CZ282927B6 - Vakcina pro imunizaci proti TBE-virové infekci jakož i způsob její výroby - Google Patents
Vakcina pro imunizaci proti TBE-virové infekci jakož i způsob její výroby Download PDFInfo
- Publication number
- CZ282927B6 CZ282927B6 CZ951769A CZ176995A CZ282927B6 CZ 282927 B6 CZ282927 B6 CZ 282927B6 CZ 951769 A CZ951769 A CZ 951769A CZ 176995 A CZ176995 A CZ 176995A CZ 282927 B6 CZ282927 B6 CZ 282927B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- protein
- virus
- tbe
- prm
- proteins
- Prior art date
Links
- 230000003053 immunization Effects 0.000 title claims abstract description 44
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 44
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 42
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 39
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 37
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 37
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 59
- 238000002649 immunization Methods 0.000 title claims description 40
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 title claims description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 4
- 208000032096 Encephalitic infection Diseases 0.000 title 1
- 208000006142 Infectious Encephalitis Diseases 0.000 title 1
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 title 1
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 claims abstract description 74
- 101710088839 Replication initiation protein Proteins 0.000 claims abstract description 53
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 45
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims abstract description 31
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 54
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 40
- 208000004006 Tick-borne encephalitis Diseases 0.000 claims description 35
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 claims description 21
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 19
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 19
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 15
- 241000710771 Tick-borne encephalitis virus Species 0.000 claims description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 10
- 101800001127 Protein prM Proteins 0.000 claims description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 7
- 101710166632 Pre-core protein X Proteins 0.000 claims description 5
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 40
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 39
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 22
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 20
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 19
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 16
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 16
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 16
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 13
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 13
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 12
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 description 11
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 11
- 229940023146 nucleic acid vaccine Drugs 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 8
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 7
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 6
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 6
- 101150013191 E gene Proteins 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 101150064860 PRM gene Proteins 0.000 description 4
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 4
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 4
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 3
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 3
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N Glycyl-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 description 2
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 2
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 2
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003067 hemagglutinative effect Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- JSLGXODUIAFWCF-WDSKDSINSA-N Arg-Asn Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O JSLGXODUIAFWCF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- DYDKXJWQCIVTMR-WDSKDSINSA-N Asp-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O DYDKXJWQCIVTMR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 1
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- WXOFKRKAHJQKLT-BQBZGAKWSA-N Cys-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CS WXOFKRKAHJQKLT-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 description 1
- 101800001632 Envelope protein E Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 206010054261 Flavivirus infection Diseases 0.000 description 1
- LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- UQHGAYSULGRWRG-WHFBIAKZSA-N Glu-Ser Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UQHGAYSULGRWRG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- IDXZDKMBEXLFMB-HGNGGELXSA-N His-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CNC=N1 IDXZDKMBEXLFMB-HGNGGELXSA-N 0.000 description 1
- VLDVBZICYBVQHB-IUCAKERBSA-N His-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CN=CN1 VLDVBZICYBVQHB-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 101000711237 Homo sapiens Serpin I2 Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010042653 IgA receptor Proteins 0.000 description 1
- KTGFOCFYOZQVRJ-ZKWXMUAHSA-N Ile-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O KTGFOCFYOZQVRJ-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- RNKSNIBMTUYWSH-YFKPBYRVSA-N L-prolylglycine Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 RNKSNIBMTUYWSH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 101150033828 NS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 1
- HMNSRTLZAJHSIK-YUMQZZPRSA-N Pro-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 HMNSRTLZAJHSIK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- HXNYBZQLBWIADP-WDSKDSINSA-N Pro-Cys Chemical compound OC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 HXNYBZQLBWIADP-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- RVQDZELMXZRSSI-IUCAKERBSA-N Pro-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 RVQDZELMXZRSSI-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- AFWBWPCXSWUCLB-WDSKDSINSA-N Pro-Ser Chemical compound OC[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 AFWBWPCXSWUCLB-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 102100034014 Prolyl 3-hydroxylase 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- PBUXMVYWOSKHMF-WDSKDSINSA-N Ser-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO PBUXMVYWOSKHMF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 102100034076 Serpin I2 Human genes 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- UQTNIFUCMBFWEJ-IWGUZYHVSA-N Thr-Asn Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O UQTNIFUCMBFWEJ-IWGUZYHVSA-N 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001738 isopycnic centrifugation Methods 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 108010004914 prolylarginine Proteins 0.000 description 1
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 108010071207 serylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000009966 trimming Methods 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000007502 viral entry Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5258—Virus-like particles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24161—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2770/24162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Řešení popisuje vakcinu pro imunizaci proti infekcím TBE-viry, obsahující neinfekční, subvirální částice, které obsahují protein E a popřípadě protein prM/M, jeho vakcinu, obsahující nukleovou kyselinu, která koduje protein E a protein prM/M, odvozené z TBE-viru, kde protein E je přítomen alespoň v podstatě úplné nativní formě popř. ji koduje.ŕ
Description
Vakcína pro imunizaci proti infekci virem klíšťové encefalitidy, způsob její výroby, neinfekční subvirální částice a nukleokyselinový a plazmidový vektor
Oblast techniky
Vynález se týká zlepšené vakcíny pro imunizaci proti TBE-virovým infekcím, jakož i způsobu její výroby.
Dosavadní stav techniky
TBE (Tick-Bome-Encephalitis) -virus je v mnoha evropských zemích, bývalém Sovětském svazu a Číně, endemický. Nemoc představuje v některých zemích střední Evropy, jako je Rakousko, 15 Čechy, Slovensko, Slovinsko nebo Maďarsko, kde každý rok je registrováno několik set případů v nemocnicích, významný problém pro veřejné zdraví (WHO; EURO Reports and Studies, 104; 1983).
TBE-virus, který' existuje ve formě západního, evropského a dálněvýchodního subtypu, patří do 20 rodu Flavivirů, které jsou RNA-viry, obalené sférickým lipidovým obalem (viz Monath, T. P.:
Flaviviruses, ve: Fields, B. N. (vyd.) Virology, Raven Press, N. Y. 1990, str. 763-814).
Flavi-virový virion obecně sestává z nukleokapsidu, který obsahuje pozitivní řetězec RNAgenomu ve spojení s virálním kapsidovým (C) -proteinem. Nukleokapsid je obklopen lipidovým 25 obalem, který obsahuje s membránou asociované proteiny E (50 až 60 kD) a M (7 až 8 kD) (Heinz a Roehrid v: vyn Regenmortel aNeurath (Hrsgb.) Immunochemistry of Viruses II. The Basis for Seradiagnosis and Vaccines. Elsevier Sciences, Amsterodam (1990), 289-305).
Hlavní obalový' protein E hraje ústřední roli v biologii Flavi-virů, kde zprostředkuje významné 30 virové vstupní funkce a vyvolává protektivní imunitní odpověď v hostiteli. Existuje již velké množství informací o struktuře obalového proteinu E TBE-viru a byl navržen strukturní model na základě mnoha biochemických a immunologických dat (Mandl aspol., J. Virol. 63 (1989), 564-571).
Chorobě se může účinně zabránit očkováním vysoce čistou formalinem inaktivovanou očkovací látkou celého viru (viz Kunc a spol., J. Med. Virol., 6 (1990), 103-109), která indukuje imunitní odpověď proti strukturnímu proteinu viru (Kunc, Ch. Acta leidensia 60, č. 2, 1-14, 1992). Tato očkovací látka se nejlépe osvědčila, ale při výrobním postupu musí být zpracovávány velké objemy infekčních a potenciálně nebezpečných suspenzí viru. Proto jsou potřebná objemná a drahá bezpečnostní opatření.
Schopnost protilátek inaktivovat virus závisí na tom, jak účinně rozpoznávají nativní strukturu proteinu na virovém povrchu. V případě TBE-virů a dalších Flavi-virů se přitom jedná v první řadě o protein E (viz Heinz a Mandl, APMIS, 101 (1994), 735-745). Pro vyvolání imunizace je 45 přitom žádoucí, aby očkovací látka obsahovala tento protein ve stejné formě, ve které je přítomen na povrchu infekčního viru. Očkovací látky celého viru mají tu nevýhodu, že nutný postup inaktivace může vést k částečným změnám struktury nativního proteinu.
Rekombinantni DNA-technologie nabízí možnost nahradit očkovací látku na bázi celého viru 50 rekombinantními proteiny, které obsahují podstatnou část proteinů, indukujících imunitní odpověď. U těchto genovětechnických expresí jednotlivých virových proteinů však není jisté, že antigenní struktura těchto rekombinatních proteinů odpovídá příslušnému proteinu na povrchu viru.
- 1 CZ 282927 B6
Exprese rekombinantních proteinů TBE-viru je například známa z práce Allisona a spol., Gemeinsame Jahrestatung ÓBG-OGGGT (1993) PÍ 14. Bylo zde zjištěno, že protein E a protein M při svých rekombinantních expresích za určitých podmínek mohou být odděleny v různé formě, mezi jiným také ve formě neinfekčních subvirálních částic.
Takové subvirální částice jsou známy pro vzdáleně příbuzné TBE-viry, zejména virus japonské encefalitidy (JEV), virus žluté horečky a Dengue-virus (viz Konishi a spol., Virology 188 (1992), 714-7 20, nebo WO 92/03545).
V práci Kohnishiho je sice popsáno, že takové subvirální částice, které byly emulgovány s Freudovým kompletním adjuvans a obsahují celý protein E, vyvolávají jistou imunitní odpověď u myší, ale na druhé straně bylo prokázáno, že s částečně C-terminálně zkráceným proteinem E může být dosaženo podstatně účinnější ochrany než s celým proteinem E proti infekci Flavivirv (WO 92/03161).
Úloha vynálezu spočívá tedy v tom, nalézt zlepšenou očkovací látku proti TBE-infekcím.
Podstata wnálezu
Tato úloha je podle vynálezu řešena vakcínou pro imunizaci proti infekci virem klíšťové encefalitidy (TBE-virem), která obsahuje neinfekční, subvirální částice, které obsahují protein E v jeho úplné nativní formě a/nebo protein prM/M, kde tyto proteiny jsou odvozeny z TBE-viru.
