CZ30141U1

CZ30141U1 - Device to enrich selected DNA fragment

Info

Publication number: CZ30141U1
Application number: CZ2016-32714U
Authority: CZ
Inventors: Marek Minárik
Original assignee: Genomac výzkumný ústav, s.r.o.
Priority date: 2016-08-17
Filing date: 2016-08-17
Publication date: 2016-12-13

Description

Oblast technikyTechnical field

Analytická chemie, molekulární biologie, genetika, lékařská diagnostikaAnalytical chemistry, molecular biology, genetics, medical diagnostics

Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Analýza DNA sekvence, jak na úrovni celého genomu, tak na úrovni vybraných DNA úseků je v současnosti rutinní technikou. Separační techniky poskytují velké možnosti pro separace DNA a RNA a analýzu genetického materiálu a odpovídajících transkripčních produktů. Kapilární elektroforéza (CE) je stále klíčovou separační metodou pro analýzu DNA. Separace v CE je typicky prováděna v křemenných kapilárách o vnitřním průměru 50 až 100 mikrometrů v separační matrici obsahující kromě pufrováného elektrolytu i viskózní hydrofilní polymer, který umožňuje rozlišení jednotlivých fragmentů DNA. Separace probíhá při vysokém separačním elektrickém poli 100 až 1000 V/cm. Plně automatizovaná instrumentace může být vybavena až 384 separačními kapilárami umožňujícími paralelní separaci více než 300 vzorků. V kombinaci s vysoce citlivou fluorescenční detekcí (nejčastěji laserem indukovanou, s limitem detekce několika molekul), jsou tyto přístroje schopné analyzovat vzorky dávkované z mikrolitrových objemů se skutečnou spotřebou odpovídající několika nanolitrům. Zásluhou těchto kapilárních sekvenátorů byl úspěšně ukončen projekt sekvenování lidského genomu. Ve vývoji jsou i mikrofabrikované systémy umožňující dosažení vyšší rychlosti separace, neb další zvýšení počtu separovaných vzorků. Integrace ve formě “čipu” navíc principiálně umožňuje spojení řady dalších jednotkových operací, jako např. DNA štěpení, PCR amplifikace, ligázové reakce, atd. Kity pro některé z těchto aplikací spolu s čipy na jednorázové použití jsou dnes již komerčně dostupné.DNA sequence analysis, both at the whole genome level and at the level of selected DNA regions, is currently a routine technique. Separation techniques provide great opportunities for DNA and RNA separation and analysis of genetic material and corresponding transcription products. Capillary electrophoresis (CE) is still a key separation method for DNA analysis. Separation in CE is typically carried out in quartz capillaries having an internal diameter of 50 to 100 microns in a separation matrix containing, in addition to a buffered electrolyte, a viscous hydrophilic polymer that allows different DNA fragments to be distinguished. The separation takes place at a high electrical separation field of 100 to 1000 V / cm. Fully automated instrumentation can be equipped with up to 384 separation capillaries allowing parallel separation of more than 300 samples. Combined with highly sensitive fluorescence detection (most often laser-induced, with a limit of detection of several molecules), these instruments are able to analyze samples dosed from microliter volumes with actual consumption corresponding to several nanoliters. Due to these capillary sequencers, the human genome sequencing project was successfully completed. Microfabricated systems are also under development to achieve a higher separation rate, or further increase the number of samples separated. In addition, integration in the form of a "chip" in principle allows for the integration of a number of other unit operations, such as DNA digestion, PCR amplification, ligase reactions, etc. Kits for some of these applications together with disposable chips are now commercially available.

