CZ282638B6 - Použití prostacyklinů pro výrobu léčiva s antimetastatickým účinkem - Google Patents

Abstract

Řešení se týká použití prostacyklinů, výhodně eptaloprostu a cicaprostu, jejich adičních solí s fyziologicky přijatelnými bázemi nebo jejich klatrátů s cyklodextriny a kombinací antagonistů tromboxanu-A.sub.2.n. s deriváty prostacyklinu, pro výrobu léčiva s antimetastatickým účinkem. ŕ

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká nových kombinovaných prostředků s antimetastatickým účinkem.

Dosavadní stav techniky

K. V. Honn a kol (Science 212, 1270 /1981/) pozorovali po aplikaci prostacyklinů (PG12) ve vysokých dávkách (10 mg/kg) krátce před interavenózní injekcí nádorových buněk B 16 melanomu myší redukci počtu metastáz v plicích. Tento účinek se přičítá inhibici adheze a agregace nádorových buněk. Pro použití je ale poločas rozpadu příliš krátký a dávka PG12 příliš vysoká. Při použití stabilnějšího analogu prostacyklinů, iloprostu, by se spíše dalo uvažovat o farmaceutickém použití.

V. Constantini a kol. (Cancer Chemother. Pharmacol. 22,239 /1988/) srovnávali antimetastatický účinek PG 12 (5 a 10 mg/kg) a Iloprostu (0,1 a 0,2 mg/kg) na vytvoření metastáz v plicích buněčné linie melanomu BL6 po i. v. injekci nádorových buněk u myší. Účinek byl závislý na počtu aplikovaných nádorových buněk a časovém intervalu mezi aplikací substance a nádorových buněk. Při různých uspořádáních pokusů se iloprost projevil jak co se týká dávky, doby účinku a dosaženého účinku PG12 daleko lepší.

Piccini a kol. (1988) získali srovnatelná data u Lewisova plicního karcinomu u myší za použití stejných dávek a podobného uspořádání pokusů. Při jednorázové dávce 0,2 mg/kg, 1 hodinu před injekcí nádorových buněk redukoval iloprost počet plicních metastáz o více než 90 %.

Uspořádání pokusů jako i. v. injekce nádorových buněk nebo jednorázové dávky látky jsou ale klinicky málo relevantní.

Další pokus popsaný Piecinim a kol. vypovídá více. Při klasickém modelu pro zjištění antimetastatické potence, totiž i. m. implantace primárního nádoru (Lewisův karcinom plic) do nohy a následné chirurgické odstranění nádoru (leg amputation), snížil iloprost v dávce 0,2 mg/kg, 1,5 hodiny před odstraněním nádoru/ počet plicních metastáz asi o 50 %. Čas přežití se ale prodloužil jen nepodstatně.

Podstata vynálezu

Nyní bylo s překvapením zjištěno, že eptaloprost, cicaprost a kombinace eptaloprostu a cicaprostu s antagonisty TXA₂ působí v protikladu k účinkům jiných prostacyklinů, které byly až dosud známé, selektivně antimetastatický, neboť není prokazatelný žádný účinek vyvolávající růst primárního nádoru.

Předmětem předloženého vynálezu tedy je použití prostacyklinů obecného vzorce I

- 1 CZ 282638 B6 _ď ^(CH2>n-COa<

II

ve kterém značí n číslo 1 nebo 3, jejich adičních solí s fyziologicky přijatelnými bázemi nebo jejich klatrátů s cyklodextriny a kombinací antagonistů tromboxanu-A2 s deriváty prostacyklinu, pro výrobu léčiva s antimetastatickým účinkem.

Výhodné je použití eptaloprostu vzorce

a jeho adičních solí s fyziologicky přijatelnými bázemi nebo jeho klatrátů s cyklodextriny pro výrobu léčiva s antimetastatickým účinkem.

Dále je výhodné použití cicaprostu vzorce

II

a jeho adičních solí s fyziologicky přijatelnými bázemi nebo jeho klatrátů s cyklodextriny pro výrobu léčiva s antimetastatickým účinkem.

-2CZ 282638 B6

Také je výhodné použití kombinace antagonistů tromboxanu-A? s deriváty prostacyklinu obecného vzorce I a jejich adičními solemi s fyziologicky přijatelnými bázemi nebo jejich klatráty s cyklodextriny pro výrobu léčiv s antimetastatickým účinkem.

