CZ289811B6

CZ289811B6 - Kosmetický prostředek

Info

Publication number: CZ289811B6
Application number: CZ19991086A
Authority: CZ
Inventors: Stewart Paton Granger; Anthony Vincent Rawlings; Ian Richard Scott
Original assignee: Unilever N. V.
Priority date: 1996-09-27
Filing date: 1997-09-18
Publication date: 2002-04-17
Also published as: CZ108699A3; RU2176498C2; US5747051A; JP3667771B2; DE69726313T2; WO1998013017A1; JP2000504036A; PL188576B1; AR009097A1; AU4555497A; DE69726313D1; PL332542A1; ZA978656B; CN1104889C; ES2210583T3; EP0955996B1; BR9712136B1; CA2266927C; CN1237899A; AU715132B2

Abstract

Podstatou °e en je zji t n , e amid hydromastn kyseliny v kombinaci s retinolem nebo retinylov²m esterem p sob synergickou inhibici diferenciace keratinocyt . Kosmetick · inky retinolu nebo retinylov²ch ester v kombinaci s amidy hydroxymastn²ch kyselin byly analogick s p soben m kyseliny retinov .\

Description

Kosmetický prostředek

Oblast techniky

Vynález se týká prostředků k péči o kůži obsahujících amid a retinol nebo retinylový ester a kosmetických metod zahrnujících aplikaci těchto prostředků na kůži.

Dosavadní stav techniky

Retinol (vitamín A) je endogenní sloučeniny, která se přirozeně vyskytuje v lidském těle a je nezbytná pro normální diferenciaci epiteliálních buněk. Deriváty přirozeného a syntetického vitamínu A byly široce používány při léčení různých kožních onemocnění a byly používány také jako prostředky pro reparaci nebo obnovu kůže. Kyselina retinová byla používána pro léčení řady stavů kůže, například akné, vrásek, lupénky, stařeckých skvrn a depigmentace (viz např. Vahlquist, A. a další, J. Invest. Dermatol., díl 94, Holland, D. B. a Cunliffe, W. J. (1990), str. 496 - 498; Ellis, C. N. a další, „Pharmacology of Retinols in Skin“, Vasel, Karger, Díl 3, (1989), str. 249-252; Lowe, N. J. a další, „Pharmacology of Retinols in Skin“, díl 3, (1989), str. 240 - 248; PCT patentová přihláška WO 93/19743.

Předpokládá se, že použití retinolu nebo retinylových esterů by bylo výhodnější než použití kyseliny retinové. Retinol je endogenní sloučenina. Estery retinolu hydrolyzují in vivo za vytvoření retinolu. Retinol a retinylové estery se pokládají za bezpečnější než kyselina retinová. Bohužel jsou však retinol a retinylové estery při léčení onemocnění kůže méně účinné než kyselina retinová.

Předkládaný vynález je založen zčásti na objevu, že kombinace retinolu nebo retinylových esterů s amidy hydroxymastných kyselin poskytuje synergickou inhibici diferenciace keratinocytů. Účinky amidů hydroxymastných kyselin spojených s retinolem nebo retinylovými estery byly analogické jako účinky kyseliny retinové. Směs amidu hydroxymastné kyseliny s retinolem nebo retinylovými estery tedy napodobuje kyselinu retinovou, aleje snadněji použitelná a bezpečnější než kyselina retinová.

Thomfeldt (patent US 5 057 501) popisuje způsob léčení pupenco-šupinových a ekzematózních onemocnění prostředkem obsahujícím seskviterpenovou sloučeninu a od přibližně 0,025 % do přibližně 35 % monokarboxylové mastné kyseliny, jejího esteru nebo amidu. Prostředky mohou také obsahovat retinoid: Thomfeldt uvádí, že některé retinoidy, totiž izotretinoin, tretinoin, etretin (všechny stereoformy kyseliny retinové) a etretinát (ester kyseliny trimethoxyfenylretinové) byly účinné proti pupenco-šupinovým onemocněním. PCT přihláška WO 93 25177 (Procter and Gambie) popisuje prostředky určené k místnímu použití na kůži, které obsahují specifický typ acyklického karboxamidového chladivá a mohou obsahovat retinoidy jako kyselinu retinovou a její deriváty (například cis a trans). PCT přihláška WO 94 03156 (Rhone Poulenc) popisuje místní prostředek obsahující kyselinu linolovou nebo její derivát jako aktivní složku pro léčení a prevence nečisté kůže (například kůže postižené uhry, pupínky nebo komedony); prostředek může také obsahovat 0,025 až 0,1 % hmotnostních tretinoinu. Evropská patentová přihláška EP 0 388 275 (Pierre Fabre Cosmetique) popisuje prostředky pro léčení mazotoku obsahující alkylkarboxamid a sůl zinku, kterou může být retinoát zinečnatý.

