CZ289415B6 - Prostředek pro potlačení růstu hub - Google Patents

Abstract

Prost°edek pro potla en r stu hub, kter² obsahuje alespo jeden lytick² enzym bun n st ny hub a alespo jednu p° rodn l tku ovliv uj c mikrobi ln bun nou membr nu, MMAS zvolenou ze skupiny nisin a p° rodn ch l tek obsa en²ch v pa itce, esneku a kurkum , v · inn koncentraci. Prost°edkem je potravin °sk² v²robek nebo kosmetick² produkt.\

Description

Prostředek pro potlačení růstu hub

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká potlačování růstu hub, zvláště při ochraně potravin proti ničení růstem hub.

Každým rokem jsou ztraceny miliony tun potravin v důsledku zničení růstem mikroorganismů. Člověk již velmi dávno zjistil, že fermentace pomocí užitečných mikroorganismů může přispět k ochraně potravin. Protože v tropických a subtropických oblastech stále není dostatek moderních chladicích zařízení, obyvatelé těchto oblastí se stále ve velké míře spoléhají na fermentaci jako prostředek pro ochranu a zabezpečení potravin.

Dosavadní stav techniky

K mikroorganismům způsobujícím kažení potravin patří bakterie a houby. Houby jsou při výrobě potravin stálým rizikem jejich zkažení. Nízkotučné pomazánky, sýry, potraviny založené na čaji, potraviny založené na ovoci a rajčatech jsou snadno zranitelné potravinářské výrobky. Inaktivace mikroorganismů působením tepla není vždy žádoucí nebo možná. Navíc spory hub přítomné v halách potravinářských provozů mohou způsobovat problémy ve stupni balení. Potlačování bakterií je relativně snadné. Houby jsou však organismy, které mohou přežívat za velmi nepříznivých podmínek. Účinné potlačování hub inhibicí klíčení nebo růstu je obtížné, zvláště za požadavku použití pouze přírodních ochranných látek.

Pod inhibicí hub se rozumí jak usmrcování hub, tak i potlačení jejich růstu bez jejich skutečného usmrcení.

Ačkoliv v potravinářském průmyslu bylo pro potlačování hub vyvinuto mnoho syntetických chemických ochranných prostředků, stále větší počet zákazníků dává přednost potravinám, jejichž složky nejsou chemického, ale přírodního původu. Proto se stále větší pozornost věnuje hledání ochranných prostředků, které mohou být získány fermentačními postupy, které se pokládají za přírodní způsob přípravy.

Tyto prostředky obsahují lytické enzymy mikrobiální buněčné stěny, které se popisují například v přehledné práci „Biological preservation of foods with reference to protective cultures, bacteriocins and food-grade enzymes“, Int. Joumal of Food Microbiology, 24 (1995) 343 - 362.

Podle WO 90/03732 mohou být chráněny rostliny proti houbám ošetřením enzymy rozkládajícími buněčnou stěnu hub, zvláště chitinázou aglukanázou, konkrétněji β-l, 3-glukanázou, β-1, 6-glukanázou a chitinázou. Tyto enzymy se s výhodou používají společně ve směsi, protože stěny buněk hub jsou normálně složeny z chitinu i glukanu v různých poměrech.

Ačkoliv se ukázalo, že tyto směsi lytických enzymů buněčné stěny jsou proti houbám účinné, jejich použití pro ochranu výrobků ve velkém měřítku je stále omezeno v důsledku jejich vysoké ceny ajejich relativně nízké účinnosti. Je možno předpokládat širší použití, jakmile se sníží potřebná účinná dávka a tím i náklady.

Pro agrochemické prostředky jsou známy synergické směsi enzymů s nepotravinářskými chemickými fungicidy (WO 90/03732 a Microbiology, 1994,140, 623 - 629).

- 1 CZ 289415 B6

Je tedy velmi zapotřebí najít zcela přírodní prostředky inhibující růst hub, založené na lytických enzymech buněčné stěny.

Podstata vynálezu

Bylo zjištěno, že látky ovlivňující membránu mikrobiálních buněk (Microbial cell membrane affecting substances, MMAS) přírodního původu inhibují růst hub v synergické směsi s alespoň jedním lytickým enzymem buněčné stěny.