Vynález se tedy týká antimetastaticky působících prostředků sestávajících z eptaloprostu nebo cicaprostu nebo jejich adičních solí s fyziologicky snesitelnými bázemi nebo jejich klatráty s cyklodextriny nebo s kombinací antagonistů thromboxanu-A₂ a derivátů prostacyklinu s obvyklými pomocnými látkami a nosiči.

Eptaloprost [(5E)-( 16S)-13,14-didehydro-1 a,-1 B-dihomo-16,20-dimethyl-3-oxa-18,18,19,19tetradehydro-6a-karbaprostaglandin-I₂] a jeho β-cyklodextrinový klatrát se mohou vyrobit podle následujícího předpisu:

Ke směsi sestávající ze 6,9 g 2-[(E)-(lS,5S,6S,7R)-7-(dimethyl-terc.-butylsilyloxy)-6-J [(3S,4S)3-(dimethyl-terc.-butylsilyloxy)-4-methyl-nona-l,6-diinyl]-bicyklo[3.3.0]oktan-3-yliden]-ethan1-olu (W. Skuballa, E. Schillinger, C.-S. Stiirzbecher, N. Vorbrůggen. J. Medicinal Chemistry 29. 313 (1986); v tomto popsána jako sloučenina 15a) a 11,5 g trimethylorto-4-brombutyrátu se vnese do 17,2 ml 50% louhu sodného a 337 mg tetrabutylammoniumhydrogensulfátu a míchá se 16 hodin při 22 °C pod argonem. Potom se zředí za chlazení ledovou vodou 20 ml vody a okyselí 10% roztokem kyseliny citrónové na pH 5. Extrahuje se třikrát vždy 300 ml etheru, organická fáze se promyje jednou 200 ml solanky, usuší se síranem horečnatým a odpaří ve vakuu. Po chromografii zbytku na silikagelu směsí hexanu a etheru (3 + 2) se získá 7,6 g (5E)-( 16S)-13,14didehydro-1 a, 1 b-dihomo-16,20-dimethyl-3-oxa-18,18,19,19-tetradehydro-6a-karbaprostaglandinE-methylester-1 l,15-bis-(dimethyl-terc.-butylesteru)jako bezbarvý olej.

IR(CHC1₃): 2953, 2925, 2859, 2230, 1730, 1250, 838 cm'¹.

Pro odštěpení silyletheru se míchá 7,25 g výše popsaného bissilyletheru 48 hodin při 24 °C se 600 ml směsi sestávající z kyseliny octové a vody a tetrahydrofuranu (65+35+10). Potom se odpaří ve vakuu a zbytek se chromatografuje na silikagelu. S ethylacetát/hexanem (3+2) se získá 3,9 g (5E)-(168)-13,14-didehytetradehydro-6a-karbaprostaglandin-I₂-methylester jako bezbarvý olej.

IR(CHC1₃): 3400 (široký), 2935, 2865, 2230, 1735 cm'¹.

Pro zmýdelnění se míchá roztok 3,66 g výše uvedeného methylesteru ve 35 ml methanolu se 35 ml 0,5 molámího louhu sodného 30 minut při 24 °C pod argonem. Potom se zředí 20 ml vody, okyselí 20% roztokem kyseliny citrónové na pH 2, extrahuje se čtyřikrát vždy 100 ml methylenchloridu, organická fáze se promyje jednou 50 ml solanky, usuší se síranem sodným a odpaří ve vakuu. Zbytek se chromatografuje za použití ethylacetátu na silikagelu. Při tom se získá 3,4 g titulní sloučeniny jako bezbarvý olej.

IR(CHC1₃): 3400 (široký), 2962, 2940, 2365, 2230, 1722 cm'¹.

β-cyklodextrinový klatrát (5 E)-( 16S)-13,14-didehydro-1 a, 1 b-dihemo-16,20-dimethyl-3-oxa18,18,19,19-tetradehydro-6a-karbaprostaglandin-I₂.

