerozpustný. Existence nukleofilních skupin zajišťuje chitosanu schopnost sorbovat kovy, jeho kladný náboj předurčuje snadnou tvorbu solí kyselin a schopnost interreagovat se záporně nabitými povrchy např. kůže a vlasů, Čehož je využívá v kosmetickém průmyslu. V těle je degradován Iysosymy, enzymy obsaženými v organe20 lách buněk imunitního systému, nebo lidskou chitinasou a V-acetyl-p-glukosamidasou.

Obr. 5 Chitin Obr. 6 Chitosan

Dalším významným polysacharidem je kyselina hyaluronová, komponovaná z opakujících sejed25 notek β- ( 1,3)-D-glukuronové kyseliny a B-íl^j-TV-acetyl-D-glukosaminu. Vyznačuje se velkou molekulovou hmotností 5.10⁴ až 5. i O⁶ g.mol“¹, která závisí na způsobu isolace a výchozím materiálu. Kyselina hyaluronová, respektive její sůl hyaluronan, je nezbytnou součástí pojivových tkání, synoviální tekutiny kloubů, hraje významnou roli v řadě biologických procesů jako hydratace, organizace proteoglykanů, diferenciace buněk, proliferace a angiogenese. Tento značao ně hydrofilní polysacharid je rozpustný ve formě soli v celé šíři pH.

-2CZ 302856 B6

Kyselina hyaluronová je zástupcem skupiny glykosaminoglykanů, která zahrnuje dále chondroitin sulfát, dermatan sulfát, keratan sulfát a heparan sulfát.

Hnědé mořské řasy rodu Phaeophycaea produkují zajímavý polysacharid - kyselinu alginovou. Tento lineární polysacharid je kombinací β-{ 1,4)-D-manuronové kyseliny a a-(l,4)-L-guluronové kyseliny, jeho rozpustnost a hydrofilita je funkcí pH, při pH nižším než pK_A obou kyselin (pH = 3,5) je nerozpustný. Vápenatá sůl kyseliny alginové je rovněž nerozpustná.

Obr. 8 Kyselina alginová

Přehled o póly sacharidech lze nalézt v knize editované Severian Dimitriu, Polysacharides, Marcel Dekker, 1998, ISBN 0824701275.

Chemie polysacharidů je značně rozsáhlá. Specifická je volba reakčních podmínek vzhledem k možné hydro lýze a řadě vedlejších reakcí.

Acylace polysacharidů je nejčastěji využívaná metoda k zavedení alkylového řetězce, který mění vlastnosti převážně hydrofilních látek na látky hydrofobní. Reakce se nejčastěji provádí působením anhydridů příslušných kyselin, chloridů kyselin nebo samotnou kyselinou za přídavku katalyzátorů. Klemann et al. (US Patent US 5 906 852; 1999) popisuje přípravu povrchově modifikované celulózy jako nízko-kalorické náhrady mouky. Připravil nízko substituované deriváty se stupněm substituce 1 až 5 %. Porovnával reaktivitu mastných kyselin a jejich chloridů. Reakce s mastnými kyselinami probíhala při teplotě 140 °C po dobu 5 hodin, reakce s chloridy za teploty místnosti trvala 2 hodiny. Do roztoku chloridu kyseliny v propyl-acetátu byla přidána celulóza. Po dvou hodinách byl bílý prášek odfiltrován a promyt acetonem. Podle Silversteina et al. (US Patent US 4 152 115; 1979) se nechá reagovat celulóza s/so-propyl esterem mastných kyselin, reakce probíhá za mírných podmínek za katalýzy s/Moluen-sulfonovou kyselinou.

Modifikace chitosanu anhydridy kyselin ve vodném prostředí byla provedena Vanlerberghem et al. (US Patent US 3 953 608; 1976). Heterogenní reakční směs vznikla přídavkem anhydridu do roztoku soli chitosanu za teploty 15 °C až 30 °C. Anhydrid byl přidáván v pevné formě nebo ve formě roztoku s inertním rozpouštědlem jako dioxan, tetrahydrofuran a ethyl-acetát). I přes hydrolýzu anhydridu ve vodném prostředí na příslušné kyseliny, výtěžky dosahovaly 70 %. Mezi použitými anhydridy nasycených kyselin byly anhydrid kyseliny jantarové, anhydrid kyseliny acetyl-jantarové, anhydrid kyseliny methyl-jantarové, anhydrid kyseliny diacetyl-tartarové, nebo anhydrid kyseliny diglykolové, mezi anhydridy nenasycených kyselin byly anhydrid kyseliny maleinové, itakonové a citrakonové, Anhydridy kyselin s 1 až 5 uhlíky a anhydrid kyseliny benzoové použil Itoi et al. (US Patent US 4 996 307; 1991) v prostředí vodného roztoku kyseliny nebo rozpouštědla mísitelného s vodou jako alkohol nebo aceton.

Prey et al. (US Patent US 3 956 278; 1976) připravil smíšené parciální estery póly sacharidů. Nejprve se nechal reagovat substrát s acylačním činidlem - ledovou kyselinou octovou při teplotě 90 °C a potom s vyšší mastnou kyselinou (laurylová, palmítová) ve formě kyseliny nebo anhydridu v přítomnosti kyselého katalyzátoru - Lewisovy kyseliny, Bronstedovy kyseliny, katex v kyselé formě, nejčastěji však s/Moluensulfonovou kyselinou.

Deriváty oligomerů kyseliny hyaluronové jsou patentovány Couchmannem et al. (US Patent US 4 761 401; 1988), kde acylace probíhá jak na hydroxylové tak amino skupině deacetylovaného hyaluronanu. Polysacharid kyseliny hyaluronové acyloval Yui et al. (US Patent US 6 673 919; 2004). O-acylace zahrnuje reakci s organickou kyselinou za přídavku kyselého katalyzátoru (minerální kyseliny, organické nebo Lewisovy kyseliny) a aktivačního činidla (;V,;V'-dicyklohexylcarbodiimid, 2-chlor-l-methyl pyridin)umiodid a ALV'-carbonyl diimidazol) nebo používá anhydridů a chloridů kyselin v přítomnosti báze. Michinori et al. (JP patent JP 7309902, 1995) připravili acylovanou kyselinu hyaluronovou reakcí s anhydridy karboxylových kyselin nebo jejich acylhalogenidy ve vodném prostředí obsahujícím s vodou mísitelné organické rozpouštědlo v přítomnosti katalyzátoru. Sapononifikací acylových skupin kyseliny hyaluronové bylo docíleno derivátů s libovolným počtem acylových skupin. Chlorid kyseliny retinové a anhydrid kyseliny máselné použilo k přípravě specifických derivátů hyaluronové kyseliny i Perbellini et al. (WO 2004/056877 Al; 2004). Pro syntézu v prostředí N,N'~dimethylformamidu byla použita kyselina hyaluronová ve formě tetrabutylamonných solí.

Buysch et al. (US Patent US 5 068 321; 1991) připravili deriváty polysacharidů s různými estery chlormravenčanu. Fenylester kyseliny mravenčí se postupně přidával v průběhu 3 hodin k suspenzi methylcelulózy, pyridinu a chlormethanu a nechal se promíchávat po dobu 20 hodin při 25 °C a následně po dobu 5 hodin při 45 °C.

Rizii et al. (US Patent US 3 963 699; 1976) připravili estery mastných kyselin polyolů, jež zahrnují monosacharidy, disacharidy a cukerné alkoholy, metodou transesterifikace bez přídavku rozpouštědla. Prvním krokem bylo zahřátí směsi polyolu a nižších esterů mastných kyselin, zpravidla přírodních látek jako např. methyl ester mastných kyselin získaných ze sojových bobů, za přídavku alkalických solí mastných kyselin a bazického katalyzátoru (alkalických kovů, hydridů a alkoholátů a tím vytvoření homogenní směsi. Směs se zahřívala na teplotu 110 °C až 180 °C a tlaku kolem 0,1 až 760 mm rtuťového sloupce. Druhým krokem byl přídavek nadbytku nižších esterů mastných kyselin.

Lalezari et aL (US Patent US 5 498 708; 1996) využívá k modifikaci oligosacharidů směsné anhydridy mastných kyselin s alkyl nebo aryl formiáty, reakce probíhá ve vodném prostředí.

Z literatury je známo, že karboxylové kyseliny, resp. karboxylovou skupinu -COOH lze převést na tzv. asymetrický anhydrid, který je reaktivní již za normálních teplot a reaguje s nukleofilními skupinami substrátu, např. amino-skupinou za vzniku amidu, s hydroxylovou skupinou za vzniku esteru a podobně (Bulletin de la Societe Chimique de France, (5), 945 až 51; 1964).

Jako reakční činidlo pro tzv. aktivaci karboxylové skupiny se používá celá škála chlormravenčanů, nejčastěji ale chlormravenčan ethylnatý (R = C₂H₅) (Synthesis, (12), 954 až 5; 1979), či isopropylnatý (R = C₃H₇).

Tato technika byla později použita i v oblasti barvení textilních vláken (GB 1009204; 1965).

-4CZ 302856 B6 barv —COOH + C1COOC₂H_S + (C₂H_S)₃N barvivo—C-O-C—OC₂H₅ + (C₂H_s> ₃NH⁺Cl barv barv

*► barviví :-NH-Subs + co₂ + c₂h_soh

4-oJ :-O-č-OC₂H₅ + aubs-OH *· barviví :-o-subs + co₂ + c₂h₅oh

Subs dulóza, polyamid

Využití 4asti barvení vlny pak popsala Oliveira-Campos a kol. (EU Appl. 95670003.3; 1995).

Směsný ydrid pro syntézu esterů a amidů karboxylových kyselin využil Lalezari et al. (US Patent L 780 542; 1988). Estery vyšších mastných kyselin se nechaly reagovat s alkyl chlormravenč. v přítomnosti báze a takto připravený anhydrid pak s příslušným alkoholem nebo aminem. íkce probíhaly ve vodném prostředí.

Podstata íálezu

Bylo zji-ao, že pomocí směsných anhydridů lze takové póly sacharidy, jako jsou například kyselina valuronová, p-(l,3),(l,6)-D-glukan, (3-(l,3)-D-glukan, oxycelulóza, chitin nebo chitosan. iiodně modifikovat. Reakci lze provádět v organickém rozpouštědle nebo ve směsi vody a o« -anického rozpouštědla, s výhodou za přítomností přídavných látek.

Modifikace polysacharidů ve 100% vodném prostředí není možná, protože polysacharidy kolem sebe mají hydrofilní obal a reakce neproběhne, jelikož dříve dojde khydrolýze směsného anhydridu. S technologickou výhodou je organické rozpouštědlo mísitelné s vodou.

Vyznačený postup je následující. Polysacharid reaguje v prostředí organického rozpouštědla nebo směsi vody a organického rozpouštědla při pH 2 až 11 a teplotě 0 °C až 150 °C se směsným anhydridem obecného vzorce I (R‘-C(=O)OC(=O)OR) (I), připraveným v prostředí organického rozpouštědla za působení chlormravenčanu alkylnatého obecného vzorce II (CIC(=O)OR) (Π), při teplotě -15 °C až+15 °C po dobu 0 až 20 min na sloučeninu obecného vzorce III

R^J-COOH (III), s výhodou v prostředí organického, polárního, aprotického, s výhodou mísitelného rozpouštědla, v přítomnosti báze za vzniku sloučeniny obecného vzorce IV polysacharid-X-C(=O)R¹ (IV),

-5CZ 302856 B6 kde R¹ je zbytek alifatického, cykloalifatického, aromatického či heterocyklického charakteru s počtem uhlíků C_t až Cis obsahující jednu nebo více karboxylových skupin, R je methyl až oktadecyl, X = NH, O, COO, S, a kde báze označuje organické báze jako trialkylamin Y₃N nebo pyridin, kde Y ~ Ci až C_]6. Póly sacharid je s výhodou vybrán ze skupiny zahrnující chitosan, chitin, glukan, kyselinu hyaluronovou, kyselinu alginovou a oxycelulózu. Reakce polysacharidu se směsným anhydridem probíhá s výhodou v přítomnosti přídavných látek vybraných ze skupiny zahrnující kationické a neionogenní tenzidy a soli LiCl, tetrabutylamonium bromid a tetrabutylamonium hydrogensulfát. Koncentrace polysacharidu je s výhodou 0,01 až 10 hmotn. % celkové hmotnosti směsi.