Vynález zahrnuje prostředky vhodné pro potlačování růstu hub, které se vyznačují tím, že obsahují alespoň jeden lytický enzym buněčné stěny hub a alespoň jednu přírodní látku ovlivňující mikrobiální membránu v účinné koncentraci. Tato látka se volí ze skupiny nisinu a amfífilních peptidů vytvářejících alfa-šroubovici a inhibitorů hub, které jsou přítomny v rostlinách (herb) používaných pro přípravu potravin - pažitce, česneku a kurkumě.

S výhodou je lytickým enzymem buněčné stěny chitináza nebo glukanáza nebo výhodněji jejich směs. Výhodnou glukanázou je β-l, 3-glukanáza, popřípadě smísená s β—1, 6-glukanázou. Enzym (enzymy) mohou být použity podle vynálezu jako oddělený, více nebo méně čistý izolovaný enzym, ale výhodnější jsou kombinace enzymů. Surové preparáty přírodního původu obsahující enzymy jsou komerčně dostupné a mohou být použity namísto purifikovaných enzymů. Jeden takový prostředek se dodává na trh pod označením NovoZyme™ 234, firma NOVO, Dánsko, přičemž jde o směs lytických enzymů obsahujících mj. chitinázu, β-l, 3-glukanázu a malé množství β-l, 6-glukanázy. Tento prostředek se vyrábí fermentací houby Trichoderma harzianum podle patentu US 4 353 891. Byl popsán rovněž ve WO 90/03732. Z rostlinných zdrojů, zvláště z rostlin schopných produkovat glukanázu a chitinázu je možno získat další přírodní směsi chitinázy a uvedených glukanáz, jak se například popisuje vPlant Physiology 101: str. 857-863.

Chitináza stejně jako glukanáza se s výhodou používají v koncentraci 0,001 až 2 % hmotnostní, vypočteno na prostředek jako celek. Množství MMAS je s výhodou v rozmezí 0,00001 až 0,1 % hmotnostních, s výhodou 0,0001 až 0,02 % hmotnostních, vztaženo na prostředek jako celek. Výhodný poměr chitinázy a β-l, 3-glukanázy je 1 : 9 až 9 :1.

Koncentrace a poměry mohou být snadno optimalizovány v závislosti na skutečných složkách prostředku.

Antifungální prostředky, určené pro použití ve výrobcích, obsahují aktivní složky ve zvýšené koncentraci, přičemž se bere v úvahu zředění v důsledku smísení.

Termín přírodní se vztahuje k původu látky. Znamená to, že látky mohou být získány z přírodního zdroje, dokonce i když mohou být MMAS získány také syntetickou výrobou. Proto obsahují prostředky pro potlačení růstu hub podle vynálezu MMAS bez ohledu na způsob jejich přípravy.

Některé MMAS mohou být již známy jako takové na základě jejich interakce s buněčnou membránou mikroorganismů. Jejich působení vede k rozpadu nebo proděravění buněčné membrány, což vede k usmrcení mikroorganismu. Pokud se tyto látky použijí samostatně u neporušených hub, buněčná stěna může pro ně představovat takovou překážku, že jejich vlastnosti potlačující růst hub se neprojeví vůbec nebo jen v malé míře.

Dobře známou přírodní látkou MMAS pro použití v rámci vynálezu je potravinářský peptid nisin s molekulovou hmotností 3,5 kDa. Nisin má jakožto bakteriocin baktericidní účinky, ale nebyly pozorovány žádné účinky na inhibici růstu hub (viz obr. 1).

-2CZ 289415 B6

Ke známým přírodním látkám MMAS také patří peptidy zvolené z dobře známé třídy peptidů vytvářejících alfa-šroubovici. Peptidy vytvářející alfa-šroubovici jsou vhodné pro použití v rámci vynálezu za předpokladu, že mají amfifílní charakter. To znamená, že jejich trojrozměrná peptidová struktura obsahuje určité oblasti shydrofobním charakterem a zároveň určité oblasti shydrofilním charakterem. Amfifílní peptidy vytvářející alfa-šroubovici mají vysoký izolelektrický bod a v důsledku toho nesou pozitivní náboj při pH, které se obvykle vyskytují u potravinářských produktů. To je výhoda, protože cílem peptidu jsou buňky hub, které na vnější straně nesou opačný náboj.