V případě analýzy izolované genomické DNA není variace v koncentracích jednotlivých fragmentů obvykle důležitá a detekční signál se obvykle nemění více než v rozsahu jednoho až dvou řádů. Nejmodemější současné metody (Next Gen Sequencing) tak mohou zodpovědět většinu otázek ohledně nukleotidových sekvencí, jako jsou např. mutace nebo polymorfizmy, s relativně nízkými náklady. V řadě případů je však třeba analyzovat stopová množství určité oligonukleotidové sekvence ve vzorku obsahujícím sto a vícenásobné množství obdobných sekvencí. Jde například o situaci, kdy je potřeba detekovat fragmenty DNA nesoucí mutaci v přebytku fragmentů nemutovaných (pocházejících ze zdravé DNA). Konkrétní aplikací je například diagnostika nádorových onemocnění, kdy časný záchyt konkrétní DNA mutace může detekovat vznikající onemocnění. Neméně důležitou aplikací je v poslední době velmi studovaná technologie tzv. tekuté biopsie, kdy jsou detekovány jednotlivé mutované fragmenty DNA kolující v periferním krevním oběhu pacienty bez nutnosti invazivního bioptování vnitřních orgánů.In the case of isolated genomic DNA analysis, variation in the concentration of individual fragments is usually not important and the detection signal usually does not change more than one to two orders of magnitude. Thus, the most advanced Next Gen Sequencing methods can answer most questions about nucleotide sequences, such as mutations or polymorphisms, at relatively low cost. In many cases, however, it is necessary to analyze trace amounts of a particular oligonucleotide sequence in a sample containing one hundred and multiple similar sequences. For example, it is necessary to detect DNA fragments carrying a mutation in an excess of non-mutated (derived from healthy DNA) fragments. A particular application is, for example, the diagnosis of cancer, where early detection of a particular DNA mutation can detect emerging diseases. Equally important application is the recently studied technology of the so-called liquid biopsy, where individual mutated DNA fragments circulating in peripheral blood circulation are detected by patients without the necessity of invasive biopsy of internal organs.

Ve výše uvedených případech jsou však běžné analytické metody, typicky vykazující citlivost záchytu mutantní DNA až při jejím minimálně 10% zastoupení, nepoužitelné a z relativně nenákladné analýzy se stává nákladný analytický problém vyžadující přístroje zahrnující selektivní obohacení mutovaného DNA fragmentu.In the above cases, however, conventional analytical methods, typically exhibiting a mutant DNA capture sensitivity of up to at least 10%, are unusable and the relatively inexpensive analysis becomes a costly analytical problem requiring instruments involving selective enrichment of the mutated DNA fragment.

Podstata technického řešeníThe essence of the technical solution

Cíle technického řešení obohacení je dosaženo použitím kolonové elektroforetické separace vzorku obsahujícího DNA fragmenty s následnou frakční kolekcí vybraných separovaných zón DNA. Nejvhodnější provedení kolonové elektroforetické separace je s využitím kapiláry o vnitřním průměru 50 až 300 mikrometrů a délce 100 až 1000 mm, naplněné polymemí separační matricí, jako např. roztoky lineárního polyaklrylamidu, nebo jeho derivátů ve vhodném elektroforetickém pufru. Vhodné jsou všechny elektroforetické pufry běžně používané v DNA elektroforetických separacích, včetně TRIS-borátového nebo TRIS/TAPS pufru. Na místo lineárního polymeru lze použít i zesíťovaný gel, nebo naopak jen pufr bez přídavku polymeru. Vhodná intenzita separačního elektrického pole se pohybuje v rozmezí 10 až 1000 V/cm. Pro správnou funkci obohacení je nezbytné splnit několik podmínek, shrnutých v následujících bodech.The aim of the technical enrichment solution is achieved by using column electrophoretic separation of a sample containing DNA fragments followed by fractional collection of selected separated DNA zones. The most preferred embodiment of the column electrophoretic separation is using a capillary having an internal diameter of 50 to 300 microns and a length of 100 to 1000 mm, filled with a polymer separation matrix, such as solutions of linear polyaclrylamide or derivatives thereof in a suitable electrophoretic buffer. Suitable are all electrophoretic buffers commonly used in DNA electrophoretic separations, including TRIS-borate or TRIS / TAPS buffer. Instead of a linear polymer, a cross-linked gel can also be used, or a buffer without polymer addition. A suitable intensity of the separation electric field is in the range of 10 to 1000 V / cm. For the enrichment to function properly, it is necessary to fulfill several conditions, summarized in the following points.