Konkrétně způsob přípravy derivátů polysacharidů probíhá tak, že ve všech případech se karboxylová kyselina R'COOH (ať už obsahuje jednu nebo více karboxylových skupin a jedná se o sloučeninu alifatického, cykloalifatického či aromatického charakteru) rozpustí v polárním, aprotickém rozpouštědle mísitelném s vodou, jako je aceton, N, Y -ďimethylformamid, N,Ν'-dimethylacetamid, jV-methylpyrrolidon, d i methyl sul foxid, l-methyl-2-pyrrolidon, />-dioxan, tetrahydrofuran, sulfolan, acetonitril.

Přidá se molámí ekvivalent (vztaženo na karboxylovou skupinu) organické báze pro zachycení vznikajícího chlorovodíku, například triethylamin, pyridin apod. Po ochlazení reakční směsi na -15 °C až 15°C se přidá molámí ekvivalent chlormravenčanu ethylnatého, Zso-propylnatého a podobně (obecně chlormravenčanu alkylnatého, R = alkyl Ci až ₁₆).

R-COOH + C1C00R + báze o o

R-C-O-C-OR + báze.HCl

Sraženinu hydrochloridu organické báze je možné odfiltrovat a roztok směsného anhydridu R^lCO₂CO₂R (v dalším textu označen také jako modifikační činidlo) se použije pro reakci s polysacharidem.

polysacharid-XH + R—i

-OR polysacharid

COj + ROH

Příprava směsného anhydridu R'CO₂CO₂R je velmi rychlá a například při 0 °C se 100% konverze výchozí kyseliny R’COOH dosáhne již za 5 minut. Delší přechovávání aktivované sloučeniny v roztoku je nežádoucí, protože vzniká symetrický anhydrid R¹ (3(=0)-0-(0=0^¹.

Reaktivita směsného anhydridu (modifikačního činidla) je tím vyšší, čím větší je kladný parciální náboj na uhlíku pocházejícího od karboxylové skupiny aktivované sloučeniny.

Výsledek reakce směsného anhydridu s póly sacharidem je také závislý na druhu použitého polysacharidu.

V případě chitosanu je nejvíce reaktivní aminová skupina. Chitosan se rozmíchá ve vodě (1 až 5 % hmotn.) a upraví se pH na hodnotu 2 až 8, s výhodou pak na hodnotu 5 až 6, kdy vznikne roztok a přitom aminové skupiny nejsou ještě plně protonovány (-NH₂ + H' = -NH₃ ⁺). Při teplotě od 0 °C do 100 °C, výhodně za teploty místnosti, se za míchání přidá roztok směsného anhydridu (modifikačního činidla). Průběh reakce je indikován vývinem CO₂. Úpravou pH do neutrální až alkalické oblasti (pH 7 až 10) se modifikovaný chitosan vysráží, případně vzniklá karboxylová sloučenina R'COOH se rozpustí a modifikovaný chitosan se odfiltruje.

chitosan-NH₂ + R-C-O-^-OR -► chitosan-NH-l-R¹ + ROH + CO₂

-6CZ 302856 B6

Přítomnost a množství nově vzniklých amidových skupin (-NH-C(O=)-) v modifikovaném polymeru lze prokázat pomocí infračervené spektroskopie, kde pás s maximem 1558 cm¹ odpovídá charakteristické amidové vibraci (Amid II). Zároveň jsou patrné asymetrické (2950 až 2940 cm¹) a symetrické (2840 až 2850 cm¹) valenční vibrace methylenových skupin.

Pokud jsou reakce prováděny v neutrálním až alkalickém prostředí, probíhají v heterogenní fázi a dané reakce se účastní i hydroxylové skupiny chitosanu.

chitosan-OH + R-í^-O-^-OR -► chitosan-0-^-R¹ + ROH + CO₂

Přítomnost a množství nově vzniklých esterových skupin (-O-C(=O)~) v modifikovaném polymeru lze prokázat pomocí infračervené spektroskopie, kde se ve spektru objeví nové vibrace s frekvencí v oblasti 1735 až 1740 cm’¹. Dalším důkazem esterových skupin je tvorba železitohydroxamového komplexu, vzniklého aminolýzou esterů v přítomnosti hydroxylaminu. Barevný produkt má charakteristickou absorbanci v rozmezí 530 až 560 nm (Samuel Patai ed., The chemistry of carboxylic acids and ester, 1969, str. 879, ISBN 471669199).

Přítomnost navázaného alkylu je charakterizována novými signály v *H-NMR spektru patřící CH₃ a CH₂ skupinám alkylu.

V případě glukanů reaguje hydroxylová skupina. Schizophylan se rozmíchá ve vodě (0,01 až 5 % hmotn.) a upraví se pH na hodnotu 2 až 11, s výhodou pak na hodnotu 5 až 6, za vzniku gelu. Při teplotě od 0 °C do 100 °C, s výhodou za teploty místnosti, se za míchání přidá roztok směsného anhydridu (modifikačního činidla). Když je reakce ukončena, modifikovaný schizophylan se vysráží, například přídavkem acetonu v pěti až desetinásobném přebytku, vztaženo na objem reakční směsi a vysrážený modifikovaný schizophylan se odfiltruje.

schizophylan-OH

schizophylan· ,-O-L + ROH + CO₂

Přítomnost a množství nově vzniklých esterových skupin (-O-C(=O)-) v modifikovaném polymeru lze prokázat pomocí infračervené spektroskopie, nebo pomocí železito-hydroxámového komplexu podobně jako v případě modifikace chitosanu.

V případě kyseliny hyaluronové a jejich solí je modifikace požadována na hydroxylové skupině.

Kyselina hyaluronová, resp. její sůl se rozpustí ve vodě (0,01 až 5 % hmotn.) a upraví se pH na hodnotu 2 až 11, s výhodou pak na hodnotu 5 až 6 za vzniku čirého roztoku, respektive gelu. Při teplotě od 0 °C do 100 °C, s výhodou za teploty místnosti, se za míchání přidá roztok směsného anhydridu (modifikačního činidla). Když je reakce ukončena, modifikovaný hyaluronan se vysráží, například přídavkem acetonu a odfiltruje.

hyaluronová	-OH + Rig O Í-OR	hyaluronová
kyselina		kyselina

Pomocí infračervené spektroskopie jsme zjistili, že u póly sacharidů, které obsahují karboxylovou skupinu, (například hyaluronan) dojde v určité míře ke vzniku asymetrického anhydridu (polysa45 charid-C(=O)OC(=O)R¹), který následnou reakcí reaguje s funkční (-OH) skupinou modifikovaného polysacharidu.

-7CZ 302856 B6

póly sacharid	O O —H-O-^-R1	h	HO—	póly sacharid
	)	r

R— póly sacharid póly sacharid o

C-OH

Ve vodném roztoku dochází také k hydrolytickým reakcím, které jsou nežádoucí a snižují výtěžek modifikace polysacharidů, a vedou ke vzniku určitého množství výchozí karboxylové kyseliny.

O O i II II

R-C-O-C-OR

H,0

R-C-OH + ^c°2 + ^R0H

V některých případech jsme zjistili přítomnost esteru R’COOR, který vzniká následnou reakcí mezi aktivovanou sloučeninou R^OjCí^R a alkoholem ROH. Tyto vedlejší produkty lze snadno z modifikovaného polymeru vymýt organickými rozpouštědly.

Oxycelulóza se při modifikaci chová jako hyaluronan.

Popsaným postupem lze kupříkladu výše uvedené polysacharidy tzv. hydrofobizovat reakcí s aktivovanými nasycenými či nenasycenými mastnými kyselinami (kyselina palmitová, stearová, etc.). S velkou výhodou a výtěžkem lze polysacharidy modifikovat Ν,Ν*-dialkylovanými aminokyselinami, takovou jako je například W-dihexyglycin, a podobně. Dále bylo zjištěno, že uvedeným postupem lze do molekuly polysacharidů naroubovat kyseliny obsahující thiolovou skupinu (použitím např. kyseliny thioglykolové, nebo dimerkaptojantarové). Vyznačeným postupem lze obdobně roubovat molekuly polysacharidů kyselinami obsahující sulfidické, disulfídické, až póly sulfidické můstky.

Dále lze popsaný postup využít k naroubování jednoduchých nenasycených kyselin na polysacharidy, speciálně kyseliny akrylové a maleinové.

S velkou výhodou lze uvedený postup využít k síťování jednotlivých polysacharidů, případně síťování různých polysacharidů dohromady, kde se použije jako síťující činidlo kyselina, která má dvě a více karboxylových skupin (např. kyselina malonová, jantarová, glutarová, etc.).

Uvedený postup lze využít i k roubování polysacharidů kyselinami, které mají ve své molekule reaktivní halogen, například kyselinou monochloroctovou, 2,3-dibrompropionovou, 3-jodpropionovou, a podobně.

Vyznačený postup lze použít i pro značení polysacharidů organickými luminofory a barvivý, které mají ve své molekule karboxylovou skupinu.

Modifikace polysacharidů ve vodě často vyžaduje přítomnost povrchově aktivních sloučenin, které jednak snižují povrchové napětí polymeru a také fungují jako fázové přenašeče mezi jednotlivými fázemi. Jako povrchově aktivní látky lze použít vhodné komerčně dostupné tenzidy katonického nebo neionogenního charakteru. V případě polysacharidů s nábojem lze použít vhodných organických solí, např. kyselina hyaluronová se připraví ve formě tetrabutylamonných solí (C. Ventura, J. Biol. Chem. (2004), 22, 23574-23579) a tyto TBA-sole hyaluronové kyseliny se pak modifikují směsným anhydridem.

Výše uvedené modifikace lze také provádět v organickém rozpouštědle, při reakčních teplotách od -20 °C do bodu varu rozpouštědla, opět s výhodou za teploty místnosti.

-8CZ 302856 B6

Modifikace v organickém rozpouštědle přináší výhodu v tom, že neprobíhají hydrolytické reakce. Na druhou stranu jsme ale pozorovali, že jako hlavní vedlejší produkt vzniká symetrický anhydrid výchozí karboxylové kyseliny R¹C(=O)-O-(C=O)R'. Tento symetrický anhydrid dále reaguje s funkčními skupinami polysacharidu, například OH skupinou a tvoří tak žádaný modifikovaný polymer (ester) a příslušné množství výchozí karboxylové kyseliny.

O o rL^-o-Í-OR¹ +

póly	O 0 t4 P Olf + t4 p π	póly
sacharid		sacharid

ίο V případě chitosanu se postupuje tak, že se chitosan, resp. jeho hydrochlorid rozmíchá v organickém rozpouštědle (0,01 až 5 % hmotn.), s výhodou v AúV -dimethylacetamidu a nebo ještě lépe v ;V,iV--dimethylacetamidu za přídavku LiCl (0,01 až 10 % hmotn.), kdy se vytvoří gel při teplotě 20 °C až 100 °C, s výhodou 60 °C. Za míchání se přidá roztok směsného anhydridu (modifikačního činidla) v organickém rozpouštědle. Když je reakce ukončena, modifikovaný chitosan se vy sráží, například přídavkem vody v pěti až desetinásobném přebytku, vztaženo na objem reakční směsi a modifikovaný chitosan se odfiltruje,

Glukan se rozmíchá v organickém rozpouštědle (0,01 až 5 % hmotnostních schizophylanu na celkovou hmotnost směsi), s výhodou v Λζ V -dimethylacetamidu a nebo ještě lépe v N,N^r20 dimethylacetamidu za přídavku LiCl (0,01 až 10 % hmotn.), kdy se utváří gel za teploty 20 °C až 100 °C, s výhodou 60 °C. Za míchání se přidá roztok směsného anhydridu (modifikačního činidla) v organickém rozpouštědle. Když je reakce ukončena, modifikovaný schizophylan se vysráží, například přídavkem acetonu v pěti až desetinásobném přebytku vztaženo na objem reakční směsi a modifikovaný schizophylan se odfiltruje.