Klaus a další (patent US 5 216 148) popisuje použití specifických komplexních karboxamidů pro léčení a prevenci neoplazmů, dermatóz a stárnutí pokožky. Van Scott a další (patent US 4 380 549) a Yu a další (US 4 363 815) popisují léčení akné, suché, vločkovité a šupinaté pokožky hydroxykyselinou nebo jejím amidem. EP 0 582 458 popisuje použití N,N-(l-4C-alkyl)lauramidu. EP 0 559 304 popisuje použití amidu obsahujícího hydroxykarbylový řetězec s alespoň 25 atomy uhlíku jako prostředku pro zvláčnění kůže. Beauquey

-1 CZ 289811 B6 a další (patent US 5 308 551) popisuje prostředek pro čištění a kondicionování kůže, který mezi dalšími složkami obsahuje l-4C-alkanolamid 8-16C-mastné kyseliny. GB 1 126 289 (Hoffman-LaRoche) popisuje zásobní vitamínový preparát obsahující vitamín A ve formě alkoholu nebo esteru, emulgátor a rozpouštědlo, které je zvoleno z alkoholu nebo dialkylamidu monokarboxylové kyseliny (například N,N-diethylacetamid, Ν,Ν-dimethylacetamid nebo Ν,Ν-dimethylformamid). Vitamínový preparát má velmi vysoký obsah vitamínů, například minimální koncentrace je 250 000 I. U. vitamínu A/ml. Dále amidy popisované v přihlášce GB 1 126 289 nezahrnují ani nezmiňují melinamid.

Dřívější evropská patentová přihláška EP 0 742 005 (Unilever; priorita 8. května 1995), zveřejněná 13. 11. 1996 (po datu priority předkládané přihlášky) popisuje kombinace amidů mastných kyselin s retinolem nebo retinylovými estery. EP 0 742 005 však neuvádí použití amidů hydroxymastných kyselin.

Výše uvedený stav techniky nepopisuje prostředky pro kondicionování kůže založené na synergických kombinacích amidů hydroxymastných kyselin s retinolem nebo retinylovým esterem. Žádný z dokumentů dosavadního stavu techniky uvedených výše neukazuje na nutnost účinné alternativy kyseliny retinové.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález zahrnuje jako jednu část prostředek pro kondicionování kůže obsahující:

(a) od 0,001 do 10 % retinoidu zvoleného ze skupiny retinolu a retinylového esteru;

(b) od 0,0001 do 50 % amidu hydroxymastné kyseliny; a (c) kosmeticky přijatelné vehikulum.

Vynález také poskytuje kosmetickou metodu kondicionování kůže, která zahrnuje místní aplikaci předkládaného prostředku na kůži. Dále poskytuje kosmetickou metodu napodobující účinek kyseliny retinové na kůži, která zahrnuje místní aplikaci prostředku podle vynálezu na kůži.

Termín „kondicionování“ jak se zde používá znamená prevenci a léčení jednoho nebo více z následujících stavů: suchá kůže, vlivem světla poškozená kůže, objevení se vrásek, stařecké skvrny, zestárlá kůže, akné, lupénka, atopická dermatóza. Prostředky jsou také použitelné pro dosažení zmírnění a/nebo řízení vylučování mazu a/nebo pro zvýšení pružnosti stratům comeum a obecně pro zvýšení kvality pokožky. Prostředky mohou být používány pro zlepšení odlupování kůže a buněčné proliferace.

Přítomnost amidu hydroxymastné kyseliny v produktu podle vynálezu podstatně zlepšuje účinek retinolu nebo retinylového esteru, tj. amid hydroxymastné kyseliny podstatně zlepšuje schopnost retinolu nebo retinylového esteru ovlivňovat proliferaci buněk. Amid hydroxymastné kyseliny nemá žádný nebo má pouze malý vliv na zlepšení prospěšných účinků na kůži, pokud se použije samostatně; podstatného zlepšení prospěšných účinků se dosáhne pouze v případě, že se kombinuje amid hydroxymastné kyseliny s retinolem nebo retinylovým esterem.

Stručně řečeno, předkládaný vynález je založen alespoň z části na objevu synergické interakce mezi retinolem nebo retinylovým esterem a amidem hydroxymastné kyseliny.

Podle předkládaného vynálezu se v důsledku zahrnutí účinného množství amidu hydroxymastné kyseliny do prostředků s obsahem retinolu nebo retinylového esteru podstatně zlepší účinnost prostředků. Alternativně je možno pro dosažení stejného účinku jako u podobného prostředku bez amidu použít nižších koncentrací retinolu nebo retinylového esteru.

-2CZ 289811 B6

Prostředky podle vynálezu obsahují jako první nezbytnou složku sloučeninu zvolenou ze skupiny retinolu, retinylových esterů a jejich směsí.

Termín „retinol“ zahrnuje mj. následující izomery retinolu: all-trans-retinol, 13-cis-retinol, 11-cis-retinol, 9-cis-retinol, 3,4-didehydro-retinol. Výhodné izomery jsou all-trans-retinol, 13-cis-retinol, 3,4-didehydro-retinol a 9-cis-retinol. Nejvýhodnější je all-trans-retinol, v důsledku jeho široké komerční dostupnosti.

Retinylový ester je ester retinolu. Termín „retinol“ byl definován výše. Retinylové estery vhodné pro použití v rámci předkládaného vynálezu jsou C1-C30 estery retinolu, s výhodou Cr-Qo estery a nejvýhodněji C₂, C₃ a Cie estery, protože jsou nejsnáze dostupné. Příklady retinylových esterů zahrnují bez omezení: retinylpalmitát, retinylformiát, retinylacetát, retinylpropionát, retinylbutyrát, retinylvalerát, retinylizovalerát, retinylhexanoát, retinylheptanoát, retinyloktanoát, retinylnonanoát, retinyldekanoát, retinylundekanoát, retinyllaurát, retinyltridekanoát, retinylmyristát, retinylpentadekanoát, retinylheptadekanoát, retinylstearát, retinylizostearát, retinylnonadekanoát, retinylarachidonát, retinylbehenát, retinyllinoleát, retinyloleát, retinyllaktát, retinylglykolát, retinylhydroxykaprylát, retinylhydroxylaurát, retinyltartrát.