Podstatné přitom je, že protein E je ve své plně nativní formě, protože jen s ní je možno poskytnout účinnou ochranu. Ve vakcíně podle vynálezu byly prokázány nativní formy proteinu E s pomocí různých analýz, zejména
a) analýzy antigenní struktury s monoklonálními protilátkami,
b) schopnosti kyselinou indukovaných změn konformace, a
c) aktivitou aglutinace krve.
Skutečnost, že vakcína podle vynálezu může být na základě svého složení neinfekční, představuje pro bezpečnost očkovací látky důležitý aspekt z hlediska známých vakcín.
Výhodné je, když protein E a/nebo protein prM/M jsou rekombinantní proteiny.
Podle jednoho zvláště výhodného provedení vakcíny je rekombinantní protein E odvozen z TBEviru, kde - podle oblasti použití - se používá jak západní (evropský) subtyp, tak i dálněvýchodní subtyp. Výhodně obsahují neinfekční částice ještě lipidovou složku, která je výhodně přítomna ve vesikulární formě.
Ukázalo se, že oproti mínění odborné veřejnosti (viz WO 92/03161), rekombinantní protein E, který je odvozen zTBE-virů, může poskytnout dostačující imunizaci proti infekcím jen v této formě neinfekčních subvirálních částic. Částečně zkrácená forma proteinu E, u které, jako ve WO 92/03161. byla odstraněna C-terminální membránová kotva, nemůže být použita pro výrobu účinné vakcíny. Vakcína podle vynálezu obsahuje výhodně neinfekční částice, které jsou prosté pomocí PCR detegovatelných, z TBE-viru odvozených, nukleových kyselin. Toto může být například prokázáno metodami, popsanými v práci Konishi-ho a spol.
-2CZ 282927 B6
Dále se vynález týká způsobu výroby TBE-vakcíny, který se vyznačuje tím, že
- se použije buněčný kultivační systém, který obsahuje kódující sekvence pro protein prM a E, kde tyto proteiny jsou odvozeny z TBE-viru,
- protein E se exprimuje ve své plné, nativní formě, přičemž
- se vytvoří subvirálni, neinfekční částice, které obsahují rekombinantní protein E v jeho úplné, nativní formě, a po případě obsahují rekombinantní protein prM/Μ, a
- částice se shromáždí, jakož i přímo použijí, pro přípravu přípravků, vhodných pro imunizaci.
Způsob podle vynálezu poskytuje velkou výhodu v tom, že není nutný inaktivační krok pro viry, například formalinem, což jednak podstatně zvyšuje kvalitu vakcíny (protein E je v nativní formě a ne ve formě, změněné zpracováním s formalinem a alespoň částečně denaturované formě), a jednak se technicky produkce této vakcíny významně usnadní, protože se částice přímo (také bez zpracování formalinem) mohou zpracovávat na farmaceutický přípravek.
Zvláště výhodné je při provedení způsobu použití buněčného systému buněčné kultury, který obsahuje kódující sekvence pro rekombinantní proteiny prM aE z TBE-viru v chromozomálně integrované formě.
Jsou však systémy buněčných kultur, ve kterých jsou k použití virální vektory, nebo systémy buněčných kultur, ve kterých se pracuje bez virů, například s plazmidovým vektorem, které jsou popřípadě rovněž vhodné pro výrobu částic podle vynálezu.
Podle jedné výhodné formy provedení způsobu se provádí jak exprese proteinu, tak také tvorba částic kontinuálně.
Dále je předmětem předloženého vynálezu použití neinfekčních, subvirálních částic, obsahujících protein E v jeho plně nativní formě a/nebo protein prM/Μ, kde tyto proteiny jsou odvozeny z TBE-viru, pro výrobu vakcíny pro aktivní imunizaci proti TBE-virové infekci.
Dále se předložený vynález týká medicínského použití neinfekčních, subvirálních částic, obsahujících v podstatě protein E v jeho úplné, nativní formě, a popřípadě protein prM/Μ, kde proteiny jsou odvozeny z TBE-viru, zejména pro výrobu přípravků anti-TBE-virusimunoglobulin. Také zde je výhodné, aby protein E a popřípadě protein prM/Μ byly rekombinantní proteiny.
S překvapením bylo nalezeno, že nukleové kyseliny, které obsahují zvolené kódující sekvence, mohou být použity také pro imunizaci proti TBE-virovým infekcím.
Ze stavu techniky je známo, že zavedení holé DNA do myší může vyvolat imunitní odpověď. Například mohou myši, kterým byl injektován plazmid, obsahující genomickou kopii lidského růstového hormonu (hGH), vyvíjet protilátku proti lidskému hGH (Nátuře, 356 (1992), 152-154).
Dále jsou popsány některé úspěšné genetické imunizace holou DNA. Při těchto genetických imunizacích byla použita DNA, která kóduje jeden nebo více antigenů viru, přičemž se in vivo syntetizují odpovídající virální antigeny. které od sebe odděleně vyvolávají každý pro sebe imunitní odpověď a následkem toho mohou vyvolávat další ochranu před virovou infekcí. Úspěšná protektivní imunita u myší intramuskulámí injekcí Influenza-virové DNA byla popsána ve PNAS 91 (1994), str. 9519-9523 (Raz a spol.). Popřípadě úspěšná imunizace krys a myší proti povrchovému antigenů viru hepatidy B (HBV) intramuskulámí injekcí plazmid-DNA, která obsahuje sekvence, kódující HBV-povrchový antigen, byla popsána ve Vaccine 12 (16), (1994),
-3CZ 282927 B6 str. 1503-1509 (Davis a spol.). Mnoho pokusů pro imunizaci holou DNA, kódující antigen pathogenu, zůstává ale bezúspěšných. Například byly sice popsány pokusy o imunizaci proti HTV prostřednictvím přímého DNA-transferu do tělesných buněk (WO 93/17706), úspěšná vakcína však tímto způsobem získána nebyla. Zvláště se jeví, že pro úspěšný imunizační účinek čisté 5 DNA-vakciny - vedle zavedení DNA do buněk- je zvláště výhodné, aby imunitní odpověď vyvolávající antigen byl přítomen v nativní formě. Exaktní struktura nativní formy, popř. biosyntetické předstupně, které jsou potřebné pro tvorbu nativní formy a struktury, jsou jen pro málo pathogenů zjištěny, takže účinná imunizace holými nukleovými kyselinami se v mnoha případech koná krajně obtížně, pokud není - na základě nedostatečných přesných znalostí ío antigenové struktury zcela nerealizovatelná podle současných znalostí.
V rozsahu předloženého vynálezu bylo zjištěno, že imunizace nukleokyselinovou sekvencí, která výhradně kóduje protein E, vyvolávající podstatnou imunitní odpověď při TBE infekci, nestačí, aby byla získána imunitní odpověď, která chrání před onemocněním
Překvapivě mohla být získána dostatečná imunitní odpověď jen použitím nukleokyselinových sekvencí, které vedle kódující sekvence pro protein E ve své plné, nativní formě, ještě obsahují sekvence, kódující protein prM/M. Dále se ukazuje, že s nukleokyselinou, obsahující protein Ekódující sekvenci, která obsahuje deleci kotvové oblasti proteinu E, nemůže být rovněž dosaženo 20 žádné úspěšné imunizace.
Předložený vynález se týká podle dalšího aspektu vakcíny pro imunizaci proti infekci virem klíšťové encefalitidy (TBE-virem), obsahující nukleovou kyselinu, která kóduje v alespoň v podstatě úplné, nativní formě, protein E a protein prM/M, odvozené zTBE-viru.
Předloženým vynálezem mohla být poprvé obecné provedena nukleokyselinová imunizace pro Flaviviry. Imunizační systém podle vynálezu je proto základní nejen pro TBE-virovou imunizaci, ale - pro velkou homologii všech Flavivirů vzhledem k proteinu E a prM/M (viz Chambers a spol., Annual Review of Microbiology, Vol. 44, 1990, str. 649-688: Flavivirus Genome 30 Organization. Expression and Replication) obecně pro imunizaci proti infekcím Flaviviry.
Podstatné pro nukleokyselinovou vakcínu pro imunizaci proti TBE-viru je, aby protein E byl kódován ve své v podstatě úplné nativní formě nukleovou kyselinou. Samozřejmě spadají vakcíny s nukleovými kyselinami, které se získají z degenerace genetického kódu z výměny 35 strukturně nepodstatných aminokyselinových rekodonů nebo z přirozeně nebo v laboratoři vyrobených mutací, popřípadě do rozsahu vynálezu, pokud tyto nukleokyselinové remodifikace, kódující sekvence proteinu E, mohou vyvolávat dostatečnou imunitní odpověď. Vakcína, obsahující nukleovou kyselinu s delecemi nebo inzercemi v kódující sekvenci proteinu E, které v podstatě ponechávají nezměněnou za imunizaci zodpovědnou strukturu proteinu E v oblasti 40 antigenního epitopu, jsou rovněž považovány za spadající do rozsahu vynálezu, protože platí za odvozené zTBE-virové sekvence. Stejné samozřejmě platí také pro kódující sekvenci proteinu prM/M. Protože protein prM/M je důležitý pro spolehlivou tvorbu a sekreci subvirální částice, nejsou sekvenční odchylky, pokud se jedná o protein prM/M, tak významné jako u proteinu B, pokud je zaručeno úspěšné sestavení částice. Charakter nukleové kyseliny není pro vynález 45 podstatný. RNA a DNA mohou být použity stejné, přičemž DNA pro svoji zvýšenou stabilitu proti RNA má v mnoha oblastech přednost. Nukleové kyseliny mohou být vyrobeny biologickou nebo chemickou syntézou.
Výhodně je nukleová kyselina, kódující protein E, odvozena od evropského nebo 50 dálněvýchodního subtypu TBE-viru, protože to jsou nejrozšířenéjší subtypy.
