CZ287958B6

CZ287958B6 - Farmaceutický přípravek pro inhibici migrace buněk vaskulárního hladkého svalstva

Info

Publication number: CZ287958B6
Application number: CZ19973744A
Authority: CZ
Inventors: Jai Pal Singh; Todd Robert Wiernicki
Original assignee: Eli Lilly And Company
Priority date: 1995-06-01
Filing date: 1996-05-30
Publication date: 2001-03-14
Also published as: AU5954196A; MX9709189A; IL118483A0; CA2222292A1; RO117996B1; MY112973A; CN1191487A; ZA964439B; EP0745384A2; NO975369D0; HUP9900851A2; KR19990022053A; EA199700450A1; US5622975A; HUP9900851A3; NZ309390A; EA000190B1; CZ374497A3; CN1089237C; AU707756B2

Abstract

Předmětem vynálezu je použití sloučeniny benzothiofenu obecného vzorce I, ve kterém R.sub.1.n. a R.sub.3.n. znamenají nezávisle na sobě atom vodíku, methyl nebo skupinu vzorce a) nebo b), kde Ar znamená fenyl nebo fenylovou skupinu substituovanou jednou nebo dvakrát alkylovou skupinou s 1 až 6 atomy uhlíku, alkoxyskupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupinou, nitroskupinou, atomem chloru, atomem fluoru nebo tri(chlor nebo fluor)methylovou skupinou, R.sub.2.n. je vybrán ze souboru sestávajícího z pyrrolidinoskupiny, hexamethyleniminoskupiny a piperidinoskupiny, nebo její farmaceuticky přijatelné soli nebo solvátu, k přípravě farmaceutického přípravku pro inhibici migrace buněk vaskulárního hladkého svalstva.ŕ

Description

Farmaceutický přípravek pro inhibici migrace buněk vaskulárního hladkého svalstva

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu inhibice migrace buněk vaskulárního hladkého svalstva.

Dosavadní stav techniky

Migrace buněk hraje důležitou roli při hojení ran, zánětu, syndromu respiračních potíží dospělých a zhoubném bujení [Sáváni a kol., J. Clin. Invest., 95, 1158- 1168 (1995), Kullmann a kol., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 8, 83 - 88 (1993), Brooks a kol., Cell, 79, 1157 - 1164 (1994)]. Migrace buněk vaskulárního hladkého svalstva z média do intimy hraje kritickou roli při tvorbě neointimity vedoucí k patogenezi vaskulámích chorob, jako je ateroskleróza, restenóza následující po PTCA a žilní bypasová ateroskleróza [Jackson a kol., Arteriosclerosis and Thrombosis, 13, 1218 - 1226 (1993), Brown a kol., Cardiovascular Res., 28, 1815 - 1820 (1995), Bell aMadri, Am. J. Pathol., 137, 7 - 12 (1990)]. Bylo zjištěno, že použití protilátek růstových faktorů stimulujících migraci buněk hladkého svalstva nebo peptidů, které blokují migraci buněk zprostředkovanou integrinem, inhibuje tvorbu neiontimy u zvířecích modelů vaskulárního zranění [Fems a kol., Science, 253, 1129 - 1132 (1991), Choi a kol., J. Vasc. Surg., 19, 125 135 (1994)].

Bylo dokázáno, že vaskulámí restenóza po perkutánní transluminámí koronární angioplastice (PTCA) je odpovědí tkáně charakterizovanou počáteční a pozdní fází. Trombóza a/nebo vazospasmy mohou přispívat k počáteční fázi, která nastává hodiny až dny po PTCA. Zdá se, že pozdní fáze je ovládána migrací SMC, proliferací a vaskulámím přetvořením. U těchto chorob přispívá zvýšená akumulace SMC migrací z média do intimy výrazně k patogenezi choroby. Přílišná proliferace a migrace buněk vaskulárního hladkého svalstva může být primárním mechanismem pro reokluzi koronárních arterií následující po PTCA, atheroktomii, laserové angioplastice a chirurgickém arteriálním bypasu štěpu, viz „Intimal Proliferation of Smooth Muscle Cells as an Explanation for Recurrent Coronary Artery Stenosis after Percutaneous Transluminal Coronaiy Angioplast,“ Austin a kol., Jounrla of the Američan College of Cardiology, 8, 369 - 375 (srpen 1985).