Výhodným esterem pro použití v rámci předkládaného vynálezu je retinylpalmitát, retinylacetát a retinylpropionát, protože jsou komerčně nejdostupnější a proto nejlacinější. Retinyllinoleát je výhodný rovněž pro svou účinnost.

Retinoid se používá v prostředku podle vynálezu v množství od 0,001 do 10 %, s výhodou v množství od 0,01 do 1 %, nej výhodněji v množství od 0,01 do 0,5 %.

Druhou nezbytnou složkou prostředků podle vynálezu je amid hydroxymastné kyseliny. Amid hydroxymastné kyseliny má následující strukturu:

OH O

I II /Ri

R4-CH-R₃-C-N<· r₂ kde R_b R₂ a R4 jsou vždy nezávisle zvoleny z atomu vodíku a alifatických nasycených nebo nenasycených, přímých nebo rozvětvených uhlovodíkových řetězců, které mohou být hydroxylované, obsahujících 1 až 20 atomů uhlíku;

R₃ je —(CH₂)_n, kde n je celé číslo od 0 do 18;

Ri, R₂ a R4 obsahují s výhodou vždy nezávisle od 2 do 20 atomů uhlíku, výhodněji od 2 do 15 atomů uhlíku a nejvýhodněji od 3 do 15 atomů uhlíku.

Amidem hydroxykyseliny je s výhodou amid a- nebo β-hydroxykyseliny, tj. n je 0 nebo 1.

Nejvýhodnější amidy hydroxymastných kyselin pro použití v prostředcích podle vynálezu jsou: laktamid-monoethanolamid, amid Ci₃-|3-hydroxykyseliny (2-hydroxy-Ci₃-amid), N-hydroxyethyl-2-hydroxy-Ci₆amid, 12-hydroxy-N-(2-hydroxyethyl)oktadekanamid a monoethanolamid ricinového oleje.

Amid je přítomen v prostředcích podle vynálezu v množství od 0,0001 do 50 %, s výhodou od 0,01 do 10 %, nej výhodněji od 0,1 do 5 %.

-3CZ 289811 B6

Kosmeticky přijatelné vehikulum

Prostředek podle vynálezu také obsahuje kosmeticky přijatelné vehikulum ve funkci diluentu, 5 disperzního prostředí nebo nosiče pro retinol a/nebo retinylester a amid hydroxymastné kyseliny v prostředku, aby byla umožněna distribuce těchto látek při aplikaci prostředku na kůži.

Vehikuly jinými než voda nebo použitými navíc kvodě mohou být kapalné nebo pevné zvláčňující prostředky, rozpouštědla, zvlhčovadla, zahušťující činidla a pudry. Zvláště výhodným 10 nevodným nosičem je polydimethylsiloxan a/nebo polydimethylfenylsiloxan. Silikony podle vynálezu mohou být sloučeniny sviskozitami kdekoliv v rozmezí od 10⁵ do 10m²s^_1 při teplotě 25 °C. Zvláště žádoucí jsou směsi silikonů s nízkou a vysokou viskozitou. Tyto silikony jsou dostupné u firmy Generál Electric Company pod obchodními známkami Vicasil, SE a SF a u firmy Dow Coming Company jako výrobky řady 200 až 550 (200 a 550 Series). Množství 15 silikonu, který může být použit v prostředcích podle vynálezu může být libovolné od 5 do 95 %, s výhodou od 25 do 90 % hmotnostních prostředku.

Kosmeticky přijatelné vehikulum bude obvykle tvořit od 5 do 99,9 %, s výhodou od 25 do 80 % hmotnostních prostředku, a může v nepřítomnosti jiných kosmetických pomocných látek 20 doplňovat prostředek do 100 %. S výhodou je vehikulum alespoň 50 % hmotnostních, výhodněji alespoň 80 % hmotnostních vody, počítáno na hmotnost vehikula. Voda s výhodou tvoří alespoň 50 % hmotnostních prostředku podle vynálezu, nejvýhodněji od 60 do 80 % hmotnostních prostředku.

Případné látky s prospěšným účinkem na kůži a kosmetické pomocné látky

Pro vytvoření buď emulze typu voda v oleji nebo olej ve vodě může být přítomen olej nebo olejovitý materiál spolu s emulgátorem, v závislosti na průměrné hydrofilně-lipofilní rovnováze (HLB) použitého emulgátoru.

Prostředky podle vynálezu s výhodou obsahují látky s ochranným účinkem proti slunečnímu záření. Tyto ochranné látky obsahují běžně používané materiály blokující ultrafialové záření. Ilustrativními sloučeninami jsou deriváty PABA, cinnamáty a salicyláty. Může být například použit oktylmethoxycinnamát a 2-hydroxy-4-mcthoxybenzofenon (známý také jako oxy35 benzon). Oktylmethoxycinnamát a 2-hydroxy-4-methoxybenzofenon jsou komerčně dostupné pod obchodními známkami ParsolMČX, popřípadě Benzofenon-3. Přesné množství látky s ochranným účinkem proti slunečnímu záření v emulzích může záviset na požadovaném stupni ochrany proti slunečnímu ultrafialovému záření.