Nejvýhodnější nukleokyselinové vakcíny jsou ty, ve kterých nukleová kyselina je plazmidový vektor. Jako zvláště vhodné plazmidové vektory byly stanoveny ty, které obsahují silné
-4CZ 282927 B6 promotory, jako např. HSV-, RSV-, EBV-, β-aktin-, adeno-, MMTV, hsp- a hGH-promotor. Silné promotory umožňují účinnou genovou expresi.
K nejvhodnějším vektorům, popř. promotorům, patří plazmidy, odvozené od plazmidu pCMVp (Mac Gregor a spol.), které obsahují CMV-Immediate Early-promotor.
Samozřejmě mohou nukleové kyseliny nukleokyselinové vakcíny podle vynálezu obsahovat ještě další kódující nebo nekódující sekvence, zejména jestliže jsou nukleokyseliny používány jako nukleokyselinový vektor.
Příklady takových dalších sekvencí jsou - vedle promotorů - ještě markerové geny, další regulátory, týkající se transkripce, translace nebo posttranslačních modifikací atd. Při těchto komplexních nukleokyselinových konstruktech je však třeba dávat pozor na to, aby po zavedení nukleové kyseliny do cílového místa nemohl být vytvořen žádny infekční virus, a vakcína tak je 15 mrtvá očkovací látka, popř. jí zůstává.
Nukleokyselinová vakcína podle vynálezu může v nejjednodušší formě obsahovat holou nukleovou kyselinu, popřípadě ve vhodném pufrovacím systému, další složky, jako léčivé přísady, nosičové substance nebo speciální substance pro specifické podání mohou být popřípadě 20 rovněž přítomny.
Aplikace nukleokyselinové vakcíny podle vynálezu se výhodně provádí injekcí, zejména intramuskulámí, intradermální nebo subkutánní injekcí, může být ale také podávána orálně.
Podávané množství nukleokyselinové vakcíny podle vynálezu se řídí typem podáni a použitou přísadou. V případě intramuskulámího podání je podávané množství obvykle vyšší než u intradermálního podání pro dosažení stejné protektivní imunitní odpovědi. Výhodně používané množství leží obecně v oblasti od 0,01 ng do 10 mg/dávku, nejvýhodněji v oblasti 1 ng až l mg/dávku.
Nukleokyselinová vakcína podle vynálezu má podstatnou výhodu v tom, že nemusí být použit žádný systém buněčné kultury pro výrobu subvirálních částic, nýbrž částice mohou být vytvořeny in vivo a tak přímo vyvolávat imunitní odpověď.
Nukleokyselinová vakcína podle vynálezu má dále proti vakcínám, které jsou založeny na proteinech, tu výhodu, že vykazuje velkou stabilitu, zejména je-li nukleovou kyselinou DNA. Tím je možné skladovat vakcínu také bez velkých nákladů na chlazeni po dlouhou dobu, přičemž při tomto skladování nejsou očekávány žádné ztráty aktivity. Zejména v lyofilizované formě může být nukleová kyselina skladována při teplotě místnosti po prakticky neomezenou dobu nepoškozená. Také rekonstituce lyofilizované nukleokyselinové vakcíny podle vynálezu může být provedena jednoduše ve srovnání s rekonstitucí lyofilizovaného proteinového roztoku, který vzhledem k charakteru proteinu může působit problémy.
Další výhodou nukleokyselinové vakcíny podle vynálezu je, že na rozdíl od konvenčních mrtvých očkovacích systémů se imunizující antigen syntetizuje in vivo a vede k vytvoření účinné imunitní celulámí odpovědi (Science, vol. 259, 19. březen 1993, str. 1691-1692, Research News: Naked DNA Points Way to Vaccines).
Podle dalšího aspektu se vynález týká nukleokyselinových sekvencí, zejména obsahujících celou kódující sekvenci proteinu E a prM/M, odvozenou od TBE-viru, jako léčiva. Podle známého stavu techniky nebylo popsáno dosažení imunizace jedinou nukleovou kyselinou s flavivirovou DNA. Medicínské použití této nukleové kyseliny (-vektorů) představuje překvapující novou možnost použití. Vektorem jsou podle vynálezu míněny každé nukleokyselinové vehikuly, také
-5 CZ 282927 B6 zejména plazmidy, viry nebo transposony.
Dosud byl popsán jeden z SV40 odvozený plazmidový vektor, který obsahuje proteinovou sekvenci proteinu prM/M a E, odvozených od TBE-viru (Allison a spol., Virus-Genes 8 (3), (1994), str. 187-198). Pro tento SV40-plazmid nebyla však diskutována možnost imunizačního účinku.
Plazmidové vektory podle vynálezu se liší od dosud popsaných plazmidových vektorů svojí vhodností k imunizaci. Proto jsou plazmidové vektory podle vynálezu, zejména ve formě k podávání hotových roztoků nebo lyofilizátů, ve stříkačce vhodné pro podání, popř. v ampuli.
U plazmidových vektorů jsou podle vynálezu výhodně účinně zabudovány promotory, které jsou vybrány ze skupiny, zahrnující CMV-, HSV-, RSV-, EBV-, β-aktin-, adeno-, MMTV-, hspa hGH-promotor, přičemž jako zvláště účinný byl prokázán CMV-Immediate Early-promotor.
Podle dalšího aspektu se předložený vynález týká použití nukleové kyseliny, obsahující celou kódující sekvenci z TBE-viru odvozeného proteinu prM/M a E, pro výrobu vakcíny.
Vynález bude nyní blíže vysvětlen pomocí příkladů provedení za pomoci obrázků.
Popis obrázků na připojených výkresech:
Obr. 1 - schematické znázornění inzertů, používaných v expresních plazmidech;
obr. 2 - schematické znázornění plazmidu pSVP, který byl použit k expresi konstruktu, uvedeného na obr. 1;
obr. 3a, b a c znázorňují plnou nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci na obr. 1 uvedeného konstruktu SV-PEwt;
obr. 4 představuje imunoprecipitaci s Tritonem X-100 solubilizovaného buněčného lyzátu po transfekci a na obr. 1 uvedenými konstrukty, jakož i po infekci s TBE-virem (COS/TBE);
obr. 5 představuje v diagramu průkaz proteinu E pomocí 4-vrstvé ELISA v supematantech buněčné kultury z COS-buněk, které byly transfikovány konstrukty, uvedenými na obr. 1;
obr. 6 představuje imunoprecipitaci supematantu buněčné kultury z COS-buněk po transfekci s SV-PEwt, popř. SV-PEst;
obr. 7 představuje diagram sedimentační analýzy supematantu COS-buněčné kultury po transfekci s SV-PEwt a SV-PEst, jakož i po infekci s TBE-virem. Směr sedimentace je zleva napravo;
obr. 8 představuje sedimentační analýzu rSP bez (SV-PEwt), popř. po zpracování s 0,5 % Tritonem X-100. Směr sedimentace je zleva napravo;
obr. 9 představuje diagram SDS-PAGE přečištěného TBE-viru a přečištěných rSP; vybarvení Coomassie-Blau;
obr. 10 představuje srovnání rSP z COS-buněk s rSP ze stabilně transfikované CHO-buněčné linie;
-6CZ 282927 B6 obr. 11 představuje diagram reaktivity 19 protein E-specifíckých monoklonálních protilátek ve 4vrstvé ELISA s TBE-virem, formalinem inaktivovaným TBE-virem, rSP a rE*;
obr. 12 reaktivitu TBE-viru, popř. rSP, ve 4-vrstvové ELISA s mAK B3, i2, IC3 aC6 bez (pH 8,0), popř. po zpracování při pH 6,0, a obr. 13 reaktivitu pE* ve 4-vrstvé ELISA smAKs B3, i2, IC3 aC6 bez (pH 8,0), popř. po zpracování při pH 6,0.
Vynález bude blíže popsán v následujících příkladech.
Příklady provedení vynálezu
1. Výroba částic
K tomuto účelu byly konstruovány 4 expresní plazmidy, které obsahují E-protein, popř. membránové kotvy prostou formu E-proteinu samotné, popř. spolu s prM (obr. 1).
Příklad výroby tohoto plazmidu je popsán Allisonem a spol., Virus Genes 8 (3) (1994), str. 187-198.
Takto popsaný výchozí plazmid pSVp je uveden na obr. 2.
Jako vektor byl použit pSV46 pro konstrukci expresních klonů. Tento vektor je derivát eukaryontního expresního vektoru (Clontech), založeného na SV40, ze kterého byl odstraněn inzert, obsahující β-galaktosidásový gen (MacGregor G. R. a Caskey C. T., Nucleic Acids res 17, 2365, 1989) štěpením sNotl areligací. Část polylinkeru ve směru dolů od translačního stopmísta byla také odstraněna za pomoci štěpení s Xbal a HindlII, naplněním Klenowem a religací. Do tohoto vektoru byly vestavěny PCR-produkty, které byly získány následovně:
Syntetický oligonukleotidový primer byl použit kamplifikaci částí cDNA, odpovídajících buď TBE-virové prM+E-oblasti nebo E samotnému. Použité nukleotidové koordináty byly podle Mandla a spol. (Mandl C. W., Heinz F. X. a Kunz C., Virology 166, 197-205, 1988) tak přepracovány, že obsahují prvních 20 nukleotidů BE-genomu (Mandl C. W., Heinz F. X., Stockl E. a Kunz C., Virology 173). 5'-primery pro prM+E- a jen-E-konstrukty byly 27mery se sekvencemi AAGCGGCCGCCATGGTTGGCTTGCAAA, popř.
AAGCGGCCGCCATGGTTACCGTTGTGT. Prvních 11 nukleotidů každé z umělých sekvencí obsahuje rozpoznávací místo pro restrikční enzym Notl (GCGGCCGC), následovanou 16nukleotidovou sekvencí buď nukleotidů 388-403 (SV-/E-řada), nebo 883-898 (SV-E-řada). V každém případě byl přirozeně se vyskytující ATG-kodon ve směru proti proudu odpovídajícího genu jako start-kodon, a primer byl sestaven tak, že obsahuje ATG ve vhodném kontextu (GCCGCCATGG) pro účinnou iniciaci translace v COS-buňkách (Kozák M., Cell 44, 283-292; Kozák M., J. Mol. Biol. 196, 947-950, 1987). Stejný 28 nukleotidů dlouhý oligonukleotid (ATGCGGCCGCTAGTCATACCATTCTGAG) byl použit jako 3’-primer pro obě konstrukce. Tento primer byl na svém 3'-konci komplementární k nukleotidům 2535-2550 a obsahoval na svém 5'-konci Notl-místo a komplement (CTA) TAG-stop kodonu ve stejném čtecím rámečku.