Vaskulámí restenóza zůstává hlavní dlouhodobou komplikací následující po chirurgické intervenci blokovaných arterií perkutánní transluminální koronární angioplastikou (PTCA), atheroktomii, laserovou angioplastikou a arteriální chirurgickým bypasem štěpu. U asi 35 % pacientů, kteří prodělali PTCA, se objevuje reokluze od tří do šesti měsíců po proceduře. Aktuální strategie ošetření vaskulámí restenózy zahrnuje mechanickou intervenci pomocí zařízení, jako je stent, nebo farmakologickou terapii zahrnující heparin, nízkomolekulámí heparin, kumarin, aspirin, rybí olej, antagonistu vápníku, steroidy a prostacyklin. Tyto strategie nedokázaly omezit rychlost reokluze a byly neúčinné pro ošetření a prevenci vaskulámí restenózy, viz „Prevention of Restenosis after Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty: The Search for a „Magie Bullet“,“ Hermans a kol., America Heart Joumal, 122, 171 - 187 (červenec 1991).

Ve zveřejněné české patentové přihlášce PV 2534-94 je popsáno použití reloxifenu k inhibici proliferace buněk hladkého svalu a restenóz. K. E. Bomfeld v časopise Trends Cardiovas. Med. 6/5, str. 143 až 151 (1996) v článku nazvaném Trensd of Cardiovascular Medicine se zabývá vztahem mezi přímou migrací a proliferací arteriálních buněk hladkého svalstva a zjišťuje, že má klíčovou úlohu při vzniku a vývoji aterosklerotické leze a vrestenóze následující po angioplastice. Jak přímá migrace, tak proliferace jsou regulovány polypeptidy navozenými po poškození arteriální stěny nebo odvozenými od cirkulujících buněk. Migrace a proliferace se

-1 CZ 287958 B6 mohou stimulovat stejnými polypeptidy prostřednictvím obecných receptorů. Tak tomu je v případě růstového faktoru odvozeného od krevních destiček (PDGF), který je nejsilnější známý růstový faktor a chemoatraktant buněk hladkého svalstva. Signální přenosová cesta vyvolaná PDGF vedoucí k přímé migraci však není identická s cesta vedoucí k proliferaci. Přitom nastává přeměna zvýšeného fosfotidylinositolu a mobilizace vápníku je spojena s přímou migrací buněk hladkého svalstva, zatímco aktivace kinázové kaskády proteinu aktivovaného mitogenem (MAP), aktivace translace a p70 S6 kinázy a regulace kináz závislých na cyklinu může regulovat replikaci a proliferaci DNA. Je tedy zřejmé, že migrace a proliferace vaskulámích svalových buněk jsou navzájem zcela odlišné a nezávislé.

Při patogenezi restenózy dochází k nadměrné buněčné proliferaci a migraci, jakožto důsledku růstových faktorů produkovaných buněčnými složkami v krvi a porušené stěny tepny, které zprostředkovávají proliferaci buněk hladkého svalstva při vaskulámí restenóze.

Prostředky, které inhibují migraci buněk hladkého svalstva, jsou vhodné pro ošetření a prevenci restenózy. Tento vynález se týká použití sloučenin jako inhibitorů migrace buněk hladkého svalstva.

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje použití sloučeniny benzothiofenu obecného vzorce I

ve kterém

Ri a R₃ znamenají nezávisle na sobě atom vodíku, methyl nebo skupinu vzorce

O O

II II

-C-(Ci-C6alkyl) nebo -C-Ar, kde Ar znamená fenyl nebo fenylovou skupinu substituovanou jednou nebo dvakrát alkylovou skupinou s 1 až 6 atomy uhlíku, alkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupinou, nitroskupinou, atomem chloru, atomem fluoru nebo tri(chlor nebo fluor)methylovou skupinou,

R₂ je vybrán ze souboru sestávajícího z pyrrolidinoskupiny, hexamethyleniminoskupiny a piperidinoskupiny, nebo její farmaceuticky přijatelné soli a solvátů, k přípravě farmaceutického přípravku pro inhibici migrace buněk vaskulámího hladkého svalstva.

