CZ285518B6

CZ285518B6 - Způsob čištění cyklosporinu A

Info

Publication number: CZ285518B6
Application number: CZ93985A
Authority: CZ
Inventors: Tibor Szánya; László Hanák; Edit Nagy; István Melczer; György Deák; Berta Makó; Gyula Márton; Judit Dencs; János Kelemen; János Bálint; Ferenc Radnai; Ernö Karácsony; Csaba Hajdufi; Vilmos Kéri; Gyöngyi Strbka; Anita Karczub
Original assignee: BIOGAL Gyógyszergyár Rt.
Priority date: 1992-05-25
Filing date: 1993-05-24
Publication date: 1999-08-11
Also published as: HUT68163A; IT1272446B; HU213553B; ITMI931063A0; US5382655A; ITMI931063A1; CZ98593A3; CA2096892C; CA2096892A1; HU9201728D0

Abstract

Čištění cyklosporinu A chromatografií ze směsí obsahujících zejména cyklosporiny A, B a C a ostatní cyklosporinové složky polárnější nebo apolárnější než cyklosporin A nebo jim podobné nečistoty spočívá v tom, že se uvedená směs nebo zbytek po jejím odpaření zahřeje pod chromatografií na teplotu 80 až 115 .sup.o .n.C, taví se a tavenina se potom chromatografuje o sobě známým způsobem. Výhodně se chromatografie provádí za postupného použití eluční soustavy tvořené směsí chloroformu, dichlormethanu a ethanolu v objemovém poměru 48:50:2 a eluční soustavy tvořené směsí chloroformu, ethylacetátu a ethanolu v objemovém poměru 48:50:2.ŕ

Description

(57) Anotace:

Způsob čištění cyklosporinu A chromatografií ze směsi, obsahující zejména cyklosporiny A, B a C a ostatní cyklosporinové složky polárnější nebo apolárnější než cyklosporin A nebo jim podobné nečistoty, jehož podstata spočívá v tom, že se směs nebo zbytek po jejím odpaření před chromatografií roztaví zahřátím na teplotu 80 až 115°C a následně ochladí na teplotu 10 až 35 °C. Výhodně se chromatografíe provádí za postupného použití eluční soustavy, tvořené směsí chloroformu, dichlormethanu a ethanolu v objemovém poměru 48:50:2, a eluční soustavy, tvořené směsí chloroformu, ethylacetátu a ethanolu v objemovém poměru 48:50:2.

Způsob čištění cyklosporinu A

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu čištění cyklosporinu A jeho izolací ze směsí, obsahujících zejména cyklosporiny A, B a C a ostatní cyklosporinové složky, které jsou polárnější nebo apolámější než cyklosporin A, jakož i nečistoty podobné těmto složkám. Uvedený způsob zahrnuje chromatografii, provedenou po předcházejícím tepelném zpracování.

Dosavadní stav techniky

Cyklosporinová antibiotika se připravují fermentací. Byli to výzkumní pracovníci firmy Sandoz Ltd., kteří jako první popsali izolaci cyklosporinů A a B, získaných kultivací fungálního kmene Cylindrocarpon lucidum Booth 5760 (švýcarský patentový spis 589,716). Od té doby až dosud bylo izolováno 25 cyklosporinů, které se označují písmeny od A do Z /Helv. Chim. Acta 70, 13 (1987)/.

Jednotlivé cyklosporinové složky, které si jsou velmi podobné, pokud jde o jejich chemické a fyzikální vlastnosti, se z fermentačního prostředí izolují extrakcí, načež se potom z takto získané surové cyklosporinové směsi jednotlivé složky dělí několikastupňovou preparativní chromatografíí. I když cyklosporin A, mající selektivní imunosupresivní účinnost, je vzhledem k této účinnosti nejcennější složkou cyklosporinového komplexu, izolují se a čistí i ostatní cyklosporinové složky.

Při způsobu, popsaném v patentovém spisu US 4,117,118, se cyklosporinová směs zavede na sloupec Sephadexu LH20 a eluuje methanolem, načež se zavede na sloupec aluminy a eluuje eluční soustavou, tvořenou směsí toluenu a ethylacetátu (15%) a nakonec se zavede na sloupec silikagelu a eluuje směsí chloroformu a methanolu (2%). Vzdor této opakované chromatografii není získaný produkt čistý aje tvořen směsí cyklosporinů A a B.