PCR-amplifikace byly za v podstatě standardních podmínek provedeny podle Cetus-protokolu (Saiki R. K., Gelfand D. H., Stoffel 5., Scharf S. J., Higuchi R., Hom G. T., Mullis K. B. a Erlich H. A., Science 239, 487-491, 1988). Reakční směsi obsahovaly 50 mM KC1; 10 mM TRis-HCl,
-7CZ 282927 B6 pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, vždy 200 μΜ dNTP, 10 ng každého primeru, 10 μΐ 1 OOOnásobného zředění cDNA-matrice a 3 j. ampliTaq-polymerázy (Perkin Elmer Cetus) v celkových objemech 100 μΐ. Vzorky byly překryty 100 μΐ parafinového oleje a amplifikovány v Perkin Elmer teplotním výměníku.
Vzorky byly udržovány 6,5 min na 94 °C, potom na teplotě tepelného zpracování 40 °C, před přídavkem Taq-polymerázy. Celkem bylo provedeno 35 amplifikačních cyklů. Každý cyklus tvoří 1,5 min při 94 °C, 3 min při 40 °C a 7 min při 68 °C. Vzorky byly pomocí fenolové a chloroformové extrakce přečištěny, vysráženy ethanolem a dvakrát opakovaně promyty dvakrát 10 destilovanou vodou. Kvalita a množství PCR-produktu byly stanoveny pomocí elektroforézy na agarosovém gelu a vzorky byly uchovávány při -20 °C až do použití v následujícím klonovacím kroku.
Byla použita polymerázová řetězová reakce pro konstrukci minibanky cDNA-plazmid-klonů 15 s inzerty, které odpovídají buď prM + E-oblasti (SV-PE-řada), nukleotidům 388-2550, nebo
E-oblasti (SV-E-řada), nukleotidů, 883-2550, TBE-virového genomu (obr. 1).
Protože TBE-virový strukturní protein byl vyroben obvykl způsobem ko-translačním zpracováním velkého polyproteinového předchůdce, byla místa strat- a stop- translace zavedena 20 na konce PCR-produktu, ve kterém byla zabudována do oligonukleotidového primeru. V každém konstruktu byl přirozený ATG-kodon, který byl umístěn ve vhodném kontextu, aby sloužil jako iniciátor-kodon, zavedený po směru interní signální sekvence, aby bylo umožněno přirozené zpracování hostitelskou-signalázou a správné zavedení do sekreční cesty. Podobným způsobem byl TG stop-kodon umístěn v každém konstruktu proti směru od místa signalázového štěpení, 25 které tvoří karboxy-konec proteinu E.
Rozpoznávací místa pro restrikční enzym Notl byla popřípadě vestavěna na konce, pro usnadnění následujícího klonování.
PCR-DNA byly rozřezány pomocí Notl a ligovány do Notl-klonovacího místa plazmidového vektoru pSV6, což umožňuje, aby byl správně inzertovaný gen za řízení časným SV40promotorem exprimován (McGregor G. R. aCaskey C. T., Nucleic Acids Res. 17, 2365, 1989). Vektor představuje také polyadenylační signál pro účinnou expresi a SV40-replikační počátek, pro umožnění replikace rekombinantních plazmidů v transfektovaných COS-buňkách, které konstitutivně exprimují velký SV40-T-antigen (Gluzman Y., Cell 23, 175-182, 1981).
Ligační směsi byly použity pro provedení transformace v E. coli HB 101 a jednotlivé na ampicilin rezistentní kolonie, které představují jednotlivé klony, byly izolovány. Orientace inzertu v každém plazmidů byla stanovena natrávením s restrikčními enzymy a elektroforézou na 40 agarosovém gelu. Klony se správně orientovanými inzerty byly použity pro další analýzu.
Plazmidy se správně orientovanými inzerty byly identifikovány restrikční analýzou a přečištěny pomocí CsCl-gradientového odstředění.
Pro každý plazmidový konstrukt byla použita přečištěná dvojřetězcová plazmidová DNA z jediného přípravku pro DNA sekvenční stanovení. Sekvenační reakce byly provedeny v PerkinElmer-teplotním měniči za použití TBE-specifických primeru, AmpliTaq-polymerázy (PerkinElmer Cetus) a s fluorescenčním barvivém značenými didezoxyterminátory podle instrukcí výrobce (Applied Biosystems). Produkty sekvenačních reakcí byly analyzovány na 50 automatickém zařízení DNA-Sequenzer 373A od Applied Biosystems.
-8CZ 282927 B6
Analýza PCR-vyrobených mutací
Pro provedení detailní analýzy klonovaných inzertů a stanovení účinnosti mutageneze Taq polymerázou bylo zvoleno 13 jednotlivých E. coli-klonů, obsahujících plazmidy SVPE-série a 9, 5 obsahujících plazmidy SV-E-série. Plazmidová DNA z každého klonu byla přečištěna a analyzována plným sekvenováním klonovaných inzertů v obou řetězcích. cDNA-sekvence pak byly porovnány s odpovídající RNA-sekvencí rodičovského standardního TBE-virového kmene Neudórfl (Mandl C. W., Heinz F. X. a Kunz C., Virology 166, 197-205, 1988).
ío Podle očekávání obsahuje každý plazmidový klon více nukleotidových rozdílů vzhledem k sekvenci standardního -TBE-viru. S několika výjimkami (viz dále) byla většina těchto změn jednotlivými mutacemi, které očividně byly zavedeny během PCR-amplifikace a byly nalezeny jen v jediném klonu.
Tabulka l: Shrnutí PCR-vyrobených mutací
Klon nukleot. _________________aminokys. změnyb________________ změnya prM E
| SV-PE 01 | 945 G A 1122G—>C 1395 C T 2027 T —> C 2480 A -> Gc | Gin 50 -> His Val 352 -> Ala | |
| 02 | 551 T-> A 1080 G -> A 1153 T->C 1168T->C 1690 A -> G 2458 G -> del | Val 24 Glu | Ser 66 -> Pro Arg 240 -> Gly Ala 495 -> posun čt. rám. |
| 03 | 952 T -> C 976 C —> T 1163 A->G 1679 A->G 1889 T-> A | Cys 158 -> Arg | Arg 2 -> Cys Lys 64 -> Arg Asn 236 —> Ser Met 306 —> Lys |
| 04d | 1434 C->T 2275 A -> T 2364 G -» A | Lys 43 5 —> Stop | |
| 05c | 701 T—>C 1488 C-> A 1492 T->C 1893 T-> A | Leu 74 -> Pro | Cys 307 —> Stop |
| 06 | 782 T -► C 865 A -> G 1002 C ->T 1972 G-> A | Leu 101 —> Pro Lys 129 —> Glu | Gly 334 -> Arg |
-9CZ 282927 B6
Tabulka 1 - pokračování
| Klon | nukleot. změnya | aminokys. změny b | |
| prM | E | ||
| 07c | 1327 G -> del 2248 G -> A | Ala 119 —> posun čt. rám. Ala 426 -> Thr | |
| 08 | 701 T-> A 2092 A -> G 2124 T->C | Leu 74 -> Gin | Met 374-> Val |
| 09 | 452 T -> Cc 960 A -> T 1746 A-»G 2086 A -> G 2142 T—>C 2290 G -> A 2361 A^G | Ile 372 Val Val 440 Ile | |
| SV-PE 10° | 1625 A^G 2475 T -> C | Asp 218 -> Gly | |
| llc | - | ||
| 12c | 1203 G-> A | Met 77 Ile | |
| 13c | 1366 T->C 1381 A-> G 1728 G-> A | Tyr 132-> His Ile 137-> Val Met 252 -> Ile | |
| SV-E 01d | 2134C->T 1239 C-> T | ||
| 02 | 1093 A->T 2301 C—>T | Met 41 -> Leu | |
| 03 | 1321 G-> A 1688 A ->G 1717G-> A 2053 A^G 2092 A —> G | Val 117 —► Ile Glu 239 -> Gly Ala 249 -> Thr Asn 361 -> Asp Met 374-> Val | |
| 04 | 2073 T —► C 2438 C-> T | Ala 489 -> Val | |
| 05 | 938 T^C 973 T -> C 2401 T -> G | (Leu 153 Pro) | Ser 1 —> Pro Ser 477 -> Ala |
- 10CZ 282927 B6
Tabulka 1 - pokračování
| Klon | nukleot. změny3 | aminokys. změny b | |
| prM | E | ||
| 06 | 891 C-»T 1151 G-> A 1364 T—>C 1567 A -> G 2045 T -> C | Cys 60 -> Tyr Val 131 -> Ala Ile 199 Val Ile 358 -> Thr | |
| 07 | 1257 T^C 1694 T—»C 1794 A —> G 2159 G^T | Leu 241 —> Pro Gly 396 -> Val | |
| 08 | 1806 A -> G 2205 A -> G | ||
| 09 | 2491 A—>delc |
anukleotidové souřadnice se týkají celého TBE-genomu;
Aminokyselinové souřadnice se týkají prM nebo E;
Aminokyselinové změny v NS1 nebo C-genu;
io dSV-PE04 jako SV-PEst přejmenován a SV-E01 přejmenován jako SV-Ewt;
edalší mutace, nezpůsobené PCR, neuvedeny (srovn. text);
fv tomto kontraktu přítomna jen C-terminální část prM.
Jak je uvedeno v tabulce 1, obsahuje 22 sekvencových inzertů (celkem 43549 bp) 71 jednotlivých nukleotidových změn, které byly zpětně zavedeny chybou Taq-polymerázy. Z těchto změn vedlo 4 (59 %) k substitucím v předpokládaných aminokyselinových sekvencích a 3 k delecím, které vedly k posunutí rámečku (tabulka 2).