Dobře známým představitelem amfífílních peptidů vytvářejících alfa-šroubovici je histatin. Jméno histatin označuje v této souvislosti všechny známé histatinové peptidy včetně peptidů histatin-1, histatin-3 ahistatin-5, stejně jako jejich směsi. Je známa jejich aminokyselinová sekvence. Histatin může být získán izolací ze slin, jak se popisuje například v JP 04-182420, ale praktičtější způsob je jejich výroba kultivací mikroorganismu obsahujícího geny kódující tento peptid.

Další amfifílní peptid vytvářející alfa-šroubovici působící na membránu je polypeptid FASLLGKALKALAKQ, kde F = fenylalanin, A = alanin, S = serin, L = leucin, G = glycin, K = lyzin, Q = glutamin. Polypeptid může být získán synteticky standardními způsoby syntézy peptidů, ale výhodně se získává kultivací mikroorganismu vybaveného odpovídajícím genetickým kódem. Jeho synergický účinek ve směsi s lytickými enzymy buněčné stěny je ukázán na obr. 4.

V první řadě je ukázán čas růstu kvasinky Saccharomyces cerevisiae v přítomnosti různých množství peptidů. Není pozorován žádný vliv peptidu na růst. Další řady se vztahují k času růstu se stejnými koncentracemi peptidů, ale se vzrůstajícím množstvím přípravku NovoZyme™ 234.

V přítomnosti lyrického enzymu buněčné stěny v koncentraci 2 mg/ml je jasně pozorovatelný synergický účinek.

Další přírodní látky MMAS působící jako inhibitory růstu hub jsou přítomny v rostlinách, vhodných pro přípravu potravin, zvláště pro výrobu sýrů, jako je pažitka, česnek a kurkuma. Příkladem těchto inhibitorů je carvacrol, jehož molekulární struktura je ukázána na obr. 5. Další vhodnou látkou MMAS je kyselina sorbová, která je známa pro své protihoubové účinky, ale pouze při použití ve vysokých koncentracích. Kyselina sorbová při samostatném použití při velmi nízkých koncentracích podle předkládaného vynálezu neposkytuje žádný protihoubový účinek. Z praktických důvodů se inhibiční sloučeniny s výhodou neizolují z rostlin, ale používají se ve formě rostlin, ve kterých jsou obsaženy. S výhodou se rostliny používají po kondicionační úpravě, jako je například sušení.

Rostliny se s výhodou přidávají ve v podstatě suché formě v koncentraci 0,01 až 10 % hmotnostních.

Vynález zahrnuje také prostředky, u kterých se MMAS získává izolací z jiných materiálů včetně výroby syntetickým způsobem.

Synergický účinek kombinace obsahující lyrický enzym a MMAS může být různý, ale obvykle je alespoň dvojnásobkem účinku stejné směsi bez synergického účinku složek. To znamená, že pro požadovaný účinek je zapotřebí pouze 50 % hmotnostních nebo méně směsi proti stavu, kdy by nedocházelo k synergickému účinku. Synergický účinek je jasně ukázán na všech obrázcích 1 až 7, připojených k předkládané přihlášce.

Prospěšný účinek synergického působení lyrického enzymu stěny houbových buněk a MMAS u potravinářských výrobků spočívá za prvé v tom, že se sníží náklady na ochranu, protože je

-3 CZ 289415 B6 zapotřebí menšího množství ochranné látky. Z hlediska výživy je však ještě důležitější, že dojde ke snížení obsahu nepřírodních potravinářských aditivních látek. Předpokládá se, že ochranné složky podle vynálezu jsou přírodního původu.

Vynález zahrnuje prostředky pro použití jako přídavné ochranné látky, které obsahují jak lytický enzym (enzymy), tak i MMAS, stejně jako hotové výrobky, do kterých byly tyto složky v požadovaném množství přidány.