Při způsobu podle patentového spisu US 4,215,199 se směs cyklosporinů A a B, získaná z fermentačního prostředí, obsahujícího převážně uvedené složky, opakovanou extrakcí, provedenou za použití methylenchloridu po předcházejícím mechanickém zpracování v methanolu, nejdříve zbaví tuků chromatografíí na sloupci silikagelu za použití eluční soustavy, tvořené směsí chloroformu a methanolu, přičemž se eluát odpaří k suchu a získaný zbytek se rozpustí v methanolu a chromatografuje na sloupci Sephadexu LH20 za použití elučního činidla, tvořeného methanolem. Eluáty se frakcionují, znovu odpaří k suchu, zbytek se rozpustí ve směsi chloroformu a methanolu v objemovém poměru 98:2 a znovu chromatografuje na sloupci silikagelu. První opouští v eluátu sloupec cyklosporin A, který je následován cyklosporinem B. Čisté cyklosporinové složky se získají odpařením eluátů.

V Helv. Chim. Acta 59(4), str. 1075-92 je popsán způsob separace směsi, obsahující cyklosporiny A a B. Při tomto způsobu se fermentační prostředí, obsahující cyklosporiny A a C, smísí s n-butylacetátem a získaná směs se mechanicky zpracuje v separátoru typu Westfalia. Po tomto zpracování se organické fáze odpaří a surová cyklosporinová směs se zbaví tuků v methanolu a petroletheru. Po odpaření se zbytek rozpustí v chloroformu a chromatografuje při elučním gradientu, přičemž se jako eluční soustava použijí směsi chloroformu a methanolu v objemových poměrech 98,5:1,5 a 97:3. V prvním eluátu je cyklosporin A, zatímco ve druhém eluátu lze nalézt cyklosporin B. Čistý krystalický produkt se získá v dalších chromatografíckých stupních. Frakce A se rozpustí v methanolu a chromatografuje na sloupci Sephadexu LH-20 za použití elučního činidla, tvořeného methanolem. Píkové frakce (frakce s obsahem produktu) se odpaří, rozpustí v toluenu a chromatografují na sloupci aluminy za použití elučního činidla, tvořeného

-1 CZ 285518 B6 toluenem, v přítomnosti rostoucí koncentrace ethylacetátu. Frakce se potom odpaří a zpracují v alkoholovém roztoku aktivním uhlím, přičemž se získá krystalický produkt. Surová frakce C se rozpustí v methanolu a chromatografuje na sloupci Sephadexu-LH 20 za použití elučního činidla, tvořeného methanolem. Píkové frakce se rozpustí v diethyletheru a cyklosporin C se separuje přidáním n-hexanu. Tento produkt se potom chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy, tvořené směsí chloroformu a ethanolu.

Výše uvedené chromatografické způsoby separace cyklosporinových směsí jsou poněkud zdlouhavé a nákladné. Opakovaná kapalinová extrakce, odpařovací stupně a následné chromatografické operace činí tento způsob nehospodámým a nevhodným pro použití v průmyslovém měřítku.

Vzhledem k tomu je cílem vynálezu nalézt způsob čištění, který by umožňoval jak separaci cyklosporinových směsí, tak i čištění cyklosporinu A, a který by byl hospodárný a vhodný pro použití v průmyslovém měřítku a který by byl méně zdlouhavý a snáze proveditelný.

Podstata vynálezu

Vynález se týká způsobu čistění cyklosporinu A chromatografií ze směsi, obsahující zejména cyklosporin A, B a C a ostatní cyklosporinové složky polárnější nebo apolámější než cyklosporin A nebo jim podobné nečistoty, jehož podstata spočívá v tom, že se směs nebo zbytek po jejím odpaření před chromatografií roztaví zahřátím na teplotu 80 až 115 °C a následně ochladí na teplotu 10 až 35 °C. Výhodně se chromatografie provádí za postupného použití eluční soustavy, tvořené směsí chloroformu, dichlormethanu a ethanolu v objemovém poměru 48:50:2, a eluční soustavy, tvořené směsí chloroformu, ethylacetátu a ethanolu v objemovém poměru 48:50:2.

Podstata vynálezu spočívá vtom, že se směs, obsahující různé cyklosporinové složky nebo zbytek, po odpaření vystaví před chromatografickou separací tepelnému zpracování. Toto tepelné zpracování zahrnuje zahřátí na teplotu 80 až 115 °C a roztavení. Při chromatografické separaci, která následuje po tomto tepelném zpracování, se jednotlivé složky dělí příznivěji a v důsledku toho může být cyklosporin A izolován s vyšší čistotou.