-1 CZ 30141 Ul-1 CZ 30141 Ul

Vzorek musí obsahovat požadované dvouřetězcové DNA fragmenty ve formě heteroduplexů jejichž tepelná stabilita (teplota tání) se liší od tepelné stability odpovídajících DNA homoduplexů. Příprava vzorku před obohacením tak musí zahrnovat zahřátí a ochlazení, kdy se z homoduplexů normální (wild type) DNA a DNA s mutací vytvoří heteroduplexy. Obsahuj e-li vzorek nadbytek normální DNA, bude po tomto kroku statisticky všechna DNA s mutacemi převedena na heteroduplexy. V případu vzorku připraveného PCR amplifikaci jsou již heteroduplexy přítomny.The sample must contain the desired double-stranded DNA fragments in the form of heteroduplexes whose thermal stability (melting point) differs from the thermal stability of the corresponding DNA homoduplexes. Thus, sample preparation prior to enrichment must include heating and cooling to produce heteroduplexes from wild-type and mutated homoduplexes. If the sample contains an excess of normal DNA, all DNA with mutations will be statistically converted to heteroduplexes after this step. In the case of a sample prepared by PCR amplification, heteroduplexes are already present.

Po nadávkování do separační kolony musí být separované zóny během elektroforetické migrace po určitou dobu vystaveny zvýšené teplotě, blízké teplotě tání DNA heteroduplexů. To zaručí částečné rozvolnění DNA heteroduplexů a jejich elektroforetickou separaci od normální DNA.After loading into the separation column, the separated zones must be exposed to an elevated temperature close to the melting point of the heteroduplex DNA for some time during electrophoretic migration. This guarantees a partial release of the DNA heteroduplexes and their electrophoretic separation from normal DNA.

V ověřeném řešení je tato podmínka zajištěna umístěním části separační kolony (10 až 80 %) ve vyhřívaném bloku s kontrolovanou teplotou.In a proven solution, this condition is ensured by placing a portion of the separation column (10 to 80%) in a heated temperature-controlled block.

Separované zóny jsou po průchodu vyhřívané části separační kolony detekovány pomocí UV nebo fluorescenčního detektoru. Detekční signál je využit k iniciaci sbírání separovaných frakcí. K tomu slouží sběrač frakcí umístěný na konci separační kolony založený na obtékání výstupu separační kolony proudem kolekční kapaliny (nejlépe separačního pufru) a následným zachytáváním kolekční kapaliny do sběrných nádobek v předem definovaných intervalech. Při objemovém průtoku kolekční kapaliny 1 až 500 mikrolitrů za minutu jsou výsledné objemy sebraných frakcí v rozsahu 0,5 až 50 mikrolitrů a jsou přímo použitelné pro další analýzu (DNA sekvenování) nebo PCR amplifikaci. Podle délky časových intervalů frakční kolekce lze dosáhnout toho, že jednotlivé frakce obsahují DNA z několika DNA separovaných zón (frakční kolekce s nízkým rozlišením), nebo je DNA z jedné migrující DNA zóny rozdělena v několika frakcích (frakční kolekce s vysokým rozlišením). Kolekce s nízkým rozlišením je vhodná k obohacení zón mutovaných DNA heteroduplexů a jejich oddělení od normální DNA. Kolekce s vysokým rozlišením je pak vhodná k přípravě čistějších frakcí nebo frakcí obsahujících DNA různých heteroduplexů. Objasnění výkresůThe separated zones are detected by the UV or fluorescent detector after passing through the heated portion of the separation column. The detection signal is used to initiate collection of the separated fractions. For this purpose, a fraction collector located at the end of the separation column is based on bypassing the outlet of the separation column with a collection liquid stream (preferably separation buffer) and subsequently collecting the collection liquid into the collection containers at predefined intervals. At a collection fluid volume flow rate of 1 to 500 microliters per minute, the resulting volumes of collected fractions are in the range of 0.5 to 50 microliters and are directly applicable for further analysis (DNA sequencing) or PCR amplification. Depending on the length of time of the fraction collection, it is possible for individual fractions to contain DNA from several DNA separated zones (low resolution fraction collection), or DNA from one migrating DNA zone is divided into several fractions (high resolution fraction collection). The low resolution collection is suitable for enriching the mutated DNA zones of heteroduplexes and separating them from normal DNA. The high resolution collection is then suitable for the preparation of purer or DNA-containing fractions of different heteroduplexes. Clarification of drawings