-2CZ 287958 B6

Nyní se uvádí podrobný popis tohoto vynálezu.

Vynález je založen na zajištění, že vybrané skupiny sloučenin obecného vzorce I jsou vhodné pro inhibici migrace buněk vaskulámího hladkého svalstva. Způsoby ošetření jsou prakticky prováděny podáváním dávky sloučeniny obecného vzorce I nebo II nebo její farmaceuticky přijatelné soli nebo solvátu, které jsou účinné pro inhibici migrace buněk vaskulámího hladkého svalstva, člověku nebo jinému savci, který to potřebuje.

Pojem „inhibuje“ je zvolen tak, aby obsahoval obecně přijímaný význam, který zahrnuje profylaktické ošetření lidského subjektu k zamezení migrace buněk hladkého svalstva a udržení pod kontrolou a/nebo ošetření existující migrace buněk hladkého svalstva. Používaný způsob zahrnuje jak terapeutické, tak profylaktické ošetření, podle toho, které je vhodné.

Obecně je sloučenina kombinována s běžnými excipienty, rozpouštědly nebo nosiči a lisována do tablet nebo formulována jako elixíry nebo roztoky vhodné pro orální podávání nebo podávání intramuskulámí nebo intravenózní cestou. Sloučenina může být podávána transdermálně a může být formulována jako dávková forma postupně se uvolňující a tak podobně.

Sloučeniny obecného vzorce I mohou být vyrobeny podle zavedených způsobů, jako jsou detailně popsány v US patentových spisech 4 133 814, 4 418 068 a 4 380 635, na které se tímto odkazuje. Obecně způsob vychází z benzo[b]thiofenu, který obsahuje 6-hydroxylovou skupinu a 2-(4-hydroxyfenylovou) skupinu. Výchozí sloučenina je chráněna, alkylována a zbavena chránící skupiny za vzniku sloučenin obecného vzorce I. Příklady přípravy těchto sloučenin jsou uvedeny ve výše uvedených US patentech.

Součástí vynálezu je použití sloučenin vzorce IA a IB

Sloučeniny tvoří farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinou nebo bází se širokou skupinou organických a anorganických kyselin a bází a zahrnují fyziologicky přijatelné soli, které jsou často používány ve farmaceutické chemii. Takové soli také nacházejí použití jako součást tohoto

-3CZ 287958 B6 vynálezu. Typické anorganické kyseliny používané k tvorbě takovýchto solí zahrnují kyselinu chlorovodíkovou, bromovodíkovou, jodovodíkovou, dusičnou, sírovou, fosforečnou, fosforičitou a podobně. Mohou být také použity soli odvozené od organických kyselin, jako jsou alifatické mono- a dikarboxylové kyseliny, alkanové kyseliny substituované fenylem, hydroxyalkanové 5 a hydroxyalkandiové kyseliny aromatické kyseliny, alifatické a aromatické sulfonové kyseliny.

Takovéto farmaceuticky přijatelné soli pak zahrnují acetát, fenylacetát, trifluoracetát, akrylát, askorbát, benzoát, chlorbenzoát, dinitrobenzoát, hydroxybenzoát, methoxybenzoát, methylbenzoát, o-acetoxybenzoát, naftalen-2-benzoát, bromid, isobutyrát, fenylbutyrát, β-hydroxybutyrát, butin-l,4-dioát, hexin-l,4-dioát, kaprát, kaprylát, chlorid, cinnamát, citrát, formiát, 10 fumarát, glykolát, heptanoát, hippurát, laktát, malát, maleát, hydroxymaleát, malonát, mandelát, mesylát, nikotinát, isonikotinát, nitrát, oxalát, ftalát, tereftalát, fosfát, monohydrogenfosfát, dihydrogenfosfát, metafosfát, pyrofosfát, propiolát, propionát, fenylpropionát, salicylát, sebekát, sukcinát, suberát, sulfát, hydrogensulfát, pyrosulfát, sulfít, hydrogensulfit, sulfonát, benzensulfonát, p-bromfenylsulfonát, chlorbenzensulfonát, ethansulfonát, 2-hydroxyethansulfonát, 15 methansulfonát, naftalen-1-sulfonát, naftalen-2-sulfonát, p-toluensulfonát, xylensulfonát, tartrát a podobně. Výhodnou solí je sůl kyseliny chlorovodíkové.

Farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinou se obvykle tvoří sloučeniny obecného vzorce I s ekvimolámím množstvím nebo s přebytkem kyseliny. Reaktanty se obecně uvádí do styku 20 v rozpouštědlech, ve kterých jsou oba rozpustné, jako je diethylether nebo benzen. K vysrážení solí za normálních okolností dochází asi po 1 hodině až 10 dnech a soli mohou být izolovány filtrací nebo rozpouštědlo může být oddestilováno obvyklým způsobem.

Báze, které jsou obvykle používány pro tvorbu solí, zahrnují hydroxid amonný a hydroxidy 25 alkalických kovů a kovů alkalických zemin, uhličitany a hydrogenuhličitany, stejně jako alifatické a aromatické aminy, alifatické diaminy a hydroxyalkylaminy. Zvláště vhodné báze pro přípravu adičních solí zahrnují hydroxid amonný, uhličitan draselný, hydrogenuhličitan sodný, hydroxid vápenatý, methylamin, diethylamin, ethylendiamin, cyklohexylamin a ethanolamin.

Farmaceuticky přijatelné soli mají obecně zvýšenou charakteristiku rozpustnosti ve srovnání se sloučeninou, od které jsou odvozeny, a tak jsou často lépe upravitelné do kompozice ve formě kapaliny nebo emulze.

Farmaceutické kompozice mohou být připraveny způsoby, které jsou známé ze stavu techniky. 35 Tak například mohou být sloučeniny doplněné běžnými excipienty, rozpouštědly nebo nosiči a formovány do tablet, kapslí, suspenzí, prášků a podobně. Příklady excipientů, rozpouštědel a nosičů, které jsou vhodné do takových kompozic, zahrnují dále uvedené látky: plnidla a nastavovadla, jako jsou škrob, cukry, mannitol a křemičité deriváty pojivá, jako jsou karboxymethylcelulóza a jiné deriváty celulózy, algináty, želatina a polyvinylpyrrolidon, zvlhčovadla, 40 jako je glycerol, dezintegrační činidla, jako jsou agaragar, uhličitan vápenatý a hydrogenuhličitan sodný, činidla pro zpomalení rozpouštění, jako je parafin, urychlovače resorpce, jako jsou kvantémí amoniové sloučeniny, povrchově aktivní činidla, jako jsou cetylalkohol, glycerolmonostearát, adsorpční nosiče, jako jsou kaolin a bentonit a lubrikanty, jako jsou mastek, stearát vápenatý a hořečnatý a pevné polyethylglykoly.

Sloučeniny mohou být také formulovány jako elixíry nebo roztoky vhodné pro orální podávání nebo jako roztoky vhodné pro parenterální podávání, například intramuskulámí, subkutánní nebo intravenózní cestou. Sloučeniny se navíc hodí k formulaci do postupně se uvolňujících dávkových forem a podobně. Kompozice mohou být sestaveny tak, že uvolňování aktivních složek 50 probíhá pouze nebo výhodně v určité části zažívacího traktu, eventuálně po určitou časovou periodu. Povlaky, potahy nebo ochranné matrice mohou být vyrobeny například z polymemích látek nebo vosků.