Hyaluronan, aíginát a pektin se rozpustí v organickém rozpouštědle (0,01 až 5 % hmotn.), s výhodou v VLV-dimethy I acetamidu za přídavku LiCl (0,01 až 10 % hmotn.) za teploty 20 °C až 100 °C, s výhodou 40 °C až 70 °C. Za míchání se k roztoku, respektive gelu přidá roztok směsného anhydridu (modifikačního činidla). Po ukončení reakce se modifikovaný hyaluronan vysrá30 ží, například přídavkem acetonu a modifikovaný hyaluronan se odfiltruje.

Farmakologicky přijatelnou solí kyseliny hyaluronové, oxycelulózy nebo kyseliny alginové je sůl sodná, draselná, lithná, vápenatá, hořečnatá, zinečnatá, kobaltnatá a manganatá, popřípadě jejích kombinace.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1, Modifikace chitosanu kyselinou hexanovou

Chitosan 0,5 g (2,87 mmol; stupeň acetylace 26 %; CAS 9012-76-4; CPN spol. sr. o.) se rozpustil přídavkem 2 cm³ 1 M HC1 ve 30 ml vody a před reakcí se upravilo pH 10% vodným roztokem NaOH na hodnotu 6,5. Kyselina hexanová (0,182 cm³; 1,46 mmol; CAS 142-62-1; Merck) se aktivovala v 15 cm³ acetonu (CAS 67-64-1, Lach-Ner a.s.) působením 0,211 cm³ triethylaminu (1,52 mmol; CAS 121—44—8; Sigma-Aldrich) a 0,145 cm³ chlormravenčanu ethylnatého (1,52 mmol; CAS 208-778-5; Merck). Aktivace probíhala při teplotě 0°C po dobu 5 min. Vytvořený směsný anhydrid se do suspenze chitosanu zfiltroval přes fritu č. 3. Po 15 min se reakční směs ohřála na 65 °C a posléze se míchala ještě další 2 hodiny. Před izolací produktu se finální směs ochladila na teplotu místnosti, pH se upravilo na hodnotu 7 a produkt se odfiltroval na Bůchnerově nálevce. Surový produkt se třikrát promyl vodou a poté absolutním 2-propanolem. Vysušením při 45 °C se získalo 0,52 g produktu.

-9CZ 302856 B6

FTIR (KBr): 2957 cm ¹ vfCH^ 2930 cm ‘ v(CH^_ax, 2872 cm ¹ vfCHd,, 1659 cm¹ v(C=O) amidl., 1558 cm ¹ %NH) amid II., 1458 cm ^! d(CH^

Příklad 2. Modifikace chitosanu kyselinou hexanovou

Chitosan 0,5 g (2,87 mmol; stupeň acetylace 26 %) se rozpustil přídavkem 2 cm³ l M HCI ve 30 cm³ vody. K roztoku se přidal 1 cm³ Althosan MB (vodný roztok alkyl-dimethyl-benzylamonium chloridu, CAS 68989—00—4; Chemotex Děčín a.s.) a pH se upravilo 10% vodným roztokem NaOH na hodnotu 4,0. Kyselina hexanová (0,726 cm³; 5,81 mmol) se aktivovala v 10 cm³ 3-methyl—2-pentanonu (CAS 565-61-7; Fisher-Scientifíc) působením 0,848 cm³ triethylaminu (6,11 mmol) a 0,582 cm³ chlormravenčanu ethylnatého (6,11 mmol). Aktivace probíhala při teplotě 0 °C po dobu 8 min. Směs se zfiltrovala do roztoku chitosanu přes fritu č, 3, reakce probíhala za intenzivního míchání po dobu 4 hod. Po skončení reakce se pH upravilo 10% vodným roztokem NaOH na hodnotu 7,0 a směs se naředila na 200 ml. Takto vzniklá suspenze se odstředila (odstředivka: Beckman J2-21) při 5000 ot./min po dobu 20 minut. Promyla se 2krát 80% 2propanolem (směs s vodou) a nakonec absolutním 2-propanolem. Produkt se sušil při teplotě 45 °C. Takto se získalo 0,64 g sypkého derivátu.

FTIR (KBr): 2957 cm ‘ v(CH₃)_ax, 2928 cm¹ vfCHJa» 2872 cm ' v(CHd_s, 2880 cm ¹ víCH^ 1742 cm ¹ v(C-O), 1663 cm ¹ v(C=O) amidl., 1564 cm ‘ %NH) amidII., 1466 cm ¹ d(CHd.

Příklad 3. Modifikace chitosanu kyselinou palmitovou

Kyselina palmitová (0,372 g; 1,45 mmol; CAS 57-10-3; Merck) se rozpustila v 10 cm³ acetonu. Za teploty 0 °C se k roztoku přidalo 0,211 cm³ triethylaminu (1,52 mmol) a 0,145 cm³ chlormravenčanu ethylnatého (1,52 mmol). Po 5 min míchání se suspenze zavedla přes fritu č. 3 do vodného roztoku chitosanu (0,5 g; 2,87 mmol; stupeň acetylace 16 %) ve vodě o pH 6,5. Během reakce se pH roztoku udržovalo 10% vodným roztokem NaOH v rozmezí 6,5 až 7,0. Prvních 15 min se reakce zahřívala na teplotu 60 °C, Reakce byla doprovázena vývinem oxidu uhličitého, po skončení reakce (3 hod) se při pH 7,0 odpařil aceton. Po ochlazení roztoku se suspenze promíchávala při pH 7,0 po dobu 20 min a zfiltrovala přes Biichnerovu nálevku. Produkt se promyl vodou a absolutním 2-propanolem. Derivát se sušil při laboratorní teplotě. Výsledný sypký produkt o hmotnosti 0,62 g měl béžovou barvu.

FTIR (KBr): 2943 cm¹ v(CH₂)_ín, 2853 cm ‘ \'(CH₂), 1659 cm ’ v(C=O) amidI., 1553 cm¹ %NH) amid II., 1466 cm ¹ (KCHy.

Příklad 4. Modifikace chitosanu ve formě jeho hydrochloridu kyselinou palmitovou

Chitosan (5 g; 0,029 mol; stupeň acetylace 26 %) se intenzivně míchal ve 150 cm³ 0,1 M HCI po dobu 1 hodiny. Chitosan ve formě hydrochloridu se vysrážel z roztoku přídavkem 500 cm³ absolutního 2-propanolu. Chitosan-hydrochlorid se odseparoval na odstředivce a promyl dvakrát 80% 2-propanolem (směs s vodou) a nakonec čistým 2-propanolem. Produkt ve formě bílého prášku se sušil při 50 °C. Takto se získalo 4,76 g chitosan-hydrochloridu ve formě bílého prášku.

Chitosan-hydrochlorid (0,5 g; 2,85 mmol) spolu s 1 g LiCl (CAS 7447—41 -8; Acros Organics) se míchal po dobu 16 hod. při teplotě 60 °C v 10 cm³ /V,7V-dimethylacetamidu (CAS 127-19-5; Sigma-Aldrich). K takto upravené reakční směsi se přikapávala aktivovaná kyselina. Kyselina palmitová (0,330 g; 1,29 mmol) se rozpustila v 10 cm³ V,V-dimethylacetamidu a ochladila na teplotu 0 °C. Kroztoku se postupně přidalo 0,188 cm³ triethylaminu (1,36 mmol) a 0,129 cm³ chlormravenčanu ethylnatého (1,36 mmol). Po 5 min se směs zfiltrovala do předem připraveného roztoku chitosan-hydrochloridu. Reakce probíhala při teplotě 60 °C, po 3 hodinách se směs vy- 10CZ 302856 B6 srážela 30 cm³ vody a zfiltrovala na fritě, promyta vodou. Filtrační koláč se rozdispergoval v 30 cm³ vody, pH se upravilo 10% vodným roztokem NaOH na 7, pomocí Ultra-Turraxu (T25basic, IKA-Werke) při 6500 otáčkách, po 1 hod. míchání se přidalo 20 cm³ acetonu a znovu se dispergoval a zfiltroval na fritě. Takto se získalo 0,49 g derivátu.

FTÍR (KBr); 2955 cm ¹ v(CH3)a!;, 2918 cm ¹ v(CHi)ax, 2848 cm¹ v(CHi)_x, 1738 cm¹ v(C=O), 1688 cm ¹ v(C=O) amid 1637 cm ¹ 6(NH) amid ÍL, 1465 cm ^z ÓiClFj·

Příklad 5. Modifikace chitosanu kyselinou thioglykolovou

Kyselina thioglykolová (0,2078 cm³; 0,81 mmol; CAS 68-11-1; Merck) se rozpustila v 15 cm³ acetonu. Za chladu se k roztoku přidalo 0,118 cm³ triethylaminu (0,85 mmol) a 0,081 cm³ chlormravenčanu ethylnatého (0,85 mmol). Po 10 min míchání na ledu se suspenze zavedla přes fritu č. 3 do 30 cm³ směsi chitosanu (0,3 g 1,62 mmol; stupeň acetylace 26 %) ve vodě o pH 7,5. Během reakce se pH roztoku udržovalo 5% vodným roztokem NaOH v rozmezí 6,5 až 7,0. Reakce byla doprovázena vývinem oxidu uhličitého, po skončení reakce (2 až 3 hod) se z reakční směsi odpařil aceton při teplotě 75 °C a pH 7,0. Vzniklý gel se promíchával po dobu 15 min při pH 8,0 a po přídavku 200 cm³ acetonu se směs zfiltrovala pres skládaný filtr. Derivát se sušil při teplotě 45 °C. Získal se 0,32 g produktu.

FTIR (KBr); 2924 cm¹ v(CHi)_as, 2870 cm¹ v(CH)s, 1705 cm ‘ v(C=O), 1556 cm ¹ v(C-()) amid 534 cm¹.

Příklad 6. Modifikace chitosanu kyselinou dithiodiglykolovou

Kyselina dithiodiglykolová (0,264 g; 1,45 mmol; CAS 505-73-7; Sigma-Aldrich) se rozpustila v 10 cm³ acetonu. Po přídavku 0,422 cm³ triethylaminu (3,26 mmol) se roztok ochladil na 0 °C a po 20 min se přikapalo 0,289 cm³ chlormravenčanu ethylnatého (3,26 mmol). Po 7 min míchání na ledu se suspenze zavedla přes fritu č. 3 do 30 cm³ směsi chitosanu (0,5 g; 1,82 mmol) ve vodě o pH 7,0. Reakce je doprovázena vývinem oxidu uhličitého, po skončení reakce (3 až 4 hod) bylo pH reakce upraveno na 7,0 a ponecháno míchat 30 min při teplotě 60 °C. Po odpaření acetonu se gel odfiltroval na Biichnerově nálevce a promyl 3krát 30 cm³ absolutního 2-propanolu. Derivát se sušil při teplotě 40 °C. Získalo se 0,48 g produktu.

FTÍR (KBr); 2922 cm ¹ ν(€Η^, 1699 cm¹ , 1561 cm¹ v(C=O) amid 1, 1597 cm 1558 cm ^{, 1419 cm ^!.