Tabulka 2 PCR-mutační schopnostnost
| Změny báz. párů | počet dosažených a | četnost (pro bp) |
| G/C -> A/T | 20 (28 %) | 4,59 x 10-4 |
| G/C -> T/A | 2 (2,8 %) | 4,59 x 10” |
| G/C -> C/G | 1(1,4%) | 2,30 x 10” |
| A/T -> G/C | 37 (52 %) | 8,50 x 10'4 |
| A/T -> C/G | 1 (1,4%) | 2,30 x 10” |
| A/T -> T/A | 7 (9,9 %) | 1,61 x 10'4 |
| G/C delece | 2 (2,8 %) | 4,59 x 10” |
| A/T delece | 1 (1,4%) | 2,30 x 10” |
- 11 CZ 282927 B6
Tabulka 2 - poračování
| Změny báz. párů | počet dosažených a | četnost (pro bp) |
| přesah | 57 (80 %) | 1,31 x 10‘3 |
| transverze | 11 (15%) | 2,53 x 10“* |
| všechny mutace | 71 (100%) | 1,63 x 10‘3 |
| ak. subst. | 42 (59 %) | 9,64 x 10“* |
| němá mutace | 24 (34 %) | 5,51 x 10“* |
| posun čt. rám. | 3 (4,2 %) | 6,89 x 10‘3 |
| term, kodony | 2 (2,8 %) | 4,59 x 10‘3 |
e43549 párů bází sekvencováno
Rozdělení mutací bylo silně ovlivněno ve prospěch A/T -> G/C aG/C -> A/T-přechodových mutací, jak již bylo drive zmíněno jinými autory (Dunning A. M., Talmud P. aHumphries S. E., Nucleic Acids Res. 16, 10393, 1988; Chen J., Sahota A., Stambrook P. J. aTischfield J. A., Mutat Res 289, 169-176, 1991; Cadwell R. C. a Joyce G. F., PCR Methods Applic 2, 28-33, 1992). Celková četnost mutace byla 163 x 10'3 na bázový pár u35-cyklové amplifikace (4,7 x 103 na bázový pár pro cyklus), byla ve shodě se zveřejněnými hodnotami pro četnost chyb pro Taq-polymerázu (15,32). Průměrná rychlost náhrady aminokyseliny byla 0,46 na gen pro prM (délka 164 aminokyselin) a 1,59 pro E (délka 496 aminokyselin).
Němá mutace na nukleotidu 930 byla přítomna ve všech klonech a předpokládá se, že vznikla jako přirozená mutace během pomnožování viru. Mimoto bylo zjištěno, že pět klonů SV-PEsérie, SV-PE05, SV-PE07, SV-PE11, SV-PE12 aSV-PE13, má společně sedm identických mutací na nukleotidech 849, 1285, 1346, 1404, 1909, 2247 a 2255. S výjimkou SV-PE10, který obsahuje tři mutace (1909, 2247 a 2255), nebyl nalezen žádný z těchto nebo jiných SV-PE-klonů nebo některý z SV-E-klonů. Jedna taková změna, nukleotidová delece v poloze 1346, působí posunutí rámečku na kodon 125 v E-genu a bylo by proto možno očekávat, že poskytne nefunkční E-protein. Protože klon, obsahující těchto sedm samotných mutací, byl získán nezávisle na separátních cDNA- a PCR-preparacích (hodnoty neuvedeny), zdá se, že tyto varianty byly přítomny již ve virové-RNA-populaci před amplifikací. Tyto zvláštní mutace nebyly proto zahrnuty do analýzy PCR-získaných mutací.
Konstrukty, které kódují E-proteiny přírodní a deletované
Navíc ke klonům, které kódují jednotlivé aminokyselinové změny, byl zájem také o výrobu prM+E a jen-E-konstruktů, které kódují deletované proteiny a proteiny přírodního typu. Protože však všechny PCR-vyrobené klony obsahují SV-PE-série mutací, které by mohly vést ke změnám v aminokyselinové sekvenci, bylo použito přímé subklonování pro výrobu konstruktu přírodního typu, který by kódoval nemodifikované prM a E-proteiny, jakož i deletovanou formu jen-Ekonstruktu.
DNA-sekvence plazmidu SV-PE04 vykazuje mimo dvou němých mutací náhradu A za T na nukleotidu 2275. čímž byl změněn AAG-kodon pro lysin 435 proteinu E na TAG-stop-kodon (tabulka 1). Z toho bylo předpovězeno. že SV-PE04 kóduje prM-protein přirozeného typu a deletovaný E-protein, kde chybí 61 karboxy-terminálních aminokyselinových zbytků, které pravděpodobně obsahují oblast, rozkládající se v membráně (Mandl C. W., Guirakhoo F., Holzmann H., Heinz F. X. a Kunz C., J. Virol. 63, 564-571, 1989). Ukázalo se, že plazmid SV-E01, ve kterém chybí velký podíl prM-genu, obsahuje jen jednu němou mutaci v E-genu, čímž se kóduje E-protein přírodního typu.
- 12CZ 282927 B6
K vytvoření prM + E konstruktů celé délky s aminokyselinovou sekvencí přírodního typu a jenE-konstruktu bez prM, ale se stop-kodonem na nukleotidu 2275, byly restrikční fragmenty z SV-PE04 aSV-EOl (dále jmenovány SV-PEst popř. SV-Ewt) vyměněny. K. tomuto účelu byla 5 použita dvě místa štěpení pro restrikční enzym CfrlOI, jedno mezi nukleotidy 960 a 961 blízko hranice prM- a E-genu, a další v genu ampicilinové rezistence vektoru. Jeden z výsledných plazmidových konstruktů, SV-PEwt, obsahuje prM-gen přírodního typu a E-gen přírodního typu z SV-Ewt, zatímco u dalšího SV-Est chybí prM-gen, tento ale obsahuje stop-kodon, obsahující E-gen z SV-PEst. Tyto změny byly stanoveny sekvencováním inzertů obou plazmidů. Tyto oba io konstrukty doplňují set ze čtyř expresních plazmidů pro porovnání struktury a zpracování z konstruktu přírodního typu (SV-PEwt) exprimovaných E-proteinů s těmi, kterým chybí prM (SV-Ewt), E-kotvová oblast (SV-PEst) nebo oba (SV-Est).
Plná sekvence PEwt inzertu je uvedena na obr, 3a, bac.
COS-buňky byly transfikovány vhodnými plazmidy a exprese rekombinantního proteinu byla analyzována následovně:
DNA-transfekce:
COS-l-buňky (Gluzman Y., Cell 23, 175-182) byly uchovávány v COS-médiu, tvořeném Dulbecco MEM (Gibco-BRL), doplněném 10 % fetálního hovězího séra, penicilinem (100 j/ml) a streptomycinem (100 pg/ml) při 37 °C a 5 % CO2.
Plazmidy, obsahující klonovaný TBE-gen, byly zavedeny liposomy zprostředkovanou transfekcí za použití modifikace způsobu Felgnera a spol. (Felgner P. L., Gadek T. R., Holm M., Roman R., Chán H. W., Wenz M., Northrop J. P., Ringold G. M. a Danielsen M., Proč Nati Acad Sci USA 84, 7413, 1987) prostřednictvím zařízení BioRad Gene Pulser do COS-l-buněk. Lipofektinová činidla (Gibco-BRL) byla v Opti-MEM-redukovaném sérovém médiu (Gibco-BRKL) zředěna na
20 pg/ml a smísena se stejnými objemy OptiMEM-1, obsahujícím 8 pg/ml odpovídající plazmidové DNA. Na transfekci bylo použito 5 pg lipofektinu a 2 pg plazmidové DNA. Směs byla ponechána stát 15 minut při teplotě místnosti pro tvorbu komplexů DNA-lipofektin a 0,5 ml této směsi bylo přidáno do každé jamky plotny pro buněčnou kulturu (Nunc) se 24 jamkami, které byly pro odstranění stop séra z růstového média dvakrát promyty 1 ml OptiMEM. Buňky 35 byly inkubovány se směsí DNA-lipofektin 5 h při 37 °C, 5 % CO2, pak byl přidán 1 ml kompletního COS-média a inkubace pokračovala přes noc. 24 h po transfekci bylo médium odstraněno a nahrazeno čerstvým COS-médiem a inkubace pokračovala do asi 46 hodin po transfekci a pak byly buňky buď fixovány pro imunofluorescenční analýzu, nebo použity pro analýzu na intracelulámí antigen pomocí ELIS A.
Analýza exprimovaných proteinů
a. Imunoprecipitace buněčných lyzátů
Transfikované buňky byly označeny 35S-cysteinem, solubilizovány s 1 % Tritonem X-100 a podrobeny imunioprecipitaci s polyklonálním králičím sérem, které bylo pro TBE-virus E a prM-proteiny specifické. Jak je zřejmé z obr. 4, vedla exprese konstruktu SV-PEwt a SV-Ewt k syntéze proteinu E autentické velikosti. Proteiny, syntetizované z SV-PEt a SV-Est, byly podle očekávání následkem svých C-terminálnich zkráceni o něco menší než standardní typ-E-proteinu.
- 13 CZ 282927 B6
b. Analýza sekrece z rekombinantních proteinů v buněčném supematantu
Supematanty transfikovaných buněk byly kvantitativně zkoušeny na přítomnost proteinu E ve dnech 0 až 4 po transfekci za použití čtyřvrstvé ELISA, jak je popsáno Heincem a spol., J. Biol.