Další výhodná případná složka je zvolena z esenciálních mastných kyselin (EFA), tj. mastných kyselin, které jsou nezbytné pro tvorbu plazmatické membrány všech buněk; v keratinocytech způsobuje nedostatek EFA hyperproliferaci buněk. Doplnění EFA tento jev opraví. EFA také zvyšují biosyntézu lipidů epidermis a poskytují lipidy pro tvorbu bariéry epidermis. Esenciální matné kyseliny se s výhodou volí z kyseliny linolové, kyseliny γ-linolenové, kyseliny 45 kolumbinové, kyseliny eikosa-(n-6,9,13)-trienové, kyseliny arachidonové, timnodonové, hexaenové a jejich směsí.

Ještě další výhodná případně přítomná složka je zvolena zazolů, například climbazolu, bifonazolu, clotrimazolu, ketokonazolu, mikonazolu, ekonazolu, itrakonazolu, flukonazolu, 50 terkonazolu, butokonazolu, sulkonazolu, lionazolu a jejich směsí. Azol může být v prostředcích podle vynálezu přítomen v množství od 0,001 do 50 % hmotnostních, s výhodou od 0,001 do 10 % hmotnostních, nejvýhodněji od 0,1 do 5 %.

Do kosmetických prostředků podle předkládaného vynálezu se často přidávají zvláčňující 55 prostředky. Obsahy těchto zvláčňuj ících prostředků mohou být od 0,5 do 50 %, s výhodou mezi

-4CZ 289811 B6 a 30 % hmotnostními z celkového prostředku. Zvláčňující prostředky mohou být zařazeny do obecných chemických kategorií jako estery, mastné kyseliny a alkoholy, polyoly a uhlovodíky.

Jako estery mohou být použity mono- nebo diestery. Vhodnými příklady mastných diesteru jsou například dibutyladipát, diethylsebakát, diizopropyldimerát a dioktylsukcinát. Vhodnými rozvětvenými mastnými estery jsou 2-ethylhexylmyristát, izopropylstearát a izostearylpalmitát. Přijatelné tribazické estery kyselin zahrnují triizopropyltrilinoleát a trilaurylcitrát. Přijatelnými mastnými estery s přímým řetězcem jsou například laurylpalmitát, myristyllaktát, oleylerukát a stearyloleát. Výhodnými estery jsou kokosový kaprylát/kaprát (směs kokosového kaprylátu a kokosového kaprátu), propylenglykol myristyletheracetát, diizopropyladipát a cetyloktanoát.

Vhodné mastné alkoholy a mastné kyseliny jsou sloučeniny obsahující 10 až 20 atomů uhlíku. Zvláště výhodné jsou sloučeniny jako cetyl, myristyl, palmityl a stearylalkohol a příslušné kyseliny.

Mezi polyoly, které mohou sloužit jako zvláčňující látky, patří přímé a rozvětvené alkylpolyhydroxylové sloučeniny. Výhodné jsou například propylenglykol, sorbitol a glycerol. Mohou být také použity polymemí polyoly jako je polypropylenglykol a polyethylenglykol. Jako látky zvyšující penetraci jsou zvláště výhodné také butylen- a propylenglykol.

Příklady uhlovodíků, které mohou sloužit jako zvláčňující činidla jsou látky s délkou uhlovodíkových řetězců v rozmezí od 12 do 30 atomů uhlíku. Konkrétními příklady jsou například minerální olej, minerální vazelína, skvalen a izoparaginy.

Další kategorií funkčních složek v rámci kosmetických prostředků podle předpokládaného vynálezu jsou zahušťovadla. Zahušťovadlo bude obvykle přítomno v množství mezi 0,1 až 20 % hmotnostních, s výhodou od 0,5 do 10 % hmotnostních z prostředku. Příklady zahušťovadel jsou zesítěné polyakrylátové látky dostupné pod obchodní známkou Carbopol od firmy B. F. Goodrich Company. Mohou být také použity gumy jako je xanthan, karagenan, želatina, karaya, pektin a guma svatojánského chleba. Za určitých okolností může být funkce zahušťovadla dosažena také látkou, která slouží jako silikon nebo zvláčňovadlo. Tuto dvojí funkci mají například silikonové gumy s viskozitou převyšující 10”³ m²s^_I a estery jako glycerolstearát.

Do kosmetických prostředků podle vynálezu mohou být přidány také pudry. Mezi tyto pudry patří křída, talek, kaolin, škrob, smektitové jíly, chemicky modifikovaný křemičitan hořečnatohlinitý, organický modifikovaný montmorillonitový jíl, hydratovaný křemičitan hlinitý, amorfní oxid křemičitý, oktenylsukcinát hlinitého škrobu a jejich směsi.

V kosmetických prostředcích podle předkládaného vynálezu mohou být také přidány další pomocné složky v menších množstvích. Tyto složky mohou zahrnovat barviva, opacifíkátory a parfémy. Množství těchto dalších pomocných látek přítomných v menším množství může být od 0,001 do 20 % hmotnostních prostředku.

Použití prostředků

Prostředek podle vynálezu je primárně určen jako produkt pro místní aplikaci na lidskou pokožku, zvláště jako prostředek pro kondicionování a vyhlazení kůže a pro prevenci nebo snížení vzniku vrásčité nebo zestárlé kůže.

Při použití se malé množství prostředku, například od 1 do 100 ml, nanese na exponované oblasti pokožky z vhodného zásobníku nebo aplikátoru a v případě potřeby se potom roztírá a/nebo vtírá do pokožky rukou nebo prsty nebo vhodným zařízením.