Příklad 7. Modifikace chitosanu kyselinou 2,3-dibrompropanovou a následné zesíťování (crosslink)

Příprava kyseliny 2,3-dibrompropanové (CAS 600-05-5)

Kyselina akrylová (5,5 cm³; 0,08 mol; CAS 79-10-7; Acros Organics) se míchala po dobu 1 hodiny při laboratorní teplotě s 6,15 cm³ bromu (0,12 mol; CAS 7726-95-6; Sigma Aldrich) a poté další 3 hod. při teplotě 40 °C na vodní lázni. Výsledná nažloutlá sraženina se odseparovala a sušila volně na vzduchu za teploty místnosti.

FTÍR (KBr): 1720 cm ¹ v(C=O), 1425 cm ¹ ,1337 cm¹, 1254 cm 1215 cm 1153 cm ^l, 949 cm ^l, 906 cm 825 cm 662 cm 631 cm 7 509 cm ¹

Reakce s kyselinou 2,3-dibrompropanovou a následné zesíťování

-11 CZ 302856 B6

Chitosan (0,5 g; 2,87 mmol) se rozpustil ve 30 cm³ vody přídavkem 2 cm³ 1 M HC1. Před reakcí se pH upravilo 10% vodným roztokem NaOH na hodnotu 7,0. Kyselina 2,3-dibrompropanová 0,134 g (0,58 mmol) se rozpustila v 15 cm³ acetonu, po vychlazení na 0 °C se postupně přidalo 0,084 cm³ triethylaminu (0,61 mmol) a 0,058 cm³ chlormravenčanu ethylnatého (0,61 mmol). Aktivovaná kyselina se poté zfíltrovala přes fritu č. 4 do roztoku chitosanu. Reakce probíhala 2 hod. při laboratorní teplotě. Poté se pH roztoku upravilo na hodnotu 8,0 přídavkem 10% vodného roztoku NaOH a míchal se další hodinu. Teplota se postupně vždy po 1 hodině zvedla na 40 °C a na 60 °C. Produkt se izoloval filtrací. Získalo se 0,48 g produktu.

FTIR (KBr): navázání kyseliny 2,3-dihromakrylové je charakterizováno píky 2922 cm ‘ v(CH2)_ax a 2854 cm ¹ v(CIH), a 1558 cm ¹ v(C=O) amid I., po zesilováni se objeví pík 1703 cm ¹ a zmizí výraznější piky 2922 a 2854 cm í

Příklad 8. Modifikace chitosanu kyselinou N,N-dihexyl-3-aminooctovou kyselinou

Příprava N,N-dihexyl-3-aminooctové kyseliny (CAS 193623-50-6)

Kyselina monochloroctová (5,5 g; 58,2 mmol; CAS 79-11-8; Nitrokémia 2000) a dihexylamin (12,34 cm³; 52,9 mmol; CAS 143-16-8; Sigma-Aldrich) se smíchaly ve 20 cm³ acetonu. Směs se zahřála na 50 °C a postupně se přidalo 0,43 g NajCCh. Reakce probíhala pod zpětným chladičem při teplotě 60 °C po dobu 30 hodin. Po negativní reakci na Ehrlichovo činidlo (důkaz nepřítomnosti aminových skupin) byla z reakční směsi odfiltrována bílá sraženina (0,7856 g), acetátový filtrát se okyselil koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou na pH 5 a produkt se vysrážel přídavkem 150 cm³ destilované vody. Výsledný lehce nažloutlý produkt (5,22 g; 21,45 mmol) se vysušil při teplotě 45 °C.

FTIR (KBr): 2959 cm¹ v(CH3)ax, 2930 cm¹ v(CH2)axt 2858 cm¹ v(CH3)x, 2793 cm ¹ v(CH3)_ax, 2521 cm 2440 cm 1876 cm¹,1716 cm¹, v(C-O) karboxylu, 1593 cm ^}, 1462 cm ⁷ SíCHý, 1053 cm 729 cm ¹ (tfCHJ.

Vlastní modifikační reakce

Chitosan (0,5 g; 2,87 mmol; stupeň acetylace 35 %) se rozpustil ve 30 cm³ vody za přídavku 2 cm³ 1 M HC1, V,V-dihexyl-3-aminooctová kyselina (0,141 g; 0,58 mmol) se rozpustila ve 20 cm³ acetonu a vychladila na teplotu 0 °C. Přidal se chlormravenčan ethylnatý (0,058 cm³; 0,61 mmol) a suspenze se po 5 min přidala k roztoku chitosanu o pH 6,5 (pH se upravilo přídavkem 10% NaOH). Po 6 hodinách se pH reakční směsi upravilo na 7,0 a produkt se izoloval filtrací přes Buchnerovu nálevku a promyl absolutním 2-propanoIem. Výsledný produkt (0,52 g) se sušil při teplotě 45 °C.

FTIR (KBr): 2926 cm ^! v(CIÍ2)_as a 2887 cm ‘ v(Cfí₃)_x, 1697 cm ¹ v(C=O) amid I.,a 1528 cm ⁷ δ(ΝΗ) amidll.

Příklad 9. Modifikace chitinu kyselinou palmitovou

Acetylace chitosanu - příprava chitinu (CAS 1398-61-4)

Chitosan (5 g; 0,029 mol; stupeň acetylace 16 %) byl rozpuštěn ve 150 cm³ vody za přídavku 1 M HC1. Přídavkem 10% NaOH bylo pH upraveno na 6,5 za vzniku bílého gelu. Následně bylo střídavě po částech přidáváno 3 cm³ acetanhydridu (0,032 mol) a 10% NaOH, kterým bylo pH udržováno v rozmezí 6,5 až 7,0. Po přídavku posledního množství acetanhydridu byla suspenze míchána za teploty místnosti po dobu 4 hodin s občasnou kontrolou pH. Chitin byl izolován snížením pH na 5 a odstředěn, promyt vodou, 80% 2-propanolem (směs s vodou) a posléze absolut- 12CZ 302856 B6 ním 2-propanolem. Produkt byl sušen při 45 °C. Takto bylo získáno 4,97 g bílého sypkého materiálu, chitosanu se stupněm acetylace 100 %.

FTIR (KBr): 1660 cm' v(C=O) amid 1558 cm' δ(ΝΗ) amid II.

Vlastní modiftkační reakce

Chitosan (0,5 g; 2,26 mmol; stupeň acetylace 100 %) se za přídavku 0,5 g LiCl rozpustil v 15 cm³ X/V-dimethylacetamidu. Směs se míchala po dobu 1 hod. při 60 °C. K takto vytvořenému io roztoku se přidalo 0,2898 g aktivované kyseliny palmitové (1,13 mmol). Kyselina palmitová se aktivovala přídavkem 0,113 cm³ chlormravenčanu ethylnatého (1,19 mmol) a 0,165 cm³ triethylaminu (1,19 mmol) při teplotě 0 °C po dobu 5 min v 10 cm³ N,N-dimethylacetamidu.

Vlastní modifikační reakce běžela 15 hod. při teplotě 60 °C. Produkt se vysrážel přídavkem 30 cm³ vody, ponechal 1 minutu intenzivně míchat na dispergačním míchadle (Ultra-Turrax

T25-basic, IKA-Werke) při 6500 otáčkách za minutu. Suspenze se zfiltrovala, k produktu se přidalo 50 cm³ acetonu a suspenze se míchala po dobu 1 hod. za teploty místnosti a zfiltrovala. Výsledkem bylo 0,52 g produktu nahnědlé barvy. Produkt byl rozpustný v 2-propanolu.

FTIR (KBr): 2924 cm 2853 cm ¹ vfCHJ, a 1734 cm ¹ v(C=O).

Příklad 10. Modifikace hyalurononanu sodného ve formě HA-TBA-TBA kyselinou octovou

Příprava HA-TBA-TBA

Roztok tetrabutylamonium-bromidu (4,226 g; 13,124 mmol; CAS 1643-19-2, Fluka) v 250 cm³ 2-propanolu (CAS 67-63-0; Merck) se za intenzivního míchání pomalu přikapal k 250 cm³ vodnému roztoku sodné soli hyaluronové kyseliny (5,0 g; 12,5 mmol/disacharid; Mw = 360.10³ g.mol“¹; CAS 9067-32-7; CPN spol. s r. o.). Po 12 hodinách míchání se k čirému roz30 toku přikapal aceton (400 cm³) a vzniklá bílá sraženina se míchala další 2 hodiny. Po částečné dekantaci a odstředění (5000 otáček/min) se derivát sušil při 45 °C za vzniku 4,121 g tetrabutylamonné soli hyaluronové kyseliny (HA-TBA).

Jemně rozetřená bílá tetrabutylamonná sůl hyaluronové kyseliny ΗΑΤΒΑ (4,121 g;

6,658 mmol/disacharid) se intenzivně míchala v 50% roztoku tetrabutylamonium hydroxid triakontahydrátu (5,300 g; 6,625 mmol; CAS 2052^49-5; Fluka). Po dvou hodinách se transparentní disperze zamrazila při -18 °C a lyofilizovala za vzniku lehce nažloutlého produktu tetrabutylamonné formy kyseliny hyaluronové HA-TBA-TBA (5,94 g).

FTIR (KBr): 2959 cm 2945 cm 2875 cm 1655 cm‘, 1618 cm¹, /568 cm ^l, 1464 cm 1407 cm ^ž, 1379 cm

Vlastní modifikační reakce

Kyselina octová (0,100 cm³; 1,742 mmol; CAS 64-19-7; Sigma-Aldrich) se rozpustila v 1 cm³ MA-dimethylformamidu (CAS 68-12-2, Lach-Ner) s přídavkem triethylaminu (0,242 cm³; 1,742 mmol). Roztok se ochladil na ledové lázni a za bezvodých podmínek se pomalu přikapal chlormravenčan ethylnatý (0,166 cm³; 1,742 mmol). Během několika sekund začala vypadávat z roztoku sraženina triethylamonium-chíoridu. Po deseti minutách intenzivního míchání se sus50 penze kvantitativně přenesla k 5 až 10% suspenzi HA-TBA-TBA (0,300 g; 0,348 mmol/disacharid) v /W-dimethylformamidu a směs se míchala 2 dny při teplotě 50 °C. Po ochlazení na teplotu místnosti se k reakční směsi přidalo 10 cm³ CHC1₃ a suspenze se homogenízovala za použití dispergačního míchadla (13500 otáček/min, maximálně 30 s), zfiltrovala za užití Buchnerovy nálevky a sypký produkt se promyl CHC1₂ a rozsuspendoval v CHC1₃. Tento proces extrak55 ce lipofilních látek do CHCI3 se opakoval třikrát. Poté se sraženina postupně suspendovala v 80%

- 13CZ 302856 B6 (směs s vodou), 80% a absolutním 2-propanolu (80 cm’) za užití dispergačního míchadla s následným odstředěním (odstředivka: Beckman J2-21) při 5000 otáček/min po dobu 20 minut. Po sušení při 50 °C přes noc se bílý produkt resuspendoval za užití dispergačního míchadla v 10 cm’ vody a pH se upravil na 7 až 8 (0,1 M NaOH). K suspenzi míchané přes noc se přikapal absolutní 2 propanol (50 cm³). Směs se odstředila (5000 otáček/min; 20 min) a výsledný ester se sušil při 50 °C. Získalo se 0,80 g HA-acetátu.

FTIR (KBr); 2893 cm 1736 cm 1654 cm 1613 cm 1409 cm 1378 cm '.