Pro ochranu proti vzdušné kontaminaci houbami může mít vynález formu rozpuštění enzymu (enzymů) v MMAS ve vodné kapalině a stříkání roztoku na povrch produktu, kterým může být potravinářský produkt, kosmetický výrobek, nebo jakýkoliv jiný výrobek, u kterého může dojít k poškození růstem hub.

Kromě toho mohou obsahovat aktivní složky podle vynálezu dodatečné složky, které jsou obvyklé v prostředcích pro potlačování růstu hub, a které mohou zahrnovat pevné diluenty, rozpouštědla, stabilizátory a regulátory pH. Prostředek může být ve formě prášku, pasty nebo kapaliny, v závislosti na zamýšleném způsobu použití. Ačkoliv prostředek podle vynálezu je zvláště vhodný jako ochranná látka pro potlačování hub v potravinách, může být také použita pro prevenci nebo potlačení nežádoucího růstu hub na jiných výrobcích, jako jsou toaletní výrobky, například kostky mýdla. Kosmetický výrobek může obsahovat inhibitor růstu hub nejen pro vlastní ochranu před houbami, ale také pro příznivý účinek na kůži ošetřovanou tímto produktem, například v případě šamponu používaného na kůži s houbovým onemocněním.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje inhibici růstu houby Aspergillus niger jako funkci koncentraci nisinu v přítomnosti a bez přítomnosti lytického enzymu buněčné stěny.

Obr. 2 ukazuje inhibici růstu houby Aspergillus niger jako funkci koncentraci histatinu v přítomnosti a bez přítomnosti lytického enzymu buněčné stěny.

Obr. 3 ukazuje inhibici růstu houby Paecilomyces variiotii jako funkci koncentraci histatinu v přítomnosti a bez přítomnosti lytického enzymu buněčné stěny.

Obr. 4 ukazuje inhibici růstu houby Saccharomyces cerevisiae naočkované do půdy malt extract broth v přítomnosti stoupajícího množství lytického enzymu buněčné stěny a v přítomnosti vzrůstajícího množství polypeptidu FASLLGKALKALAKQ.

Obr. 5 ukazuje míru růstu houby Paecilomyces variotii, zaočkované do půdy „malt extract broth“ v přítomnosti lytického enzymu buněčné stěny a/nebo v přítomnosti carvacrolu.

Obr. 6 ukazuje inhibici růstu houby Penicillium rogueforti na čerstvém sýru jako funkci koncentrace lytického enzymu buněčné stěny s a bez přidaných rostlin.

Obr. 7 ukazuje růst houby Penicillium rogueforti zaočkované do zpracovaného sýra v průběhu 16 dnů v přítomnosti samotného nisinu nebo samotného lytického enzymu buněčné stěny, v přítomnosti jak lytického enzymu buněčné stěny, tak i nisinu, a v nepřítomnosti obou.

Vynález bude dále ilustrován následujícími příklady.

-4CZ 289415 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Inhibice růstu hub lytickým enzymem buněčné stěny a nisinem

Byl připraven vodný roztok (s použitím demineralizované vody) obsahující 0,2 % hmotnostních protihoubové látky NovoZyme™ 234 a 0,002 % hmotnostních nisinu. 75 μΐ roztoku bylo ohřáto na 20 °C a přidáno do jamky mikrotitrační destičky. Potom bylo zahřáto 75 μΐ roztoku obsahujícího 4 % hmotnostní půdy malt extract broth (firmy Osoid), 0,75 % hmotnostních agaru (firmy Difco) a 1000 spor houby Aspergillus niger na teplotu 25 °C a přidáno k testovacímu roztoku v jamce (pH 5,1).

Postup byl opakován s roztoky obsahujícími 0,004, 0,008, 0,016, 0,032 a 0,064 % hmotnostních nisinu. Obsahy jamek byly důkladně promíseny a na směs bylo navrstveno 75 μΐ parafinového oleje. Potom byly destičky uzavřeny fólií propustnou pro kyslík (Merlin).

V průběhu 360 hodin byla měřena optická hustota (OD) při 620 nm v pravidelných intervalech s použitím zařízení Multiscan devise MCC 340. Nárůst houby byl určen, jestliže došlo ke zvýšení OD (optické hustoty) alespoň 0,1.