Cyklosporinová směs, získaná z fermentačního prostředí, obsahuje cyklosporinové složky, které jsou z chromatografického hlediska odlišné, zejména cyklosporiny A, B a C a nečistoty, které jsou apolámější nebo polárnější než cyklosporin A. Hlavní část uvedených nečistot je tvořena ostatními cyklosporinovými složkami nebo nečistotami, které jim jsou podobné.

Vzhledem ke skutečnosti, že jak cenné cyklosporinové složky, tak i uvedené nečistoty jsou si chromatograficky velmi podobné, a to při použití libovolných elučních směsí, nemůže být dosaženo požadovaného rozdělení cyklosporinové směsi vjediném chromatografickém stupni, neboť chromatografické píky, odpovídající jednotlivým složkám cyklosporinové směsi, se překrývají. Za účelem izolace některých cyklosporinových složek v čistém stavu je třeba provést další chromatografické čisticí stupně.

Vynález je založen na poznatku, spočívajícím vtom, že jestliže se směs, obsahující různé cyklosporinové složky, vystaví před chromatografickou separací tepelnému zpracování, potom může být dosaženo příznivého rozdělení jednotlivých složek cyklosporinové směsi a cyklosporin A může být potom získán ve vysoké čistotě. Čištění a jednostupňové chromatografické zpracování může být provedeno snadno a ekonomicky.

Uvedené tepelné zpracování, předcházející chromatografickou separaci, zahrnuje zahřátí směsi na teplotu dostatečnou k roztavení a udržení směsi v roztaveném stavu po určitou dobu. K roztavení cyklosporinové směsi dochází při teplotě 80 až 115 °C, a to v závislosti na čistotě

-2CZ 285518 B6 surového produktu. Tavenina se potom výhodně udržuje v roztaveném stavu při téže teplotě po dobu půl hodiny až jedné hodiny, načež se výhodně pomalu ochladí (během 5 hodin) na teplotu až 35 °C. Takto tepelně zpracovaný produkt se potom chromatografuje.

Podle získaných zkušeností mohou být tepelnému zpracování za účelem dosažení lepší chromatografické separace podrobeny nejen pevné směsi, nýbrž stejného výsledku může být dosaženo tepelným zpracováním zbytku pevné směsi, získaného z roztoku výše specifikovaným způsobem (3. (kontrola) a příklad 5).

Chromatografíe se provádí změnou následujících elučních soustav: chloroform/ methylenchlorid/ ethanol (48:50:2) a chloroform/ethylacetát/ethanol (48:50:2) v příkladech 1 a 3 a aceton/ methylenchlorid (18:20) a aceton/methylenchlorid (20:80) v příkladech 3 a 4.

Tepelné zpracování, předcházející chromatografickou separaci, má za následek příznivější 15 separaci cyklosporinové směsí v případě, kdy se použije jakákoliv z výše uvedených elučních směsí. Cyklosporin A se získá v obzvláště vysoké čistotě v případě, kdy se použije trojsložková eluční směs.

Byly provedeny pokusy, zahrnující chromatografickou separaci tepelně zpracovaných a nezpra20 covaných cyklosporinových směsí, majících stejné složení, za použití výše uvedených elučních soustav. Získané výsledky jsou ilustrovány na připojených obr. 1 a obr. 2. Čistota produktu, získaného z některých frakcí (% hmotn.) je v grafech na uvedených obrázcích vynesena proti objemu eluentu. Z těchto obrázků je zřejmé, že v případě tepelně zpracovaných vzorků se dosáhne příznivější separace složek a odpovídající produkty mohou být takto získány ve vyšší 25 čistotě.

V následující tabulce jsou uvedeny výsledky výše uvedených pokusů, zahrnujících čištění tepelně zpracovaných a nezpracovaných cyklosporinových směsí, vyjádřené jako hmotnost získaného produktu s čistotou vyšší než 90 % hmotn. a výtěžek v %.