Příklad 11. Modifikace hyaluronanu sodného ve formě HA-TBA-TBA kyselinou hexanovou

Kyselina hexanová (0,217 cm³; 1,742 mmol) se rozpustila v 1 cm³ /V,/V-dimethylformamidu s přídavkem triethy laminu (0,242 cm’; 1,742 mmol). Roztok se ochladil na ledové lázni a pomalu se přikapal chlormravenčan ethylnatý (0,166 cm’; 1,742 mmol). Během několika sekund začala vypadávat z roztoku sraženina triethylamonium-chloridu. Po deseti minutách intenzivního míchání se suspenze kvantitativně přenesla k 5 až 10% suspenzi HA-TBA-TBA, připravené podle příkladu 13 (0,300 g; 0,348 mmol/di sacharid) v N, N-d i methyl formám idu a směs se míchala 2 dny při teplotě 50 °C. Po ochlazení na teplotu místnosti se k reakční směsi přidalo 10 cm³ CHC1₃ a suspenze se homogenizovala za použití dispergačního míchadla (13500 otáček/min, maximálně 30 s), zfiltrovala za užití Biichmanovy nálevky a sypký produkt se promyl CHCfi a suspendoval v CHCfi. Tento proces extrakce 1 ipofílních látek do CHC1₃ se opakoval třikrát. Poté se sraženina postupně resuspendovala v 80% (směs s vodou) a absolutním 2-propanolu (80 cm³) za užití dispergačního míchadla s následným odstředěním (odstředivka: Beckman J221) při 5000 otáček/min po dobu 20 min. Po sušení při 50 °C přes noc se bílý produkt resuspendoval za užití dispergačního míchadla v 10 cm³ vody a pH se upravilo na 7 až 8 (0,1 M NaOH). K suspenzi míchané přes noc se přikapal absolutní 2-propanol (50 cm³). Směs se odstředila (5000 otáček/min; 20 min) a výsledný ester se sušil při 50 °C. Získalo se 0,90 g HA-hexanoátu. FTIR(KBr): 2942 cm 2895 cm ^J, 1734cm ^l, 1654 cm 1619cm 1410cm 1377 cm

Příklad 12. Modifikace hyaluronanu sodného kyselinou hexanovou

0,156 cm³ kyseliny hexanové (1,25 mmol) se rozpustilo ve 20 cm³ acetonu a přidalo se 0,182 cm³ triethy laminu (1,31 mmol). Acetonový roztok se vychladil na 8 °C a poté se přikapalo 0,125 cm³ chlormravenčanu ethylnatého (1,31 mmol). Aktivace probíhala 10 min při teplotě 8 °C a směs se následně zfiltrovala. Filtrát se postupně přidával do zahřátého roztoku sodné soli kyseliny hyaluronové (0,5 g; 1,25 mmol; Mw = 398.10³ g.moT¹) rozpuštěné ve 100 cm³ demineralizováné vody za přídavku 1,0 cm³ Althosanu MB (vodný roztok alkyl-dimethyl-benzyl-amonium chloridu, CAS 68989-00-4; Chemotex Děčín, a.s.) za teploty 65 °C. Reakce probíhala při teplotě 65 °C po dobu 15 minut s následným pozvolným zchlazením na teplotu místnosti, celková doba reakce byla 4 hodiny. Po skončení reakce se přidalo 1,0 g NaCl a 250 cm³ absolutního 2-propanolu. Produkt se po sedimentaci a děkantaci promyl absolutním 2-propanolem (50 cm³) a sušil při teplotě 50 °C po dobu asi 14 hodin. Získalo se 0,51 g bílého produktu.

FTÍR (KBr): 2915 cm ^! 1738 cm ‘ v(C=O), 1654 cm

Příklad 13. Modifikace hyaluronanu sodného kyselinou palmitovou

Hyaluronan sodný (0,25 g; 0,64 mmol; Mw - 3 50,4.10³ g.moT¹) se míchal v 10 cm³ N,Ndimethylacetamidu po dobu 16 hod. při teplotě 60 °C. Aktivace kyseliny palmitové (0,165 g; 0,64 mmol) probíhala při teplotě 0 °C po dobu 5 min ve 10 cm³ A,/V-dimethylacetamidu působením 0,094 cm³ triethylaminu (0,68 mmol) a 0,064 cm³ chlormravenčanu ethylnatého

- 14CZ 302856 B6 (0,68 mmol). Takto vytvořená suspenze se zfiltrovala pres fritu ě. 3 do roztoku předem připravené směsi hyaluronanu sodného. Reakce probíhala 5 hod, při teplotě 60 °C a poté po přídavku 20 cm³ vody další 1 hod. při laboratorní teplotě. Ke směsi se přidalo 0,1 g NaCl a produkt se vysrážel přídavkem 200 cm³ absolutního 2-propanolu. Produkt se po sedimentaci a dekantaci promyl absolutním 2-propanolem (50 cm³) a sušil při teplotě 50 °C po dobu asi 14 hodin. Získalo se 0,22 g bílého produktu.

FTIR (KBr): 2915 cm^! 1738 cm¹ v(00), 1654 cm¹.

Příklad 14. Modifikace hyaluronanu sodného kyselinou palmitovou

Hyaluronan sodný (0,25 g; 0,64 mmol; Mw = 350,4.10³ g.mof¹) se míchal v 5 cm³ N,Ndimethylformamidu po dobu 16 hod. při teplotě 60 °C. Aktivace kyseliny palmitové (0,165 g; 0,64 mmol) probíhala při teplotě 0 °C po dobu 5 min ve 10 cm³ W-di methy Iformam idu působením 0,094 cm³ triethylaminu (0,68 mmol) a 0,064 cm³ chlormravenčanu ethylnatého (0,68 mmol). Takto vytvořená suspenze se zfiltrovala přes fritu č. 3 do roztoku předem připravené směsi hyaluronanu sodného. Reakce probíhala 5 hod. při teplotě 60 °C a poté po přídavku 20 cm³ vody další 1 hod. při teplotě místnosti. Ke směsi bylo přidáno 0,1 g NaCl a produkt se vysrážel 200 cm³ absolutního 2-propanolu. Produkt se po sedimentaci a dekantaci promyl absolutním 2-propanolem (50 cm³) a sušil při teplotě 50 °C po dobu asi 14 hodin. Získalo se 0,28 g bílého produktu.

FTIR (KBr): 2915 cm ' v(CFh) _a!i} 1738 cm¹ v(C=O), 1654 cm '.

Příklad 15. Modifikace hyaluronanu sodného kyselinou palmitovou

Hyaluronan sodný (0,25 g; 0,64 mmol; Mw = 350,4.10³ g.moT¹) byl míchán v 5 cm³ N,Ndimethylformamidu za přídavku 0,5 g LiCl po dobu 16 hod. při teplotě 60 °C. Aktivace kyseliny palmitové (0,165 g; 0,64 mmol) probíhala při teplotě 0°C po dobu 5 min ve 10 cm³ ATJV-dimethylformamidu působením 0,094 cm³ triethylaminu (0,68 mmol) a 0,064 cm³ chlormravenčanu ethylnatého (0,68 mmol). Takto vytvořená suspenze se zfiltrovala přes fritu č. 3 do roztoku předem připravené směsi hyaluronanu sodného. Reakce probíhala 5 hod. při teplotě 60 °C a poté po přídavku 20 cm³ vody další 1 hod. při teplotě místnosti. Ke směsi bylo přidáno 0,05 g NaCl a produkt byl vysrážen přídavkem 200 cm³ absolutního 2-propanolu. Produkt byl po sedimentaci a dekantaci promyl absolutním 2-propanolem (50 cm³) a sušen při teplotě 50 °C po dobu asi 14 hodin. Získalo se 0,23 g bílého produktu.

FTIR (KBr): 2915 cm ¹ v (Clí2)^ 1738 cm ¹ v (C O), 1654 cm

Příklad 16. Modifikace hyaluronanu lithného kyselinou palmitovou

Hyaluronan sodný (0,15 g; 0,39 mmol; CPN spol. s r. o.) se míchal v 3 cm³ 2V,A-dimethylacetamidu za přídavku 0,25 g LiCl po dobu 16 hod. při teplotě 60 °C. Aktivace kyseliny palmitové (0,100 g; 0,39 mmol) probíhala při teplotě 0 °C po dobu 5 min ve 5 cm³ A,/V-dimethylacetamidu působením 0,056 cm³ triethylaminu (0,40 mmol) a 0,039 cm³ chlormravenčanu ethylnatého (0,40 mmol). Takto vytvořená suspenze se zfiltrovala přes fritu č. 3 do roztoku předem připravené směsi hyaluronanu sodného. Reakce probíhala 5 hod. při teplotě 60 °C a poté po přídavku 15 cm³ vody další 1 hod. při teplotě místnosti. Ke směsi se přidalo 0,05 g NaCl a produkt se vysrážel přídavkem 100 cm³ absolutního 2-propanolu a zfiltroval přes Buchnerovu nálevku. Získalo se 0,12 g bílého produktu.

FTIR (KBr): 2915 cm ‘ ν(ΟΗ^_αχ, 1738 cm ¹ v(C=O), 1654 cm ‘ v(C=O) karboxylu.

- 15CZ 302856 B6

Příklad 17. Modifikace hyaluronanu líthného kyselinou palmitovou

Hyaluronan lithný (0,15 g; 0,39 mmol) se rozpustil ve 3 cm³ ;V_T;V—dimethylacetamidu za 16 hod. při teplotě 60 °C. Aktivace kyseliny palmitové (0,100 g; 0,39 mmol) probíhala při teplotě 0 °C po dobu 5 min ve 5 cm³ jV.TV-dimethylacetamidu působením 0,056 cm³ triethylaminu (0,40 mmol) a 0,039 cm³ chlormravenčanu ethylnatého (0,40 mmol). Takto vytvořená suspenze byla zfiltrována přes fritu č. 3 do roztoku předem připravené směsi hyaluronanu sodného. Reakce probíhala 5 hod. při teplotě 60 °C a poté po přídavku 15 cm³ destilované vody další 1 hod. při teplotě místnosti. Ke směsi se přidalo 0,05 g NaCl a produkt se vysrážel přídavkem 100 cm³ absolutního 2propanolu a zfiltroval přes Bůchnerovu nálevku. Získalo se 0,11 g bílého produktu.

FTIR (KBr): 2915 cm ‘ v (Cl {2) 1738 cm ¹ v(C-O) esteru, 1654 cm ¹ v(C=O) karboxylu.

Příklad 18. Modifikace tetrabutylamonné soli kyseliny hyaluronové (HA-TBA) kyselinou palmitovou.

Příprava tetrabutylamonné soli kyseliny hyaluronové

Hyaluronan sodný (10 g; 0,026 mol; Mw = 380.10³ g.mol”¹) se rozpustil v 800 cm³ demineralizované vody a následně míchal se silně kyselým katexem (Amberlite H⁺ 120IR; Erspol s r. o.) po dobu 24 hodin při teplotě místnosti. Roztok se zfiltroval a míchal 6 hodin při teplotě místnosti s 9,44 g (0,0278 mol) tetrabutylamonium hydrogensíranu (CAS 32503-27-8; Sigma-Aldrich). Tetrabutylamonné sůl kyseliny hyaluronové se vy srážela přídavkem 2500 cm³ absolutního 2propanolu a sušila při teplotě 50 °C přes noc.

Vlastní modifikační reakce

Kyselina palmitová (0,3203 g; 1,25 mmol) se rozpustila v 30 cm³ acetonu a přidalo se 0,175 cm³ triethylaminu (1,26 mmol). Acetonový roztok se vychladil na 8 °C (externě ledem) a poté se přikapalo 0,120 cm³ chlormravenčanu ethylnatého (1,26 mmol). Aktivace probíhala 10 min při teplotě 8 °C a směs se následně filtrovala. Filtrát se postupně přidával do roztoku tetrabutylamonné soli kyseliny hyaluronové (0,5 g; 0,8 mmol) rozpuštěné v 50 cm³ dimethylsulfoxidu (CAS 67-68-5; Fisher-Scientific) za přídavku 0,175 cm³ triethylaminu (1,26 mmol). Reakce probíhala při teplotě 45 °C po dobu 5 hodin. Po skončení reakce bylo pH upraveno pomocí 0,1 M HCl na hodnotu 4,8 a reakční směs se čistila dialýzou po dobu 3 dnů proti vodě a následně lyofilizována. Ze získaného produktu (0,5608 g) se dále odstranila tetrabutylamonné sůl pomocí katexu (Amberlite H⁺ 120IR) vsádkovým způsobem. Po dekantaci katexu se roztok neutralizoval pomocí 0,lM NaOH a vy izolovala se suspenze vodorozpustného derivátu (0,2272 g) a nerozpustného podílu (0,0712 g). Výsledné podíly se extrahovaly (0,25% vodný roztok, či suspenze) diethyletherem v objemovém poměru 1:1a následně 2:1. Vodný roztok se zmrazil a lyofilizoval. Získalo se 0,0186 g vodorozpustného derivátu a 0,0092 g ve vodě nerozpustného derivátu.