Obr. 1 ukazuje dobu (v hodinách) potřebnou pro nárůst spor houby v prostředí obsahujícím nisin v koncentracích stoupajících od 0 do 0,032 % hmotnostních. V nepřítomnosti enzymu (první řada) neměl nisin samotný žádný podstatný vliv na zdržení nástupu růstu houby po 100 hodinách, zjištěném pro směs bez nisinu.

Enzymový preparát NovoZyme™ 234 (0,1 % hmotnostních) obsahující chitinázu a glukanázu při použití bez přídavku nisinu ukazuje nepatrnou inhibici růstu houby. Směsi obsahující nisin spolu s enzymovým preparátem (druhá řada) vykazují výrazný účinek, což je zřejmé ze silně zvýšených časů potřebných pro nárůst.

Příklad 2

Inhibice nárůstu houby lytickým enzymem buněčné stěiy a histatinem

Byl připraven vodný roztok (demineralizovaná voda) obsahující 0,2 % hmotnostních antifungální látky NovoZyme™ 234 a 0,002 % hmotnostních histatinu. 75 μΐ roztoku bylo ohřáto na 20 °C a přidáno do každé jamky mikrotitrační destičky. Potom bylo přidáno 75 μΐ roztoku obsahujícího 4 % hmotnostní půdy malt extract broth (firmy Oxoid), 0,75 % hmotnostních agaru (firmy Difco) a 1000 spor houby Aspergillus niger, zahřátého na 25 °C k testovacímu roztoku v jamce (pH5,l).

Postup byl opakován s roztoky obsahujícími 0,004, 0,008, 0,016, 0,032 a 0,064 % hmotnostních histatinu. Obsah jamek byl důkladně promíchán a přes směs bylo převrstveno 75 μΐ parafinového oleje. Potom byly destičky uzavřeny fólií propouštějící kyslík (Merlin). V průběhu 360 hodin bylo měřeno OD při 620 nm v pravidelných intervalech s použitím zařízení Multiscan devise MCC 340. Nárůst houby byl definován, pokud byl přírůstek OD alespoň 0,1.

Obr. 2 ukazuje dobu (v hodinách) potřebnou pro nárůst spor houby v prostředí obsahujícím peptid histatin v koncentracích zvyšujících se od 0 do 0,32 % hmotnostních. V nepřítomnosti

-5CZ 289415 B6 jakéhokoliv enzymu (první řada) se zdá být histatin poněkud aktivní při brždění růstu houby, zvláště v koncentraci 0,008 % hmotnostních a vyšší.

Enzymový preparát obsahující chitinázu a glukanázu NovoZyme™ 234 při použití v koncentraci 0,1 % hmotnostních bez přidaného histatinu (druhá řada, první sloupec) nevykazuje téměř žádnou inhibici růstu houby. Směsi obsahující histatin spolu s enzymovým preparátem však vykazují značný nárůst inhibice růstu houby i v koncentraci histatinu nižší než 0,008 % hmotnostních (druhá řada).

Příklad 3

Inhibice nárůstu houby v přítomnosti lytického enzymu buněčné stěny a histatinu

Byl opakován příklad 2 s použitím houby Paecilomyces variotii. Histatin bez enzymu vykazuje nárůst inhibice růstu houby při koncentracích 0,004 % hmotnostních a vyšších (obr. 3, první řada). S přídavkem 0,1 % hmotnostních enzymové směsi (druhá řada) je možno pozorovat jasný nárůst účinku i při koncentracích histatinu 0,04 % hmotnostních a nižších.

Příklad 4

Inhibice nárůstu hub lytickým enzymem buněčné stěny a polypeptidem FASLLGKALKALAKQ

Byl připraven vodný roztok (demineralizovaná voda) obsahující 2 mg/ml protihoubového prostředku NovoZyme™ 234 a 40 pg/ml polypeptidu. 75 μΐ roztoku bylo zahřáto na 20 °C a přidáno do jamky mikrotitrační destičky. Potom bylo na 25 °C zahřáto 75 μΐ roztoku obsahujícího 4% hmotnostní půdy malt extract broth (firma Oxoid) a 1000 buněk kvasinky Saccharomyces cerevisiae a přidáno do testovacího roztoku v jamce (pH 5,1) za získání směsi obsahující 20 pg/ml polypeptidu.