	Nezpracovaná směs	Tepelně zpracovaná směs
	Příklad 1	Příklad 3	Příklad 2	Příklad 4
Hmotnost cyklo-
sporinu A	20,26 g	0,0 g	111,80 g	11,94 g
Výtěžek	14,08 %	0,0 %	77,75 %	38,89%
Cyklosporin A
(čistota vyšší než
97,5 % hmotn.)	0,0 g	0,0 g	21,03 g	0,0 g
Výtěžek	0,0 %	0,0 %	14,62 %	0,0 %

Z výše uvedené tabulky je zřejmé, že v případě tepelně zpracovaných produktů se v důsledku lepší separace může izolovat značně vyšší množství látky s čistotou, přesahující 90% hmotn.. Rovněž je třeba uvést, že v případě, kdy se vychází z tepelně zpracovaných produktů a kdy se 35 použije následujících elučních směsí: chloroform/methylenchlorid/ethanol (48:50:2) a chloroform/ethylacetát/ethanol (48:50:2), je možné získat cyklosporin A v jediném stupni s čistotou 97,5 hmotn., požadovanou lékopisem USA. Výtěžek produktu, získaného v kvalitě, požadované lékopisem USA, je prakticky identický s výtěžkem všech produktů, získaných v čistotě, přesahující 90 % hmotn. v případě, kdy se chromatografuje předběžně nezpracovaný produkt.

V následující části popisuje vynález blíže objasněn příklady jeho konkrétního provedení, které mají pouze ilustrační charakter a které nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen formulací patentových nároků. V těchto příkladech jsou čištěny surové cyklosporinové

-3 CZ 285518 B6 směsi zbavené tuku, které jsou získané kultivací mikroorganismu Tolypocladium varium (depoziční číslo: NCAIM(P)F001005) a izolací z fermentačního prostředí. Obsah účinné látky byl stanoven vysokovýkonnou kapalinovou chromatografií, popsanou v lékopise USA (Pharmacopoeia XXII).

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Zařízení: axiálně tlakovaná preparativní kolona pro kapalinovou chromatografii o objemu 4 dm³, plněná silikagelem s velikostí částic od 63 do 200 pm.

Pracovní podmínky: axiální hydraulický tlak: 1 MPa, průtok: 60 cm³/min, eluční soustava 1: chloroform/methylenchlorid/ethanol v objemovém poměru = 48:50:2, eluční soustava 2: chloroform/ethylacetát/ethanol v objemovém poměru - 48:50:2, množství čištěného produktu: 280 g, složeni Čištěného produktu:

CA (= cyklosporin A): 51,36 % hmotn.,

CB (= cyklosporin B): 7,92 % hmotn.,

CC (= cyklosporin C): 7,92 % hmotn..

Uvedená směs se rozpustí v 1 dm³ eluční soustavy 1 a zavede na chromatografický sloupec.

Eluce se započne eluční soustavou 1 a po spotřebování 20 dm³ této eluční soustavy se v eluci pokračuje za použití eluční soustavy 2. Průběh eluce je graficky zobrazen na připojeném obr. 1 (vynesené hodnoty jsou označené prázdnými kroužky).

Eluční soustava (dm³)	Odpařená látka (g)	CA (% hmotn.)	CB (% hmotn.)	Ztráta sušením (% hmotn.)	m_CA (g)	CA* (% hmotn.)
9	10,0
10	19,48	72,26	-	2,39	14,61	74,04
11	21,47	74,95	-	4,72	17,32	78,67
12	12,94	80,59	-	2,34	10,73	82,56
13	10,26	88,29	-	1,75	9,23	89,42
14	9,30	86,64	-	1,65	8,21	88,15
15	8,95	89,13	-	1,45	8,10	90,44
16	7,25	90,99	-	1,65	6,71	92,52
17	5,85	92,11	-	1,18	5,45	93,22
18	4,99	84,74	-	1,57	4,30	86,12
19	4,06	82,55	-	2,46	3,45	84,65
20	3,55	84,31	-	1,87	3,05	86,00
21**	2,52	84,37	-	2,22	2,18	86,42
22	2,48	82,59	-	3,25	2,12	85,37
23	1,98	82,86	-	3,93	1,71	86,22
24	18,67	88,34	-	1,48	16,77	89,68
25	9,44	85,52	-	1,48	8,21	86,80

-4CZ 285518 B6

26	7,03	79,10	-	1,32	5,65	80,24
27	6,57	67,96	15,88	1,53	4,75	69,11
28	7,21	35,66	45,73	1,47	2,67	36,21
29	4,95	10,84	62,37	1,25	0,59	10,99
30	2,30	3,52	64,57	0,61	0,09	3,55
31	0,40	3,09	68,82	0,49	0,01	3,16
32	1,00	3,22	69,05	0,52	0,03	3,23
33	0,85	-	75,99	0,33	—	—
34	1,83	-	76,05	0,46	—	—
35	2,20	-	-	-	-	-

CA* množství cyklosporinů A, vztažené na sušinu, ** změna eluční soustavy,

Výtěžek: 20,26 g, 14,08 %,

Čistota: vyšší než 90 % hmotn.