FTIR (KBr): nerozpustný podíl: 2954 cm¹ v(CHj)ax, 2920 cm ¹ v(CH?j_<s„ 2850 cm¹ vfCHý,, 1731 cm ¹ (C=O) ester; rozpustný podíl: píky menší intenzity; 2920 cm ' v(CHda5, 2850 cm ^! v(CHýx, 1734 cm ^! (C=O) ester.

Příklad 19. Modifikace kyseliny hyaluronové ve formě HA-TBA-TBA kyselinou palmitovou

Kyselina palmitová (0,3203 g; 1,25 mmol) se rozpustila v 20 cm³ dimethylsulfoxidu a přidalo se 0,175 cm³ triethylaminu (1,26 mmol) a po dobrém rozmíchání se přidalo 0,120 cm³ chlormraven- 16CZ 302856 B6 čanu ethylnatého (1,26 mmol). Reakční směs se za chlazení míchala 10 minut při teplotě 8°C a následně zfiltrovala přes fritu č. 3 a získal se roztok směsného anhydridů.

HA-TBA-TBA připravená postupem v příkladu 13 (0,2 g) se rozpustila v 20 cm³ dimethylsulfo5 xidu a přidal se roztok směsného anhydridu palmitové kyseliny a reakční směs se míchala 20 h při 40 °C. Produkt se izoloval srážením 2-propanolem a následně se promýval 80% roztokem 2propanolu (3-krát 100 cm³) a nakonec se promyl absolutním 2-propanolem. Získalo se 0,1637 g produktu. Derivát se rozpustil ve vodě v koncentraci 0,2 hmotnostních procent a převedl se přes kolonu naplněnou silně kyselým katexem v kyselé formě (Amberlite FT 102 IR). Roztok převeio děný přes katex se neutralizoval pomocí 0,lM NaOH a lyofilizoval. Na vrstvě katexu zůstal nerozpuštěný podíl. Produkt se rozpustil (popř. suspendován) ve vodě v koncentraci 0,2 % a extrahoval se diethyletherem v objemovém poměru 1:1 a následně vodná fáze se extrahovala znovu diethyletherem v poměru 2:1. Vodná fáze se zamrazila a lyofilizovala. Získalo 0,0962 g vodorozpustného podílu a 0,0461 g vodného podílu z extrahované suspenze.

FTIR (KBr): vodorozpustný podíl: 2918 cm ¹ v(CHdax, 2850 cm¹ v(CIIJ,, 1734 cm ‘ (C=O) ester; extrahovaná suspenze: 2921 cm ¹ v(CH^as> 2852 cm ¹ v(CHJs, 1733 cm ‘ (C=O) ester, 1701 cm¹ v(C--O).

Příklad 20. Modifikace hyaluronanu sodného kyselinou 2,3-dibrompropanovou

Hyaluronan sodný (0,25 g; 0,64 mmol; Mw = 547,10³ g.mof¹) se spolu s 1 g LiCl rozpustil v 10 cm³ Y,V-dimethylacetamidu za míchání po dobu 16 hod. při 70 °C za tvorby gelu. Kyselina

2,3-dibrompropanová připravená postupem v příkladu 7 (0,075 g; 0,32 mmol) se rozpustila v 10 cm³ Y,Y-dimethylacetamidu spolu s 0,047 cm³ triethyíaminu (0,34 mmol) a ochladila na 0°C. Po 15 min míchání se k roztoku přidalo 0,032 cm³ chlormravenčanu ethylnatého (0,34 mmol) a vzniklá suspenze se intenzivně míchala po dobu 5 min a poté zfiltrovala do předem připraveného gelu hyaluronanu sodného. Reakce probíhala po dobu 5 hod. při teplotě 40 °C.

Reakční směs se naředila 25 cm³ vody a po přídavku 0,1 g NaCl se produkt vysrážel přídavkem 200 cm³ absolutního 2-propanolu a zfiltroval pres skládaný filtr a promyl 3krát 30 cm³ absolutního 2-propanolu. Po usušení při teplotě 40 °C se získalo 0,24 g produktu.

FTIR (KBr): 2924 cm ¹ v(CHz)_u,, 1734cm^l v(C=O), 1622 cm¹, 1434cm 1377 cm *, 601 cm

Příklad 21. Modifikace hyaluronanu sodného N,N-dihexyl-3-amino-octovou kyselinou

Příprava N,N-dihexyl-3-aminooctové kyseliny (CAS 193623-50-6)

Glycin (5 g; 66,6 mmol; CAS 56-40-6; Merck) se rozmíchal spolu s 21,63 cm³ hexyljodidu (146,57 mmol; CAS 638-45-9; Sigma-Aldrich) ve 20 cm³ acetonu). Směs se zahřála na 50 °C a postupně se přidal 1 g Na₂CO₃. Reakce probíhala pod zpětným chladičem při teplotě 70 °C po dobu 42 hod. Před izolací bylo pH upraveno koncentrovanou HCl (35 %) na hodnotu 4,0 a po vy srážení přídavkem 300 cm³ acetonu se sraženina zfiltrovala přes skládaný filtr. Sraženina se potom znovu rozmíchala v acetonu (300 cm³) a znovu zfiltrovala. Výsledný produkt (6,02 g; 24,73 mmol) se sušil při teplotě 45 °C.

FTIR (KBr): 3425 cm¹, 3123 cm 2842 cm ¹ vtCIFT, 1716 cm¹ v(C=O) karboxylů, 1592 cm ^!,

1 469 cm ¹ d(CH^ 1407 cm¹, 1336 cm ‘, 1254 cm¹, 1128 cm 673 cm '.

Vlastní modifikační reakce

V 10 cm³ acetonu se rozmíchalo 0,063 g kyseliny Y.Y-dihexyl-3-aminooctové (0,26 mmol) a po vychlazení na 0 °C se ke směsi přidalo 0,025 cm³ chlormravenčanu ethylnatého. Po 5 min se

- 17CZ 302856 B6 směs přilila k 1% roztoku hyaluronanu sodného (0,5 g; 1,29 mmol) ve vodě. Za intenzivního míchání se roztok ponechal 3 hod. při laboratorní teplotě. Produkt se izoloval přídavkem 0,1 g NaCl a přídavkem 200 cm³ čistého 2-propanolu. Po filtraci přes skládaný filtr se produkt znovu promyl 2-propanolem. Získalo 0,49 g produktu.

FTIR (KBr): 2957 cm ¹ v(CTf₃)_a„ 2028 cm ‘ v^H^, 2858 cm ¹ vfCH^ 1740 cm ^! v(C=O),

1645 cm 1618 cm ¹ δ(ΝΗ), 1580 cm 1469 cm ¹ 6(CH^).

Příklad 22. Modifikace hyaluronanu sodného N,N-dihexyl-3-amino-octovou kyselinou

Ve 20 cm³ acetonu se rozpustilo 0,316 g kyseliny W—dihexyl-3-arninoctové (1,30 mmol) připravené postupem popsaným v příkladu 9. Po vychlazení na 0 °C bylo se ke směsi přidalo 0,130 cm³ chlormravenčanu ethylnatého (1,36 mmol) a po 5 min intenzivního míchání se směs přilila k 1% roztoku hyaluronanu sodného (1 g; 2,57 mmol) ve vodě. Reakční směs se míchala po dobu 4 hodin při teplotě místnosti. Produkt se izoloval přídavkem 0,1 g NaCl a 500 cm³ 2-propanolu, promyl 80% 2-propanolem (vodná směs) a absolutním 2-propanolem. Produkt se detekoval a sušil při teplotě 45 °C. Získalo se 1,29 g produktu.

FTIR (KBr): 2957 cm ' v(CH₃)_a,, 2928 cm ¹ 2858 cm ¹ 1740 cm ¹ v(C=O),

1645 cm 1618 cm ¹ δ(ΝΗ), 1580 cm 1469 cm ¹ SfCHi).

Příklad 23. Modifikace hyaluronanu sodného hyaluronové kyselinou 3-jódpropionovou

Kyselina 3-jódpropionová (0,0429 g; 0,215 mmol; CAS 141-76—4; Acros Organics) se rozpustila ve 20 cm³ acetonu. Za chladu se k roztoku přidalo 0,0313 cm³ triethylaminu (0,226 mmol) a 0,0215 cm³ chlormravenčanu ethylnatého (0,226 mmol). Po 10 min aktivace při teplotě -5 °C se roztok vpravil do 0,5 % vodného roztoku kyseliny hyaluronové (0,5 g). Během reakce se pH roztoku udržovalo 5% roztokem NaOH v rozmezí 8,0 až 8,5. Po skončení reakce (3 hod) se k roztoku přidalo 0,1 g NaCl a 100 cm³ acetonu. Derivát se zfiltroval přes skládaný filtr a sušil při teplotě 45 °C. Derivát se poté znovu rozpustil v 50 cm³ vody a znovu se vy srážel přídavkem 100 cm³ acetonu. Produkt se vysušil při teplotě 45 °C. Získalo se 0,48 g produktu.

FTIR (KBr): 2899 cm ¹ v(CH₃)s, 1734 cm¹ v(C-O) esteru, 1654 cm ¹ v(C=O) karboxylu, 1558 cm ‘, 1375 cm ’, 1317 cm 623 cm ¹ v (C-I).

Příklad 24. Roubování chitosanu kyselinou hyaluronovou

Kyselina hyaluronové (0,2636 g; 0,72 mmol; Mw = 80,48.10³ g.mol¹; CAS 9004-61-9; CPN spol. s r. o.) ve formě volné kyseliny se rozpustila ve 30 cm³ pyridinu (CAS 110-86-1; LachNer) za tvorby gelu (nutno míchat 24 hodin), který se aktivoval při teplotě 0 °C přídavkem 0,0694 cm³ chlormravenčanu ethylnatého (0,73 mmol) po dobu 10 min. Tento gel se vnesl do zahřáté suspenze 0,5% chitosanu v demineralizované vodě (0,1 g; 0,57 mmol; stupeň deacetylace 69 %) o pH 6,5 a teplotě 85 °C. Po 30 minutách míchání se reakční směs zvolna zchladila k teplotě místnosti a míchala se ještě 2 hodiny. Posléze se přidalo 500 cm³ demineralizované vody a tolik 10% roztoku NaOH, aby se z roztoku začal vylučovat polymer (pH přibližně 6,5), který se po sedimentaci promyl 3-krát 80% 2-propanolem (50 cm³; směs s vodou) a 2-krát absolutním 2propanolem (50 cm³). Produkt se sušil při teplotě 50 °C po dobu asi 14 hodin. Získalo se 0,1135 g nažloutlého produktu.

FTIR (KBr): 2922 cm ¹ v(CHp_a„ 2881 cm¹ 1734 cm ¹ v(C=O), 1616 cm ^!, 1417 cm ^l,

1377cm ¹, 667cm ‘.