Postup byl opakován za získání roztoků vždy s obsahem 2 mg/ml prostředku NovoZyme™ a 10, 5, 2,5, 1,3, 0,6 a 0 pg/ml polypeptidu. Byla připravena řada roztoků se stejnými koncentracemi polypeptidu, ale s obsahem 1 mg/ml prostředku NovoZyme™. Byly připraveny odpovídající rozsahy obsahující 0,5,0,25 a 0 mg/ml prostředku NovoZyme™.

Obsahy jamek byly důkladně promíseny a na směs bylo navrstveno 75 μΐ parafinového oleje. Nakonec byly destičky uzavřeny fólií propustnou pro kyslík (Merlin).

V průběhu 360 hodin byla měřena OD 620 nm v pravidelných intervalech s použitím přístroje Multiscan devise MCC 340. Nárůst hub byl stanoven, pokud došlo k přírůstku OD alespoň 0,1.

Obr. 4 ukazuje dobu (v hodinách) potřebnou pro nárůst buněk kvasinek v prostředí obsahujícím polypeptid a enzym v různých koncentracích. V nepřítomnosti jakéhokoliv enzymu (první řada) nemá samotný polypeptid žádný pozorovatelný účinek na nárůst hub. Prostředek obsahující pouze přípravek NovoZyme™ 234 a žádný polypeptid ukazuje pouze určitou míru inhibice růstu hub při koncentraci lytického peptidů alespoň 1 mg/ml. Synergismus s polypeptidem je jasně viditelný při koncentraci enzymu 2 mg/ml.

-6CZ 289415 B6

Příklad 5

Inhibice nárůstu hub s lytickým enzymem buněčné stěny a carvacrolem

Byly připraveny roztoky (30 ml) obsahující 1 μΜ carvacrol rozpuštěný v půdě malt extract broth. Přípravek NovoZyme™ 234 byl přítomen v koncentracích 1,01 a 0 mg/ml. Pro porovnání byl připraven roztok obsahující koncentraci 1 mg/ml přípravku NovoZyme™, ale bez přítomnosti carvacrolu, a jeden ve kterém nebyl enzym ani carvacrol přítomen. 50 ml lahve na sérum naplněné roztoky byly zaočkovány 1000 sporami Paecilomyces variotii.

Výška sloupců v obr. 5 označuje míru nárůstu houby pozorovanou v průběhu 10 dnů. Nejvyšší sloupce („100“) označují plný nárůst houby, ke kterému dojde v roztocích bez carvacrolu a s koncentrací enzymu 1 mg/ml nebo méně. Pozorovaná inhibice růstu je vyjádřena sloupci „50“. Přítomnost carvacrolu v koncentraci 1 μΜ způsobuje inhibici růstu i v nepřítomnosti 15 enzymu. Jestliže je přítomno 1 mg/ml enzymu spolu s koncentrací 1 μΜ carvacrolu, nedochází ani ke klíčení spor hub (sloupce „25“).

Příklad 6

Inhibice nárůstu hub lytickým enzymem buněčné stěny a rostlinami

V boxu s laminámím tokem vzduchu byly připraveny vzorky čerstvého sýra obsahující 0, 0,5 a 2 % hmotnostní prášku NovoZyme™ 234 a vzorek obsahující 2 % hmotnostní inaktivovaného prášku NovoZyme™ 234. Stejná série byla připravena navíc s obsahem 1,6% hmotnostních směsi rostlin obsahující pažitku, česnek a kurkumu. Produkty byly naplněny do malých sterilních víček (přilepených do většího víčka) pomocí sterilního nože tak, že byl získán rovný povrch sýra.

Byla připravena suchá suspenze spor Penicillium rogueforti a počet spor ve směsi byl zjištěn 30 nastříkáním na 10 identických vzorků agaru Malt Extract Agar v 10 víčkách. Pro zabránění vysušení těchto víček byla víčka našroubována na skleněnou nádobu obsahující agar NaCl (aw = 0,99). Dvě nádoby byly inkubovány 3-5 dnů při teplotě 25 °C. Po inkubaci byly počítány kolonie a pro stanovení počtu spor hub byl vypočten aritmetický průměr.