Příklad 2

Zařízení: axiálně tlakovaná preparativní kolona pro kapalinovou chromatografíi o objemu 4 dm³, plněná silikagelem Měrek s velikostí částic 63 až 200 pm.

Pracovní podmínky: axiální hydraulický tlak: 1 MPa, průtok: 60 cm³/min, eluční soustava 1: chloroform/methylenchlorid/ethanol v objemovém poměru 48:50:2, eluční soustava 2: chloroform/ethylacetát/ethanol v objemovém poměru 48:50:2, množství čištěného produktu: 280 g, složení čištěného produktu:

CA (=cyklosporin A): 51,35 % hmotn.,

CB (=cyklosporin B): 7,92 % hmotn.,

CC (=cyklosporin C): 7,92 % hmotn..

Uvedená směs se vystaví tepelnému zpracování při teplotě 110 °C na vzduchu po dobu jedné hodiny, načež se v průběhu 5 hodin ochladí na teplotu 20 °C stále pod atmosférou vzduchu. Tavenina se potom rozpustí v 1 dm³ eluční soustavy 1 a zavede na chromatografický sloupec. Eluce se zahájí eluční soustavou 1 a po spotřebování 27 dm³ této soustavy se v eluci pokračuje za použití eluční soustavy 2. Průběh eluce je graficky zobrazen na obr. 1 (vynesené hodnoty jsou označené plnými kroužky).

-5CZ 285518 B6

Eluční	Odpařená	CA	CB	Ztráta	m_CA	CA*
soustava	látka			sušením
(dm³)	(g)	(% hmotn.)	(% hmotn.)	(% hmotn.)	(g)	(% hmotn.)
31	15,59	93,54		1,68	14,84	95,18
32	21,55	94,76	-	2,87	21,03	97,56
33	8,93	91,68	-	2,01	8,36	93,56
34	4,33	89,13	0,38	1,42	3,92	90,59
35	2,79	86,12	0,84	1,42	2,44	87,37
36	6,72	72,30	14,98	1,05	4,92	73,17
37	6,92	13,39	46,49	1,76	1,04	13,64
38	2,82	9,05	72,50	1,41	0,29	9,18
39	1,02	7,43	69,24	0,89	0,08	7,50
40	1,07	5,0	67,09	1,42	0,06	5,60
41	1,10	6,79	69,63	3,52	0,11	7,04
42	0,89	4,06	68,15	4,29	0,07	4,25
43	1,20	4,24	77,21	4,78	0,10	4,46
44	1,13	2,83	90,51	0,10	0,03	2,83
45	1,34	1,72	85,29	-	0,02	-
46	1,44	1,63	80,80	0,92	0,03	-

Celkový výtěžek: 118,8 g (77,75 %),

Čistota: vyšší než 90 % hmotn.,

Čistota 21,03 g produktu (14,62 %) byla vyšší než 97,5 % hmotn.).

Příklad 3

Zařízení: kolona pro preparativní chromatografii o objemu 700 cm³, plněná silikagelem Měrek s velikostí částic 63 až 200 pm.

Pracovní podmínky: průtok: 3 cm³/min, eluční soustava 1: aceton/methylenchlorid v objemovém poměru 18:82, eluční soustava 2: aceton/methylenchlorid v objemovém poměru 20:80, množství čištěné směsi: 50 g rozpuštěno v 350 ml methylenchloridu, složení čištěné směsi:

CA (=cyklosporin A): 61,48 % hmotn.,

CB (=cyklosporin B): 9,41 % hmotn.,

CC (=cyklosporin C): 7,47 % hmotn..

Průběh eluce je graficky zobrazen na obr. 2 (vynesené hodnoty jsou označené prázdnými kroužky).

-6CZ 285518 B6

Eluční	Odpařená látka	CA	CB	Ztráta sušením	m_CA	CA*
soustava
(dm³)	(g)	(% hmotn.)	(% hmotn.)	(% hmotn.)		(% hmotn.)