Technické řešení podle navrhovaného užitného vzoru popisuje schéma na Obr. 1 a 2.The technical solution according to the proposed utility model is described in FIG. 1 and 2.

V tomto zařízení je separační kapilára i umístěna mezi dávkovacím blokem 2 a sběračem frakcíIn this apparatus, the separation capillary 1 is positioned between the dosing block 2 and the fraction collector

3. Část separační kapiláry prochází termostatovaným blokem 4. Po nadávkování vzorku a zapojení zdroje vysokého napětí 5 probíhá elektroforetická separace DNA. Zóny jsou separovány podle délky v nich obsažených DNA fragmentů. Po dosažení termostatovaného bloku dochází ke zpomalení migrace heteroduplexních DNA fragmentů a jejich separaci od stejně dlouhých fragmentů normální DNA. Jednotlivé zóny jsou následně detekovány detektorem 6, jehož signál je monitorován pomocí řídící jednotky (počítač) 7. Řídící jednotka 7 může být dále využita i pro řízení termostatovaného bloku 4 a zdroje vysokého napětí 5, který dodává separační elektrický proud do dávkovacího bloku 2 a sběrače frakcí 3 pomocí elektrod 8.3. Part of the separation capillary passes through a thermostatic block 4. After the sample is dosed and the high voltage source 5 is connected, electrophoretic DNA separation takes place. The zones are separated according to the length of the DNA fragments contained therein. Upon reaching the thermostatic block, the migration of heteroduplex DNA fragments is slowed and separated from equally long fragments of normal DNA. The individual zones are then detected by a detector 6 whose signal is monitored by the control unit (computer) 7. The control unit 7 can furthermore be used to control the thermostatic block 4 and the high-voltage source 5, which supplies separation electric current to the dosing block 2 and the collector. fraction 3 by electrodes 8.

Detail jednoho z možných uspořádání sběrače frakcí je na obrázku 2. V tomto vyobrazení je výstup separační kapiláry 1 umístěn v kapilárním přívodu kolekční kapaliny 9. V tomto přívodu je umístěna i elektroda 8 zdroje stejnosměrného vysokého napětí 5. Kolekční kapalina 10, dodávaná například zvýše položeného zásobníku (nevyznačeno), unáší zóny DNA H, migrující z výstupu separační kapiláry I, do sběrné nádobky 12.A detail of one possible fraction collector arrangement is shown in Figure 2. In this illustration, the outlet of the separation capillary 1 is located in the capillary supply of the collecting fluid 9. The electrode 8 of the DC medium voltage 5 is also located there. The reservoir (not marked) carries the DNA zones H migrating from the outlet of the separation capillary I to the collecting vessel 12.