-5CZ 289811 B6

Forma výrobku a balení

Kosmetický prostředek pro místní použití na kůži podle vynálezu může být vhodně formulován 5 jako pleťová voda, krém nebo gel. Prostředek může být balen ve vhodném zásobníku vyhovujícím jeho viskozitě a zamýšlenému použití u zákazníka. Například pleťová voda nebo krém může být balena v lahvičce nebo kuličkovém aplikátoru nebo aerosolovém zařízení s hnacím plynem nebo zásobníku opatřeném pumpičkou vhodnou pro obsluhu prstem. Pokud je prostředkem krém, může být jednoduše skladován v nedeformovatelné lahvičce nebo zásobníku 10 pro vytlačování, jako je tuba nebo nádobka s víčkem. Prostředek může být také obsažen v kapslích jako jsou kapsle popisované v patentu US 5 063 057.

Vynález tedy také poskytuje uzavřenou nádobku obsahující výše definovaný kosmeticky přijatelný prostředek.

Vynález bude ilustrován následujícími konkrétními příklady. Retinoidy byly získány od firmy Sigma.

Příklady provedení vynálezu

Materiály a metody

Buněčná kultura

Lidské keratinocyty izolované z novorozenecké předkožky působením trypsinu byly pěstovány v médiu Dulbecco Modification Eagle (DME) Hams F12 (1:1)/10% fetální telecí sérum v přítomnosti ozářených myších fibroblastů 3T3 pro vytvoření dělících se kolonií keratinocytů. Buňky byly pěstovány za uvedených podmínek až do druhé pasáže a pro další použití skladovány 30 v zamraženém stavu. Zmražené keratinocyty druhé pasáže byly roztaveny a vysety na výše uvedené médium a pěstovány 5 dnů před převedením na bezsérové růstové médium pro keratinocyty založené na MCDB 153 (KGM) firmy Clonetics Corporation, San Diego, CA, obsahující 0,15 mM Ca, nebo bezsérové médium pro keratinocyty (KSFM) firmy GIBCO obsahující 0,09 mM Ca. Sedmý den, kdy již buňky narostly do 80 až 90 % konfluence byly 35 trypsinizovány a vysety do bezsérového média pro různé experimenty.

Transglutaminázový test

Transglutaminázový test a diferenciace keratinocytů

Při procesu konečné diferenciace v epidermis se na vnitřním povrchu buněčné periferie vytvoří vrstva proteinu o tloušťce 15 nm, známá jako zrohovatělý obal (comified envelope (CE). CE je složen z četných rozdílných proteinů, které byly vzájemně zesítěny vytvořením N^E-(Y-glutamyl) lyzin izodipeptidových vazeb katalyzovaných působením alespoň dvou různých tansglutamináz 45 exprimovaných v epidermis.

Transglutamináza I (TGáza I) je exprimována v nadbytku v diferencovaných vrstvách epidermis, zvláště v granulámí vrstvě, ale je nepřítomna v nediferencované bazální epidermis. TGáza I je tedy užitečným markérem diferenciace epidermálních keratinocytů, přičemž vysoké hladiny 50 TGázy I ukazují na více diferencovaný stav. Pro testování stavu diferenciace kultivovaných keratinocytů v následujících příkladech byl použit test na TGázu I ELISA s použitím protilátky proti TGáze I.

-6CZ 289811 B6

Pro příklad 1 bylo použito následujícího postupu:

Keratinocyty (kultivované výše popsaným způsobem) byly vysety do 96jamkových destiček s hustotou 3000 buněk na jamku v objemu 200 μΐ média. Po inkubaci po dobu 4 dnů byla média změněna na média obsahující testované sloučeniny (šestinásobné opakování jednoho testu). Buňky byly kultivovány dalších 72 hodin a potom bylo médium odsáto a destičky uchovány při -70 °C. Destičky byly vyjmuty z mrazicího boxu a buňky promyty PBS. Bylo přidáno 100 μΐ sterilní vody a buňky byly rozbity zmrazením při -70 °C a novým roztátím. Buňky byly potom inkubovány 1 hod při pokojové teplotě v PBS/3 % BSA (promývací pufr s obsahem bovinního sérového albuminu), a promyty čerstvým alikvotem promývacího pufru. Buňky byly inkubovány s 50 μΐ primárních protilátek monoklonální myší protilátky (IgG) proti lidské transglutamináze získaných od firmy Biomedical Industries zředěných v poměru 1:2000 v promývacím pufru po dobu 1 hod při 37 °C a potom dvakrát opláchnuty promývacím pufrem. Buňky byly potom inkubovány s 50 μΐ sekundární protilátky (fragment Fab, protimyší IgG s konjugovanou peroxidázou firmy Amersham) zředěné 1:4000 promývacím pufrem po dobu 1 hodiny při 37 °C a potom dvakrát opláchnuty promývacím pufrem. Buňky byly inkubovány se substrátovým roztokem (4 mg o-fenylendiaminu a 3,3 μΐ 30 % H₂O₂ v 10 ml 0,1 M citrátového pufru pH 5,0) 5 minut při pokojové teplotě v temnu (pod hliníkovou fólií). Reakce byla ukončena přidáním 50 μΐ 4N H₂SO₄. Absorbance vzorků byla odečítána na čtecím zařízení pro destičky při 492 nm. Z šesti opakování byly u čtyř přidány obě protilátky, dvě byla smísena pouze se sekundární protilátkou (tj. pro určení pozadí vazby protilátky konjugované s enzymem). Hladiny TGázy I byly stanoveny odečtením pozadí od výsledků z každého testu a určením střední hodnoty ± standardní odchylka pro každé opakování vystavené oběma protilátkám.