Stand. (1986), 14: 133-141. Na obr. 5 uvedené výsledky ukazují, že jen ty konstrukty, které koexprimují prM-protein, vedly k sekreci proteinu E. Imunoprecipitace ze supematantu (obr. 6) potvrzuje, že rozdílné proteiny měly stejné délky, jako odpovídající intracelulámí proteiny (srov. obr. 4).
io Sekrece rekombinantních proteinů představuje enormní výhodu z produkčního hlediska, protože se tak eliminuje potřeba lýze buněk pro získání požadovaného proteinu a odstranění kontaminovaného buněčného materiálu. Za vhodných podmínek to umožňuje také kontinuální sklizeň rekombinantních proteinů bez zničení buněk.
c. Charakterizace různých rekombinantních proteinů
Na obr. 5 uvedené supematanty byly podrobeny zonálnímu odstředění v sacharózových hustotních gradientech za použití 5 až 30 % (hmotn./hmotn.) sacharózových gradientů a zařízení Beckman SW-40-Rotor. Odstřední probíhalo při 3800 ot./min a při 4 °C 100 minut. Gradienty 20 byly frakcionovány a protein E byl v každé frakci kvantitativně stanoven pomocí čtyřvrstvé ELISA (viz Heinz a spol., J. Biol. Stand. (1986)14: 133-141). Supematant virem infikovaných buněk byl použit jako kontrola, která má dva protein-E-příslušné píky (obr. 7), z nichž jeden odpovídá kompletnímu viru a druhý takzvanému neinfekčnímu pomalu sedimentujícímu hemaglutininu (slowly-sedimenting hemagglutinin (SHA)) (viz Russel a spol. (1980), 25 Chemical and antigenic structure of flaviviruses. Ve: Schlesinger R. W. (vyd.) The Togaviruses, 503-529, Academie Press). Supematant z SV-PEwt transfikovaných buněk obsahuje částicovou formu E se sedimentační rychlostí podobnou virální SHA, zatímco C-terminálně zkrácený protein E z SV-PEst netvoří žádné stabilní částice a zůstává nad gradientem.
Částicová forma z SV-PEwt byla nazvána rekombinantní subvirální částice (recombinant subviral particle, rSP) a rozpustná forma z SV-PEst rekombinantní E* (rE*).
Zpracování rSP s 0,5 % tritonem X-100 disociuje částice, jak bylo prokázáno sedimentační analýzou na obr. 8, což svědčí o nepřítomnosti lipidové membrány.
Příprava rSP a rE*
a. Čištění rSP
Supematanty SV-PEwt transfikovaných COS-buněk byly vyčeřeny 30minutovým odstřeďováním při 10000 ot/min při 4 °C ve vysokorychlostní odstředivce Sorvall a částice potom byly sklizeny odstředěním při 44000 ot/min, 4 °C, po 120 min, přičemž byl použit Beckman Ti45 Rotor. rSPobsahující peletová frakce byla v TAN-pufru, pH 8,0, resuspendována a nanesena na 5-20 % sacharózové gradienty, které byly vyrobeny se stejným pufrem. Po 90minutovém odstředění při
3 8 00 ot/min a 4 °C za použití Beckman SW40-Rotoru byly vzorky frakcionovány a píkové frakce byly identifikovány testy na HA-aktivitu (Clarke a Casals, 1958, Aver. J. Trop. Med. Hyg. 7 : 561-573). Píkové frakce ze zonálních gradientů byly dále přečištěny pomocí rovnovážné centrifugace (35000 ot/min, 4 °C, přes noc) a frakce byly opět pomocí HA identifikovány. Celkový protein E byl pomocí 4-vrstvé ELISA určen kvantitativně a čistota byla stanovena za použití vybarvení pomocí Coomasie-Blau prostřednictvím SDS-PAGE (obr. 9).
- 14CZ 282927 B6
b. rE*-Preparace
Séra prosté supematanty z SV-PEst-transfíkovaných COS-buněk byly vyčeřeny, jak je popsáno výše, a ultrafiltrací asi 15krát zahuštěny.
Výroba buněčné linie s chromozomálně integrovanými prM a E-geny
Pro výrobu stabilně transfikovaných buněk, které produkují rSP, byl použit dihydrofolátreduktázový (DHFR)-selekční systém (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & 10 Sons, lne.), jakož i takový konstrukt, který obsahuje plny gen pro prM a E-protein (obr. 1) a vede k syntéze a sekreci aSP. Transfer DHRF-genu byl proveden za pomoci plazmidu pSV2-dhfr (S. Subramani aspol., Mol. Cell. Biol. 1, 854-864, 1981), transfer prM- aE-genu za pomoci plazmidu CMV-PEwt, který byl vyroben překlonováním inzertu z plazmidu SV-PEwt do plazmidu pCMVp (Clontech).
DHFR-deficientní křečci buněčná linie CHO-DG44 (Som. Cell. Mol. Get. 12, 555-666, 1986) byla pěstována v HAM F12-médiu + 10 % fetálního telecího séra (FKS) a transfíkována s pCMV-PEwt jakož i pSV2-dhfr v poměru 20 : 1 elektroporací za použití zařízení BioRad Gene Pulser. Transfikované buňky byly dále pěstovány 2 dny v HAM F12-médiu + 10 % FKS, potom 20 trypsinizovány a vysety ve vysokém zředění pro získání jediného, DHFR a prM+E exprimujícího buněčného klonu v selekčním médiu (MEM-α bez ribo- a deoxyribonukleotidu + 10 % dialyzovaného FKS) v Petriho miskách. Po asi 10 dnech byly přeneseny jednotlivé pod mikroskopem pozorovatelné buněčné kolonie do malých nádobek pro buněčnou kulturu a dále pomnožovány. Ty buněčné klony, které produkují FSME-specifický antigen, byly identifikovány 25 analýzou supematantu buněčné kultury pomocí ELISA.
Jeden z těchto klonů (CHO-37) byl použit pro získání a charakterizaci jím produkovaných rSP.
Proto byly buňky pěstovány ve výše uvedeném selekčním médiu a rPS v buněčném supematantu podrobeny stejnému čisticímu postupu, jak je popsán pro ty, které byly získány z COS-buněk. 30 Obr. 10 představuje výsledek odstředění při sacharózovém hustotním gradientu, při kterém rSP z COS-buněk byly porovná s těmi, které byly získány ze stabilní transfikované buněčné linie CHO-37. Byly použity následující podmínky odstředění: 20-50 % sacharóza, Beckman TI-40Rotor, 35000 ot/min přes noc. Po odstředění byly gradienty frakcionovány a jednotlivé frakce analyzovány v hemaglutinačním testu a ELISA na FSME-virus-specifický antigen. Jak je z obr. 35 zřejmé, nevykazují oba přípravky žádné rozdíly v sedimentačním chování, popř. ve specifické hustotě, jakož i specifické hemaglutinační aktivitě.
2. Charakterizace ve vztahu k nativní proteinové struktuře
Takto připravené přípravky byly podrobeny následující analýze:
a. Analýza antigenní struktury s monoklonálními protilátkami
b. Schopnost kyselinami vyvolaných konformačních změn
c. Hemaglutinační aktivita k a. Antigenní struktura
Antigenní struktura formalinem inaktivovaného celého viru, rSP a rE* byla porovnávána s touto strukturou z nativního infekčního viru za použití 19 protein-E specifických monoklonálních protilátek (Mandl a spo., 1989, J. Virol. 63: 564-571; vlastní pokus). Reaktivita každé jednotlivé monoklonální protilátky s každým z výše uvedených přípravků byla analyzována ve 4-vrstvé
- 15CZ 282927 B6
ELISA, jak je popsáno Heinzem a spol., J. Biol. Stand. (1986), 14: 133-141. Přitom byly všechny antigenní přípravky použity v předem stanovené konstantní koncentraci proteinu Ε 1 μΐ/ml a byla použita každá z monoklonálních protilátek ve zředění, které poskytuje s nativním infekčním virem extinkční hodnotu v oblasti 0,5 až 1,6.
Jak je zřejmé z obr. 11, je vzor reaktivity s mAk u rSP a neinfekčního viru prakticky identický, z čehož lze odvodit, že protein E je v rSP v téže nativní formě, jako v infekčním viru.
Inaktivace formalinem naproti tomu působí výrazné změny v antigenní struktuře, které se také týkají epitopů, které vážou neutralizující protilátky. Toto se týká jak neutralizujících mAk il (Mandl a spol., 1989, J. Virol. 63: 564-571), jejichž epitop byl zničen zpracováním s formalinem, tak i epitopu v oblasti domény A, jakož i domény B (Mandl a spol., 1989, J. Virol. 63: 564-571), které vykazují přinejmenším sníženou reaktivitu. Tyto analýzy ukazují také, že E* ve své struktuře žádným způsobem neodpovídá nativnímu proteinu E na virovém povrchu.
k b) Kyselinou indukované konformační změny
TBE-virus byl vnesen za pomoci receptor-zprostředkující endocytózy do buněk a tím došlo v endozomech s jejich kyselejším pH (< 6,4) k indukci specifické změny konformace, která je 20 potřebná pro fúzi virové membrány s endozomovou membránou a tím k infekčnosti viru. Tyto strukturní změny mohou být dosaženy změnou reaktivity jednotlivé mAk (Heinz a spol., 1994, Virology 198: 109-117) a týkají se jiných epitopů i2 a iC3 (silná redukce reaktivity), popř. C6 (zesílená reaktivita), ale ne epitopu B3.
Tylo změny jsou podstatné pro funkci proteinu E. Schopnost reagovat na kyselé pH popsaným způsobem představuje kriterium pro to, zdaje protein E v nativní, infekčnímu viru odpovídající formě. Přípravky rSP, rE* a infekčního viru v triethanolaminovém pufru pH 8,0 byly za pomoci pufru, obsahujícího 0,05 m mES, 0,1 m NaCl a 0,1 % hovězího albuminu, smíseny tak, že hodnota pH odpovídá 6,0, 10 min při 37 °C inkubovány a potom za pomoci triethanolaminu opět nastaveny na pH 8,0. Potom byla stanovena reaktivita těchto přípravků před a po inkubaci při kyselém pH s mAK B3, i2, IC3 a C6 ve 4-vrstvé ELISA, jak je popsána v antigenní struktuře. Výsledky jsou uvedeny na obr. 12 a 13 a ukazují, že kyselejší pH v proteinu E rPS způsobuje stejné strukturní změny jako v infekčním viru (viz obr. 12), ale že stejná analýza u rE* neposkytuje žádný důkaz o podobném přesmyku (viz obr. 13).
k c) Specifická hemaglutinační aktivita
Charakteristická vlastnost infekčního FSME-viru je schopnost, že za určitých podmínek mohou aglutinovat husí erythrocyty (hemaglutinační aktivita). Tato vlastnost je zprostředkována 40 proteinem E a je tak dalším indikátorem pro existenci nativní, funkční struktury tohoto proteinu.