Příklady uskutečnění technického řešeníExamples of technical solutions

Příklad využití uskutečněného technického řešení je dokumentován na Obr. 3. Horní záznam (Obr. 3A) ukazuje výsledek kapilámě-elektroforetické separace směsi fragmentů DNA s použitím navrhovaného zařízení. Směs DNA fragmentů, z nichž jeden obsahuje hledanou mutaci, byla nadávkována napětím 3 000 V po dobu 20 sekund na separační kapiláru (70 pm vnitřní průměr, celková délka 51 cm, délka od nástřiku k detektoru 46 cm) termostatovanou na 60 stupňů Celsia. Ve výsledném záznamu separace, která, probíhala při napětí 12 000 V, je fragment obsahující hledanou mutaci označený M, stejný fragment, který danou mutaci nemá jako W. Dolní záznam (Obr. 3B) ukazuje výsledek shodné separace této směsi, kdy bylo provedeno obohacení mutant-2CZ 30141 Ul ního fragmentu jeho záchytem a oddělením od ostatních fragmentů. Z tohoto záznamu je zřejmé výrazné zvýšení koncentrace mutovaného fragmentu oproti fragmentu nemutovanému o zhruba 100 % (dvojnásobné zvětšení plochy píku M oproti ploše píku W).An example of utilization of the implemented technical solution is documented in FIG. 3. The upper plot (Fig. 3A) shows the result of capillary-electrophoretic separation of a mixture of DNA fragments using the proposed device. A mixture of DNA fragments, one of which contains the mutation of interest, was dosed at 3000 volts for 20 seconds on a separation capillary (70 µm ID, total length 51 cm, length from injection to detector 46 cm) thermostated at 60 degrees Celsius. In the resulting separation record, which occurred at 12,000 volts, the fragment containing the mutation of interest is designated M, the same fragment that does not have the mutation as W. The lower record (Fig. 3B) shows the result of the same separation of this mixture when enrichment was performed. mutant-2EN 30141 The lower fragment by its capture and separation from the other fragments. This record shows a marked increase in the concentration of the mutated fragment relative to the non-mutated fragment by approximately 100% (a two-fold increase in the area of peak M over the area of peak W).

Průmyslová využitelnostIndustrial applicability

Popsané zařízení pro detekci a obohacení DNA s mutací je využitelné všude tam, kde je třeba obohatit, nebo izolovat čisté frakce malého množství DNA s mutacemi, přítomné ve velkém nadbytku normální DNA. Tato potřeba je nej častější pro využití v lékařském výzkumu a DNA diagnostice. Další použití je možné také pro detekci malých koncentrací patogenů při bakteriální kontaminaci, nebo zneužití v rámci bioterorizmu.The described mutation DNA detection and enrichment device is useful wherever it is desired to enrich or isolate pure fractions of small amounts of mutant DNA present in a large excess of normal DNA. This need is most common for use in medical research and DNA diagnostics. Further use is also possible for detecting small concentrations of pathogens in bacterial contamination or misuse in bioterrorism.

NÁROKY NA OCHRANUPROTECTION REQUIREMENTS

Claims

A DNA detection and enrichment device with a mutation consisting of a separation capillary (1), a dosing block (2), a high voltage source (5) and a capillary detector (6), characterized in that the outlet end of the separation capillary (1) opens in the fraction collector (3).

Device according to claim 1, characterized in that the separation capillary (1) passes through a thermostatic block (4) at a temperature adjustable according to the mutation in the range of 50 to 100 degrees Celsius to separate the mutated and unmutated DNA fractions.

Device according to claim 2, characterized in that the fraction collector (3) is formed by a capillary inlet of the collecting fluid (9) adjusted to bypass the outlet end of the separation capillary (13) with an adjustable flow rate of 1 to 500 microlitres per minute. separated DNA fractions (11) migrating from the outlet end of the separation capillary to the collection vessel (12).

Apparatus according to claim 3, characterized in that a detector (6) is arranged on the separation capillary (1) between the thermostatic block (4) and the fraction collector (3) to detect DNA inside the separation capillary (1).