Pro příklad 2 bylo použito následujícího postupu:

Keratinocyty (kultivované výše popsaným způsobem) byly vysety do 96jamkových destiček na hustotu 3000 buněk na jamku v 200 μΐ kultivačního média. Po čtyřdenní inkubaci byla média zaměněna za média obsahující testované sloučeniny (šestinásobné opakování na test). Buňky byly kultivovány dalších 72 hodin, potom bylo médium odsáto a destičky skladovány při -70 °C. Po vyjmutí destiček z mrazicího boxu byly buňky rozbity dalším zmražením a roztátím a potom promyty třikrát PBS. Buňky byly inkubovány 1 hodinu při pokojové teplotě pufrem TBS/5%BSA. Potom byly buňky inkubovány se 100 μΐ monoklonální myší protilátky proti lidské transglutamináze (IgG) (primární protilátka) získané od firmy Biomedical Technologies lne. zředěné v poměru 1:2000 v pufru TBS/1 % BSA 2 hodiny při 37 °C a potom šestkrát opláchnuty promývacím pufrem (TBS/1 % BSA/0,05 % Tween-20). Dále byly buňky inkubovány se 100 μΐ fragmentu Fab, protimyší protilátkou IgG konjugovanou s peroxidázou (sekundární protilátka) firmy Amersham, zředěnou 1:4000 promývacím pufrem, po dobu 2 hodin při 37 °C a potom byly buňky třikrát opláchnuty promývacím pufrem a třikrát PBS. Buňky byly inkubovány se substrátovým roztokem (4 mg o-fenylendiaminu a 3,3 μΐ 30 % H₂O₂v 10 ml 0,lM citrátového pufru, pH 5,0) 5 minut při pokojové teplotě v temnu (pod hliníkovou fólií). Absorbance vzorků byla odečítána na čtecím zařízení pro destičky při 492 nm. Z šesti opakování byly u čtyř přidány obě protilátky, dvě byla smísena pouze se sekundární protilátkou (tj. pro určení pozadí vazby protilátky konjugované s enzymem). Hladiny TGázy I byly stanoveny odečtením pozadí od výsledků z každého testu a určením střední hodnoty ± standardní odchylka pro každé opakování vystavené oběma protilátkám.

Test na DNA

Hladina TGázy I detekovaná po působení na buňky by mohla být ovlivněna počtem buněk, tj. čím vyšší je počet buněk, tím vyšší je hladina detekované TGázy I. Hladina TGázy I byla tedy normalizována na obsah DNA v buňkách ve stejné jamce, čímž byl odstraněn rozptyl způsobený rozdílným počtem buněk. Kvantifikace DNA je zvláště užitečným indikátorem počtu buněk,

-7CZ 289811 B6 včetně počtu keratinocytových buněk, protože každá buňka má za všech okolností identický genom a proto identické množství DNA. Celkový obsah DNA v buňkách v jamce je proto přímo úměrný počtu buněk v této jamce. Kvantifikace DNA byla použita pro normalizaci údajů obsahu TGázy na počet buněk.

Keratinocyty byly vysety do 96jamkových destiček s hustotou 3000 buněk na jamku ve 200 μΐ média. Po čtyřdenní inkubaci byla média zaměněna za média s obsahem testovaných sloučenin (šest replikátů na test). Buňky byly kultivovány dalších 72 hodin a potom bylo médium odsáto a destičky skladovány alespoň 1,5 hodin při -70 °C. Destičky byly vyjmuty z mrazicího boxu a ponechány roztát v průběhu 30 minut. Bylo přidáno ΙΟΟμΙ/jamku barviva Hoechst (konečná koncentrace 1 μg/ml) a směs byla inkubována 15 minut, zakryta a potom odečítána ve fluorimetru (excitace 360 nm, emise 460 nm). Roztok barviva byl odstraněn a jamky byly pro přípravu na test TGázy promyty PBS.

Příklad 1

Kyselina retinová je účinnější než retinol při měnících se stádiích diferenciace keratinocytů

Byl vyšetřován vliv na hladiny transglutaminázy normalizované na obsah DNA buněk po přídavku kyseliny retinové (RA) a retinolu (ROH). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1

Působení na buňky	Střední hladina TGázy/DNAxl0“⁴± s.d. (% kontroly)	Hodnota p v.s. kontrola	Hodnota p vs. 2,5xl0~'M ROH	Hodnota p vs. 2,5x10~*M ROH	Hodnota p vs. 2,5x10^_™ ROH
Kontrola	2,44 ± 0,24 (100%)	-	0,001	0,001	0,001
2,5 x 10’⁷M RA	0,16 ±0,11 (7%)	0,001	0,001	0,001	0,001
2,5xlO^/MROH	0,14 ±0,22 (47%)	0,001	-	0,001	0,001
2,5 x 10~⁸Μ RA	0,34 ± 0,40 (55 %)	0,001	0,2	0,001	0,001
2,5 x 10'⁸M ROH	0,89 ± 0,30 (77 %)	0,001	0,001	-	0,001
2,5xlO^MRA	0,87 ±0,49 (77%)	0,001	0,001	0,784	0,001
2,5xlO⁹MROH	2,70 ± 0,59 (>100 %)	0,001	0,001	0,001	-

n = 3

Všechny koncentrace testované kyseliny retinové, tj. 2,5 x 10“⁷M, 2,5 x 10⁸M a 2,5 x 10 ⁹M snižovaly diferenciaci keratinocytů proti ethanolové kontrole v podstatně vyšší míře, než tomu bylo u odpovídajících koncentrací 2,5xlO’⁷M, 2,5xlO ⁸M a 2,5xlO^_9M retinolu. Pokles hladiny transglutaminázy byl závislý na dávce jak u kyseliny retinové, tak i retinolu. To je v souladu se zjištěním, že kyselina retinová má vyšší inhibiční účinek na diferenciaci epitelu než retinol.