Hemaglutinační test byl proveden, jak je popsáno v práci Clarke-a aCasals-e (1958), Amer. J. Trop. Med. Hyg. 7: 561-573 za použití husích erythrocytů při pH 6,4.
Infekční virus, formalinem inaktivovaný virus, rSP a rE* byly nastaveny na obsah antigenu 45 5 pg/ml podle ELISA a analyzovány v hemaglutinačním testu. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 3. Z nich vyplývá, že rSP obsahuje stejnou specifickou hemaglutinační aktivitu jako infekční virus, a že tato proteinem E zprostředkovaná aktivita byla zcela ztracena při inaktivaci formalinem. Přípravek rE* neobsahuje žádnou měřitelnou HA-aktivitu.
- 16CZ 282927 B6
Tabulka 3
HA-aktivita
Přípravek infekční virus formal. inakt. virus rSP rE*
HA-titr
512
512 <2
3. Imunogenita u myší
Imunogenita následujících antigenních přípravků byla analyzována imunizací myší:
- formalinem inaktivovaný přečištěný virus
- rSP
- rE*
Obsah proteinu E byl stanoven v enzymové imunozkoušce (Heinz a spol., 1986, J. Biol.-Stand, 14:133-141) a všechny přípravky byly nastaveny na stejnou antigenovou koncentraci na 5 pg/ml. Podle dosud používané TBE-vakcíny (FSME-ImmunR) byl užit jako ředicí pufr PBS pH
7.4, obsahující 0,1 % lidského albuminu a 0,2 % A1(OH)3 jako adjuvans.
Imunogenita rSP a rE* byla také testována bez přídavku adjuvans.
Imunizační protokol:
S každým z přípravků byly imunizovány subkutánně skupiny vždy 15 g vážících myší Swiss albino (5 samiček a 5 samečků) dvakrát v odstupu 14 dnů, přičemž na myš a imunizaci bylo použito 0,2 ml antigenu. Týden po druhé imunizaci následoval odběr krve a všechny myši byly infikovány s 500 LD50 myšího patogenního TBE-virového kmene Hypr (Challenge Test). Myši byly pozorovány po 14 dnů na výskyt encefalitidy, vedoucí k uhynutí.
Identické podíly séra každé jednotlivé myši z 10 skupin, které byly imunizovány stejným imunogenem, byly spojeny a analyzovány na obsah TBE-virus-specifických protilátek v enzymové imunozkoušce (ELISA), testu potlačení hemaglutinace (HHT) a neutralizačním testu.
ELISA byla provedena za použití přečištěného TBE-viru jako antigenu, jak popsal Heinz a spol., (1984), J. Gen. Virol. 65: 1921-1929. HHT byl proveden, jak popsal Clarke aCasals (1958), Amer. J. Trop. Med. Hyg. 7: 561-573, přičemž byly použity husí erythrocyty při konečném pH
6.4. Pro neutralizační test byly použity BHK-21 buňky a koncentrace viru 500 infekčních jednotek.
Výsledky imunizačního pokusu jsou shrnuty v následující tabulce 4. Z nich je zřejmé, že rSP jak bez, tak také s adjuvans tak jako formalinem inaktivovaný celý virus chrání myši před smrtelnou dávkou TBE-viru. Naopak nebylo po imunizaci rE* pozorováno žádné (bez adjuvans) nebo jen minimální ochranné působení (s adjuvans).
S ohledem na produkci protilátek rSP dokonce předčily formalinem inaktivované viry, zvláště významně při použití A1(OH)3 adjuvans. Toto se týká jak v ELISA prokázaného virus-vázajícího antigenu, tak také ještě významnější chránící imunitní odpovědi - v HHT a NT měřených
- 17CZ 282927 B6 protilátkách, které také blokují specifické funkce viru (hemaglutinací, popř. infekčnost).
Ve shodě s nepřítomnou, popř. malou ochrannou účinností byla také indukce protilátek rE* velmi nízká, popř. neprokazatelná.
Ukazuje se také, že rSP představují vynikající imunogeny, které chrání před zvláště smrtelně probíhající encefalitidou a ve vztahu k indukci funkčních, virus neutralizujících protilátek, předčí formalinem inaktivovaný celý virus.
Tabulka 4
Imunizace myší
Challenge Test protilátkový titr
| počet přežívajících k celk. počtu (=10) | ELISA | HHT | NT | |
| form. inakt. | 10/10 | 10000 | 40 | 20-40 |
| virus+adjuvans | ||||
| rSP bez adjuvans | 10/10 | 12000 | 80-160 | 40-80 |
| rSP+adjuvans | 10/10 | 30000 | 160 | 160 |
| rE* bez adjuvans | 0/10 | 100 | <10 | < 10 |
| rE*+adjuvans | 1/10 | 4000 | < 10 | < 10-10 |
| pufrová kontrola | 0/10 | neg | < 10 | 8< 10 |
4. Imunizace s holou DNA
K imunizaci s holou DNA byly použity plazmidy, které je obsahují na obr. 1 uvedené inzerty pod kontrolou CMV-Immediate Early-promotorů. Tyto plazmidy (CMV-PEwt, CMV-PEst, CMVEwt, CMV-Est) byly získány překlonováním inzertů popsaných plazmidů SV-PEwt, SV-PEst, SV-Ewt a SV-Est do plazmidů pCMVp (Clonentech) (Mac Gregor a spol., Nucleic Acids Research, IRL Press, sv. 17, č. 6, 1989, str. 2365: Construction of plasmids that express E. coli β-galactosidaxe in mammalian cells”) a přečištěny odstředěním s CsCl-hustotním gradientem (Maniatis a spol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. 1982).
CMV-PEwt obsahuje sekvence pro standardní typ proteinu prM a E.
CMV-PEst obsahuje sekvence pro standardní typ proteinu prM a deletovanou sekvenci proteinu E, přičemž kodony pro 62 karboxyterminálních aminokyselin, které tvoří membránovou kotvu proteinu E, chybí.
V CMV-Ewt není velká část prM-sekvence přítomna, aleje přítomna plná sekvence standardního 35 typu proteinu E.
CMV-Est neobsahuje žádnou prM-sekvenci a deletovanou protein E-sekvenci z CMV-PEst.
Každý z těchto čtyř plazmidů byl ve dvou koncentracích (60 pg/ml a 300 pg/ml v PBS) použit 40 pro imunizaci myší (Swiss albino), přičemž pro každý plazmidový preparát bylo použito 10 myší (5 samiček a 5 samečků). Každá myš byla intradermálně injikována 2krát 100 μΐ každého DNA- 18CZ 282927 B6 přípravku v odstupu 2 týdnů. Jako kontroly byly použity plazmid pCMVp v koncentraci 300 pg/ml, jakož i PBS, stejným způsobem. Pro porovnání s konvenční imunizací byly skupiny vždy 10 myší imunizovány s formalin-inaktivovaným virem v koncentracích 1 pg/ml a 5 pg/ml vždy 2krát v odstupu 2 týdnů, přičemž bylo injikováno 0,2 ml myši subkutánně a 0,2 % A1(OH)3 5 byl použit jako adjuvans. Jeden týden po druhé imunizaci byla myším odebrána krev pro průkaz specifických protilátek v ELISA a současně se provedla intraperitoneální Challenge-infekce s 500 LDjoo TBE-viru. Doba pozorování byla 3 týdny. Výsledky průkazu protilátek a ochrany jsou shrnuty v tabulce 5. Z ní je zřejmé, že při DNA-imunizaci mohla být dosažena ochrana proti smrtelné infekci s RBE-virem jen tím plazmidem, který obsahuje gen pro úplné prM- a E10 proteiny. Toto je pravděpodobně vysvětlováno tím, že je přítomnost prM/Μ proteinu nutná pro výstavbu subvirálních částic, ve kterých je protein E přítomen v imunogenní formě.
Tabulka 5
Výsledky ochrany myší
| Imunogen plazmid | ochrana | proti látka-pozit i vn í |
| PE-wt 60 pg/ml | 6a/10b | lc/10d |
| PE-wt 300 μg/ml | 9/10 | 5/10 |
| E-wt 60 μg/ml | 0/10 | 0/10 |
| E-wt 300 μg/ml | 0/10 | 0/10 |
| PE-st 60 μg/ml | 0/10 | 0/10 |
| PE-st 300 μg/ml | 0/10 | 0/10 |
| E-st 60 μg/ml | 0/10 | 0/10 |
| E-st 300 μg/ml | 0/10 | 0/10 |
| CMV-p300 pg/ml | 0/10 | 0/10 |
| Kontroly HCOH virus 1 μg/ml | 4/10 | 4/10 |
| HCOH virus 5 μg/ml | 10/10 | 10/10 |
| PBS | 0/10 | 0/10 |
apočet ochráněných myší, bpočet zkoušených myší, cpočet ELISA pozitivních myší, dpočet zkoušených myší.
Claims (21)
1. Vakcína pro imunizaci proti infekci virem klíšťové encefalitidy (TBE-virem), vyznačující se tím, že obsahuje neinfekční, subvirální částice, které obsahují protein E v jeho úplné, nativní formě a/nebo protein prM/Μ, kde tyto proteiny jsou odvozeny z TBE-viru.
- 19CZ 282927 B6
2. Vakcína podle nároku 1, vyznačující se tím, že protein E a/nebo protein prM/M jsou rekombinantní proteiny.
3. Vakcína podle nároku 2, vyznačující se tím, že rekombinantní protein E je
5 odvozen z evropského nebo dálněvýchodního subtypu TBE-viru.
4. Vakcína podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že neinfekční částice dále obsahuji lipidovou složku, která výhodně je ve vesikulámí formě.
ío
5. Vakcína podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se t i m , že neinfekční částice jsou prosté pomocí PCR detekovatelných, z TBE-virů odvozených, nukleových kyselin.