Konkrétní dávka sloučeniny obecného vzorce I, požadovaná pro inhibici migrace buněk hladkého 55 svalstva podle tohoto vynálezu, bude závislá na závažnosti stavu, cestě podávání a podobných

-4CZ 287958 B6 faktorech, které budou záviset na rozhodnutí ošetřujícího lékaře. Obecně budou přijatelné a účinné denní dávky od 0,1 do asi lOOOmg/den a obvykle od asi 50 do asi 200 mg/den. Takovéto dávky budou podávány subjektu, který potřebuje léčení, jedenkrát až asi třikrát každý den nebo častěji podle potřeby, aby inhibovaly účinně migraci buněk hladkého svalstva.

Lokální dodávání inhibíčních množství aktivní sloučeniny pro ošetření migrace buněk vaskulámího hladkého svalstva nebo restenózy může být provedeno pomocí různých technik, které dostávají sloučeninu do nebo poblíž postiženého místa. Příklady technik lokálního podávání nejsou limitovány, ale pouze ilustrovány dostupnými technickými metodami. Příklady zahrnují lokální katétry pro podávání, specifické nosiče k dodání do určeného místa, implantáty, přímé injekce nebo přímé aplikace.

Lokální podávání pomocí katétru dovoluje podávání farmaceutického prostředku přímo na místo postižení. Příklady lokálního podávání za použití balonového katétru jsou popsány v EP 383 492 A2 a US 4 636 195 (Wolinsky, 13. ledna 1987).

Lokální podávání pomocí implantátu představuje chirurgické zavedení základní hmoty, která obsahuje farmaceutický prostředek, do postiženého místa. Implantovaná základní hmota uvolňuje farmaceutický prostředek pomocí difúze, chemické reakce nebo rozpouštědlových aktivátorů [Large, Science, 249, 1527 - 1533 (září 1990)].

Příkladem lokálního podávání pomocí implantátu je použití stentu. Stenty jsou určeny pro mechanickou prevenci zhroucení a reokluze koronárních tepen. Začlenění farmaceutického prostředku do stentu dodává léčivou látku přímo na postižené místo. Lokální dodávání touto technikou popsal Kohn v Pharmaceutical Technology (říjen 1990).

Jiným příkladem je dodávací systém, ve kterém je polymer, který obsahuje farmaceutický prostředek, injektován do místa postižení v kapalné formě. Polymer se potom vytvrdí do formy Implantátu in šitu. Tato technika je popsána ve WO 90/03768 (Donn. 19. dubna 1990).

Jiným příkladem je dodávání farmaceutického prostředku pomocí polymemího endoluminálního podávání. Tato technika používá katétr k aplikaci polymemího implantátu na vnitřní povrch lumenu. Farmaceutický prostředek začleněný do biologicky odbouratelného polymemího implantátu je poté uvolňován na operovaném místě. Tato technika je popsána ve WO 90/01969 (Schindler, 23. srpna 1989).

Posledním příkladem lokálního dodávání pomocí implantátu je přímá injekce váčků nebo mikročástic do postiženého místa. Tyto mikročástice mohou být složeny z látek, jako jsou proteiny, lipidy, cukry nebo syntetické polymery. Tyto mikročástice mají farmaceutický prostředek zabudovaný v mikročástici nebo na mikročástici jako povlak. Dodávací systém zahrnující mikročástice popsal Lange v Science, 249,1527 - 1533 (září 1990) a Mathiowitz a kol. v J. App. Póly. Sci„ 26, 809(1981).

Lokální podávání pomocí specifických nosičů je popsáno jako připojení farmaceutického prostředku na nosič, který přivede léčivou látku do místa postižení. Příklady takovýchto technik dodávání zahrnují použití nosičů, jako jsou proteinové ligandy nebo monoklonální protilátky [Lange, Science, 249, 1527 - 1533 (září 1990)].

Lokální dodávání přímou aplikací zahrnuje použití topických aplikací. Příkladem lokálního podávání přímou aplikací je aplikace farmaceutického prostředku přímo do arteriálního bypasového štěpu během chirurgického zákroku.