- 18CZ 302856 B6

Příklad 25. Roubování hyaluronanu sodného kyselinou glukuronovou

Kyselina glukuronová (0,2427 g; 1,25 mmol; CAS 14984-34-0; Serva Feinbiochemica) se roz5 míchala ve 20 cm³ acetonu při 8 °C (externí chlazení ledem), přidalo se 0,183 cm³ triethylaminu (1,32 mmol) a při teplotě 8 °C se aktivovala přídavkem 0,125 cm³ chlormravenčanu ethylnatého (1,37 mmol) po dobu 10 min. Tato směs se vnesla do 0,5% roztoku sodné soli hyaluronové kyseliny v demineralizované vodě (0,5 g; 1,25 mol; Mw = 3 89.10³ g.moT¹) o pH 7,0. Po 4 hodinách míchání se přidalo 250 mg NaCl a 250 cm³ absolutního 2-propanoIu. Po sedimentaci se produkt io promyl 3-krát 80% 2-propanolem (50 cm³; směs s vodou; míchání 60 minut) a 2-krát absolutním 2-propanolem (50 cm³; míchání 15 minut). Produkt se sušil při teplotě 50 °C po dobu asi hodin. Získalo se ,4512 g bílého produktu.

FTIR (KBr); 2922 cm¹ vfCHdas, 2897 cm ^/ vfCH^·, 1733 cm ¹ v(C=O), 1616 cm 1558 cm

Příklad 26. Roubování hyaluronanu sodného chitosanem

Hyaluronan sodný (0,25 g; 0,64 mmol; Mw = 547,10³ g.moT¹) se spolu s l g LiCl rozpouštěl v 10 cm³ Α,/V-dimethylacetamidu po dobu 16 hod. při 70 °C za tvorby gelu. Kyselina 2,3dibromakrylová (0,075 g; 0,32 mmol) připravená postupem popsaným v příkladu 7 se rozpustila v 10 cm³ λζ/V-dimethylacetamidu spolu s 0,047 cm³ triethylaminu (0,34 mmol) a ochladila na 0 °C, po 15 min se k roztoku přidalo 0,032 cm³ chlormravenčanu ethylnatého (0,34 mmol) a vzniklá suspenze se intenzívně míchala po dobu 5 min a poté zfiltrovala do předem připravené25 ho gelu hyaluronanu sodného. Reakce probíhala po dobu 5 hod. při teplotě 40 °C. Chitosan (0,25 g; 1,44 mmol) se rozpustil v 15 cm³ vody za přídavku 1 cm³ 1M HC1. Zvýšením pH na hodnotu 7,0 10 % vodným roztokem NaOH se vytvořil gel, který se přidal do reakční směsi. Reakční směs se míchala další hodinu při teplotě 60 °C. Produkt se vy srážel přídavkem 200 cm³ absolutního 2-propanolu a zfiltroval přes skládaný filtr a promyl 3krát 30 cm³ absolutního 2-pro30 panolu. Po usušení při teplotě 40 °C se získalo 0,52 g produktu.

FTIR (KBr): 2922 cm¹ vfCHd™ 2881 cm¹ v(CHi)_x, 1734 cm¹ v(C=O), 1616 cm 1417 cm 1377cm ¹, 667 cm

Příklad 27. Modifikace schizophylanu kyselinou hexanovou

Kyselina hexanová (1,148 cm³; 9,202 mmol) se rozpustila ve 4 cm³ Y,/V-dimethylformamidu s přídavkem triethylaminu (1,280 ml; 9,202 mmol). Roztok se ochladil na ledové lázni a za bez40 vodých podmínek se pomalu přikapal chlormravenčan ethylnatý (0,876 cm³; 9,202 mmol). Během několika sekund začala vypadávat z roztoku sraženina triethylamoniumchloridu. Po deseti minutách intenzivního míchání se suspenze kvantitativně přenesla k 10% suspenzi schizophylanu (0,600 g; 1,840 mmol/disacharid; CAS 9012-72M); CPN spol. s r, o.) v MV-dimethylformamidu s pyridinem (0,297 cm³; 3,681 mmol) a směs se míchal přes noc při teplotě 60 °C. Po ochlazení na teplotu místnosti se k reakční směsi přidalo 10 cm³ CHCla a suspenze se homogenizovala za použití dispergačního míchadla (13500 otáček/min, maximálně 30 s), zfiltroval za užití Biichnerovy nálevky a sypký produkt se promyl CHCI3 a suspendoval v CHC1₃. Tento proces extrakce lipofilních látek do CHC1₃ se opakoval třikrát. Poté se sraženina postupně suspendovala v 80%, 80% a absolutním 2-propanolu (80 cm³) za užití dispergačního míchadla s následným odstředě50 ním (6500 otáček/min; 20 min). Výsledný ester se sušil při 50 °C pres noc. Tímto postupem se získalo 0,35 g lehce nažloutlých krystalů schizophylan-hexanoátu.

FTIR (KBr): 2957, 2932, 2874, 1736, 1637, 1450, 1419, 1375 cm

- 19CZ 302856 B6

Příklad 28. Modifikace schizophylanu kyselinou hexanovou

Kyselina hexanová (0,172 cm³; 1,38 mmol) se rozpustila ve 30 cm³ /V,/V-dimethylacetamidu. Za teploty 0 °C se k roztoku přidalo 0,192 cm³ triethylaminu (1,38 mmol) a 0,132 cm³ chlormravenčanu ethylnatého (1,38 mmol). Po 5 min intenzivního míchání se suspenze filtrovala pres fritu č. 3 na schizophylan (0,5 g; 2,78 mmol) v pevném stavu. Reakce běžela po dobu 15 hodin při teplotě 60 °C. Reakční směs se naředila 30 cm³ vody a míchala další 4 hodiny při teplotě místnosti. Produkt se vysrážel přídavkem 150 cm³ absolutního 2-propanolu a vysušil při teplotě 45 °C. Získalo se 0,52 g produktu.

FTIR (KBr): 2926 cm ¹ VÍCH?)™ 1734 cm ‘ v(C=O), 1628 cm ¹ v(C=O), 1628 cm ‘ v(C=O), 1512 cm 1454 cm ¹ %CHi).

Příklad 29. Modifikace schizophylanu kyselinou hexanovou

Schizophylan (0,5 g; 2,78 mmol) se míchal 16 hod. při teplotě 60 °C v 10 cm³ YTV-dimethylacetamidu za vzniku gelu. Kyselina hexanová (0,364 cm³; 2,78 mmol) se rozpustila v 10 cm³ N,Ndimethylacetamidu. Za teploty 0 °C se k jejímu roztoku přidalo 0,405 cm³ triethylaminu (2,91 mmol) a 0,278 cm³ chlormravenčanu ethylnatého (2,91 mmol). Po 5 min intenzivního míchání se suspenze filtrovala přes fritu č. 3 do předem připraveného gelu schizophylanu. Reakce běžela po dobu 5 hodin při teplotě 60 °C. Reakční směs se poté naředila 15 cm³ vody a míchala další hodinu při laboratorní teplotě. Produkt se vysrážel 200 cm³ absolutního 2-propanolu a homogenizoval za použití dispergačního míchadla (13500 otáček/min, maximálně 30 s) a izoloval odstředěním (odstředivka: Beckman J2-21) při 5000 otáček/min po dobu 15 minut. Produkt se promyl 100 cm³ absolutního 2-propanolu a opět izoloval odstředěním a sušil při 50 °C. Získala se 0,49 g produktu.

FTIR (KBr): 2926 cm¹ v^H^, 1734 cm¹ v(C=O), 1628 cm' vtC-O), 1512 cm¹, 1454 cm ¹ tfCHi).

Příklad 30. Modifikace schizophylanu kyselinou palmitovou

Kyselina palmitová 0,356 g; 1,39 mmol) se rozpustila v 15 cm³ jV.Y-dimethylformamidu. Za teploty 0 °C se k roztoku přidalo 0,192 cm³ triethylaminu (1,39 mmol) a 0,132 cm³ chlormravenčanu ethylnatého (1,39 mmol). Po 5 min míchání se suspenze filtrovala přes fritu č. 3 do schizophylanu (0,5 g; 2,78 mmol) rozpuštěného v 15 cm³ XTV-dimethylformamidů. Reakce běžela po dobu 15 hodin při teplotě 60 °C. Reakční směs se naředila 30 cm³ vody a míchala další 2 hodiny. Produkt se vysrážel přídavkem 150 cm³ absolutního 2-propanolu. Získalo se 0,62 g produktu.

FTIR (KBr): 2918 cm ¹ v(CHi)_as, 2851 cm¹ vfCHJ* 1738 cm¹ v(C=O), 1628 cm¹ v(C=O), 1510 cm ^l, 1460 cm ¹ ^CH^, 723 cm ¹ ctfCHi).

Příklad 31. Modifikace schizophylanu kyselinou palmitovou

Schizophylan (0,5 g; 2,78 mmol) se míchal 16 hod. při teplotě 60 °C v 10 cm³ M/V-dimethylacetamidu za vzniku gelu. Kyselina palmitová (0,712 g; 2,78 mmol) se rozpustila v 15 cm N,Ndimethylacetamidu. Za teploty 0 °C se k roztoku přidalo 0,405 cm³ triethylaminu (2,91 mmol) a 0,278 cm³ chlormravenčanu ethylnatého (2,91 mmol). Po 5 min intenzivního míchání se suspenze filtrovala přes fritu č. 3 do předem připraveného gelu. Reakce běžela po dobu 5 hodin při teplotě 60 °C. Reakční směs se poté naředila 15 cm³ vody a míchala další hodinu při teplotě místnosti. Produkt se vysrážel 200 cm³ absolutního 2-propanolu a homogenizoval za použití dispergačního míchadla (13500 otáček/min, maximálně 30 s) a izoloval odstředěním (odstřediv-20CZ 302856 B6 ka: Beckman J2-21) při 5000 otáček/min po dobu 15 minut. Produkt se smíchal s 20 cm³ absolutního 2-propanolu a opět homogenizoval a odstředil. Produkt se sušil při 45 °C. Získalo se 0,67 g produktu.

FTIR (KBr): 2918 cm¹ vfCH^, 2851 cm¹ vfCHz),, 1738 cm ¹ v(C=O), 1628 cm ¹ v(C=O), 1510cm^l, 1469 cm¹ ŮCFFj, 723 cm ' (tfCHJ.

Příklad 32. Modifikace schizophylanu kyselinou palmitovou

Schizophylan (0,5 g; 2,78 mmol) se míchal 16 hod. pri teplotě 60 °C v 10 cm³ V, A-dimethyl acetamidu za přídavku 1 g LiCl. Kyselina palmitová (0,712 g; 2,78 mmol) se rozpustila v 10 cm³ XV-dimethylacetamidu. Za teploty 0 °C se k roztoku přidalo 0,405 cm³ triethylaminu (2,91 mmol) a 0,278 cm³ chlormravenčanu ethylnatého (2,91 mmol). Po 5 min intenzivního míchání se suspenze filtrovala přes fritu č. 3 do předem připraveného gelu. Reakce běžela po dobu 5 hodin pri teplotě 60 °C. Reakční směs se poté naředila 15 cm³ vody a míchala další hodinu pri teplotě místnosti. Produkt se vysrážel 200 cm³ absolutního 2-propanolu a homogenizoval za použití dispergačního míchadla (13500 otáček/min, maximálně 30 s) a izoloval odstředěním (odstředivka: Beckman J2-21) při 5000 otáček/min po dobu 15 minut. Produkt se smíchal s 20 cm³ acetonu a homogenizoval za použití dispergačního míchadla (13500 otáček/min, maximálně 30 s). Po přídavku 100 cm³ absolutního 2-propanolu se opět homogenizoval a odstředil. Produkt se sušil pri 45 °C. Získalo se 0,53 g produktu.

FTIR (KBr): 2918 cm ¹ v(CHz)as, 2851 cm ¹ v(CH^St 1738 cm ¹ v(C=O), 1628 cm ¹ v(C-O), 1510 cm¹, 1460 cm¹ ŮCHy 723 cm ‘ tafCHi).