41,75 g β-cyklodextrinu se rozpustí ve 298 ml vody při 80 °C a přikape se roztok 1,5 g (5E)(16 S)-13,14-didehydro-14,1 b-dihomo-16,20-dimethyl-3-oxa-18,18,19,19-tetradehydro-6a-karbaprostaglandin-L ve 24 ml ethanolu během 15 minut. Míchá se 4 hodiny při 60 °C a ponechá se vychladnout přes noc za míchání. Vyloučená pevná látka se odsaje, promyje se 50 ml směsi sestávající z vody a ethanolu (1:1) a suší se 24 hodin při 13,3 Pa a 25 °C nad oxidem fosforečným a získá se 39 g volně tekoucích krystalů β-cyklodextrinového klatrátu výše

-3 CZ 282638 B6 uvedeného analogu karbocyklinu. Obsah analogu karbocyklinu v klatrátu se stanoví titrací a činí 3,3 %.

Cicaprost a jeho β-cyklodextrinový klatrát se mohou vyrobit v souladu se způsobem, který je popsán v EP-PS 119 949 a mezinárodním zveřejňovacím spisu WO 87/05294.

Jako antagonisty tromboreceptorů TXA₂ přicházejí v úvahu všechny sloučeniny, které jsou například popsány v: 35017-315; US 4472-586; US 4263-207; US 4394-515; US 428-365; BE 883-713; 35 7093-962; EP 43-292; EP 82-646; DE 3346-047; WO 8400-754; US 4474-884; DE 3401-986; DE 3127-343; BE 897-763; EP 74-861; AU 8425-607; EP 78-668; DE 3339-019; EP 137-426 a uN. H. Wilson aR. D. Jones v: Advances in Prostaglandin, Thromboxane and Lenkotriene Research 14, 420-423 (1985), jakož i K. Stogmeier et al. v: Thrombosis Research 35,379-395 (1984).

Například lze uvést:

4-[2-(benzolsulfonamido)-ethyl]-fenoxyoctová kyselina (BM 13 177) [K. Stegmeier et al. v: Thrombosis Research 35, 379-395, 1984).

[ 1 α(Ζ),2β,5α]-(+)-7-[5-[[( 1, l-bifenyl)-4-yl]methoxy]-2-(4-morfolinyl)-3-oxo-cyklopentyl]-4heptanová kyselina (AH 23848) (Br. J. Pharmac. (1985), 86, 259) [ip,2a(5Z),3a,4p]-7-[[2-[(fenylamino)-karbonyl]hydrazino]methy]-7-oxabicyklo[2.2.1]hept-2yl]-5-heptanová kyselina (SQ 29.548) (Prostaglanins 29, 785 (1985))

4-(4-chlorbenzensulfonylamido)-ethylbenzenoctová kyselina (EM 13 505) (Intem. Conf. Deukotrienes and prostanoids in Health and Disease, Tel-Aviv. Oct. 1985, str. 10)

7-[3-[[[(fenylamino)karbonyl]hydrazinol]-methyl]bicyklo[2.2.1.]hept-2-yl][la,2P,(Z),3a,4a] (EP 045) a 7-[(lS,2S,4R)-3-[l-(3-fenylthioreidoimino)ethyl(bicyklo[2.2.1]heptan-2-yl]-5-heptanová kyselina (EP 092) (obě látka R. A. Armstrong et al. V Br. J. Pharmacol. 84. 595-607, 1985] dibenzo[b,f]thiepin-3-methanol-5,5-dioxid(L 640035) [C-C. Chán v: Europ. J. Pharmacol. 110 (3), 323-328, 1985)

2,7(1H) -isochinolinsulfonamidy, N7-(3-chlorfenyl) N2-[[7-[[(3-chlorofenyl)aminosulfonyl]-3,4dihydro(SKF 88046) [B. M. Weich an et al. v: Prostoglandins Leukotrianes and Medicine 15, 167-175, 1984).

Při intravenózní infůzi Eptaloprostu, cicaprostu nebo výše uvedených kombinací jsou nezbytné dávky pro den například množství asi 50 až 250 pg. Při orální aplikaci se používá asi 125 až 350 pg pro den. Pro perorální aplikaci obsahuje jednotka dávky 25 až 50 pg, u retardujících formulací 25 až 250 pg, ve formě tablet, dražé, kapslí, pilulek, suspenzí nebo roztoku, které mohou být vyrobeny obvyklým způsobem používaným v galenice, za přidání přísad používaných v galenice a nosičů.