200	—	—	-	—	—	—
400	—	—	—	—	—	—
600	-	—	—		—	—
800	8,38	66,38	-	0,44	5,56	66,67
1000	10,82	77,66	-	1,0	8,40	78,76
1200	4,26	77,71	-	0,99	3,31	78,48
1400	2,88	71,23	0,22	1,26	2,05	72,13
1600	1,99	71,64	0,50	1,83	1,42	72,97
1800	1,45	68,16	1,03	1,35	0,98	69,09
2000	1,12	72,41	1,42	0,35	0,81	72,66
2200	1,09	59,57	1,60	1,12	0,64	60,24
2400	0,89	63,17	2,22	0,64	0,56	59,73
2600	0,78	59,35	2,64	0,64	0,46	59,73
2800	0,85	-	-		—	—
3000	0,53	50,02	4,06	0,70	0,26	50,35
3200	0,74	-	-	—	—	—
3400	0,40	40,65	4,32	0,73	0,16	40,94
3600	0,40	30,78	4,17	0,51	0,12	30,15
3800	0,63	—	—	—	—	—
4000	0,48	-	—	—	—	—
4200	0,40	—	—	—	—	—
4400	0,40	-	—		—	—
4600	0,20	—	—	—	—	—
4800**	0,26	-	—		—	—
5000	0,50	—	—		—	—
5200	0,25	—	—	—		—
5400	0,07	—	—	—	—	—
5600	0,03	—	—	—		—
5800	0,06	—	—	—		—
6000	0,06	-	—		—	—
6200	0,04	—	—			—
6400	11,48	2,38	0	0,57	0,27	0,39
6600	0,25	-	-	—	—	—

CA* koncentrace cyklosporinu A, vztažená na sušinu, ** změna eluční soustavy.

Nebyl izolován žádný produkt, jehož čistota by přesahovala 90 % hmotn..

Obsah cyklosporinu A ve frakci, mající nejvyšší obsah účinné látky, činí 78,7 %, což odpovídá 8,4 g čistého cyklosporinu A.

Příklad 4

Zařízení: kolona pro preparativní kapalinovou chromatografii o obsahu 700 cm³, naplněná silikagelem Měrek s velikostí částic 63 až 200 pm.

Pracovní podmínky: průtok: 3 cm³/min, eluční soustava 1: aceton/methylenchlorid v objemovém poměru 18:82, eluční soustava 2: aceton/methylenchlorid v objemovém poměru 20:80, množství čištěné směsi: 50 g směsi tepelně zpracované po dobu jedné hodiny při teplotě 110 °C. Tavenina se ochladí, rozpustí v 350 cm³ methylenchloridu a převede na chromatografický sloupec, složení čištěné směsi:

CA (= cyklosporin A): 61,48 % hmotn., io CB (= cyklosporin B): 9,41 % hmotn.,

CC (= cyklosporin C): 7,47 % hmotn..

Průběh eluce je graficky zobrazen na připojeném obr. 2 (vynesené hodnoty jsou označené plnými kroužky).

Eluční	Odpařená	CA	CB	Ztráta	m_CA	CA*
soustava	látka			sušením
(dm³)	(g)	(% hmotn.)	(% hmotn.)	(% hmotn.)	(g)	(% hmotn.)
600
800	0,29	-	-	-	-	-
1000	5,4	68,50	-	0,33	3,69	68,72
1200	13,26	90,09	—	1,37	11,94	91,34
1400	4,48	88,20	-	0,50	3,95	88,64
1600	2,84	84,41	0,39	0,34	2,39	84,69
1800	1,98	81,88	0,87	0,46	1,62	82,25
2000	1,38	78,16	1,30	0,44	1,07	78,50
2200	1,49	77,40	1,92	1,37	1,15	78,47
2400	0,95	70,80	2,26	1,14	0,67	71,61
2600	0,75	66,99	3,09	0,34	0,50	67,21
2800	0,60	64,78	4,07	0,66	0,38	65,21
3000	0,39	58,07	5,34	0,63	0,22	58,43
3200	0,45	53,11	5,22	0,31	0,23	53,27
3400	0,41	46,48	5,84	0,47	0,19	46,69
3600	0,37	-	-	-	-	-
3800	0,34	-	-	-	-	-
4000	0,23	-	-	-	-	-
4200	0,27	—	-	-	-	-
4400	0,19	—	-	-	-	-
4600	0,16	-	-	-	-	-
4800	0,10	-	-	-	-	-
5000**	0,20	-	-	-	-	-
5200	0,15	-	-	-	-	-
5400	0,18	-	-	-	-	-
5600	0,28	-	-	-	-	-
5800	0,10	-	-	-	-	-
6000	0,04	—	-	-	-	-
6200	5,23	2,52	43,28	0,48	0,13	2,49
6400	4,59	—	6,82	0,56	-	-
6600	0,62	-	0,87	0,34	-	-
6800	0,06	-	-	-	-	-