Obvykle je výhodné podávat sloučeninu obecného vzorce I ve formě adiční soli s kyselinou, jak je běžné při podávání farmaceutických prostředků nesoucích bazické skupiny, jako je

-5CZ 287958 B6 piperidinový kruh. Je také výhodné podávat takovou sloučeninu orální cestou starším lidem (například ženám po menopauze). Pro tyto účely jsou dostupné následující orální dávkové formy.

Příklady provedení vynálezu

Prostředky

V dále popsaných prostředcích výraz „aktivní složka“ znamená sloučeninu obecného vzorce I.

Prostředek 1: Želatinové kapsle

Tvrdé želatinové kapsle se připravují za použití těchto složek:

Složka____________________ aktivní složka škrob, NF škrob, prášek schopný tečení kapalný silikon, 3,50 cm².s'‘

Množství (mg/kapsle) 0,1 až 1000 0 až 650 0 až 650 0ažl5

Složky se smíchají, prošijí sítem s rozměrem otvorů 0,314 mm (No. 45 mesh U.S. sieve) a plní do tvrdých želatinových kapslí.

Dále se uvádějí příklady zvláštních prostředků ve formě kapsle se sloučeninou obecného vzorce I, kde takovou složkou je raloxifen.

Prostředek 2: Raloxifenová kapsle

Složka____________________ raloxifen škrob, NF škrob, prášek schopný tečení kapalný silikon, 3,50 cm².s''

Prostředek 3: Raloxifenová kapsle

Složka raloxifen škrob, NF škrob, prášek schopný tečení kapalný silikon, 3,50 cm/s'¹

Prostředek 4: Raloxifenová kapsle

Složka____________________ raloxifen škrob, NF škrob, prášek schopný tečení kapalný silikon, 3,50 cnr.s'¹

Množství (mg/kapsle)

112

225,3

1,7

Množství (mg/kapsle)

108

225,3

1,7

Množství (mg/kapsle)

103

225,3

1,7

Množství (mg/kapsle)

150

397

Prostředek 5: Raloxifenová kapsle

Složka____________________ raloxifen škrob, NF škrob, prášek schopný tečení kapalný silikon, 3,50 cm².s~‘

Zvláštní prostředky popsané výše se mohou změnit a poskytnou dostatečné odchylky ve shodě s tímto vynálezem.

Prostředky ve formě tablet se mohou připravit za použití složek uvedených dále.

Prostředek 6: Tablety

Složka____________________ aktivní složka celulóza, mikrokrystalická oxid křemičitý, sublimovaný kyselina stearová

Množství (mg/tableta) 0,1 až 1000 0 až 650 0 až 650 0 až 15

Složky se smíchají a slisují do formy tablet.

Dále uvedeným postupem se podle jiného provedení mohou připravit tablety, z nichž každá obsahuje 0,1 až 1000 mg aktivní složky.

Prostředek 7: Tablety

Složka______________________ aktivní složka škrob celulóza, mikrokrystalická polyvinylpyrrolidon (jako 10% roztok ve vodě) natriumkarboxymethylcelulóza stearát hořečnatý mastek

Množství (mg/tableta)

0,1 až 1000

4,5

0,5

Aktivní složka, škrob a celulóza se prošijí sítem s rozměrem otvorů 0,314 mm (No. 45 mesh U.S. sieve) a důkladně promíchají. S výsledným práškem se smíchá roztok polyvinylpyrrolidonu a vzniklá hmota se potom prošije sítem s rozměrem otvorů 1,168 mm (No. 14 mesh U.S. sieve). Granule takto připravené se vysuší za teploty 50 až 60 °C a prošijí sítem s rozměrem otvorů 0,192 mm (No. 18 mesh U.S. sieve). Ke granulím se potom přidá natriumkarboxymethylcelulóza, stearát hořečnatý a mastek, které se prosily sítem s rozměrem otvorů 0,246 mm (No. 60 mesh U.S. sieve), a po vzájemném smíchání se hmota lisuje na tabletovacím stroji za vzniku tablet.