Příklad 33. Modifikace schizophylanu kyselinou thioglyko lovou

Schizophylan (0,5 g; 2,78 mmol) se míchal 16 hod. při teplotě 60 °C v 10 cm³ MA-dimethylacetamidu za vzniku gelu. Kyselina thioglykolová (0,396 g; 2,78 mmol) se rozpustila v 15 cm³ Α,Α-dimethylacetamidu. Za teploty 0 °C se k roztoku přidalo 0,405 cm³ triethylaminu (2,91 mmol) a 0,278 cm³ chlormravenčanu ethylnatého (2,91 mmol). Po 5 min intenzivního míchání se suspenze filtrovala pres fritu č, 3 do předem připraveného gelu. Reakce běžela po dobu 5 hodin při teplotě 60 °C. Reakční směs se poté naředila 15 cm³ vody a míchala další hodinu při laboratorní teplotě. Produkt se vysrážel 200 cm³ absolutního 2-propanolu a homogenizoval za použití dispergačního míchadla (13500 otáček/min, maximálně 30 s) a odstředěn (odstředivka: Beckman J2-21) při 6500 otáček/min po dobu 15 minut. Produkt byl promyt znovu homogenizován pomocí dispergačního míchadla ve 100 cm³ absolutního 2-propanolu a opět izoloval odstředěním a sušen při 50 °C. Bylo získáno 0,58 g produktu.

FTIR (KBr): 2924 cm ¹ v(CHy,,, 1738 cm ¹ v(C=O), 1701 cm 1620 cm¹ v(C-O), 1508 cm 1460 cm ¹ %CH2)> 723 cm ^/ (otCHJ.

Příklad 34. Modifikace schizophylanu fluorescenční sondou - pyren-1 -karboxylovou kyselinou

Fluorescenční sonda, pyren-l-karboxylová kyselina (0,02 g; Mw = 246,26; CAS 19694-02-1; Sigma-Aldrich), byla rozpuštěna v 10 cm³ acetonu. Za chladu bylo k roztoku přidáno 8,22 mg triethylaminu (0,081 mmol) a 8,81 mg chlormravenčanu ethylnatého (0,081 mmol). Po 10 min aktivace byl tento roztok přidán k čirému gelu tvořeného schizophylanem (1 g; 3,56 mmol) ve 100 cm³ vody o pH 10,0. Reakční směs byla intenzivně míchána po dobu 3 hodin. Výsledný produkt byl vysrážen a několikrát promyt acetonem k odstranění nezreagované fluorescenční sondy. Fluorescenční derivát schizophylanu byt sušen na vzduchu. Derivát vykazuje silnou

-21 CZ 302856 B6 modrou fluorescenci s maximem excitační absorpce při 343 až 361 nm a s maximem emise při 384 až 409 nm.

Příklad 35. Modifikace schizophylanu fluorescenční sondou -4-( nafto 1(1,2-d )(1,2,3 }-tr i azo 1-2yl)benzoovou kyselinou

Fluorescenční sonda, 4-{naftol(l,2-d)(1,2,3)-triazol—2-yl) benzoová kyselina (0,02 g; Mw = 289,29; CAS 635727-98-9; Univerzita Pardubice), byla rozpuštěna v 10 cm³ acetonu. Za chladu bylo k roztoku přidáno 7,00 mg triethylaminu (0,069 mmol) a 7,50 mg chlormravenčanu ethy lnatého (0,069 mmol). Po 10 min aktivace byl tento roztok přidán k čirému gelu tvořeného schizophylanem (1 g; 3,56 mmol) ve 100 cm³ vody o pH 10,0. Reakční směs byla intenzivně míchána po dobu 3 hodin. Výsledný produkt byl vysrážen a několikrát promyt acetonem k odstranění nezreagované fluorescenční sondy. Fluorescenční derivát schizophylanu byl sušen na vzduchu. Derivát vykazuje silnou fluorescenci s maximem excitační absorpce při 345 až 370 nm a s maximem emise při 390 až 400 nm.

Příklad 36. Modifikace schizophylanu fluorescenční sondou -l,2-naftoylenbenzimidazoI-6karboxylovou kyselinou

Fluorescenční sonda, 1,2-naftoylbenzimidazol-6-karboxylová kyselina (0,02 g; Mw = 314,29; CAS 96840-80-1; VÚOS a.s. Pardubice), se rozpustila v 10 cm³ acetonu. Za chladu se k roztoku přidalo 6,44 mg triethylaminu (0,064 mmol) a 6,90 mg chlormravenčanu ethylnatého (0,064 mmol). Po 10 min aktivace se tento roztok přidal k čirému gelu tvořenému schizophylanem (1 g; 3,56 mmol) ve 100 cm³ vody o pH 10,0. Reakční směs se intenzivně míchala po dobu 3 hodin. Výsledný produkt se vy srážel a několikrát promyl acetonem k odstranění nezreagované fluorescenční sondy. Fluorescenční derivát schizophylanu se sušil na vzduchu. Derivát vykazuje silnou fluorescenci s maximem absorpce při 391 až 396 nm a s maximem emise při 495 až 523 nm.

Příklad 37. Modifikace oxycelulózy kyselinou hexanovou

Oxycelulóza ve formě vápenaté soli (0,5 g; 2,56 mmol; CAS 52001-91-9, Aliachem a.s.) se rozpustila za přídavku Ig LiCl v 10 cm³ /V,/V-dimethylacetamidu, a to mícháním nejprve 20 hod. pří 60 °C a pak 2 hod. při 100 °C. Ke směsi se přidalo 50 cm³ absolutního ethanolu, a po rozmíchání se oddestiloval ve formě azeotropu s vodou. K takto připravenému gelu se přikape aktivovaná kyselina hexanová (0,356 cm³; 2,85 mol). Aktivace probíhala v 10 cm³ /V,/V-dÍmethylacetamidu pří teplotě 0 °C přídavkem 0,419 cm³ triethylaminu (3,24 mmol) a 0,294 cm³ chlormravenčanu ethylnatého (3,24 mmol). Vlastní modifikační reakce probíhala při teplotě 65 °C po dobu 5 hodin. Směs se posléze naředila 30 cm³ vody a vy srážela přídavkem 200 cm³ absolutního 2propanolu, homogenizovala za použití dispergačního míchadla (13500 otáček/min, maximálně 30 s) a odstředila (odstředivka: Beckman J2-21) pří 6500 otáček/min po dobu 15 minut. Produkt se znovu homogenizoval pomocí dispergačního míchadla v 100 cm³ absolutního 2-propanolu a izoloval odstředěním a sušil při 50 °C. Získalo se 0,45 g produktu.

FTIR (KBr): 2923 cm¹ 1738 cm¹ v(C=O) esteru, 1612 cm¹ v(C=O) karboxylu,

1420 cm

Příklad 38. Modifikace alginátu sodného kyselinou hexanovou

Kyselina alginová ve formě sodné soli (0,5 g; 2,58 mmol; CAS 9005-38-3, Sigma-Aldrich) se míchala spolu s 1 g LÍCI v 5 cm³ ΛζΑ-dimethylacetamidu, a to mícháním nejprve 20 hod. při

-22CZ 302856 B6 °C a pak 2 hod. při 100 °C. Ke směsi se přidalo 50 cm³ absolutního ethanolu, a po rozmíchání se oddestiloval ve formě azeotropu s vodou. K takto připravenému gelu se prikape aktivovaná kyselina hexanová (0,356 cm³; 2,85 mol). Aktivace probíhala v 10 cm³ AŮV-dimethylacetamidu při teplotě 0 °C přídavkem 0,419 cm³ triethylaminu (3,24 mmol) a 0,294 cm³ chlormravenčanu ethylnatého (3,24 mmol). Vlastní modifikační reakce probíhala při teplotě 65 °C po dobu 7 hodin. Směs se posléze naředila 50 cm³ vody a vy srážela přídavkem 200 cm³ absolutního 2propanolu, homogenizovala za použití dispergačního míchadla (13500 otáček/min, maximálně 30 s) a odstředila (odstředivka: Beckman J2-21) při 6500 otáček/min po dobu 15 minut. Produkt se znovu homogenizoval pomocí dispergačního míchadla v 100 cm absolutního 2-propanolu a izoloval odstředěním a sušil při 50 °C. Získalo se 0,48 g produktu.

FTIR (KBr): 2923 cm¹ vfCHfas, 1/40 cm ' v(C-O) esteru, 1612 cm ¹ v(C=O) karboxylu, 1420 cm¹.

Claims (11)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob přípravy derivátů polysacharidů, vyznačující se tím, že polysacharid reaguje v prostředí organického rozpouštědla nebo směsi vody a organického rozpouštědla při pH
2. 2 až 11 a teplotě 0 °C až 150 °C se směsným anhydridem obecného vzorce I (R*-C(=O)OC(=O)OR) (I), připraveným v prostředí organického rozpouštědla za působení chlormravenčanu alkylnatého obecného vzorce II (C1C(=O)OR) (II), při teplotě -15 °C až +15 °C po dobu 0 až 20 min. na sloučeninu obecného vzorce 111 R'-COOH (III), v přítomnosti báze za vzniku sloučeniny obecného vzorce IV polysacharid-X-C(=O)R' (IV), kde R¹ je zbytek alifatického, cykloalifatického, aromatického či heterocyklického charakteru s počtem uhlíků C_t až Cj₈ obsahující jednu nebo více karboxylových skupin,

   R je methyl až oktadecy 1,

   X = NH, O, COO, S, a kde báze označuje organické báze jako trialkylamin Y₃N nebo pyridin, kde

   Y = C, až Ciď2. Způsob přípravy podle nároku l, vyznačující se tím, že polysacharidy zahrnují chitosan, chitin, glukan, kyselinu hyaluronovou, kyselinu alginovou a oxycelulózu.

   -23 CZ 302856 B6
3. 3. Způsob přípravy podle nároku 2, vyznačující se tím, že chitosan má molekulovou hmotnost v rozsahu 1.10³ až 5.10⁵ g-mol·¹ a je ve formě acetylované, kde stupeň acetylace dosahuje 0 až 100 %, neboje ve formě hydrochloridu.
4. 4. Způsob přípravy podle nároku 2, vyznačující se tím, že kyselina hyaluronová má molekulovou hmotnost v rozsahu 1.10³ až 5.10⁶ g.mor¹ a je ve formě volné kyseliny, nebo ve formě stabilní farmaceuticky přijatelné soli, nebo ve formě tetrabutylamonné soli HA-TBA resp. HA-TBA-TBA.
5. 5. Způsob přípravy podle nároku 2, vyznačující se tím, že glukan je specifikován jako β-(IJj-glukan, p-(l,3),(l,6)-D-glukan, p-(l,6)-D-glukan nebo jejich karboxy methy 1deriváty s molekulovou hmotností v rozsahu 1.10³ až 1.10⁶ g.mol^-1.
6. 6. Způsob přípravy podle nároku 2, vyznačující se tím, že oxycelulóza je ve formě volné kyseliny nebo ve formě stabilní farmako logicky přijatelné soli.
7. 7. Způsob přípravy podle nároku 2, vyznačující se tím, že kyselina alginová podle nároku 2 je ve formě volné kyseliny nebo ve formě stabilní farmakologicky přijatelné soli.
8. 8. Způsob přípravy podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že reakce polysacharídů se směsným anhydridem probíhá v přítomnosti přídavných látek vybraných ze skupiny zahrnující kation ické a neionogenní tenzidy a soli LiCl, tetrabutylamonium bromid a tetrabutylamonium hydrogensulfát.
9. 9. Způsob přípravy podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že koncentrace polysacharídů je 0,01 až 10 hmotn. % celkové hmotnosti směsi.
10. 10. Způsob přípravy podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že reakce chlormraveněanu alkylnatého obecného vzorce II se sloučeninou obecného vzorce 111 probíhá v prostředí organického, polárního, aprotického, s vodou mísitelného rozpouštědla,
11. 11. Způsob přípravy podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že organické rozpouštědlo je vybráno ze skupiny zahrnující aceton, N,N-á i methyl formamid, N,Ndimethylacetamid, jV-methylpyrrolidon, dimethylsulfoxid, 1,4-dioxan, pyridin, l-methyl-2pyrrolidon a tetrahydrofuran.