Příklad 2

Amidy hydroxymastných kyselin a retinol působí synergický na inhibici diferenciace keratinocytů.

Vliv na hladiny TGázy I normalizované na obsah DNA v buňkách byl vyšetřován jako odezva na 72hodinové působení testovaných sloučenin. Amid byl získán u firmy Quest Intemational Amid Cu β-hydroxykyseliny má následující strukturu:

-8CZ 289811 B6

OH O

I II

CH₃(CH₂)₉CH-CH₂-C

I nh₂

Tabulka 2A

Vliv retinolu a amidu C]₃ β-hydroxykyseliny na poměr TGáza/DNA keratinocytů

Působení na buňky	Střední hladina TGázy/DNAxlO’⁵ ± s.d. (% kontroly)	Hodnota p vs. kontrola	Hodnota p vs. 2,5x10'⁸M ROH	Hodnota p vs. 2,5x10⁴M RA	Hodnota p vs. 10*⁸ amidu C13-p-hydroxy kyseliny
Kontrola	18,42 ±3,88 (100%)	-	0,001	0,001	0,875
2,5 x 10’⁸MRA	1,05 ± 1,05 (6 %)	0,001	0,001	-	0,001
2,5 x 10~^sM retinol	14,62 ±2,99 (79%)	0,001	-	0,001	0,001
10’⁸M amid Ο3-βhydroxykyseliny	18,53 ±4,58 (101 %)	0,875	0,001	0,001	—
2,5 x 1 (TM ROH + 10-⁸M amid C13β-hydroxykyseliny	11,36 ±2,43 (62%)	0,001	0,001	-	0,001

n = 3

2,5 x 10 ⁸M kyselina retinová byla velmi účinná při represi hladin keratinocytové TGázy I (na 6 % proti kontrolní hladině).

2,5 x 10“⁸M retinol měl menší účinnost než kyseliny retinová (79%) a 10^_8M amid Cl3 β-hydroxykyseliny neměl při samostatném použití žádný inhibiční účinek na hladinu keratinocytové TGázy I. Kombinace 2,5 x 10^_8M retinolu + 10“⁸M amidu C13 β-hydroxykyseliny však reprimovala hladinu keratinocytové TGázy I na 62 % proti kontrolní hladině. Amid C13 β-hydroxykyseliny a retinol proto působí synergicky na represi diferenciace keratinocytů analogickým způsobem jako účinkuje kyselina retinová.

Jako odpověď na 72 hodinové působení testovaných sloučenin byl vyšetřován vliv hladin TGázy I na obsah DNA buněk. „Lactamide MEA“ je monoethanolamid kyseliny mléčné. Byl získán od firmy Croda Chemicals. Lactamide MEA má následující strukturu:

O || .CHz-CHrOH CH₃CH-C-N\

I OH

-9CZ 289811 B6

I Tabulka 2B

Vliv retinolu a laktamidu MEA na diferenciaci keratinocytů

Působení na buňky	Střední hladina TGázy/DNAxlO“⁸ ± s.d. (% kontroly)	Hodnota p vs. kontrola	Hodnota p vs. 2,5x10’⁷M ROH	Hodnota p vs. 2,5x10'⁷M RA	Hodnota p vs. 10“⁶ laktamidu MEA
Kontrola	64,11 ±3,19(100%)		0,001	0,002	0,001
2,5x10’⁷MRA	46,71 ± 7,83 (73 %)	0,002	0,030	—	0,049
2,5 x 10”⁷M retinol	58,47 ±6,25 (91 %)	0,110	—	0,030	0,311
ÍO^M laktamidMEA	55,22 ± 2,43 (86 %)	0,001	0,311	0,049	—
2,5 x 10’⁷M ROH + ÍO^M laktamidMEA	46,29 ± 6,79 (72%)	0,001	0,018	0,049	-

2,5 x 10^_7M kyselina retinová byla účinná při represi hladiny keratinocytové TGázy I (na 73 %) proti hladině v kontrole. 2,5 x 10~⁷M retinol a ÍO^M laktamid-DEA byly při inhibici hladiny keratinocytové TGázy I méně účinné při samostatném použití. Avšak 2,5 x 10“⁷M retinol + 10”⁶M laktamid-DEA reprimoval keratinocytovou TGázul na 72 % kontrolní hladiny. 10 Laktamid-MEA a retinol proto působí synergicky a reprimují diferenciaci keratinocytů analogickým způsobem jako kyselina retinová. Příklady 1 a 2 ukazují, že kyselina retinová snižuje v závislosti na dávce diferenciaci keratinocytů. V příkladech 1 a 2 byla kyselina retinová použita jako pozitivní kontrola a referenční sloučenina, se kterou byly další analyzované sloučeniny srovnávány. Retinol byl při snižování diferenciace keratinocytů neúčinný.