Suspenze, které vždy obsahují 0,1 až 1000 mg léčiva na dávku objemu 5 ml, se připraví takto:

-7CZ 287958 B6

Množství (mg/5 ml)

Prostředek 8: Suspenze

Složka aktivní složka natriumkarboxymethylcelulóza sirup roztok kyseliny benzoové ochucovadlo barvivo vyčištěná voda

0,1 až 1000 mg mg

1,25 mg

0,10 ml podle potřeby podle potřeby do 5 ml

Aktivní složka se prošije sítem s rozměrem otvorů 0,314 mm (No. 45 mesh U.S. sieve) a smíchá s natriumkarboxymethylcelulózou a sirupem, za vzniku hladké pasty. Roztok kyseliny benzoové, ochucovadla a barviva se zředí určitým množstvím vody a potom přidá k pastě za míchání. Ke směsi se poté přidá dostatečný objem vody, aby se dosáhlo požadovaného objemu.

Testy

Sloučeniny podle vynálezu mají schopnost inhibovat migraci buněk vaskulámího hladkého svalstva, jak je dokázáno dále.

Buňky hladkého svalstva prasečí aorty

Prasečí aorty byly získány z čerstvě poražených kastrovaných samců vepře na místních jatkách. Buňky hladkého svalstva byly získány stejným způsobem, jaký byl dříve popsán (Bonin a kol., 1989). Uvedeno v krátkosti, aorta byla podélně rozříznuta a endothelium bylo odstraněno jemným oškrabáním povrchu lumenu holicí čepelkou. Aorta byla poté několikrát promyta sterilním růstovým médiem, které obsahovalo Dubeccoem modifikované Eaglesovo médium (DMEM), 10% zárodečné hovězí séru, L-glutamin (2 mM), penicilín (100 jednotek/ml) a streptomycin (100 pg/ml). Proužky mediálních buněk hladkého svalstva byly sloupnuty z vnější vrstvy cévní stěny a nakrájeny na 1 až 2mm kousky. Explantáty byly umístěny do 24jamkové kultivační nádoby obsahující výše uvedené kultivační médium. Do 5 až 7 dnů byl pozorován růst buněk zexplantátů. Po 10 až 14 dnech byly explantáty odstraněny, buňky byly podrobeny trypsinaci a přeočkovány do T75 baněk obsahujících 15 ml růstového média.

Lidské buňky hladkého svalstva

Lidské buňky koronárního a aortického hladkého svalstva byly získány od Clonetics Corporation (San Diego, CA, USA). Oba typy buněk byly kultivovány v růstovém médiu, které zde bylo popsáno u prasečích buněk hladkého svalstva.

Zkoušky migrace buněk hladkého svalstva

Řízená migrace buněk hladkého svalstva získaných z prasečích a lidských arterií v gradientu růstových faktorů odvozených od krevních destiček byla provedena za použití modifikované Boydenovy komory využívající 96 transjamkových systémů a polykarbonátových filtrů s 8μηι póry (Neuro Probe, lne., Cabin John, NJ, USA). Buňky hladkého svalstva kultivované v T75 baňkách byly převedeny do Dubeccoem modifikovaného Eagles/F12 média prostého fenolové červeně (DMEM/F-12), obsahujícího 2% zárodečné hovězí sérum, L-glutamin (2 mM), penicilín (100 jednotek/ml) a streptomycin (100 g/ml). Po 24 hodinách byly buňky podrobeny trypsinaci za použití tiypsin/EDTA prosté fenolové červeně („phenol red free trypsin/EDTA“) EDTA prosté fenolové červeně („phenol red free trypsin/EDTA“) (Gibco, BRL). Buňky (2,5 x 10‘⁶ buněk/ml) byly suspendovány vDMEM/F12 prostém fenolové červeně obsahujícím 1 % plazmy chudé na krevní destičky a různé koncentrace sloučeniny obecného vzorce I. 100 μΐ suspenze buněk bylo přidáno do vrchních jamek modifikované Boydenovy komory. Jamky spodní komory byly