6. Způsob výroby TBE-vakcíny, vyznačující se tím, že
15 - se použije buněčný kultivační systém, který' obsahuje kódující sekvence pro protein prM a E, kde tyto proteiny jsou odvozeny z TBE-viru,
- protein E se exprimuje ve své plné, nativní formě, přičemž
20 - se vytvoří subvirální, neinfekční částice, které obsahují rekombinantní protein E v jeho úplné, nativní formě a popřípadě obsahují rekombinantní protein prM/Μ, a
- částice se shromáždí, jakož i přímo použijí pro přípravu přípravků, vhodných pro imunizaci.
7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že se použije systém buněčné kultury, který obsahuje v chromozomálně integrované formě kódující sekvence pro protein prM a E, kde proteiny jsou odvozeny z TBE-viru.
30
8. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že v systému buněčné kultury jsou používány virové vektory.
9. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že se v systému buněčné kultury pracuje bez viru.
10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že se použije plazmidový vektor.
11. Způsob podle některého z nároků 6 až 10, vyznačující se tím, že se exprese proteinů a tvorba částic provádí kontinuálně.
12. Neinfekční, subvirální částice, obsahující protein E v jeho úplné, nativní formě a/nebo protein prM/Μ, kde proteiny jsou odvozeny z TBE-viru, podle nároku 1, pro výrobu vakcíny pro aktivní imunizaci proti infekcím TBE-viry.
45
13. Neinfekční. subvirální částice podle nároku 12, vyznačující se tím, že protein E a/nebo protein prM/Μ jsou rekombinantní proteiny.
14. Neinfekční. subvirální částice, obsahující protein E v jeho úplné, nativní formě a/nebo protein prM/Μ, kde proteiny jsou odvozeny z TBE-viru, podle nároku 1, pro výrobu anti-TBE-
50 virus-imunoglobulinových přípravků.
15. Neinfekční, subvirální částice podle nároku 14, vyznačující se tím, že protein E a/nebo protein prM/Μ jsou rekombinantní proteiny.
-20CZ 282927 B6
16. Nukleokyselinový vektor, obsahující celou kódující sekvenci proteinů E apeM/M, odvozených ze Flaviviru, zejména TBE-viru, jako léčivo.
17. Nukleokyselinový vektor, obsahující celou kódující sekvenci proteinů E aprM/M, odvozených ze Flaviviru, zejména TBE-viru, s výjimkou plazmidového vektoru, odvozeného od SV 40.
18. Nukleokyselinový vektor podle nároku 16, vyznačující se tím, že je jím plazmidový vektor.
19. Plazmidový vektor podle nároku 18, vyznačující se tím, že promotor plazmidového vektoru je zvolen ze skupiny, zahrnující CMV-, HSV-, RSV-, EBV-, β-aktin-, adeno-, MMTV-, hsp- a hGH-promotor.
20. Plazmidový vektor podle nároku 19, vyznačující se tím, že promotor plazmidového vektoru je CMV-promotor.
21. Nukleové kyseliny, zahrnující celou kódující sekvenci proteinů prM/M a E, odvozených od flaviviru, pro výrobu vakcíny pro imunizaci proti infekcím TBE-virem.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT0135294A AT402897B (de) | 1994-07-08 | 1994-07-08 | Verbesserte vakzine zur immunisierung gegen tbe-virusinfektionen sowie ein verfahren zu dessen herstellung |
| AT0087195A AT405607B (de) | 1995-05-23 | 1995-05-23 | Verbesserte vakzine zur immunisierung gegen tbe-virusinfektionen sowie ein verfahren zu dessen herstellung |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ176995A3 CZ176995A3 (en) | 1996-01-17 |
| CZ282927B6 true CZ282927B6 (cs) | 1997-11-12 |
Family
ID=25594155
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ951769A CZ282927B6 (cs) | 1994-07-08 | 1995-07-07 | Vakcina pro imunizaci proti TBE-virové infekci jakož i způsob její výroby |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0691404B1 (cs) |
| AT (2) | ATE206459T1 (cs) |
| CZ (1) | CZ282927B6 (cs) |
| DE (2) | DE59509667D1 (cs) |
| DK (2) | DK0869184T3 (cs) |
| ES (2) | ES2165109T3 (cs) |
| FI (2) | FI117974B (cs) |
| HU (2) | HU219503B (cs) |
| RU (1) | RU2150294C1 (cs) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6258788B1 (en) | 1997-11-20 | 2001-07-10 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | DNA vaccines against tick-borne flaviviruses |
| US7425437B2 (en) | 1999-11-26 | 2008-09-16 | Crucell Holland B.V. | Vaccines against West Nile Virus |
| CA2481479C (en) | 2002-02-26 | 2012-12-11 | Maxygen, Inc. | Novel flavivirus antigens |
| WO2006067122A2 (en) | 2004-12-20 | 2006-06-29 | Crucell Holland B.V. | Binding molecules capable of neutralizing west nile virus and uses thereof |
| CA2608058C (en) | 2005-05-12 | 2013-09-10 | Crucell Holland B.V. | Host cell specific binding molecules capable of neutralizing viruses and uses thereof |
| HUE027099T2 (hu) | 2006-06-06 | 2016-08-29 | Crucell Holland Bv | Humán kötõmolekulák staphylococcus elleni ölõaktivitással és alkalmazásuk |
| EP2219671A4 (en) | 2007-11-09 | 2011-02-09 | Salk Inst For Biological Studi | USE OF TAM RECEPTOR INHIBITORS AS IMMU ENHANCERS AND TAM ACTIVATORS AS IMMUNOSUPPRESSORS |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0284791B1 (de) * | 1987-03-20 | 1995-05-03 | IMMUNO Aktiengesellschaft | DNA- und RNA-Moleküle des westlichen Subtyps des FSME-Virus, Polypeptide, die von diesen Molekülen codiert werden, und deren Verwendung |
| MY109299A (en) * | 1990-08-15 | 1996-12-31 | Virogenetics Corp | Recombinant pox virus encoding flaviviral structural proteins |
| WO1992003161A1 (en) | 1990-08-27 | 1992-03-05 | The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce | Flavivirus envelope proteins with increased immunogenicity for use in immunization against virus infection |
| DK0584348T3 (da) | 1992-03-11 | 2005-09-19 | Powderject Vaccines Inc | Genetisk vaccine mod immundefektvirusser |
-
1995
- 1995-06-21 HU HU9501832A patent/HU219503B/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-06-21 HU HU9903233A patent/HU224199B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-07-06 AT AT98107383T patent/ATE206459T1/de active
- 1995-07-06 ES ES98107383T patent/ES2165109T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-06 AT AT95890132T patent/ATE198909T1/de active
- 1995-07-06 EP EP95890132A patent/EP0691404B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-06 DE DE59509667T patent/DE59509667D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-06 DK DK98107383T patent/DK0869184T3/da active
- 1995-07-06 EP EP98107383A patent/EP0869184B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-06 DK DK95890132T patent/DK0691404T3/da active
- 1995-07-06 DE DE59508988T patent/DE59508988D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-06 ES ES95890132T patent/ES2155510T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-07 CZ CZ951769A patent/CZ282927B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-07-07 FI FI953371A patent/FI117974B/fi not_active IP Right Cessation
- 1995-07-07 RU RU95113194/14A patent/RU2150294C1/ru not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-01-17 FI FI20070041A patent/FI118222B/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HU219503B (hu) | 2001-04-28 |
| FI117974B (fi) | 2007-05-15 |
| ATE206459T1 (de) | 2001-10-15 |
| FI118222B (fi) | 2007-08-31 |
| RU2150294C1 (ru) | 2000-06-10 |
| FI20070041A (fi) | 2007-01-17 |
| DE59508988D1 (de) | 2001-03-01 |
| EP0691404B1 (de) | 2001-01-24 |
| FI953371A (fi) | 1996-01-09 |
| HU9903233D0 (en) | 1999-11-29 |
| EP0869184A3 (de) | 1999-05-12 |
| ATE198909T1 (de) | 2001-02-15 |
| EP0691404A2 (de) | 1996-01-10 |
| HU9501832D0 (en) | 1995-08-28 |
| EP0691404A3 (de) | 1997-11-12 |
| FI953371A0 (fi) | 1995-07-07 |
| EP0869184A2 (de) | 1998-10-07 |
| ES2155510T3 (es) | 2001-05-16 |
| CZ176995A3 (en) | 1996-01-17 |
| EP0869184B1 (de) | 2001-10-04 |
| HUT72395A (en) | 1996-04-29 |
| HU224199B1 (hu) | 2005-06-28 |
| DK0691404T3 (da) | 2001-03-19 |
| DE59509667D1 (de) | 2001-11-08 |
| DK0869184T3 (da) | 2001-12-17 |
| ES2165109T3 (es) | 2002-03-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10555997B2 (en) | Antigens and vaccines directed against human enteroviruses | |
| AU2019285048B2 (en) | Nanoparticle vaccines with novel structural components | |
| JP4504464B2 (ja) | キメラフラビウイルスワクチン | |
| US10227385B2 (en) | Chimeric poly peptides and the therapeutic use thereof against a flaviviridae infection | |
| Griffin et al. | Measles: old vaccines, new vaccines | |
| US20110110974A1 (en) | Methods and kits for inducing a ctl response using a prime boost regimen | |
| US20150056244A1 (en) | Antigens and Vaccines Directed Against Human Enteroviruses | |
| FI118222B (fi) | Parannettu rokote Flavivirusinfektioiden vastaiseen immunisointiin | |
| CA2340788A1 (en) | Recombinant nonstructural protein subunit vaccine against flaviviral infection | |
| CN102711817B (zh) | 基于dna疫苗和嵌合体病毒的诱导抗登革热病毒的免疫应答的方法、试剂盒、质粒和组合物 | |
| AU2003216046B2 (en) | Construction of West Nile virus and dengue virus chimeras for use in a live virus vaccine to prevent disease caused by West Nile virus | |
| MXPA99007949A (es) | Vacunas de flavivirus quimerico |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20130707 |