Antagonisty tromboreceptorů se používají podle předloženého vynálezu v množstvích, která se pohybují v oblasti množství používaných až dosud v humánních studiích (Riess, Η., E. Hillet, B. Reinhardt, C. Bráuning v: Thrombosis Research 15. 371-378, 1984). Obecně stačí 100 až 3000 mg/den, s výhodou 200 až 1200 mg/den BM 12177, popřípadě 1 až 150 mg/den, s výhodou 2 až 100 mg/den AH 23 848 nebo SQ 29 548, nebo biologicky ekvivalentní množství jiného antagonisty tromboxanových receptorů.

-4CZ 282638 B6

Pro výhodnou perorální aplikaci přichází v úvahu zejména tablety, dražé, kapsle, pilulky, suspense nebo roztoky, které se doplňují obvyklým způsobem přísadami a nosiči užívanými v galenice.

U kombinací se mohou používat hmotnostní množství prostacyklin/prostacyklinový analog/prostaglandinu a antagonistů receptorů tromboxanu, které jsou při společné aplikaci ve srovnání s dávkami jednotlivých účinných látek, používaných dosud při jiných indikacích, silně sníženy.

PC/PCA/PG aTXAA se používají kombinovány do jedné dávkové jednotky nebo odděleně a současně nebo sekventielně ve hmotnostním poměru v podstatě asi 1:1 až 1:10 000 (například ve stejném vehikulu, tabletě nebo i olejovém roztoku jako směsi benzylbenzoátu a ricinového oleje.

Jako cyklodextrin přichází v úvahu v první řadě β-cyklodextrin.

Příklady provedení vynálezu

Pro buněčné linie R 3327 Mat-Lu, používané při pokusech, jsou v článku J. T. Isaacs (Current Concepts and Approaches to the Study of Prostatě Cancer 513-576, 1987, Allan R. Liss, lne., Animal Model Systems) na str. 533 uvedeni výzkumníci a laboratoř, kteří tuto MAT-Lu Sublino měli poprvé v rukou: D. W. Lanzan, W. D. W. Heston, D. Kadmon a W. R. Fair (Division of Urology, Dept. Of Surgery, Washington University School of Medicine, St. Louis). Kromě toho jsou popsány zvířecí kmeny, ve kterých tato Subline vzniká, a podrobné charakteristiky růstu těchto buněčných linií. D. W. Lazan et al. popisují v Cancer Research 42.1390 (1982), jak se jednobuněčná suspense nádorových buněk R 3327 Mat-Lu preparuje z jednotlivé krysy pomocí čerstvě vyříznutého nádoru slabin.

R 3327 MAT-Lu, získaná Dr. Issacsem, John Hopkins Univ., rychle roste nezávisle na endokrinologii a nevykazuje žádné měřitelné receptory steroidů. Množství metastáz činí 100 %. Doba přežití zvířete se pohybuje po s. c. implantaci asi okolo 35 dnů. Pro důkaz antimetastatického účinku derivátu prostacyklinu, popřípadě kombinovaných produktů, sestávajících z antagonistů TXA₂ a prostacyklinů, bylo zvoleno uspořádání s s. c. implantací bez odstranění primárního nádoru.

1. Nádor se odebere za aseptických podmínek asi 1 týden po implantaci donorovému zvířeti. V MEM 199 (minimum escential medium, standardizované médium firmy Gibco, UK) se nádor zbaví nekrotických části a rozřeže se na kusy s délkou hrany asi 2 mm. Dospělým, samčím Copkiysám (OLAC, Anglie) se implantuje 1 kousek nádoru subkutánně. Zvířata se rozdělí na 4 skupiny po 10 zvířatech. Již následujícího dne se zvířatům implantovaly s. c. Alzetovy minipumpy. Vel. 1: rozpouštědlo, vel. 2: iloprost (300 ng/kg/min), vel. 3: eptaloprost (100 ng/kg/min). 16. den se pumpy vymění. Nádory se změří jedenkrát týdně posuvným měřítkem. Plocha nádoru se vypočte jako součin největšího průměru a na tento kolmo stojícího průměru. Na konci pokusu se zvířata usmrtí dekapitací. V krvi se zjistí hladina účinné látky. Plíce se preparují, 24 hodin fixují v Bouinchově roztoku a potom se uchovávají v alkoholu. Počet metastáz v plících se určí výpočtem. Toto je usnadněno tím, že se metastázy Bouinchovým roztokem nebarví. Dále se provede klasifikace na velké a malé metastázy.