-8CZ 287958 B6 naplněny 43 μΐ DMEM/F-12 s obsahem 1 % plazmy chudé na krevní destičky, 5 ng/ml PDGF a různé koncentrace sloučenin. Komory byly inkubovány při teplotě 37 °C v 5% oxidu uhličitém po dobu 5 hodin. Migrační membrána byla odstraněna z komory a buňky z vrchní strany membrány byly odstraněny bavlněným tampónem. Buňky, které migrovaly na spodní stranu membrány, byly fixovány v methanolu a vybarveny pomocí detekčního roztoku Diff-Quick (Baxter). Migrace buněk byla kvantitativně vyhodnocena buď spektrofotometricky, za použití mikrotitračního odečítače (ThermoMax, Molecular Dynamics, lne.), nebo spočítáním buněk v 40x zvětšeném poli (HPF) za použití invertního mikroskopu (Nikon, lne.).

Pro experimenty zahrnující předinkubaci buněk se sloučeninou bylo léčivo umístěno do média pro předběžné zpracování v určitých koncentracích, v oddělených baňkách, a inkubováno 18 hodin. Podmínky kultivace buněk při těchto zkouškách používajících předinkubaci byly přesně stejné jako podmínky použité při experimentech popsaných pro akutní účinky léčiva.

Tabulka I

Stimulace migrace buněk prasečího aortického hladkého svalstva (Porcine Aortic Smooth Muscle Cell - SMC - Migration) růstovým faktorem odvozeným od krevních destiček (Platelet-Derived Growth Factor - PDGF)

PDGF (ng/ml)	Migrace SMC (650 nm) (O.D. 650 nm)
0,04 0,80 1,50 3,00 6,00 12,00 25,00	0,016 ±0,008 0,009 ± 0,003 0,013 ±0,007 0,028 ± 0,008 0,058 ±0,010 0,052 ± 0,007 0,047 ± 0,009

Tabulka II

Inhibice PDGF indukované prasečí aortické SMC migrace sloučeninou A* a β-estradiolem

Migrace SMC (O. D. 650 nm)

Koncentrace (nM)	Sloučenina A	β-estradiol
0,0	0,053 ±0,015	0,053 ±0,015
0,1	0,035 ± 0,005	0,032 ± 0,003
1,0	0,030 ± 0,005	0,023 ± 0,003
10,0	0,032 ± 0,007	0,034 ± 0,006

* Sloučenina A má obecný vzorec I, kde R] a R₃ je vodík a R₂ je pyrrolidinová skupina.

Výše uvedená aktivita naznačuje, že sloučeniny podle vynálezu jsou schopny inhibovat migraci buněk vaskulámího hladkého svalstva a její účinky.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití sloučeniny benzothiofenu obecného vzorce I ío ve kterém

Ri a R₃ znamenají nezávisle na sobě atom vodíku, methyl nebo skupinu vzorce

O O •5 II II

-C-(Ci-C₆alkyl) nebo -C-Ar, kde Ar znamená fenyl nebo fenylovou skupinu substituovanou jednou nebo dvakrát alkylovou skupinou s 1 až 6 atomy uhlíku, alkoxyskupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxy20 skupinou, nitroskupinou, atomem chloru, atomem fluoru nebo tri(chlor nebo fluor)methylovou skupinou,

R₂ je vybrán ze souboru sestávajícího z pyrrolidinoskupiny, hexamethyleniminoskupiny a piperidinoskupiny, nebo její farmaceuticky přijatelné soli a solvátu, k přípravě farmaceutického přípravku pro inhibici migrace buněk vaskulámího hladkého svalstva.
2. Použití podle nároku 1, kde sloučenina obecného vzorce I je ve formě své hydrochloridové soli, k přípravě farmaceutického přípravku pro inhibici migrace buněk vaskulámího hladkého svalstva.
3. Použití podle nároku 1, kde sloučeninou obecného vzorce I je sloučenina vzorce

-10CZ 287958 B6 nebo její hydrochloridová sůl, k přípravě farmaceutického přípravku pro inhibici migrace buněk vaskulámího hladkého svalstva.
4. Použití podle nároku 1, k přípravě farmaceutického přípravku pro inhibici aterosklerózy, restenózy, zánětu nebo zhoubného napadení.