Stejným způsobem byly stejnou suspenzí spor zaočkovány povrchy sýra. Vzniklo inokulum s 10(exp2) až 10(exp4) sporami. Vzorky byly našroubovány na skleněné nádoby obsahující agar NaCl (aw = 0,99) pro zabránění vysušení a byly inkubovány při teplotě 20 °C.

V průběhu několika týdnů po inokulaci byly zaočkované vzorky sýra kontrolovány 3 x týdně na 40 viditelné poškození houbami. Byla také měřena aktivita β-glukanázy pro zjištění účinku doby skladování na aktivitu enzymu v prostředí sýra. V průběhu experimentu nebyl zjištěn pokles aktivity β-glukanázy.

Tabulka I ukazuje zpoždění nárůstu hub pro různé prostředky.

Tabulka I

Růst hub při 20 °C na sýru	Viditelné poškození houbou po n dnech
Bez ochranného prostředku	5
Přítomny pouze rostliny (1,6 % hmot.)	7-10
Přítomen prostředek NovoZyme™ 234 (2 % hmotn.)	7
Rostliny (1,6% hmotn.) + NovoZyme™ 234 (2% hmotn.)	>70

-7CZ 289415 B6

Obr. 6 ilustrující tabulku I ukazuje, že přítomnost směsi rostlin a přípravku NovoZyme™ 234 (druhá řada) má překvapivě silný synergický inhibiční účinek na nárůst spor houby Penicillium rogueforti.

Příklad 7

Potraviny chráněné proti růstu hub

Povrch zpracovaného sýra byl ve svém středu zaočkován houbou Penicillium rogueforti. V boxu s laminámím tokem vzduchu byla připravena směs nisinu a lytických enzymů. Vzorky byly pozorovány v průběhu 16 dnů (viz obr. 7).

Vzorky neobsahující ochranné prostředky nebo obsahující ochranné prostředky v koncentraci pouze 0,05 % hmotnostních (500 ppm) nisinu ukázaly nárůst hub již po čtyřech dnech. Nárůst hub je vyjádřen jako průměr kolonií. Jestliže byl přítomen přípravek NovoZyme™ 234 (koncentrace 2 % hmotnostní), nárůst hub byl podstatně zpožděn a byl viditelný teprve po 12 dnech. Vzorky, které obsahovaly jak NovoZyme™ (2 % hmotnostní), tak i nisin (0,05 % hmotnostních) vykazovaly podstatně snížený nárůst dokonce i po 16 dnech.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (7)

1. Prostředek pro potlačení růstu hub, vyznačující se tím,že obsahuje v synergicky účinné koncentraci alespoň jeden lytický enzym buněčné stěny hub a alespoň jednu přírodní látku ovlivňující mikrobiální membránu, MMAS, zvolenou ze skupiny nisin a přírodních látek ovlivňujících mikrobiální membránu obsažených v pažitce, česneku a kurkumě.

2. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že jako lytický enzym obsahuje chitinázu spolu s p-l,3-glukanázou a popřípadě p-l,6-glukanázou.

3. Prostředek podle nároku 2, vyznačující se t í m, že poměr chitinázy a glukanázy je 9 :1 až 1 : 9.

4. Prostředek podle některého z nároků 2až3, vyznačující se tím, že každý z enzymů chitinázy a glukanázy je přítomen v koncentraci 0,001 až 2 % hmotnostní, vztaženo na prostředek jako celek.

5. Prostředek podle některého z nároků laž4, vyznačující se tím, že MMAS je přítomna v koncentraci 0,00001 až 0,1 % hmotnostních, s výhodou 0,0001 až 0,02% hmotnostních, vztaženo na prostředek jako celek.

6. Prostředek podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že má účinnost potlačující růst hub, která je alespoň dvakrát větší, než je účinnost stejné směsi v nepřítomnosti synergického účinku jejích složek.

7. Prostředek podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že