-8CZ 285518 B6

CA* koncentrace cyklosporinu A, vztažená na sušinu, ** změna eluční soustavy,

Výtěžek: 11,94 g, 38,89 %.

Čistota: vyšší než 90 % hmotn..

Příklad 5

Zařízení: kolona pro preparativní kapalinovou chromatografii o obsahu 700 cm³, naplněná silikagelem Měrek, majícím velikost částic 63 až 200 pm.

Pracovní podmínky: průtok: 3 cm³/min.

eluční soustava 1: aceton/methylenchlorid v objemovém poměru 18:82, eluční soustava 2: aceton/methylenchlorid v objemovém poměru 20:80.

Roztok 50 g látky, rozpuštěné v methylenchloridu, se odpaří a takto získaný zbytek se tepelně zpracuje po dobu dvou hodin při teplotě 80 °C a zavede na chromatografický sloupec.

Složení čištěné směsi:

CA (= cyklosporin A): 30,74 % hmotn., CB (= cyklosporin B): 4,7 % hmotn., CC (= cyklosporin C): 3,7 % hmotn..

Eluční	Odpařená	CA	CB	Ztráta	m_CA	CA*
soustava	látka			sušením
(dm³)	(g)	(% hmotn.)	(% hmotn.)	(% hmotn.)	(g)	(% hmotn.)
800
1000	8,95	74,32	-	0,85	6,65	74,93
1200	8,56	85,33	—	1,45	7,30	86,53
1400	3,91	86,03	-	1,32	3,36	87,68
1600	2,72	84,20	0,42	0,58	2,29	84,68
1800	1,94	76,74	0,47	0,96	1,48	77,02
2000	1,54	84,71	1,13	0,38	1,30	84,73
2200	1,28	84,95	1,78	0,42	1,08	85,28
2400	1,04	85,38	2,36	0,36	0,88	85,68
2600	1,02	84,25	3,51	0,28	0,85	84,45
2800	0,76	82,36	4,27	0,38	0,62	82,55
3000	0,56	78,25	4,85	0,54	0,43	78,63
3200	0,48	76,38	4,25	0,64	0,36	76,74
3400	0,47	-	-	-	-	-
3600	0,42	-	-	-	-	-
3800	0,62	-	-	-	-	-
4000	0,32	-	-	-	-	-
4200	0,54	-	-	-	-	-
4400	0,56	-	-	-	-	-
4600	0,54	-	-	-	-	-
4800	0,54	-	-	-	-	-
5000**	0,61	-	-	-	-	-
5200	0,78	-	-	-	-	-
5400	0,92	-	-	-	-	-
5600	0,62	-	-	-	-	-

-9CZ 285518 B6

CA* koncentrace cyklosporinů A, vztažená na sušinu ** změna eluční soustavy.

Nebyla izolována žádná frakce s obsahem účinné látky, přesahujícím 90 %. Obsah cyklosporinů A ve frakci, mající nej vyšší obsah účinné látky, činí 87,08%, což odpovídá 3,36 g čistého cyklosporinů A.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob čištění cyklosporinů A chromatografií ze směsi, obsahující zejména cyklosporiny A, B a C a ostatní cyklosporinové složky polárnější nebo apolámější než cyklosporin A nebo jim podobné nečistoty, vyznačený tím, že se směs nebo zbytek po jejím odpaření před chromatografií roztaví zahřátím na teplotu 80 až 115 °C a následně ochladí na teplotu 10 až 35 °C.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se chromatografie provádí za postupného použití eluční soustavy, tvořené směsí chloroformu, dichlormethanu a ethanolu v objemovém poměru 48:50:2, a eluční soustavy, tvořené směsí chloroformu, ethylacetátu a ethanolu v objemovém poměru 48:50:2.