2. Účinek iloprostu a eptaloprostu na R 3327 MAT-LU PC

Při zvoleném uspořádání pokusu (s. c. implantace nádoru, žádné odstranění primárního nádoru) jsou stanoveny požadavky na antimetastatický účinek, které je nutno stanovit velmi vysoké, neboť primární nádor průběžně vylučuje metastázy.

-5CZ 282638 B6

Tělesná hmotnost nebyla na konci pokusu při terapii prostacykliny nijak signifikantně snížena.

	tělesná hmotnost (g)	plocha nádoru (mm2)
kontrola	315 ± 28	1966 ±791
iloprost	282 ± 43	1658 ±485
eptaloprost	281 ±43	1928 ±691

Růst nádoru byl asi od 12 dne po implantaci velmi progresivní (obr. 1). Specifický inhibitor metastáz by neměl mít na růst primárního nádoru žádný vliv. Za použití iloprostu a eptaloprostu nebyl zjištěn rovněž žádný rozdíl v růstu primárního nádoru ve srovnání s kontrolou.

Informaci o antimetastatickém potenciálu udává sama o sobě vyhodnocení plicních metastáz pouze v plicích metastázujících PC. Nalezené metastázy jsou proměnné co se týká jejich velikosti od 1 mm průměru až asi do 3 mm. Je možné provést rozdělení na malé a velké metastázy, aniž by se vyskytovalo mnoho mezních případů.

Při použití iloprostu v tomto modelu nebyla pozorovatelná žádná redukce celkového počtu plicních metastáz.

Eptaloprost vede naproti tomu k významnému a výraznému snížení celkového poctu metastáz (obr. 2). U rozdělení na malé a velké metastázy se ukazuje, že iloprost projevuje trend redukovat počet velkých metastáz (obr. 3), naproti tomu co počet malých metastáz má tendenci se oproti kontrole zvyšovat (obr. 4). Významný účinek na počet metastáz lze rovněž pozorovat u eptaloprostu, který je u velkých metastáz výraznější než u malých metastáz.

3. Při druhém pokusu se stejným uspořádáním experimentu jako u 2 se eptaloprost aplikuje denně perorálně ode dne implantace nádoru až do ukončení pokusu v dávkách 0,1 až 0,5 mg/kg. Opět nebyl zjištěn žádný účinek na primární nádor. Zatím co při dávkách 0,1 mg/kg nebylo možné zjistit žádný účinek na počet plicních metastáz, vede eptaloprost při vyšších dávkách 0,5 mg/kg tělesné hmotnosti k významné redukci (p < 0,05, Dunnettův test) k významné redukci počtu metastáz (obr. 5).

Přehled obrázků na výkresech

Dále jsou uvedeny významy obr. 1 až 5:

Obr. 1: účinek iloprostu a eptaloprostu na růst R 3327 MAT-Lu PC (primární nádor)

Obr. 2: účinek iloprostu a eptaloprostu na celkový počet plicních metastáz,

Obr. 3: účinek iloprostu a eptaloprostu na počet velkých plicních metastáz,

Obr. 4: účinek iloprostu a eptaloprostu na počet malých plicních metastáz,

Obr. 5: účinek eptaloprostu při různých množstvích dávek na počet plicních metastáz.

Claims (5)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití prostacyklinů obecného vzorce ve kterém značí n číslo 1 nebo 3, jejich adičních solí s fyziologicky přijatelnými bázemi nebo jejich klatrátů s cyklodextriny a kombinací antagonistů tromboxanu-A₂ s deriváty prostacyklinů, pro výrobu léčiva s antimetastatickým účinkem.
2. 2. Použití eptaloprostu vzorce a jeho adičních solí s fyziologicky přijatelnými bázemi nebo jeho klatrátů s cyklodexti iny pro výrobu léčiva s antimetastatickým účinkem.
3. 3. Použití cicaprostu vzorce

   O'^X^^xCCCH

   II a jeho adičních solí s fyziologicky přijatelnými bázemi nebo jeho klatrátů s cyklodextriny pro výrobu léčiva s antimetastatickým účinkem.
4. 4. Použití kombinace antagonistů tromboxanu-A2 s deriváty prostacyklinu obecného vzorce
5. 5 I a jejich adičními solemi s fyziologicky přijatelnými bázemi nebo jejich klatráty s cyklodextriny pro výrobu léčiv s antimetastatickým účinkem.

   5 výkresů

   -8CZ 282638 B6 povrch tumoru (mm²)