Neočekávané výsledky příkladů 1 a 2 však spočívaly v tom, že účinek retinolu na kultivované keratinocyty může být zvýšen na úrovně přibližující se účinnosti kyseliny retinové kombinací retinolu nebo retinylového esteru s amidem hydroxymastné kyseliny - sloučeninou, která sama o sobě nemá žádný nebo má jen pouze velmi malý vliv. Výše popsané výsledky ukazují, že amid 20 hydroxymastné kyseliny působí synergicky sretinolem nebo retinylovým esterem na snížení diferenciace keratinocytů, což napodobuje účinek kyseliny retinové.

Příklady 3 až 8 ilustrují místní prostředky podle předkládaného vynálezu. Prostředky mohou být zpracovány obvyklým způsobem. Jsou vhodné pro kosmetické použití. Prostředky jsou zvláště 25 vhodné pro aplikaci na vrásčitou, drsnou, suchou, vločkovitou, zestárlou a/nebo ultrafialovým zářením poškozenou kůži pro zlepšení vzhledu a pocitu na kůži stejně jako pro aplikaci na zdravou kůži pro prevenci nebo zpomalení jejího poškozování.

Příklad 3

Tento příklad ilustruje emulzi typu voda v oleji s vysokým obsahem vnitřní fáze obsahující prostředek podle vynálezu.

	% hmotnostní
Retinol	0,5
Úplně hydrogenovaný kokosový olej	3,9
Amid Co β-hydroxymastné kyseliny	5
Brij 92’	5
Bentone 38	0,5
MgSO₄ x 7H₂O	0,3
Butylovaný hydroxytoluen	0,01
Parfém	podle potřeby
Voda	do 100

* Brij 92 je polyoxyethylen (2) oleylether

-10CZ 289811 B6

Příklad 4

Tento příklad ilustruje krém typu olej ve vodě obsahující prostředek podle vynálezu.

	% hmotnostní
Retinylpalmitát	0,15
Minerální olej	4
Laktamid MEA	1
Brij 56’	4
Alfol 16RD*	4
Triethanolamin	0,75
Butan-l,3-diol	3
Xanthanová guma	0,3
Parfém	podle potřeby
Butylovaný hydroxytoluen	0,01
Voda	do 100

* Brij 56 je cetylalkohol POE (10) Alfol 16RD je cetylalkohol

Příklad 5

Tento příklad ilustruje alkoholovou pleťovou vodu obsahující prostředek podle vynálezu.

	% hmotnostní
Retinylpalmitát N-hydroxyethyl-2-hydroxy-Ci3 amid Ethanol Parfém Butylovaný hydroxytoluen Voda	0,15 0,1 40 podle potřeby 0,01 do 100

Příklad 6

Tento příklad ilustruje další alkoholovou pleťovou vodu obsahující prostředek podle vynálezu.

	% hmotnostní
Retinol	0,15
N-hydroxyethyl-2-hydroxy-Ci3 amid	0,1
Ethanol	40
Antioxidant	0,1
Parfém	podle potřeby
Voda	do 100

Příklad 7

Tento příklad ilustruje opalovací krém obsahující prostředek podle vynálezu.

-11 CZ 289811 B6

	% hmotnostní
Retinol	0,01
12-hydroxy-N-(2-hydroxyethyl)oktadekan- amid	0,1
Silikonový olej 2 x 10'⁴M^{1 2}s¹	7,5
Glycerylmonostearát	3
Cetostearylalkohol	1,6
Polyoxyethylen-(20)-cetylalkohol	1,4
Xanthanová guma	0,5
Parsol 1789	1,5
Oktylmethoxycinnamát (PARSOL MCX)	Ί
Parfém	podle potřeby
Barvivo	podle potřeby
Voda	do 100

Příklad 8

Tento příklad ilustruje nevodný prostředek k péči o pleť obsahující prostředek podle vynálezu.

	% hmotnostní
Kyselina retinová	0,15
Monoethanolamid ricinového oleje	1
Silikonová guma SE-30¹	10
Silikonová kapalina 345²	20
Silikonová kapalina 344³	55,79
Skvalen	10
Kyselina linolová	0,01
Cholesterol	0,03
Kyselina 2-hydroxy-n-oktanová	0,7
Linoleát vitamínu E	0,5
Bylinný olej	0,5
Ethanol	2

¹ Dimethylsilikonový polymer s molekulovou hmotností alespoň 50 000 a viskozitou alespoň 10 x 10’³m²s^_1 při 25 °C firmy GEC.

ío ² Dimethylsiloxanový cyklický pentamer firmy Dow Coming Corp.

³ Dimethylsiloxanový tetramer firmy Dow Coming Corp.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Kosmetický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje (a) od 0,001 % do 10 % sloučeniny zvolené ze skupiny retinol, retinylový ester a jejich směsi;

20 (b) od 0,0001 % do 50 % amidu hydroxymastné kyseliny; a (c) kosmeticky přijatelné vehikulum.
2. Kosmetický prostředek podle nároku 1,vyznačující se tím, že retinylový ester je zvolen ze skupiny retinylpalmitát, retinylacetát, retinylpropionát, retinyllinoleát a jejich směsi.

-12CZ 289811 B6
3. Kosmetický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že složkou (a) je retinol.
4. Kosmetický způsob péče o pokožku, vyznačující se tím, že zahrnuje místní 5 aplikaci prostředku podle některého z nároků 1 až 3 na kůži.
5. Kosmetický způsob napodobování účinku kyseliny retinové na kůži, vyznačující se t í m, že zahrnuje aplikaci prostředku podle některého z nároků 1 až 3 na kůži.